CN117305512A - 一种用于检测大豆植物mon87705的核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测大豆植物MON87705的核酸检测方法，以双重环介导等温扩增技术、链置换反应、CRISPR/Cas12a构建侧流层析传感器，根据大豆内参基因Lectin的LAMP产物设计SD反应序列，根据转基因大豆MON87705转化体特异性序列的LAMP产物设计crRNA，利用碱基互补原理与CRISPR/Cas12a反应的反式切割活性，只需在一次检测流程中分别读取两次LFB的检测结果，即可实现大豆内参基因Lectin与转基因大豆MON87705转化体特异性序列的逻辑化检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测大豆植物MON87705的检测方法，具体是一种用于检测大豆植物MON87705的核酸检测方法。
背景技术
目前，针对转基因食品的检测往往需要进行内标准基因和转基因转化体两个靶标进行两次检测，这大大增加了检测成本和操作复杂性，并且延长了检测时间。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是由Notomi的团队在2000年首创的，它可以在1小时或更短的时间内等温扩增靶向核酸模板到109个拷贝或更多，其具有单酶体系、扩增效率高等优点，联用侧流层析传感器（Lateralflow biosensor，LFB），则可以在简单操作下实现高灵敏快速直观的检测，但二者联用往往需要半抗原标记，构建的LFB也往往需要使用抗体作为识别元件，成本较高。
综上所述，如何提供一种操作简便、低成本、快速、灵敏、可视化的转基因食品检测方法，是食品安全和转基因食品领域亟需解决的问题之一。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于检测大豆植物MON87705的LAMP-SD-CRISPR的核酸序列组合以及一种核酸检测方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一方面，本发明提供了一种用于检测大豆植物MON87705的LAMP-SD-CRISPR的核酸序列组合，所述核酸序列组合包括双重LAMP引物组、SD长链及短链组合、crRNA；
其中，所述双重LAMP引物组选自如下A-E组中的一组或多组：
引物组A，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F31、B31、FIP1和BIP1，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
引物组B，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F32、B32+3、FIP2和BIP2+3，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
引物组C，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F33、B32+3、FIP3和BIP2+3，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:9、SEQID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8所示；
引物组D，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F34、B34、FIP4和BIP4，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
引物组E，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F35、B35、FIP5和BIP5，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
优选地，双重LAMP引物组选自引物组A、C和D。
所述crRNA选自如下序列之一：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGGACAACGGUGCCUUGGCC，SEQ ID NO:23；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCGGACAUGAAGCCAUUUAC，SEQ ID NO:24；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAUUGAAGAGACUCAGGGU，SEQ ID NO:25。
另一方面，本发明提供一种用于检测大豆植物MON87705的核酸检测方法，包括以下步骤：
S1、两组引物进行的LAMP反应；
S2、以LAMP反应产物进行的SD反应；
S3、以未孵育的SD反应混合物进行的CRISPR/Cas12a***反应；
S4、以LFB进行SD反应与CRISPR/Cas12a***反应产物的检测。
作为本发明的进一步方案，本方法所用的LAMP反应步骤：
（1）样品前处理：将生物样品进行DNA提取得到DNA模板。
（2）将所有所需试剂稀释到合适浓度。
（3）按照体系加入各试剂，65℃反应60 min后以80℃保持5 min使酶失活，产物4℃保存或进行下一步方案。
作为本发明的进一步方案，本方法所用的SD反应步骤：
将长链（如SEQ ID NO:26所示）与短链（如SEQ ID NO:27所示）以10×Cas12a-ssDNA Buffer II溶解至10 µM，以长链：短链为2.3：2.2体积比混合，取出4.5 µL及0.5 µLddH2O共同加入25 µL LAMP产物混匀，取出其中2 µL进行CRISPR/Cas12a反应，剩余37℃孵育20 min后4℃储存备用。
作为本发明的进一步方案，本方法所用的CRISPR/Cas12a***反应步骤：
将取出的未孵育的2 µL的SD反应混合物添加到预混的CRISPR/Cas12a***反应体系，37℃孵育20 min后4℃储存备用。
作为本发明的进一步方案，本方法所用的LFB检测反应产物的步骤：
SD产物检测：在样品孔中加入99 µL running buffer (4×SSC + 10 mM Tris-HAc + 0.002% TritionX-100 + 2% BSA + 0.1% Tween20)与1 µL SD产物，在LFB的样品垫上边缘喷涂1.5 µL金标抗体，将传感器样品垫***样品孔，等待几分钟，即可观察到结果（CL处出现红色表明试纸层析状况正常；TL处出现红色表明结果为阳性，即待测样品含有大豆内标准基因Lectin的核酸）。
CRISPR/Cas12a反应产物检测：在样品孔中加入90 µL running buffer (4×SSC+ 10 mM Tris-HAc + 0.002% TritionX-100 + 2% BSA + 0.1% Tween20)与10 µLCRISPR/Cas12a反应产物，在LFB的样品垫上边缘喷涂1.5 µL金标抗体，将试纸样品垫***样品孔，等待几分钟，即可观察到结果（CL处出现红色表明试纸层析状况正常；TL处出现红色表明结果为阴性，即待测样品不含有MON87705转基因大豆转化体成分）。
根据两次LFB检测结果，在第一次检测结果中TL与CL处正常出现红色条带，且在第二次检测结果中只有CL处正常出现红色条带则可以判断为样品中检测出转基因大豆MON87705转化体成分；在第一次检测结果中TL与CL处正常出现红色条带，且在第二次检测结果中TL与CL处也都正常出现红色条带则可以判断为样品中未检测出转基因大豆MON87705转化体成分；在第一次检测结果中只有CL处正常出现红色条带，则可以判断为样品中未检测出大豆成分；出现其他情况，则可以判断该次检测无效。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明利用LAMP反应、SD反应、CRISPR/Cas12a***反应构建了LFB；
2、本方法使LFB不再受限于半抗原标记及抗体，只需要在一次检测流程中读取两次LFB结果，即可实现大豆内标准基因Lectin与转基因大豆MON87705转化体特异性序列的逻辑化检测；
3、本发明降低了LFB的制造成本，并且具有良好的检测特异性，定性检测限可达到0.1 wt%。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为转基因大豆MON87705检测原理（A. LAMP原理；B. SD原理；C. CRISPR/Cas12a反应原理；D. LFB原理）。
图2为金纳米颗粒（A）与金纳米-核酸信号探针（B）透射电镜照片及400~600 nm紫外-可见吸收光谱（C）。
图3为MON87705引物LAMP产物电泳图（A. 第1组引物；B. 第2组引物；C. 第3组引物；D. 第4组引物；E. 第5组引物；泳道M：D2000 DNA Marker；泳道1：阴性对照；泳道2：转基因大豆MON87705基因组模板组）。
图4为Lectin基因引物与MON87705引物LAMP产物电泳图（L.Lectin基因引物；A.第1组引物；B. 第3组引物；C. 第4组引物；泳道M：D2000 DNA Marker；泳道0：阴性对照；泳道1：非转基因大豆基因组模板组；泳道2：转基因大豆MON87705基因组模板组）。
图5为LAMP产物SD结果（A. LFB条带；B. Image J峰面积；a：Lectin基因引物与阴性对照；b：Lectin基因引物与非转基因大豆基因组模板；c：Lectin基因引物与转基因大豆MON87705基因组模板；d：引物1与非转基因大豆基因组模板；e：第1组引物与转基因大豆MON87705基因组模板；f：第3组引物与非转基因大豆基因组模板；g：引物3与转基因大豆MON87705基因组模板；h：第4组引物与非转基因大豆基因组模板；i：第4组引物与转基因大豆MON87705基因组模板）。
图6为双重LAMP产物SD结果（A. LFB条带；B. Image J峰面积；a：阴性对照；b：第1组引物与非转基因大豆基因组模板；c：第1组引物与转基因大豆MON87705基因组模板；d：第4组引物与非转基因大豆基因组模板；e：第4组引物与转基因大豆MON87705基因组模板）。
图7为双重LAMP体系引物添加量优化（A. LFB条带；B. Image J峰面积；a：2 µLLectin 基因长引物与阴性对照；b：2 µLLectin 基因长引物与大豆基因组模板；c：2.5 µLLectin 基因长引物与阴性对照；d：2.5 µLLectin 基因长引物与大豆基因组模板）。
图8为SD长短链比例优化（A. LFB条带；B. Image J峰面积；a：阴性对照；b：大豆基因组模板）。
图9为CRISPR/Cas12a反应crRNA选择（A. LFB条带；B. Image J峰面积；a：阴性对照；b：非转基因大豆基因组模板；c：转基因大豆MON87705基因组模板）。
图10为SD反应的特异性（A. LFB条带；B. Image J峰面积；a：大豆基因组模板；b：玉米基因组模板；c：油菜基因组模板）。
图11为LAMP-LFB逻辑化检测转基因大豆MON87705的特异性（A. LFB条带； B.Image J峰面积；a：大豆基因组模板SD结果；b：转基因大豆MON87705基因组模板（10 wt%）10；c：转基因大豆MON87769基因组模板（100 wt%）；d：转基因大豆GTS40-3-2基因组模板（100 wt%））。
图12为LAMP-LFB逻辑化检测转基因大豆MON87705的灵敏度（A. LFB条带；B.Image J峰面积；a：大豆基因组模板SD结果；b：非转基因大豆基因组；c：转基因大豆MON87705基因组模板（10 wt%）；d：转基因大豆MON87705基因组模板（1 wt%）；e：转基因大豆MON87705基因组模板（0.1 wt%）f：转基因大豆MON87705基因组模板（0.01 wt%））。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例说明。
实施例1 检测大豆植物MON87705的核酸检测方法原理设计及验证
（1）原理设计与验证
本发明将LAMP、SD、CRISPR/Cas12a与LFB相结合检测转基因大豆MON87705，其原理如图1所示，大豆内标准基因Lectin的核酸模板经LAMP产生的产物中成环单链部分与长短链孵育后的形成的双链发生SD反应，将短链核酸释放，其3′端序列被LFB上金纳米-核酸信号探针基于碱基互补结合后随着传感器向上层析，T线上的核酸与短链核酸5′端序列互补，在T线处形成“金纳米-核酸信号探针——短链——T线核酸”的三明治夹心结构，使T线显色。C线则直接与金纳米-核酸信号探针结合显色。除SD发生的反应外，转基因大豆MON87705转化体特异性序列产生的LAMP双链产物会激发CRISPR/Cas12a反应激活Cas12a的反式单链切割活性，切碎SD反应释放的短链，使T线处无法形成“金纳米-核酸信号探针——短链——T线核酸”三明治夹心结构，无法显色。C线仍直接与金纳米-核酸信号探针结合显色。
本发明验证过程中涉及琼脂糖凝胶电泳，具体步骤为：
首先需要配置50×TAE缓冲液（用500 mL水加热搅拌溶解242.2 g三羟甲基氨基甲烷，随后加入500 mM的乙二胺四乙酸二钠溶液（pH 8.0），用冰乙酸将pH调至8.0，加水定容至1000 mL），使用时稀释至1×TAE缓冲液。进行琼脂糖凝胶电泳时首先利用蒸馏水将制胶工具清洗干净，选用合适的制胶平板与齿梳将其架好。准确称量2 g琼脂糖干粉，将其用100mL的1×TAE缓冲液溶解在250 mL锥形瓶中以配置2%的琼脂糖凝胶。将锥形瓶盖好透气的封口膜放入微波炉中加热融化，冷却至不烫手后加入5 µL的EB溶液（10 mg/mL）混匀，倒入制胶平板，待其凝固后取下齿梳，随后将制胶平板连同凝胶一起放入加有适量1×TAE缓冲液的电泳槽中排出梳孔中的空气后取出，取5 µL待测产物加入1 µL 6×Loading Buffer混合均匀后上样到梳孔中，并在合适的梳孔中加入D2000 DNA Marker，上样结束后将凝胶放回电泳槽接通电源，在120 V电压下电泳25 min后取出凝胶，于紫外凝胶成像***上对待测产物及Marker的位置进行观察。
本发明验证过程中涉及LFB的构建，具体步骤：
金纳米颗粒的制备：酸缸浸泡（过夜）后的圆底烧瓶，分别用自来水、蒸馏水、超纯水洗涤3次，干燥后用作反应容器。将100 mL 1 mM氯金酸溶液煮沸后垂直加入10 mL 38.8nM柠檬酸三钠，（每加一次换一次枪头，避免过热蒸汽影响实验结果；用锡箔纸包住烧瓶口，透出小口），立刻计时并封口防止挥发，观察颜色变化为“黄-黑-红”，共计10 min后停止加热，水浴冷却至室温（建议避光）（冰箱冷藏），于4℃储存。
金纳米-核酸信号探针的制备：首先，将1 μL浓度为100 mM的dATP加入1 mL金纳米颗粒中，之后将该混合物于室温下培育20 min。之后，将15 μL的1%的SDS 溶液缓慢加入混合物中，并于摇床上培育10 min。随后将NaCl溶液（100 μL，0.2 M），以每十分钟20 μL的速度加入到混合液中。将0.25 OD DNA片段（如SEQ ID NO:28所示）与混合液放于60°C的水浴中培育3 h。完成培育后，将所获得的溶液于12000 rpm 的转速下离心15 min，弃去上清，并用PBS洗涤沉淀，将获得的红宝石色的沉淀物分散并保存于20 μL的洗脱液中(20 nMNa3PO4•12H2O +5% BSA + 0.25% Tween-20 + 10% sucrose) 即为金纳米-核酸信号探针，于4℃储存。
LFB组装：将0.5 OD的T线核酸（如SEQ ID NO:29所示）与C线核酸（如SEQ ID NO:30所示）与等体积的1 mg/mL链霉亲和素混合孵育过夜后，作为T线与C线溶液，将T线溶液装入三维喷点平台喷头1，固定在距NC膜下边缘1.1 cm的位置上，将C线溶液装入三维喷点平台喷头2，固定在距NC膜下边缘1.6 cm的位置上，使T线喷头与C线喷头间的距离为5.0 mm。将NC膜粘到PVC底板上，设置划线速度为1.0 µL/cm，将划线溶液均匀喷涂在NC膜上。将已喷好的NC膜37℃烘干3 h后将吸水垫紧靠背板上边缘粘到背板上，小心抹平；将结合垫粘到背板合适位置，小心抹平；将样品垫紧靠背板下边缘粘到背板上，小心抹平。用可编程切条机将粘贴好的试纸长条切成3.5 mm宽的试纸，将切好的试纸放入装有干燥剂的包装袋内，常温储存备用。
金纳米颗粒与金纳米-核酸信号探针的表征见图2。
（2）引物选择
以表1中设计的5组LAMP引物针对转基因大豆MON87705提取的DNA基因组（50 ng/µL）依照表2中的单重LAMP体系进行反应，以2%琼脂糖凝胶电泳对LAMP产物进行检测结果如图3所示。其中第1组、第3组和第4组引物可以特异性扩增转基因大豆MON87705提取的DNA基因组，选择这三组引物进行后续实验。以大豆内标准基因Lectin基因引物，第1组、第3组和第4组转基因大豆MON87705引物分别对非转基因大豆基因组（50 ng/µL）和转基因大豆MON87705基因组（50 ng/µL）依照表2中的LAMP体系进行反应，以2%琼脂糖凝胶电泳（含有0.1 µg/mL EB）对LAMP产物进行检测（图4），第3组引物在扩增非转基因大豆基因组时会产生预计外的产物，因此后续试验使用第1组与第4组引物进行后续试验。同时以各引物的LAMP产物进行SD反应，结果如图5所示，可知这些引物的LAMP产物不会对SD反应结果造成干扰，可以进行后续试验。分别以第1组、第4组引物与大豆内标准基因Lectin基因引物依照表3中的双重LAMP体系进行反应，并以LAMP产物进行SD反应，反应产物以LFB进行检测，结果如图6所示。
表1 LAMP引物组序列
表2 单重 LAMP反应体系
表3 双重LAMP初始反应体系
实施例2 检测条件优化结果
（1）双重LAMP体系引物添加量
将大豆内标准基因Lectin基因长引物改为添加2.5 µL，其余条件与表3中的双重LAMP体系相同，其SD反应结果LFB进行检测，结果如图7所示。相较于原条件，使用2.5 µL大豆内标准基因Lectin基因长引物有较为明显的颜色提升，后续试验添加2.5 µLLectin基因长引物。
（2）SD长短链比例优化
更多的长链可以使短链尽可能饱和，但是也会影响后续转基因特异性转化检测的效率，因此将长链（如SEQ ID NO:26所示）与短链（如SEQ ID NO:27所示）按照比例2.1:2.0，2.2:2.1，2.3:2.2，2.4:2.3，2.5:2.4混合并按照比例以水补足至5份体积，进行SD反应，结果通过LFB进行检测，如图8所示。在长短链添加比例为2.3:2.2时可以取得最佳的检测效果，故后续试验SD长短链比例选择2.3:2.2。
（3）CRISPR/Cas12a反应crRNA选择
将第1组引物与大豆内标准基因Lectin基因引物的双重LAMP产物进行CRISPR/Cas12a反应，反应产物以LFB进行检测，结果如图9所示。使用GMO crRNA2（如SEQ ID NO:24所示）时Cas12a切割效率最高，后续实验选择GMO crRNA2进行。
实施例3 检测方法的检测性能
（1）特异性
在优化的最佳实验条件下，测试LAMP与SD反应对大豆基因组的特异性，使用大豆基因组（50 ng/µL）、玉米基因组（100 ng/µL）、油菜基因组（100 ng/µL）进行LAMP之后的SD反应结果由LFB进行检测，如图10所示。LAMP与SD反应具有良好的特异性，只有大豆样品才会触发反应。
在优化的最佳实验条件下，测试LAMP、SD及CRISPR/Cas12a结合LFB构建的检测转基因大豆MON87705方法的特异性。使用转基因大豆MON87705（10 wt%）、转基因大豆MON87769（100 wt%）、转基因大豆GTS40-3-2（100 wt%）提取基因组后，稀释至50 ng/μL浓度以LAMP、SD及CRISPR/Cas12a结合LFB构建的检测转基因大豆MON87705方法进行检测，反应结果由LFB进行检测，结果如图11所示。LAMP、SD及CRISPR/Cas12a结合LFB构建的检测转基因大豆MON87705方法可以特异性地识别转基因大豆MON87705的基因组，特异性良好。
（2）灵敏度
为得到LAMP、SD及CRISPR/Cas12a结合LFB构建的检测转基因大豆MON87705方法的定性检测限，将转基因大豆MON87705磨粉后以10，1，0.1，0.01 g添加进100 g非转基因大豆粉末中，混匀，这样得到了含有10、1、0.1、0.01 wt%转基因大豆MON87705的大豆样品，提取基因组，以50 ng/µL基因组进行试验，检测结果由LFB进行检测，结果如图12所示。可以确认本方法可以检测转基因事件MON87705大豆添加的定性检测限为0.1 wt%，与《农业部2122号公告-4-2014转基因植物及其产品成分检测耐除草剂和品质改良大豆MON87705及其衍生品种定性PCR方法》的检出限一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于检测大豆植物MON87705的LAMP-SD-CRISPR的核酸序列组合，其特征在于，包括双重LAMP引物组、SD长链及短链组合、crRNA。
2.如权利要求1所述的核酸序列组合，其特征在于，所述双重LAMP引物组，选自如下A-E组中的一组或多组：
引物组A，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F31、B31、FIP1和BIP1，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
引物组B，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F32、B32+3、FIP2和BIP2+3，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
引物组C，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F33、B32+3、FIP3和BIP2+3，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8所示；
引物组D，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F34、B34、FIP4和BIP4，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
引物组E，为LectinF3、LectinB3、LectinFIP、LectinBIP、F35、B35、FIP5和BIP5，分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
优选地，双重LAMP引物组选自引物组A、C和D。
3.如权利要求1所述的核酸序列组合，其特征在于，所述SD长链及短链组合中，长链序列为CGACTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA，如SEQ ID NO:26所示；短链序列为ACAACTCAATAAGTCG，如SEQ ID NO:27所示。
4.如权利要求1所述的核酸序列组合，其特征在于，所述crRNA，其特征在于，crRNA选自如下序列之一：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGGACAACGGUGCCUUGGCC，SEQ ID NO:23；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCGGACAUGAAGCCAUUUAC，SEQ ID NO:24；
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAUUGAAGAGACUCAGGGU，SEQ ID NO:25。
5.一种使用权利要求1所述的核酸序列组合检测大豆植物MON87705的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、两组引物进行的LAMP反应；
S2、以LAMP反应产物进行的SD反应；
S3、以未孵育的SD反应混合物进行的CRISPR/Cas12a***反应；
S4、以LFB进行SD反应与CRISPR/Cas12a***反应产物的检测。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸序列组合。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，LAMP反应体系为：
两组长引物（FIP、BIP）终浓度分别为1 μM和0.8 μM；所有短引物（F3、B3）终浓度为0.1μM；脱氧核苷酸溶液混合物终浓度为1.4 mM；甜菜碱终浓度为0.8 M；硫酸镁终浓度为5 mM；Bst酶终浓度为320 U/mL；使用生物样品中提取出的DNA在总体积为25 µL的buffer体系中65℃反应60 min。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，SD反应体系为：
在25 µL的LAMP反应产物中添加浓度为10 μM的长链：短链体积比为2.3：2.2的混合物4.5 µL，加入0.5 µL ddH2O混匀后，取出2 µL后在buffer体系中下37℃孵育20 min。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，CRISPR/Cas12a***反应体系为：
2 µL的SD反应孵育前混合物；终浓度为0.5 µM的crRNA；终浓度为0.5 μM的LbaCas12aNuclease；在总体积为20 µL的buffer体系中37℃孵育20 min。
10.权利要求1所述的核酸序列组合或权利要求5所述的检测方法在豆制品中转基因大豆成分检测及试剂盒开发中的应用。
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2023
- 2023-11-30 CN CN202311616318.8A patent/CN117305512B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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