CN1173136A - 用造血蛋白刺激红细胞生成的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用造血蛋白血小板生成素并有选择地结合红细胞生成素刺激红细胞生成的方法。所提供的上述方法可用于在体外和体内、在骨髓和外周血细胞中刺激红细胞生成。另外,还披露了治疗血小板减少患者和贫血患者的方法。

Description

用造血蛋白刺激红细胞生成的方法
血细胞生成是由骨髓里的多能干细胞发育并分化成血细胞的过程。这一过程涉及多肽生长因子(细胞因子)的复杂的相互作用，所述因子通过靶细胞上的膜结合受体而起作用。细胞因子的作用会导致细胞增殖和分化，就特定细胞因子而言，其通常是谱系特异的和/或时间特异的。一种细胞的发育，如由干细胞生成血小板或红细胞，可能需要若干种细胞因子以正确的顺序协同作用。
已知的细胞因子包括白介素，如IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-8等；和集落刺激因子，如G-CSF，M-CSF，GM-CSF，红细胞生成素(EPO)等。一般，白介素起到免疫反应和炎症反应的介体的作用。刺落刺激因子能刺激骨髓衍生细胞的增殖，激活成熟的白细胞，并且构成宿主对炎症、感染和免疫攻击反应的一个整体部分。
业已研制出多种细胞因子作为治疗剂。已将几种集落刺激因子结合癌症的化疗使用，以加速患者免疫***的恢复。白介素-2、α-干扰素和γ-干扰素被用于治疗某些癌症。能刺激红细胞发育的EPO被用于治疗因肾衰竭而发生的贫血。负责刺激巨核细胞生成和血小板生成的因子不能作特定的鉴定，部分原因是缺乏好的资源，缺乏好的分析方法，并缺乏对其生产位点的了解，尽管已用了三十年的时间来提取并鉴定这些因子，这种情况直到最近才有所改善。在文献中被称作“血小板生成素”的巨核细胞生成因子(见最近由Mc-Donald所作的综述，Exp.Hematol.16：201-205，1988；和McDon-ald，Am.J.Ped.Hematol.Qncol.14：8-21，1992)现在已被鉴定和提取(见待批的美国专利申请No.08/252,491；Lok等，Nature 369：565-568，1994；和Kaushansky等，Nature 369：568-571，1994；以上文献均被收作本文的参考)。
与血小板功能异常相关的轻度出血症(MBDs)比较常见(Bach-mann，Seminars in Hematology 17：292-305，1980)，象多种先天性血小板功能紊乱都是，包括Bernard Soulier综合症(血小板GPIb缺损)，Glanzmann′s血小板机能不全(GPIIb和GPIIIa缺损)，先天性无纤维蛋白原血症(血浆和血小板中血纤维蛋白原含量减少或缺乏)，和灰色血小板综合症(缺乏α-颗粒)。另外，还有多种疾病与血小板分泌、贮集缺陷、血小板花生四烯酸途径异常、血小板环加氧酶和凝血恶烷合成酶缺陷以及血小板活化缺陷相关(见Rao和Holmsen的综述，Seminar in Hematology 23：102-118.1986)。目前，尚不十分了解这些缺陷中大部分的分子基础。
贫血是红细胞(红细胞)生成缺陷，它会导致由血液向机体组织转运的氧气量减少。因出血而引起的大量失血、因自身抗体、辐射或化学药品的作用而引起的红细胞破裂或因高海拔或长时间丧失意识引起的氧气摄入减少都会导致缺氧。当组织出现缺氧时，EPO的产生受到刺激，并能增加红细胞的产生。EPO能促进骨髓里的原前体细胞转化成原红细胞，原红细胞随后成熟，合成血红蛋白，并作为红细胞释放到循环***中。当循环***中红细胞的数量多于正常组织供氧所需数量时，循环***中EPO的含量降低。
巨核细胞和红细胞含量的严重减少与通过化疗和辐射治疗各种癌症相关，并与诸如AIDS、再生障碍性贫血和脊髓发育不良这样的疾病相关。当巨核细胞和/或红细胞的含量变得太低时，例如，血小板数低于25,000～50,000，血细胞比容低于25，则容易产生明显的病态，而且，在某些场合，上述含量还会危及生命。除了治疗所述疾病外，具体治疗还包括针对血小板减少(低血小板数)的血小板输血和用EPO刺激红细胞生成，或针对贫血的红细胞输血。
分子生物学的最新进展大大增进了我们对血细胞生成的了解，但同时也发现其生成过程极为复杂。虽然已鉴定了多种细胞因子，而且已证实了其中一些的临床应用价值，但本领域仍需要能刺激骨髓和淋巴前体增殖和分化及成熟血细胞生成的其它试剂。特别需要能刺激巨核细胞和红细胞谱系的细胞，包括血小板和红细胞发育和增殖的试剂。本领域还需要可用于同时治疗细胞减少症和贫血的试剂，如因骨髓中造血细胞的破裂而引起的贫血，这种现象出现在诸如通过化疗和辐射治疗癌症的情况和病理性情况，如脊髓发育不良、AIDS、再生障碍性贫血、自身免疫病或炎症。本发明能满足上述要求并具有相关的其它优点。
本发明的一个目的是提供用于促进红细胞生成的方法，该方法是通过在有TPO和EPO的条件下培养骨髓或外周血细胞而实现的，TPO和EPO的用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体数目比在没有TPO的条件下所培养的细胞产生的多，其中，所述TPO包括选自以下序列的一段氨基酸序列：序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；和序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266；
本发明的另一个目的是提供用于促进红细胞生成的方法，该方法是通过在有一种含TPO的组合物的条件下培养骨髓或外周血细胞而实现的，TPO的用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体数目比在没有TPO的条件下所培养的细胞产生的多，其中，所述TPO包括选自以下序列的一段氨基酸序列：序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；和序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266；
本发明的又一个目的是提供一种通过服用一种含TPO的组合物刺激在哺乳动物中红细胞生成的方法，TPO在一种可以药用的媒介物中，该方法用于使红系细胞增殖或分化提高，其中，所述TPO包括选自下列序列的一段氨基酸序列：序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；和序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266。
本发明的再一个目的是提供一种通过服用一种含EPO和TPO的组合物刺激在哺乳动物中红细胞生成的方法，EPO和TPO在一种可以药用的媒介物中，该方法用于使红系细胞增殖或分化提高，其中，所述TPO包括选自以下序列的一段氨基酸序列：序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；和序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266。
本发明的另一个目的是提供用于刺激来自体内的红细胞生成的方法，该方法包括与一种组合物一起培养骨髓或外周血细胞，该组合物含有一定量的血小板生成素和红细胞生成素，其用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体的数目比在没有血小板生成素的条件下所培养的细胞产生的多，其中，所述血小板生成素的用量为100pg/ml-10ng/ml，红细胞生成素的用量为0.5-5个单位/ml。
本发明还有一个目的是提供用于刺激来自体内的红细胞生成的方法，该方法包括与一种组合物一起培养骨髓或外周血细胞，该组合物含有一定量的血小板生成素，其用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体的数目比在没有血小板生成素的条件下所培养的细胞产生的多，其中，血小板生成素的用量为100pg/ml-10ng/ml。
图1表示与仅添加EPO相比，向培养的骨髓细胞中添加TPO和EPO之后红细胞系集落生成得以增强。
图2表示在给事先因辐射和化疗而使各类血细胞减少的动物服用TPO后，服用了TPO的动物的红细胞的减少不再那么严重，并很快恢复正常。
在对本发明进行详细说明之前，对本文中使用的一些术语进行定义是很有帮助的：
等位变体：通过突变而产生的一个基因的另一种形式，或由该突变基因所编码的另一种多肽。基因突变可以是沉默型的(所编码的多肽不发生变化)或是编码具有不同氨基酸序列的多肽。
cDNA：通过一种信使RNA模板的逆转录而制备的互补DNA，或这种分子的克隆或扩增的拷贝。互补DNA可以是单链的或是双链的。
表达载体：一种线状或环状的DNA分子，它包括一个编码一种感兴趣的多肽的片段，该片段可操作地同能实现其转录的其它片段连接。所述其它片段包括启动子和终止序列，而且，还可以包括一个或几个复制起点，一个或几个选择标记，一个增强子，一个聚腺苷酸化信号等。表达载体通常是由质粒或病毒DNA产生，或是同时含有二者的因子。“可操作地连接”一词是指所述片段是安排好的，以使其能与设计的目标一致起作用，例如，转录始于启动子，并经编码片段至终止子。
基因：编码一种多肽的一段染色体DNA。一个基因包括一个或几个编码氨基酸的片段，有时在这些编码片段之间散布有非编码的“间插序列”(“内含子”)，和侧翼非编码片段，这些非编码片段支持编码序列的转录。
互补分子：与参考序列相比，具有互补的碱基序列和相反取向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′互补于5′CCCGTG-CAT3′。
启动子：一个基因的一部分，RNA聚合酶与其结合，mRNA的合成也由此处开始。
如上所述，本发明提供了用具有造血活性的蛋白刺激血小板生成和红细胞生成的方法。本文中“造血”一词是指刺激骨髓或淋巴前体增殖和/或分化的能力，这种能力用标准分析方法测定。例如，可参见Metcalf，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：5327-5330，1980；Met-calf等，J.Cell.Physiol.116：198-206，1983；和Metcalf等，Exp.Hematol.15：288-295，1987。通常，是在有测试样品和对照样品的条件下培养骨髓细胞。然后通过目测和/或染色评价培养物中细胞的增殖和分化。特别优选的分析方法是Mosman的MTT比色分析法(J.Immunol.Meth.65：55-63，1983；收作本文的参考)。
在本文中，“红细胞生成”是指红系细胞前体的增殖和/或分化。红系细胞增殖和分化的标准测定方法包括血细胞比容和网织红细胞计数。血细胞比容是红细胞的一种测定指标，通常以由红细胞的总血体积的百分比形式表示。网织红细胞计数是测1～2天龄细胞所含的mRNA(成熟红细胞中无mRNA)并通过染色评价核糖体的聚集(Erslev，A.，”Reticulocyte Enumeration”，Hematology，McGraw-Hill，NY，1990)。网织红细胞计数是在计数的500或1000个细胞中这种细胞的百分比。网织红细胞的平均范围是0.8％-1.2％。EPO可以商购(R&D***，Minneapolis，MN和Amgen，ThousandOaks，CA)，其活性通过根据另一种红细胞生成素的国际参比制剂校准而进行测定(Annable等，Bull.Wld.Hlth.Org.47：99，1972)，可使用体内分析法，测定掺入无缺氧性(exhypoxic)红细胞增多小鼠的红细胞的56Fe的量(Cotes等，Nature 191：1065，1961)；或使用体外细胞增殖分析法，该方法采用一种因子依赖型人红白细胞系，TF-1(Kitamura等，J.Cell.Physiol.140：323，1989)。
本发明的部分基础是发现血小板生成素(TPO)能促进红系细胞生长。当本发明人给血小板减少的哺乳动物服用TPO时，除了血小板增加之处，还惊奇地发现TPO能加强红细胞的恢复并能迅速提高血细胞比容水平。
编码典型的人和小鼠TPO蛋白的cDNA克隆的序列分别示于序列1和3中，而相应的氨基酸序列分别示于序列2和4中。本领域技术人员可以理解，序列1、2、3和4所示序列以及序列5和6所示人基因组序列相应于所述人体基因的单个等位基因，并且预计存在等位变异。同样显而易见的是，本领域技术人员可以用不同的密码子制造位点，以便于该核苷酸序列的操作。
本发明提供了用基本上与序列2的蛋白及其种的同系物同源的蛋白刺激红细胞生成的方法。“分离的”一词是指一种蛋白不是存在于其天然环境中的状态，如与血液和动物组织分离。在一种优选形式中，分离的蛋白基本上不含其它蛋白，尤其是来源于动物的其它蛋白。理想的是提供高度纯化形式的蛋白，即纯度大于95％，大于99％更好。本文所说“基本上同源”是指蛋白质的氨基酸序列与序列2所示序列或其种的同系物有50％相同，60％相同较好，至少80％相同更好。所述蛋白若与序列2或其种的同系物至少有90％相同将更好，有95％或更多的相同最好。序列相同的百分比用常规方法测定。例如，参见Altschul等，Bull.Math.Bio.48：603-616，1986和Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，1992。简单地说，将两个氨基酸序列对齐，以使优化排列等级，采用的间隙开放度为10，间隙延伸度为1，和“blosum 62”的Henikoff和Henikoff(同上)分级点阵，如表1所示(氨基酸用标准的单字母密码表示)。百分相同率计算如下：
Figure A9519670200121
表1A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  VA  4R -1  5N -2  0  6D -2 -2  1  6C  0 -3 -3 -3  9Q -1  1  0  0 -3  5E -1  0  0  2 -4  2  5G  0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6H -2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4K -1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5M -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7S  1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4T  0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7V  0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4
基本上同源的蛋白的特征是具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加。以上改变最好是微不足道的，即为保守氨基酸置换，不会明显影响该蛋白的折叠或活性(见表2)；小的缺失，通常为1～大约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，如一个氨基末端的蛋氨酸残基，一个最多约为20～25个残基的小的接头肽，或一个有利于纯化的小的延伸，如一个多组氨酸片段，一个抗原表位或一个结合域。一般参见Ford等，Protein Expression and Purification 2：95-107，1991，该文献被收作本文的参考。
                         表2
                   保守氨基酸置换
碱性：         精氨酸
               赖氨酸
               组氨酸
酸性：         谷氨酸
               天冬氨酸
极性：         谷氨酰胺
               天冬酰胺
疏水的：       亮氨酸
               异亮氨酸
               缬氨酸
芳族的：       苯丙氨酸
               色氨酸
               酪氨酸
小型的：       甘氨酸
               丙氨酸
               丝氨酸
               苏氨酸
               蛋氨酸
可以用本领域已知的方法鉴定TPO和EPO中的基本氨基酸，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(alanine-scanning mutagenesis)(Cunningham和Wells，Science 244，1081-1085，1989)。在后一种技术中，将单个丙氨酸诱变引入该分子中的每个残基，并测定所得突变型分子的生物活性(例如，受体结合，体外或体内增殖活性)，以确定对该分子的生物活性起关键作用的氨基酸残基。通过分析晶体结构可以确定配体—受体相互作用位点，是通过诸如核磁共振、晶体学或光亲和标记之类的技术测定的。例如，参见de Vos等，Science255：306-312，1992；Smith等，J.Mol.Biol.224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992。
最近，已根据对结构—功能关系的阐释证实了EPO的生物活性突变蛋白(Boissel等，J.Biol.Chem.268：15983-15993，1993和Higuchi等，J.Biol.Chem.267：7703-7709，1992)。 Strickland等在EP0428267中披露了具有不同的唾液酸组成的EPO异构型。
一般，预计细胞因子有4-α螺旋结构，其中的第一和第四个螺旋对于配体—受体互作最为重要，而且在该家族的成员中保守程度更高。参见序列2所示的人TPO氨基酸序列，对细胞因子序列所做的比较表明，上述螺旋分别位于氨基酸残基29-53、80-99、108-130和144-168之间(边界为±4个残基)。通过与人的序列进行比较，可以确定小鼠和其它非人TPOs的螺旋边界。TPO的其它重要结构特征包括在序列2的位置28、50、106和172上的半胱氨酸残基。
除了上述造血蛋白之外，本发明的方法还包括使用所述蛋白的片段和编码该片段的分离的多核苷酸分子。特别感兴趣的是至少长度为10个氨基酸、与MPL受体结合的片段，和编码这种多肽的至少长度为30个核苷酸的多核苷酸分子。通过已知的筛选方法鉴定这种类型的多肽，如通过消化完整的蛋白或合成小的、重叠的多肽或多核苷酸(并使该多核苷酸表达)，选择性地结合上述结构分析技术。然后测试所得到的多肽特异地结合MPL受体并通过MPL受体刺激细胞增殖的能力。结合是用常规方法测定的，如由Klotz所披露的方法，Science 217：1247，1982(“Scatchard分析)。简单地讲，在有较高浓度未标记的TPO的条件下将放射性标记的测试多肽与带有MPL受体的细胞一起培养。通过在邻苯二甲酸酯油中离心将结合细胞，标记的多肽与未标记的多肽分离。试验多肽的结合亲和力是通过标绘纵坐标上结合标记与游离标记之比和横坐标上的结合标记而确定的。结合的特异性是通过与除TPO之外的细胞因子竞争而测定的。受体结合也可用将MPL受体(或其配体结合胞外域)固定化的方式通过沉淀试验化合物确定。简单地说，将所述受体或其一部分固定在一种不可溶的支持物上。对试验化合物进行标记，例如，对于重组试验化合物来说，对宿主细胞进行代射标记，或用常规的体外标记方法(如放射性碘化)标记。然后，让标记过的化合物与固定的受体结合，除去未结合的材料，并检测结合的标记化合物。用于检测各种标记的方法在本领域中是已知的。对增殖的刺激通常是用带有MPL受体的细胞通过MTT比色分析或3H-胸苷掺入分析而测定的。分析各种浓度下多肽的活性，浓度范围通常为1nm至1mM。
还提供了多达50或更多个残基，较好为100或更多个残基，更好为约140或更多个残基，以至接近完整的成熟蛋白的较大的多肽。例如，对序列2所示氨基酸序列中从残基28至残基172所作的分析和模拟表明，该分子的这一部分是能够自我组装的类生长因子结构域。同样感兴趣的是含有该核心类细胞因子结构域加上一个或几个初级翻译产物的其它片段或结构域的分子。因此，所感兴趣的其它多肽包括示于表3中的那些。
            表3小鼠TPo(序列4)
Cys(residue 51)--Cys(residue 195)
Cys(51)--Val(196)
Cys(51)--Pro(206)
Cys(51)--Ser(207)
Cys(51)--Asn(216)
Cys(51)一Arg(235)
Cys(51)--Arg(244)
Cys(51)--Arg(249)
Cys(51)--Gln(259)
Cys(51)--Arg(273)
Ser(45)--Cys(195)
Ser(45)--Val(196)
Ser(45)--Pro(206)
Ser(45)--Ser(207)
Ser(45)--Asn(216)
Ser(45)--Arg(235)
Ser(45)--Arg(244)
Ser(45)--Arg(249)
Ser(45)--G1n(259)
Ser(45)--Arg(273)人TPO(序列2)
Cys(28)--Cys(172)
Cys(28)--Val(173)
Cys(28)--Arg(175)
Cys(28)--Arg(185)
Cys(28)--Asn(193)
Cys(28)--Arg(198)
Cys(28)--Phe(207)
Cys(28)--Gln(235)
Cys(28)--Arg(266)
Ser(22)--Cys(172)
Ser(22)--Val(173)
Ser(22)--Arg(175)
Ser(22)--Arg(185)
Ser(22)--Asn(193)
Ser(22)--Arg(198)
Ser(22)--Phe(207)
Ser(22)--Gln(235)
Ser(22)--Arg(266)
本领域技术人员可以理解，所述分子的中间形式(例如，其C--末端为序列4的残基196-206的分子、其C-末端为序列2的残基185-193的分子或其N-末端为序列2的残基22-28的分子)同样有用，正如那些如上述所述的有一个或几个氨基酸置换、缺失、***或N-或C-末端延伸的多肽。因此，本发明提供了长度至少为10个氨基酸残基，较好为至少50个残基，更好为至少100个残基，最好为至少约140个残基的造血多肽，其中，所述多肽基本上与序列2所示的类似大小的多肽同源。
在本发明中被用于刺激红细胞生成的蛋白，可以按照常规技术在遗传工程化的宿主细胞中生产。合适的宿主细胞是那些能被外源DNA转化或转染并在培养基中生长的细胞，还包括细菌、真菌细胞，和培养的高等真核细胞。Sambrook等(Molecuar cloning：A Labora-tory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)和Ausubel等(同上)披露了对克隆的DNA分子进行操作并将外源DNA引入各种宿主细胞的技术，以上内容被收作本文的参考。在以下文献中披露了重组EPO的生产：Lin等，EP014805；Fritsch等，EP0411678；Fritsch等，EP0205564；Heg-wick等，EP0209539；Lin等，WO85/02610；US4，677195和US4,703,008。重组TPO的生产披露于以下文献中：Lok等，Nature 369：563-568，1994；Bartlay等，Cell 77：1117-1124，1994和Sauvage等，Nature 369：533-538，1994。
一般，在一个表达载体上编码一种细胞因子的DNA序列可操作地同一个转录启动子和终止子连接。所述载体通常带有一个或几个选择标记和一个或几个复制起点，不过，本领域技术人员可以理解，在某些***内，选择标记可以设置在不同的载体上，而外源DNA的复制可以通过整合到宿主细胞基因组中而实现。启动子、终止子、选择标记、载体和其它因子的选择是在本领域普通技术人员水平上进行常规设计的事情。很多这类因子在文献中都有记载并可从供货商处购买。
为了引导一种蛋白进入宿主细胞的分泌通道，在表达载体上设置一个分泌信号序列(也被称作前导序列、前原序列或前序列)。该分泌信号序列以正确读框与编码一种感兴趣的蛋白的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码感兴趣的蛋白的DNA序列的5′端，尽管某些信号序列也可位于感兴趣的DNA序列中的其它位置(例如，参见Welch等，US5,037,743；Holland等，US5,143,830)。所述分泌信号序列可在正常状态下与感兴趣的蛋白结合，或是来自编码另一种分泌蛋白的基因。
酵母细胞，特别是酵母属(Sacharomyces)的细胞是用于生产用于本发明的细胞因子的优选宿主。例如用外源DNA转化酵母细胞的方法以及由转化的细胞生产重组蛋白的方法披露于以下文献中：Kawasaki，US4,599,311；Kawasaki等，US4,931,373；Brake，US4,870,008；Welch等，US5,037,743；和Murray等，US4,845,075。这些文献被收作本文的参考。转化的细胞通过由选择标记确定的表型进行选择，选择标记通常为药物抗性或在缺乏一种特定营养物(如亮氨酸)的条件下生长的能力。用于酵母的优选载体***是由Kawasaki等(US4,931,373)披露的POT1载体***，这种载体***可以通过在含葡萄糖的培养基中生长选择转化的细胞。用于酵母的优选分泌信号序列为酿酒酵母(S.cerevisiae)MFα1基因的分泌信号序列(Brake，同上；Kurjan等，US4,546,082)。用于酵母的合适启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(例如，Kawasaki，US4,599,311；Kingsman等，US4,615,974；和Bitter，US4,977,092，这些文献被收作本文的参考)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。以下美国专利：US4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454也被收作本文的参考。用于其它酶母的转化***在本领域中也是已知的，所述其它酵母包括多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Lac-tis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、季也蒙毕赤酵母(P.guillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)。例如，可参见Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132：3459-3465，1986和Cregg，US4,882,279。
其它真菌细胞也可用作宿主细胞。例如，按照Mcknight等在US4,935,349中披露的方法可以采用曲霉属(Aspergillus)细胞，该专利被收作本文的参考。Sumino等在US5,162,228中披露了转化黄青色枝顶孢(Acremonium chrysogenum)的方法，该专利被收作本文的参考。Lambowitz在US4,486,533中披露了转化脉孢菌属(Neurospora)的方法，该专利被收作本文的参考。
培养的哺乳动物细胞也是优选的宿主细胞。用于将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52：456，1973)，电击法(Neu-mann等，EMBOJ.1：841-845，1982)和DEAE葡聚糖介导的转染(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley andSons公司，NY，1987)。这些方法均被收作本文的参考。在培养的哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法披露于诸如下列的专利文献中：Levinson等，US4,713,339，Hagen等，US4,784,950；Palmiter等，US4,579,821；和Ringold，US4,656,134。这些专利均被收作本文的参考。优选的培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC NO.CRL1650)，COS-7(ATCC NO.CRL1651)，BHK(ATCC NO.CRL1632)，BHK 570(ATCC NO.CRL10314)，293(ATCC NO.CRL1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)和中国仓鼠卵(例如CHO-K1；ATCC NO.CCL61)细胞系。其它合适的细胞系为本领域所熟知，并可从诸如美国典型培养物保藏所(Rockville，Mary-land)之类的公共保藏机构获得。一般，优选强力转录启动子，如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。例如，参见US4,956,288。其它合适启动子包括来自金属硫蛋白基因(US 4,579,821和4,601,978，这些专利被收作本文的参考)和腺病毒主要晚期启动子的启动子。
药物选择通常被用于筛选已***了外源DNA的培养的哺乳动物细胞。这种细胞一般被称为“转染子”。已经在有选择剂的条件下培养过并能将所感兴趣的基因传给其子代的细胞被称为“稳定的转染子”。优选的选择标记是编码对抗生素新霉素抗性的基因。选择是在有新霉素类药物，如G-418等的条件下进行的。选择***还可用于提高感兴趣的基因的表达水平，一种被称作“扩增”的过程。扩增是这样进行的：在有低含量选择剂的条件培养转染子，然后提高选择剂的用量，以选择能产生高水平感兴趣的基因的产物的细胞。一种优选的扩增选择标记是二氢叶酸还原酶，它能产生氨甲蝶呤抗性。也可采用其它抗药性基因(例如潮霉素抗性，多种药物抗性，嘌呤霉素乙酰转移酶)。
可以用作宿主细胞的其它高等真核细胞包括昆虫细胞、植物细胞和禽细胞。昆虫细胞的转化及由这种细胞生产外源蛋白的方法披露于以下文献中：Guarino等，US5,162,222；Bang等，US4,775,624；和WIPO公开WO94/06463，这些文献被收作本文的参考。Sinkar等披露了将毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)用作在植物细胞中表达基因的载体(J.Biosci.(Bangalore)11：47-58，1987)。
优选的原核宿主细胞为细菌大肠杆菌(E.coli)，尽管芽胞杆菌属(Bacillus)和其它属的细菌也可采用。转化所述宿主细胞的技术，以及在宿主细胞中表达克隆的外源DNA序列的技术在本领域中也广为人知(例如，见Sambrook等，同上)。当在诸如大肠杆菌之类的细菌中表达蛋白时，该蛋白通常是作为不可溶的颗粒体留在细胞质里，或通过细菌分泌序列引导至壁膜间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收颗粒体并用例如异硫氰酸胍变性。然后通过稀释变性剂使变性的蛋白发生重折叠。在后一种情况下，可以可溶的功能形式从壁膜间隙回收所述蛋白，该方法包括破坏(例如，通过超声处理或渗透压休克)细胞以便释放壁膜间隙的内含物，以及回收所述蛋白。
按照常规方法在一种培养基中培养转化或转染过的宿主细胞，所述培养基中含有为选择的宿主细胞所必须的养分及其它成分。各种适用培养基，包括确定成分培养基和复合培养基为本领域所熟知，这些培养基通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。根据需要，培养基中还可含有诸如生长因子或血清之类的成分。生长培养基通常以如下方式选择含有外源加入的DNA的细胞，例如，通过药物选择，或必须养分缺陷，该缺陷能由表达载体上所携带的或共转染至宿主细胞中的选择标记弥补。
可将转基因动物技术用于生产用于本发明的TPO和EPO。优选在宿主雌性哺乳动物的乳腺内生产所述蛋白。在乳腺内表达所述蛋白，并接着把感兴趣的蛋白分泌到乳汁中，能克服在从其它来源分离蛋白时会遇到的很多困难。乳汁易于收集，可以大量供应，而且已做过很好的生化鉴定。另外，主要乳蛋白在乳汁中的浓度也较高(约1～15g/l)。
从商业角度考虑，将具有大的产乳量的物种用作宿主显然是理想的。尽管可以采用诸如小鼠和大鼠之类的较小的动物(最好在受孕验证阶段)，但最好采用牲畜类哺乳动物，包括，但不局限于猪、山羊、绵羊和牛。特别优选绵羊，因为该物种现有的转基因历史、产乳量、成本及收集绵羊乳的设备易于获得等因素。为了比较影响选择宿主物种的因素，参见WIPO公开文献WO88/00239。通常，理想的是选择为奶场使用而培养的一种宿主动物品种，如East Friesland绵羊，或通过在后期培养转基因系引入产奶场牲畜。在任何情况下都应使用已知的、健康状况良好的动物。
为了实现在乳腺中的表达，使用了来自一种乳蛋白基因的转录启动子。乳蛋白基因包括编码酪蛋白(见US5,304,489，收作本文参考)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和乳清酸性蛋白的基因。优选β-乳球蛋白(BLG)启动子。就绵羊β-乳球蛋白而言，通常采用该基因的一段大约406 bp的5′侧翼序列区，(不过，优选采用高达大约5kbp的较大的5′侧翼序列区)，如包括β-乳球蛋白基因的5′侧翼启动子和非编码部分的约4.25kbp DNA片段。见Whitelaw等，Biochem J.286：31-39，1992。也可采用来自其它物种的启动子DNA的类似片段。
还可将β-乳球蛋白基因的其它片段结合到结构中，如待表达基因的基因组片段。本领域一般认可缺乏内含子的结构，所述内含子如那些与那些含所述DNA序列相比表达较差的片段(见Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 85：836-840，1988；Palmiter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：478-482，1991；Whitelaw等，TransgenicRes.1：3-13，1991；Wo89/01343；WO91/02318)。就此而言，一般理想的是，可能的话使用编码感兴趣的蛋白或多肽的基因的全部或部分天然内含子，最好还包括来自β-乳球蛋白基因的至少一些内含子。一个这样的片段是一种DNA片段，它能提供来自绵羊β-乳球蛋白基因的3′非编码区的内含子剪接和RNA聚腺苷酸化。当用它取代一个基因的天然3′非编码序列时，所述绵羊β乳球蛋白片段能提高并稳定感兴趣的蛋白或多肽的表达水平。在其它实施方案中，细胞因子序列的起始ATG周围的片段被来自一种乳特异蛋白基因的相应序列所置换。这种置换能产生一种推定的组织特异性起始环境，以促进表达。常见的是用诸如BLG之类的基因置换完整的细胞因子前—原序列和5’非编码序列，不过，也可置换较小的片段。
为了在转基因动物中表达细胞因子，将编码细胞因子的DNA片段可操作地同为其表达所需的其它DNA片段结合，以便产生表达单位。所述其它片段包括上述启动子及用于实现转录终止和mRNA聚腺苷酸化的序列。所述表达单位还包括一个编码一种分泌信号序列的DNA片段，该片段可操作地同编码细胞因子的片段连接。所述分泌信号序列可以是一种天然细胞因子分泌信号序列或是另一种蛋白，如乳蛋白的分泌信号序列。例如，参见Von Heihje，Nul.Acids Res.14：4683-4690，1986；和Meade等，US4,873,316，该专利被收作本文参考。
表达单位的构建通常是这样进行的：将一个细胞因子编码序列***一种质粒或噬菌体载体中，载体中含有其它DNA片段，不过，所述表达单位也可通过基本上任何序列的连接来构建。尤其常见的是提供一种含有一个编码乳蛋白的DNA片段的载体，并用感兴趣的细胞因子的编码序列取代所述乳蛋白编码序列，从而形成一种包括所述乳蛋白基因的表达控制序列的基因融合体。在任何场合下，在质粒或其它载体中克隆所述表达单位都有助于细胞因子序列的扩增。扩增通常是在细菌(如E.col)宿主细胞中进行，因此，所述载体通常包括一个复制起点和一个可在细菌宿主细胞中起作用的选择标记。
然后将表达单位引入所选择的宿主物种的受精卵(包括早期胚)中。异源DNA的引入可以用几种常规方法中的一种完成，包括显微注射(如US4,873,191)、逆转录病毒感染(Jaenisch，Science 240：1468-1474，1988)或利用胚胎干(ES)细胞的定点整合(见Bradley等所作的综述，Bio/Technology 10：534-539，1992)。然后将上述卵植入假孕母体的输卵管或子宫内，并使其发育成熟。在其种系中带有引入的DNA的子代，能以正常的孟德尔方式将所述DNA传给其后代，使得转基因畜群能够发育。
用于产生转基因动物的一般方法为本领域所熟知，例如，参见Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1986；Simons等，Bio/Technology 6：179-183，1988；Wall等，Biol.Reprod.32：645-651，1985；Buhler等，Bio/Technology 8：140-143，1990；Ebert等，Bio/Technology 9：835-838，1991；Krimpenfort等，Bio/Technology.9：844-847，1991；Wall等，J.Cell Biochem.49：113-120，1992；US4,873,191和4,873,316；WIPO公开文件WO 88/00239，WO90/05188，WO92/11757；和GB87/00458。以上文献均被收作本文的参考。用于将外源DNA引入哺乳动物及其生殖细胞中的技术最初是在小鼠上发展起来的。例如，参见Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA77：7380-7384，1980；Gordon和Ruddle，Science 214：1244-1246，1981；Palmiter和Brinster，Cell 41：343-345，1985；Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442，1985；和Hogan等(同上)。这些技术随后被应用于较大型的动物，包括各种家畜(例如，参见WIPO公开文件WO88/00239、WO90/05188，和WO92/11757；和Simons等Bio/Technology 6：179-183，1988)。总之，在目前所采用的产生转基因小鼠或家畜的最有效的方法中，按照本领域的标准技术将感兴趣的几百个线性DNA分子注射到受精卵的前核之一中。也可采用将DNA注射到合子的细胞质中的方式。
也可以在转基因植物中进行生产。表达可以是普遍的或是定向于一种特定器官，如块茎。参见Hiatt，Nature 344：469-479，1990；Edelbaum等，J.Interferon Res.12：449-453，1992；Sijmons等，Bio/Technology 8：217-221，1990；和欧洲专利局公开文件EP255,378。
TPO和EPO是用本领域广为人知的方式纯化的，如基于该蛋白的大小、电荷、可溶性及其它特性进行的亲和纯化和分离。当所述蛋白是在培养的哺乳动物细胞中产生时，最好是在无血清的培养基中培养所述细胞，以便限制混杂蛋白量。收获培养基并进行分级分离。优选的分级分离方法包括在伴刀豆凝集素A或其它凝集素上进行亲和层析，从而利用该蛋白上的碳水化合物。也可用固定化MPL受体蛋白或其配体结合部分或通过利用一种亲和标记物(如聚组氨酸、物质P或其它能得到抗体或其它特异结合剂的蛋白)纯化TPO。可以在感兴趣的蛋白与亲和标记物之间设置一个特异的裂解位点。已从表现较高EPO水平的***患者体内提纯到EPO，见US4,397,840，US4,303,650和US，3,865,801和Miyake等，J.Bi-ol.Chem.252：5558，1977。已利用反相HPLC纯化了由***患者和重组方法获得的EPO(Hewick等，US4,677,195)。
TPO蛋白可用于需要提高骨髓中造血细胞的增殖能力的场合，如用于细胞减少症和贫血的治疗，如再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合症、自身免疫病、AIDS、化疗或放疗。
含有TPO的组合物在治疗以低红细胞产生能力(贫血)为特征的疾病，特别是伴随低血小板产生能力(血小板减少)的疾病时十分有用。已知对癌症和病灶进行的化疗会同时导致患者的血小板和红细胞水平降低。
已发现TPO组合物能有效提高循环红细胞和红细胞前体细胞的含量。循环***中这种细胞的减少被称为贫血。血液中的红细胞含量可以每100ml血液中的血红蛋白量或每100ml血液中的堆积红细胞体积形式测定。如果患者的血红蛋白含量低于11～13gm/100ml血液(取决于患者的年龄和性别)时，即可诊断为贫血。本发明的方法特别适用于治疗与骨髓缺损相关的贫血的治疗，患这种贫血时，血细胞生成能力的下降与例如化疗的毒性作用相关。
业已发现TPO蛋白可用于血小板减少和贫血的同步治疗，例如通过提高血小板生产能力同时提高红细胞含量。贫血和血小板减少症与异组疾病和临床症状相关，它们可以单独或协同作用以产生病状。较低的血小板量可能与贫血相关，例如因大量输血或异常骨髓破裂所致的稀释性减少。例如，用于癌症治疗的化疗药物能抑制骨髓中血小板和红细胞祖细胞的发育，从而导致血小板减少和贫血，限制了化疗，并可能需要输血。另外，某些恶性肿瘤会损害血小板和红细胞的产生及分布。用于杀死恶性肿瘤细胞的放射治疗也会杀死血小板和红细胞祖细胞。血小板和红细胞的异常破坏，可能因诸如与骨髓有关的白血病和淋巴瘤或转移性癌症之类的血液病而起。将TPO用于治疗并发的贫血和血小板减少的其它指征包括再生障碍性贫血和药物引起的骨髓抑制，例如在用AZT对HIV感染进行化疗或治疗时所产生的骨髓抑制。
血小板减少的表现为出血增多，如鼻、口部或胃肠道粘膜出血，以及从伤口、溃疡或注射部位渗出。贫血的症状包括因劳累而引起的呼吸困难、眩晕、疲劳、皮肤和粘膜苍白。当与血小板减少有关时，会出现网织膜出血。
业已将EPO用于刺激红细胞产生。EPO是分子量约为34，000Da的糖蛋白，它能以三种形式存在：α、β和脱唾液酸(asailo)形式。α和β形仅在碳水化合物的成分上略有差异，但具有相同的效力、生物活性和分子量。脱唾液酸形式是除去了末端碳水化合物(唾液酸)的α或β形式。当机体处于健康状态，而且组织能从现有数量的红细胞得到足够的氧合作用时，红细胞生成素以极低的浓度存在于血浆中。例如，参见Lin等，US4,703,008；Lin等，WO85/02610；Fritsch等，EP0411678；Hewick等，EP0209539和Hewick等，US4,677,195。这些专利均被收作本文的参考。
在正常个体中，红细胞的产生是受到精确控制的，以充分氧合组织，而又不会产生过多的红细胞和妨碍循环。红细胞产生的减少会导致组织缺氧，刺激EPO表达并提高血浆里的内源EPO。EPO通过刺激骨髓里推定的前体细胞转化成前成红细胞而增加红细胞的产生，所述前成红细胞随后成熟，合成血红蛋白并作为红细胞释放到循环***中。
为提供TPO和EPO对红细胞生成的刺激效果，本发明并非必须服用外源EPO。如上文所述，红细胞含量的降低，在某些场合下会导致内源EPO含量的升高(高于500mU/ml血浆)，因此仅服用TPO就足够了。当红细胞生成素的表达水平不高时，最好与TPO组合物一起服用红细胞生成素。
EPO被作为治疗剂给100ml血液中血红蛋白浓度低于10gm的***患者服用。服用方式可以是静脉内(IV)注射或皮下(SC)注射，而且注射次数根据患者的身体状况从每日至每周加以改变(DeMarchi等，Clin.and Experim.Rheumatol.11：429-444，1993；Miller等，N.Eng.J.of Med.322：1689-1692，1990；Nissenson等，Annals ofInt.Med.114：402-416，1991；Erslev，Sem.Oncol.19(8)Suppl.8：14-18，1992和PROCIT Epotin-alfa package insert，Amgen，Thou-sand Oalks，CA)。
作为药物使用，TPO和EPO被制成供肠胃外使用，特别是供静脉内注射或皮下注射使用，按常规方法输药。静脉内使用是通过浓缩药团注射或输液，而进行的时间通常为1～几小时。一般，药用配方中包括与可以药用的媒介物组合的造血蛋白，所述媒介物如盐水、缓冲盐水、溶于水中的5％葡萄糖等。配方中还可以包括一种或几种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白，以免蛋白损失在药瓶表面等。另外，TPO和EPO可以与其它细胞因子，特别是早期作用细胞因子，如干细胞因子IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF组合。当采用这种综合治疗时，所述细胞因子可以组合在单一的配方中或作为单独的配方使用。配制方法在本领域广为人知，并披露于以下文献中：Remington′Pharmaceutical Sciences，Gennaro，ed.，Mack Pub-lishing Co.，Easton PA，1990，该文献被收作本文的参考。TPO的治疗剂量范围通常为1.0×105-100×105单位/公斤患者体重/日，最好为1.0×105-25×105单位/kg/日，剂量的确定是基于对大于95％的纯蛋白进行的体外细胞***发生分析(本领域技术人员可以理解，用培养的细胞在体外进行分析所得结果通常在±20％的范围内波动)。上述剂量相当于约1.2μg/kg/日-114μg/kg/日，最好为1.2μg/kg/日-50μg/kg/日。在某些场合，较低的剂量范围较为合适，例如，当患者表现出较高的敏感性或需要较长时间的处理时。在这种场合，理想的剂量范围为0.1×105-50×105单位TPO/kg/日，最好为0.5×105-25×105单位TPO/kg/日。 EPO的治疗剂量通常为10～150U/kg患者体重/日，最好为50～150U/kg/日。对TPO和EPO来说，确切剂量由医师根据被认可的标准确定，将受治病症的性质和严重性、患者特征等因素考虑进去。剂量的确定可以由本领域普通技术人员完成。通常，在化疗、放射治疗或骨髓移植后给患者服用所述蛋白的时间长达28天，或者直到血小板数目达到＞20,000/mm3，最好是＞50,000/mm3，血细胞比容为30-33％，网织红细胞数最少超过基线2倍。更为常见的是服用所述蛋白一周或一周以上，通常为7～14天。通常，TPO或EPO的治疗有效用量是足于产生在临床上明显改善淋巴或骨髓祖细胞的增殖和/或分化的量，其表现为成熟细胞(如血小板或红细胞)的循环水平提高。对于血小板疾病的治疗将一直持续到血小板数达到至少20,000/mm3，最好为50,000/mm3 。对于贫血的治疗将一直持续到血细胞比容水平达30-33％，网织红细胞数至少超过基线2倍，达到适于对血细胞比容产生显著影响的水平。如上文所述，网织红细胞的正常范围为0.8％-1.2％。TPO和EPO也能与其它细胞因子，如IL-3、-6和-11；干细胞因子；G-CSF和GM-CSF组合使用。在组合治疗方案中，其它细胞因子的日用剂量一般为：GM-CSF，5-15μg/kg；IL-3，1-5μg/kg；和G-CSF，1-25μg/kg。例如，对表现低的嗜中性白细胞水平的患者用GM-CSF进行组合治疗。
TPO和EPO也可用于体外，如用于自身骨髓培养物。简单地说，在化疗之前从患者体内取出骨髓，并用TPO处理，有选择地与EPO组合，有选择地与一种或几种其它细胞因子组合。在化疗之后再将处理过的骨髓送回患者体内，以加速骨髓的恢复。另外，还可将TPO单独以及与EPO组合起来用于自体内扩增骨髓或外周血祖细胞(PBPC)。可以在化疗之前用干细胞因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，以便把早期祖细胞释放到外周循环***中。可从外周血中收集并浓缩上述祖细胞，然后在培养物中用TPO和EPO处理，处理时选择性地结合一种或几种细胞因子，所述细胞因子包括，但不局限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11，以便分化并增殖成高密度巨核细胞培养物，在对患者进行高剂量放疗之后即可将这种培养物送回患者体内。从体内治疗骨髓时TPO的剂量范围为100pg/ml-10ng/ml，最好为500pg/ml-3ng/ml，EPO的剂量范围为0.5单位/ml-5单位/ml，最好为0.5单位/ml-2单位/ml。
以下的非限定性实施例将对本发明做进一步的说明。例I.诱导红细胞集落形成
在EPO的生理水平上添加TPO，可使红细胞集落形成单位(CFU-E)的产量高于仅用EPO时的产量水平。
通过股骨冲洗(femoral flushing)自BDF1小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)分离骨髓细胞。将细胞(2×104/100μl块)悬浮于一种培养基中，该培养基中含有补充了30％的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、1％牛血清白蛋白、5×10-5M β-巯基乙醇和2×10-5M CaCl2的α培养基(Flow Laboratories，McLean，VA)。以120U/ml的浓度将重组小鼠TPO加入1.5％的商陆促***原脾细胞调节剂中，并加入2单位/ml的人EPO，以促进早期红细胞祖细胞(BFU-E)的生长。把2单位/ml的人EPO加入到晚期红细胞祖细胞(CFU-E)集落中。
TPO的活性单位是通过分析其对TPO依赖型细胞系的促***活性而测定的。将披露于待批美国专利申请NO.08/252,491(申请日1994年6月1日)中的用一种小鼠TPO表达载体转染的一种BHK细胞系(pZGmp1-1081；根据布达佩斯条约于1994年2月14日以E.coli DH 5α转化体的形式交由美国典型培养物保藏所保藏，其地址为12301Parklawn Drive，Rockville，MD，确认的保藏号为69566)生长在无血清培养基中。收集调节培养基，并用该标准液制成渐近促***活性曲线。靶细胞为BaF3/MPLR1.1(能表达一种稳定转染的I型小鼠MPL受体的IL-3-依赖型细胞；根据布达佩斯条约于1994年9月28日交由位于12301Parklawn Drive，Rockville，MD的美国典型培养物保藏所保藏，所给保藏号为CRL 11723)。确定1/2最大活性点(16条曲线的平均)的值为50U/ml。计算出原始标准溶液含26,600U/ml小鼠TPO。
为了检验样品，在PRMI1640培养基中稀释培养上清液或纯化的蛋白制剂，该培养基中补充了57μM2-巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、PSN抗生素混合物、10mM HEPES和10％加热失活的胎牛血清，通常采用8-24倍的稀释倍数。简言之，将100μl稀释的试验样品或标准样品与100μlBaF3细胞(加入的细胞数最终约为10,000细胞/孔)混合于96孔板的孔中。内标包括8个100U/ml小鼠TPO的2倍稀释液，用于小鼠TPO分析，或8个150U/ml小鼠TPO的2倍稀释液，用于人TPO分析。向每一孔中加2μl3H-胸苷(1μCi/μl；Amersham)，并在37℃下培养该板过夜。
用一个Packard装置将每个板上每一孔里的内容物转移到一个滤膜/板上。用水将滤膜洗8次，干燥滤膜并计数。通过与标准曲线比较确定每一样品孔里的TPO活性单位。
以0～300mU/ml范围内的各种浓度加入人EPO(Amgen公司，Thousand Oaks，CA)，加入或不加120单位TPO。通过加入10％柠檬酸化的牛血浆开始凝血。
在37℃温度下，在含有5％CO2的完全湿化的气氛中培养骨髓培养物2天。红细胞集落具有40个以上细胞。培养之后收获凝块，干燥、用联苯胺染色并计算红细胞集落(Broudy等，Arch of Biochemand Biophys.265：329-336，1988)。结果表示成最大集落生长，并且为2-3个重复板的至少3个独立实验的平均值。
图1表示当EPO处于0-100mU/ml的生理浓度范围时，加入120U/mlTPO会导致红细胞祖细胞集落的数目显著增加。例II.TPO-诱导的网织红细胞的增加
与未处理过的动物相比，用TPO处理的动物其网织红细胞数增加。
将10只雄BALB/C小鼠(Simonsen Labs，Gilroy，CA；约8周龄)分成由5只小鼠组成的一个TPO处理组和一个由5只小鼠组成的假饲组。在20mM Tris(pH8.1)、0.9％NaCl和0.25％兔血清白蛋白(RSA)中制备剂量为12.5kU的小鼠重组TPO。假饲组仅用缓冲液处理。连续6天，每天1次，每次以0.2ml的量给每只小鼠腹膜内注射12.5kU的TPO或缓冲液。在第0天(d＝0)时抽每只小鼠的血，并作全血计数(CBC)，包括测定每只小鼠的网织红细胞数。在第6天(d＝6)抽这些动物的血并将其宰杀，同时测定CBCs和网织红细胞数。对于假饲处理的动物来说，网织红细胞数由d＝0时的基线4.5％提高至d＝6时8.7％；而对于TPO处理的动物来说，网织红细胞数由d＝0时的基线5.3％提高至d＝6时的12.0％。例III.在TPO处理的动物中提高红细胞生成
与未处理的动物相比，给用辐射和化疗药物处理过的动物服用TPO表现出能提高红细胞生成的恢复能力。
在一台Gamacell 40放射仪(Nordion国际公司，Kanata，Ontari-on，加拿大)上用137Cs对4-6周龄的雌性C57BL/6J小鼠进行放射处理，并在d＝0时以腹膜内注射1.2mg卡铂(Bristol Laboratories，Princeton，NJ)的方式进行处理。或用TPO处理小鼠或仅用TPO缓冲液处理。在d＝1至d＝14期间服用TPO或TPO缓冲液。将小鼠分为以下三组：
第1组：8只小鼠，用500cGy辐射+1.2mg卡铂+TPO缓冲液处理14天；
第2组：8只小鼠，用500cGy辐射+1.2mg卡铂+25kU TPO/日处理14天；
第3组：8只小鼠，用500cGy辐射+1.2mg卡铂+75kU TPO/日处理14天。
TPO是在含有20mM Tris(pH8.1)，0.9％NaCl和0.25％RSA的缓冲液中配制的。在第0(为建立基准)、4、6、8、10、11(CBC和网织红细胞数)、13(CBC和网织红细胞数)、15、18、20、22、25和27(CBC和网织红细胞数)抽小鼠的血并测CBCs，然后将其宰杀。
图2表明，第2和第3组TPO处理的动物，从统计上看有一个较短的贫血期(其红细胞水平恢复至基线的速度明显快于仅用缓冲液处理的动物)。
表4表明，在第13天上第2和3组TPO处理的动物的网织红细胞数高于仅用缓冲液处理的动物。以上结果表明，红细胞水平的改善是由于红细胞产生的增加，而不是由于红细胞破裂的减少(或丧失，即出血较少)。另外，在对照或处理组中均未发现病理性出血的证据。
                  表4剂量           第10天    第13天      第15天     第27天75 kU/日    7.0±1.8    9.7±2.2   16.9±1.1   5.3±0.6
        (4)         (4)         (4)        (8)25 kU/日    4.6±3.1    9.8±1.3    10.6±0.9   2.7±0.4
        (3)         (3)         (3)        (7)媒介物      4.7±3.3    2.4±1.2    7.7±4.3   3.2±0.9
        (3)         (3)         (3)        (6)
平均值±标准平均误差(n)
平均值是由网织红细胞的百分比求得。
从以上说明可以了解，尽管为了说明的目的而对本发明的具体实施方案做了说明，但在不脱离本发明实质和范围的前提下可对本发明进行各种改变。因此，本发明的范围只能由提交的权利要求书限定。
                       序列表(1)一般信息
(I)申请人：华盛顿大学
           Seattle
           WA
          98195
(II)发明名称：用造血蛋白刺激红细胞生成的方法
(III)序列数：6
(IV)相关地址：
   (A)收件人：ZymoGenetics，Inc.
   (B)街道：1201 Eastlake Avenue East
   (C)城市：Seattle
   (D)州：WA
   (E)国家：美国
   (F)邮编：98102
(V)计算机可读形式：
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容
   (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.25版
(VI)当前申请资料：
   (A)申请号：
   (B)申请日：
   (C)分类号：
(VIII)律师/代理人信息：
   (A)姓名：Sawislak，Deborah A.
   (B)注册号：37，438
   (C)文件/档案号：94-09C2PC
(Ix)电信信息：
   (A)电话：206-442-6672
(B)传真：206-442-6678(2)序列1信息：
(I)序列特征：
   (A)长度：1062bp
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性
   (II)分子类型：cDNA
(ix)特征：
   (A)名称/键：CDS
   (B)位置：1..1059
(xi)序列描述：序列1：ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA     48Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala1               5                 10                  15AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC     96Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val
         20                  25                  30CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC     144Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
     35                  40                  45CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT     192Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
 50                  55                 60GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG     240Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65                 70                  75                   80GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG       288Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met
             85                  90                  95GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG       336Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
        100                 105                 110CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC       384Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
    115                 120                 125CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT       432Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130                 135                 140CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG       480Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145                 150                 155                 160CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC       528Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala
            165                 170                 175CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG       576Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
        180                 185                 190AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT       624Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
    195                 200                 205GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA       672Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
210                 215                 220TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG       720Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225                 230                 235                 240GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA       768Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly
            245                 250                 255ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG       816Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
        260                 265                 270GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC       864Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
    275                 280                 285CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT       912Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
290                 295                 300ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC       960Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305                 310                 315                 320CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC       1008His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
            325                 330                 335CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA       1056Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
        340                 345                 350GGG TAA                                                               1062Gly(2)序列2信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：353氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列2：Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala1               5                  10                  15Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val
         20                  25                  30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
     35                  40                  45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
 50                  55                  60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65                  70                  75                  80Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met
             85                  90                  95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
        100                 105                 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
    115                 120                 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130                 135                 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145                 150                 155                 160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala
            165                 170                 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
        180                 185                 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
    195                 200                 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
210                 215                220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225                 230                 235                 240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly
            245                 250                 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
        260                 265                 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
    275                 280                 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
290                 295                 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305                 310                 315                 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
            325                 330                 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
        340                 345                 350Gly(2)序列3信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：1486bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vii)直接来源：   (B)克隆：1081(ix)特征：(A)名称/键：CDS(B)位置：105..1241(xi)序列描述：序列3：CCTCGTGCCG GTCCTGAGGC CCTTCTCCAC CCGGACAGAG TCCTTGGCCC ACCTCTCTCC      60CACCCGACTC TGCCGAAAGA AGCACAGAAG CTCAAGCCGC CTCC ATG GCC CCA GGA      116
                                             Met Ala Pro Gly
                                               1AAG ATT CAG GGG AGA GGC CCC ATA CAG GGA GCC ACT TCA GTT AGA CAC       164Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr Ser Val Arg His5                  10                  15                  20CTG GCC AGA ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GCG GCC ATG CTT CTT       212Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu
             25                  30                  35GCA GTG GCA AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCC GTA GCT CCT GCC TGT GAC       260Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp
         40                  45                  50CCC AGA CTC CTA AAT AAA CTG CTG CGT GAC TCC CAC CTC CTT CAC AGC       308Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser
     55                  60                  65CGA CTG AGT CAG TGT CCC GAC GTC GAC CCT TTG TCT ATC CCT GTT CTG       356Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu
 70                  75                  80CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ACG GAA       404Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu85                  90                  95                 l00CAG AGC AAG GCA CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTG TCC CTT CTA CTG GAG       452Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu
            105                 110                 115GGA GTG ATG GCA GCA CGA GGA CAG TTG GAA CCC TCC TGC CTC TCA TCC       500Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser
        120                 125                 130CTC CTG GGA CAG CTT TCT GGG CAG GTT CGC CTC CTC TTG GGG GCC CTG       548Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu
    135                 140                 145CAG GGC CTC CTA GGA ACC CAG CTT CCT CTA CAG GGC AGG ACC ACA GCT       596Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala
150                 155                 160CAC AAG GAC CCC AAT GCC CTC TTC TTG AGC TTG CAA CAA CTG CTT CGG       644His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu Arg165                 170                 175                 180GGA AAG GTG CGC TTC CTG CTT CTG GTA GAA GGT CCC ACC CTC TGT GTC       692Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro Thr Leu Cys Val
            185                 190                 195AGA CGG ACC CTG CCA ACC ACA GCT GTC CCA AGC AGT ACT TCT CAA CTC       740Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Gln Leu
        200                 205                 210CTC ACA CTA AAC AAG TTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACG       788Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr
    215                 220                 225AAC TTC AGT GTC ACA GCC AGA ACT GCT GGC CCT GGA CTT CTG AGC AGG       836Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg
230                 235                240CTT CAG GGA TTC AGA GTC AAG ATT ACT CCT GGT CAG CTA AAT CAA ACC       884Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr245                 250                 255                 260TCC AGG TCC CCA GTC CAA ATC TCT GGA TAC CTG AAC AGG ACA CAC GGA       932Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly
            265                 270                 275CCT GTG AAT GGA ACT CAT GGG CTC TTT GCT GGA ACC TCA CTT CAG ACC       980Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr
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    295                 300                 305GCA TTC AAC CTC CAG GGT GGA CTT CCT CCT TCT CCA AGC CTT GCT CCT      1076Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro
310                 315                 320GAT GGA CAC ACA CCC TTC CCT CCT TCA CCT GCC TTG CCC ACC ACC CAT      1124Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His325                 330                 335                 340GGA TCT CCA CCC CAG CTC CAC CCC CTG TTT CCT GAC CCT TCC ACC ACC      1172Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr
            345                 350                 355ATG CCT AAC TCT ACC GCC CCT CAT CCA GTC ACA ATG TAC CCT CAT CCC      1220Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro
        360                 365                 370AGG AAT TTG TCT CAG GAA ACA TAGCGCGGGC ACTGGCCCAG TGAGCGTCTG         1271Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr
    375CAGCTTCTCT CGGGGACAAG CTTCCCCAGG AAGGCTGAGA GGCAGCTGCA TCTGCTCCAG    1331ATGTTCTGCT TTCACCTAAA AGGCCCTGGG GAAGGGATAC ACAGCACTGG AGATTGTAAA    1391ATTTTAGGAG CTATTTTTTT TTAACCTATC AGCAATATTC ATCAGAGCAG CTAGCGATCT    1451TTGGTCTATT TTCGGTATAA ATTTGAAAAT CACTA                               1486(2)序列4信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：379氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列4：Met Ala Pro Gly Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr1               5                  10                  15Ser Val Arg His Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala
         20                  25                  30Ala Met Leu Leu Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala
     35                  40                  45Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His
 50                  55                  60Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser65                  70                  75                  80Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys
             85                  90                  95Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser
        100                 105                 110Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser
    115                 120                 125Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu
130                 135                 140Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly145                 150                 155                 160Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln
            165                 170                 175Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro
        180                 185                 190Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser
    195                 200                 205Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly
210                 215                 220Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly225                 230                 235                 240Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln
            245                 250                 255Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
        260                 265                 270Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr
    275                 280                 285Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn
290                 295                 300Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro305                 310                 315                 320Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu
            325                 330                 335Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp
        340                 345                 350Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met
    355                 360                 365Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr
370                375(2)序列5信息：
(I)序列特征：
  (A)长度：4823bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(II)分子类型：DNA(基团组)
(ix)特征：
  (A)名称/键：CDS
  (B)：位置：join(632..644，876..1003，1290..1376，3309..
                  3476，3713..4375)
(xi)序列描述：序列5：CTTTCTTGCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTCT TTCTTTTTTT TTTTTGAGAC GGAGTTTCAC      60TCTTATTGCC CAGGCTGGAG TGCAATGGTG CGATCTCGGC TCACCACAAC CTCCGCCTCC     120CAGGTACAAG CGATTCTCCT GTCTCAGCCT CCCAAGTAGC TTGGATTACA GGCATGAACC     180ACCACACCCT GCTAGTTTTT TTGTATTTCG TAGAGCCGGG GTTTCACCAT GTTAGTGAGG     240CTGGTGGCGA ACTCCTGACC TCAGGTGATC CACCCGCCTT GGACTCCCAA AGTGCTGGGA     300TTACAGGCAT GAGCCACTGC ACCCGGCACA CCATATGCTT TCATCACAAG AAAATGTGAG     360AGAATTCAGG GCTTTGGCAG TTCCAGGCTG GTCAGCATCT CAAGCCCTCC CCAGCATCTG     420TTCACCCTGC CAGGCAGTCT CTTCCTAGAA ACTTGGTTAA ATGTTCACTC TTCTTGCTAC     480TTTCAGGATA GATTCTTCAC CCTTGGTCCG CCTTTGCCCC ACCCTACTCT GCCCAGAAGT     540GCAAGAGCCT AAGCCGCCTC CATGGCCCCA GGAAGGATTC AGGGGAGAGG CCCCAAACAG     600GGAGCCACGC CAGCCAGACA CCCCGGCCAG A ATG GAG CTG ACT  G GTGAGAACAC      654
                               Met Glu Leu Thr
                                 1ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC     714TGCAGGGGGC AGGAAGCTGG GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG     774ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG     834ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G  AA TTG CTC CTC         886
                                          Glu Leu Leu Leu
                                            5GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT       934Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala
 10                  15                  20CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC       982Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser25                  30                  35                  40CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC         1033His Val Leu His Ser Arg Leu
             45CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT    1093GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAAGGA    1153TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA AGCTCTCGTC TAGAGATAGT ACTCATGGAG    1213GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC    1273CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA        1322
              Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr
                       50                  55CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC      1370Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr
 60                  65                 70CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT       1426Gln Met75CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA    1486GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT    1546GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA    1606AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCCGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG    1666AAGCAAGACT CATATGTCAT CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC    1726AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC    1786AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG    1846AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC    1906GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAGAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT    1966CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA    2026GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA    2086AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG    2146GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA    2206TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT    2266AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA    2326GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT    2386GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA    2446GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG CAATAGTTTA AAAAACTAAA    2506ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG    2566CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT    2626CTCATACCTA CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC    2686CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC CCGGATTCAA    2746GCGATTCTCC TGTCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC AGGTGCCCAC CACCATGCCC    2806AGCTAATTTG TGTATTTGTG GTAGAGATGG GGTTTCACCA TGTTGGGCAG GCTGATCTTG    2866AACTCCTGAC CTCAGGTGAT CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG    2926TGAGCCACTG CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG    2986CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA GGGCAGATTT    3046CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC    3106TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG    3166GAATTCCTGC CCTGGGTGGG ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC    3226TGCTGGCTAC TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT    3286CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA     3338
                     Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly
                                  80                  85GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG      3386Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu
         90                  95                 100GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC      3434Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val
    105                 110                 115CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG              3476Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln
120                 125                 130GTAAGTCCCC AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCCCTAGAA    3536GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG ATCTACTAAG    3596AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC TGTCTTTCCT ACTTAGACAA    3656GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAG        3712CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC     3760Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile
    135                 140                 145TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG     3808Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Ar9 Phe Leu Met
150                 155                 160CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA     3856Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr165                 170                 175                 180GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA     3904Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro
            185                 190                 195AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA     3952Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg
        200                 205                 210ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG     4000Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys
    215                 220                 225ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC     4048Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro
230                 235                 240GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC     4096Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu245                 250                 255                 260TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA     4144Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser
            265                 270                 275GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT     4192Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr
        280                 285                 290TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT     4240Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro
    295                 300                 305CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT      4288Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu
310                 315                 320CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC      4336Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn325                 330                 335                 340ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC       4385Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly
            345                 350AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG    4445GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA    4505TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT    4565TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA    4625AATTTGCAAC TCACTGATTC TCAACATGCT CTTTTTCTGT GATAACTCTG CAAAGACCTG    4685GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG AGTCAGAAAA CAGAGGAAGG    4745GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC CCATCCCCTT TACTATCATT    4805CTCAGTGGGA CTCTGATC                                                  4823(2)序列6信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：353氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：序列6：
    Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala
      1               5                  10                  15Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val
         20                  25                  30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser ArgLeu Ser
     35                  40                  45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
 50                  55                  60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65                  70                  75                  80Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met
             85                  90                  95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
        100                 105                 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
    115                 120                 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130                 135                 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145                 150                 155                 160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala
            165                 170                 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
        180                 185                 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
    195                 200                 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
210                 215                 220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225                 230                 235                 240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly
            245                 250                 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
        260                 265                 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
    275                 280                 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
290                 295                 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305                 310                 315                 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
            325                 330                 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
        340                 345                 350Gly

Claims (6)

1.一种用于在体外刺激红细胞生成的方法，包括用一种含有一定量血小板生成素(TPO)和红细胞生成素(EPO)的组合物培养骨髓或外周血细胞，TPO和EPO的用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体数比在没有TPO的条件下培养的细胞所产生的多，其中，所述TPO包括选自以下序列的氨基酸序列：
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；以及
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266。
2.一种用于在体外刺激红细胞生成的方法，包括用一定量的TPO培养骨髓或外周血细胞，TPO的用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体数比在没有TPO的条件下培养的细胞所产生的多，其中，所述TPO包括选自以下序列的氨基酸序列：
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；以及
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266 。
3.一种用于刺激红细胞生成的方法，包括给需要用药的哺乳动物服用一种含有与一种可以药用的媒介物组合的TPO的组合物，TPO的用量足于产生红系细胞增殖或分化的增加，其中，所述TPO包括选自以下序列的氨基酸序列：
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；以及
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266。
4.一种用于刺激红细胞生成的方法，包括给需要用药的哺乳动物服用一种含有与一种可以药用的媒介物组合的TPO和EPO的组合物，TPO和EPO的用量足于产生红系细胞增殖或分化的增加，其中，所述TPO包括选自以下序列的氨基酸序列：
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基172；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基235；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基28至残基266；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基185；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基193；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基198；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基207；
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基235；以及
序列2所示氨基酸序列，从氨基酸残基22至残基266。
5.一种用于在体外刺激红细胞生成的方法，包括用一种含有一定量的血小板生成素(TPO)和红细胞生成素(EPO)的组合物培养骨髓或外周血细胞，其用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体数比在没有TPO的条件下培养的细胞所产生的多，其中，所述TPO的用量为100pg/ml-10ng/ml，EPO的用量为0.5单位/ml-5单位/ml。
6.一种用于在体外刺激红细胞生成的方法，包括用一种含有一定量的血小板生成素(TPO)的组合物培养骨髓或外周血细胞，TPO的用量足于使所产生的红细胞或红细胞前体数比在没有TPO的条件下培养的细胞所产生的多，其中，所述TPO的用量为100pg/ml-10ng/ml。
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CN109526226A (zh) * 2016-07-07 2019-03-26 鲁比厄斯治疗法股份有限公司 与表达外源rna的治疗性细胞体系有关的组合物和方法

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