CN117305258A - 手性内酯化合物的合成方法及羰基还原酶ChKRED20突变体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种手性内酯化合物的合成方法及羰基还原酶ChKRED20突变体和应用，本发明中首先是利用醛类化合物和结构如式Ⅱ所示的化合物作为最初的底物，利用光催化剂(TBADT)合成底物化合物a，如此扩大了羰基还原酶ChKRED20突变体的底物谱，突破了一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质的限制。
Description
技术领域
本发明涉及化学生物技术领域，具体涉及一种手性内酯化合物的合成方法及羰基还原酶ChKRED20突变体和应用。
背景技术
以绿色化学及可持续发展为原则的指导下，开发新型高效合成手性内酯化合物的策略亟待解决。内酯结构是组成许多天然化合物和高价值医药中间体的重要骨架，因此，如何从简单的底物出发高效合成手性内酯化合物具有实际应用意义。现如今，在制备手性内酯化合物的过程中，常用的化学合成法具有诸多不足：
1、手性催化剂合成复杂，催化反应条件苛刻，污染大；
2、副反应多，难以从体系中分离，回收效果不好；
3、能耗高，需要用到加热反应器或者低温反应器。
因此，基于生物催化与光催化结合的方法合成手性内酯化合物成为研究热点，生物催化方法能够促进反应并精确控制其立体化学结果，因此在合成对映体内酯方面迅速得到推广，光催化反应由于其能耗低，污染小也受到广泛的研究。但是考虑到酶在工业生产中具有不稳定性以及应用范围受限，仍有一些问题需要解决：
1.、酶催化过程中使用到的辅酶或者辅因子价格昂贵，经济效益不高；
2、酶催化具有专一性，一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质；
3、许多光催化剂合成复杂，合成过程中产生的污染较大。
发明内容
为了解决上述问题的一些问题，本发明中将光催化剂四丁基铵十聚钨酸盐(TBADT)与羰基还原酶ChKRED20结合，能够从简单易得的醛类化合物和结构式如Ⅱ所示的化合物作为初步底物，通过两步法生成手性内酯化合物。
基于此，本发明的目的之一是提供一种用于手性内酯化合物合成的羰基还原酶ChKRED20突变体。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种用于手性内酯化合物合成的羰基还原酶ChKRED20突变体，以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第97位、第153位和第188位中的至少两位上的氨基酸进行突变；
其中，以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸；
以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第153位的丝氨酸突变为亮氨酸；
以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第188位的酪氨酸突变为丝氨酸。
本发明的目的之二是将羰基还原酶ChKRED20突变体用于手性内酯化合物的合成。
本发明的目的之三是提供一种手性内酯化合物的合成方法，包括以下步骤：
步骤1、在保护气体氛围下，将醛类化合物和结构式如Ⅱ所示的化合物溶于溶剂中，加入光催化剂四丁基铵十聚钨酸盐，然后在光反应器中反应10～14h，制得底物化合物a；
步骤2、将底物化合物a、羰基还原酶ChKRED20突变体分散于溶剂中进行酶催化反应制得手性内酯化合物；
其中，式Ⅱ的结构式为：其中，R1为/>和/>中的任意一种；其中，手性内酯化合物的合成工艺路线如图2所示。优选地，本发明中如Ⅱ所示的化合物可以是丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯以及巴豆酸甲酯等。
本发明的有益效果为：本发明中首先是利用醛类化合物和结构式如Ⅱ所示的化合物作为最初的底物，利用光催化剂(四丁基十钨酸铵，TBADT)合成底物化合物a，如此扩大了羰基还原酶ChKRED20突变体的底物谱，突破了一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质的限制。
进一步，醛类化合物的结构式如式Ⅰ所示，式Ⅰ的结构式为：其中R为 中的任意一种；
R2为H、F、NC、Cl、Br、Me、MeO、CF3、Et、tBu、CF3O、CF3S和EtO中的任意一种；
R3为F、Me、CN、Br和Cl中的任意一种；
R4为Me或CF3。
进一步，步骤2中醛类化合物与结构式如Ⅱ所示的化合物的摩尔比为1:1～5:4；保护气体为氮气；光催化剂与结构式如Ⅱ所示的化合物的质量比为3:2～2:1；优选地，醛类化合物与结构式如Ⅱ所示的化合物的摩尔比为2:1。
进一步，步骤3中的酶催化反应的条件为：35～38℃下反应42～54h。优选地，酶催化反应的条件为：37℃下反应48h。
进一步，光催化剂四丁基铵十聚钨酸盐的制备方法如下：
将钨酸盐和四丁基溴化铵溶于溶剂后进行加热，并调节其pH值为2～3后继续反应20～40min制得光催化剂。优选地，其pH值为2，反应时间为30min。
进一步，钨酸盐与四丁基溴化铵的摩尔比为25～32:10～17；钨酸盐为钨酸钠；溶剂为去离子水；加热后的温度为85～95℃。
本发明具有以下有益效果：
本发明中通过将光催化剂丁基铵十聚钨酸盐(TBADT)与羰基还原酶ChKRED20突变体相互结合，通过两步利用简单易得的醛类化合物和结构式如Ⅱ所示的化合物合成了手性内酯化合物；
另外，本发明同时对野生型ChKRED20进行了设计(即，以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第97位、第153位和第188位的氨基酸中的至少两位上的氨基酸进行突变)以耐受大体积的γ-酮酸酯底物，将其用于光催化后获得的底物化合物a，成功高效合成了一系列具有高对映选择性的手性内酯化合物；
因此，将光催化剂丁基铵十聚钨酸盐(TBADT)与羰基还原酶ChKRED20突变体相互结合成功的扩展了底物谱，同时突变株M3C1(即，以羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，第97位、第153位和第188位上的氨基酸均发生突变)具有更好的底物普适性。
附图说明
图1为底物化合物a的合成路线示意图；
图2为手性内酯化合物e的合成路线图；
图3为底物化合物2a的氢谱图；
图4为底物化合物2a的碳谱图；
图5为消旋体2e标样的液相光谱图；
图6为手性内酯化合物2e的液相光谱图；
图7为光反应器实物结构示意图；
图8为底物化合物1a的氢谱图；
图9为底物化合物5a的氢谱图；
图10为底物化合物10a的氢谱图；
图11为底物化合物12a的氢谱图；
图12为底物化合物15a的氢谱图；
图13为底物化合物16a的氢谱图；
图14为手性内酯化合物5e的氢谱图；
图15为手性内酯化合物10e的氢谱图；
图16为手性内酯化合物17e的氢谱图；
图17为手性内酯化合物26e的氢谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
光催化剂四丁基十钨酸铵(TBADT)的合成，该光催化剂由通过下述合成：
将钨酸钠(30.3mmol)和四丁基溴化铵(14.9mmol)溶解在去离子水中(100mL)形成反应体系，然后加热至90℃并使用2M的盐酸溶液将反应体系的pH值调节为2并快速混合形成悬浮液，继续在90℃下反应30min，反应结束后冷却至时室温并过滤得到白色固体，得到的白色固体用水洗涤后进行真空干燥获得粗产品。
将粗产品溶解在热乙腈中，然后在-20℃下放置12小时，再用过滤器收集固体颗粒，并用少量冷乙腈洗涤获得纯TBADT。此外，滤液可再进行浓缩制备TBADT。
实施例2
羰基还原酶ChKRED20突变体的构建，其以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第97位、第153位和第188位中的至少两位上的氨基酸进行突变；其中，野生型ChKRED20序列如下所示：ATG GGA ATT TTA GAC AAC AAA GTA GCA CTT GTT ACA GGAGCAGGA TCC GGA ATC GGA TTA GCT GTT GCT CAT TCG TAT GCA AAAGAA GGC GCC AAA GTTATT GTA TCC GAT ATT AAT GAA GAT CACGGT AAC AAA GCA GTC GAA GAC ATT AAA GCACAA GGC GGG GAAGCG TCT TTT GTA AAA GCA GAT ACT TCA AAC CCT GAA GAA GTGGAA GCTTTA GTA AAA AGA ACA GTA GAA ATC TAC GGA AGA CTTGAT ATT GCA TGT AAT AAT GCGGGA ATC GGT GGC GAA CAG GCGCTG GCA GGC GAT TAC GGT CTC GAC AGC TGG CGA AAAGTA TTAAGC ATA AAT CTT GAT GGC GTA TTC TAC GGG TGC AAA TAT GAGTTA GAA CAA ATGGAA AAA AAC GGG GGC GGC GTT ATT GTG AATATG GCC TCT ATT CAT GGT ATT GTT GCTGCA CCG CTT TCC TCAGCC TAC ACT TCT GCA AAG CAC GCA GTG GTA GGG CTT ACT AAAAATATA GGA GCA GAA TAC GGA CAG AAA AAT ATC CGT TGC AATGCG GTG GGG CCT GCT TATATT GAA ACC CCG CTG TTG GAA AGCCTG ACA AAG GAA ATG AAG GAA GCA CTG ATT TCAAAA CAT CCGATG GGA AGA CTG GGA AAA CCT GAA GAA GTA GCA GAA CTG GTGTTG TTC CTGAGT TCA GAA AAA TCA TCT TTT ATG ACG GGA GGCTAT TAT CTT GTA GAT GGT GGC TACACG GCA GTT TAA(SEQ ID NO.1)。
1、突变体M1B(Q97L)的构建，包括以下步骤：：
步骤1、以野生型ChKRED20为DNA模板序列，利用PCR技术对97位的谷氨酰胺进行定点突变为亮氨酸。选取正向引物：5’-ggaatcggtggcgaacttgcgctggcaggcgat-3’(SEQ IDNO.2)，反向引物：3’-atcgcctgccagcgcaagttcgccaccgattcc-5’(SEQ ID NO.3)。PCR条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸6min，共25个循环，再72℃延伸10min。PCR结束后加入1μL的DpnI在37℃下消化1h。然后取10μL以热击法转入50μL的E.coliDH5α感受态细胞中，然后挑取单克隆菌株送至公司测序验证。
步骤2、将步骤1中突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，涂布含有卡那霉素的LB平板，培养12h。挑取单克隆于96孔板，每孔含有200μL TB培养基(含有50μg/mL卡那霉素，0.5mM IPTG)，30℃，180rpm，震荡培养18h。用96孔板复制器复制各单克隆于LB固体培养基平板，37℃培养12h后，4℃冰箱保存。
纯酶液的制备：挑取单克隆至LB(含卡那霉素50μg/mL)培养基中，37℃过夜培养，以1％的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/mL)培养基中，37℃培养3h，加入0.5mM IPTG诱导后，30℃继续培养至18h。4℃、6000rpm离心收集菌体。重悬于Buffer A(50mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)，细胞均质机破碎，之后以13000rpm，4℃离心20min。纯化采用镍柱亲和层析(Bio-Rad)，将上清液加入已用Buffer A平衡的柱料中，轻微混匀30min，用含有20mM咪唑的Buffer A漂洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的Buffer A的缓冲液洗脱目的蛋白，并以磷酸钠缓冲液透析除去咪唑(0.1M，pH 8.0)，最后电泳鉴定纯度。
2、突变体M1A(S153L)的构建与突变体M1B(Q97L)的构建方法相同，利用PCR技术对153位的丝氨酸进行定点突变为亮氨酸，不同之处在于，所用引物如下所示：
S153L-正向引物：5’-gttgctgcaccgcttctttcagcctacacttct-3’(SEQ ID NO.4)；
S153L-反向引物：3’-agaagtgtaggctgaaagaagcggtgcagcaac-5’(SEQ ID NO.5)。
3、突变体M2(Q97L/S153L)的构建方法与突变体M1B(Q97L)的构建方法相同，不同之处在于：
步骤1中以突变体M1B(Q97L)为DNA模板序列，对改基因的153位氨基酸进行定点突变，具体的将第153位的丝氨酸突变为亮氨酸，得到M2(Q97L/S153L)突变株；所用引物为：S153L-正向引物：5’-gttgctgcaccgcttctttcagcctacacttct-3’(SEQ ID NO.6)，
S153L-反向引物：3’-agaagtgtaggctgaaagaagcggtgcagcaac-5’(SEQ ID NO.7)。
4、突变体M3C1(Q97L/S153L/Y188S)的构建方法与突变体M1B(Q97L)的构建方法相同，不同之处在于：
步骤1中以突变体M2为DNA模板序列，对改基因的188位氨基酸进行定点突变，具体地，将第188位的酪氨酸突变为丝氨酸，得到M3C1(Q97L/S153L/Y188S)突变株；所用引物为：
M3C1-正向引物：5’-gcggtggggcctgctagcattgaaaccccgctg-3’(SEQ ID NO.8)，
M3C1-反向引物：3’-cagcggggtttcaatgctagcaggccccaccgc-5’(SEQ ID NO.9)。
实施例3
一种手性内酯化合物的合成方法，包括以下步骤：
步骤1、底物化合物a的合成路线如图1所示：
(1)底物2a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入4-氟苯甲醛(16mmol)和丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物2a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物2a。
(2)5a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入3-溴苯甲醛(16mmol)和丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物5a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物5a。
(3)10a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入3-甲基苯甲醛(16mmol)和丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物10a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物10a。(4)12a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入2-甲基苯甲醛(16mmol)和丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物12a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物12a。
将底物化合物12a进行氢谱测试分析，测试结果详见图11，从图11中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物12a。
(5)15a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入苯甲醛(16mmol)和巴豆酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物15a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物15a。
(6)底物16a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入苯甲醛(16mmol)和甲基丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物16a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物16a。
(7)底物17a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入4-(叔丁基)苯甲醛(16mmol)和丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物17a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物17a。
其中，17a氢谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.93(d,J＝8.3Hz,2H),7.48(d,J＝8.2Hz,2H),3.70(s,3H),3.38–3.26(m,2H),2.76(t,J＝6.7Hz,2H),1.34(s,9H)；即，本实施例中成功合成了底物化合物17a。
(8)底物26a的制备具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入2-萘醛(16mmol)和丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物26a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物26a。
其中，26a氢谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.46(s,1H),8.00(d,J＝8.6Hz,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.87–7.79(m,2H),7.54(dt,J＝19.8,7.0Hz,2H),3.70(s,3H),3.41(t,J＝6.6Hz,2H),2.80(t,J＝6.6Hz,2H)；即，本实施例中成功合成了底物化合物26a。
步骤2、手性内酯化合物e的合成路线如下图2所示；
(1)手性内酯化合物2e的制备具体为：将底物化合物2a(0.5mM)和实施例2中获得的ChKRED20-M3C1(突变体M3C1，1mol％，第97位、第153位和第188位上的氨基酸均发生突变，第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第153位的丝氨酸突变为亮氨酸，第188位的酪氨酸突变为丝氨酸)分散于异丙醇(i-PrOH 10％)中，然后在37℃的条件下反应48h制得手性内酯化合物2e。
(2)手性内酯化合物5e的制备具体为：将底物化合物10a(0.5mM)和实施例2中获得的ChKRED20-M3C1(1mol％，第97位、第153位和第188位上的氨基酸均发生突变，第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第153位的丝氨酸突变为亮氨酸，第188位的酪氨酸突变为丝氨酸)分散于异丙醇(i-PrOH 10％)中，然后在37℃的条件下反应48h制得手性内酯化合物5e。
(3)手性内酯化合物10e的制备具体为：将底物化合物10a(0.5mM)和实施例2中获得的ChKRED20-M3C1(1mol％，第97位、第153位和第188位上的氨基酸均发生突变，第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第153位的丝氨酸突变为亮氨酸，第188位的酪氨酸突变为丝氨酸)分散于异丙醇(i-PrOH 10％)中，然后在37℃的条件下反应48h制得手性内酯化合物10e。
(4)手性内酯化合物17e的制备具体为：将底物化合物17a(0.5mM)和实施例2中获得的ChKRED20-M3C1(1mol％，第97位、第153位和第188位上的氨基酸均发生突变，第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第153位的丝氨酸突变为亮氨酸，第188位的酪氨酸突变为丝氨酸)分散于异丙醇(i-PrOH 10％)中，然后在37℃的条件下反应48h制得手性内酯化合物17e。
(5)手性内酯化合物26e的制备具体为：将底物化合物26a(0.5mM)和实施例2中获得的ChKRED20-M3C1(1mol％，第97位、第153位和第188位上的氨基酸均发生突变，第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第153位的丝氨酸突变为亮氨酸，第188位的酪氨酸突变为丝氨酸)分散于异丙醇(i-PrOH 10％)中，然后在37℃的条件下反应48h制得手性内酯化合物26e。
实施例4
一种手性内酯化合物的合成方法，包括以下步骤：
步骤1、底物化合物1a的合成路线如下所示：
具体为：
往圆底烧瓶中加入乙腈(10mL)和实施例1制备的TBADT(800mg)，并通入氮气；然后在氮气氛围下，往圆底烧瓶中继续注入苯甲醛(16mmol)和丙烯酸甲酯(8mmol)，然后将圆底烧瓶置于自制的光反应器中(由两个390nm的LED光源组成，其结构如图7所示)于20℃下反应12h，制得含底物化合物1a的混合物；
反应结束后，将混合物置于空气中进行淬灭反应并直到反应物的颜色由蓝色变为透明液体；然后再向混合物中加入30mL乙酸乙酯以沉淀TBADT并过滤，然后减压蒸发滤液，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，柱层析纯化得到底物化合物1a。
步骤2、性内酯化合物1e的合成路线如下所示：
具体为：将底物化合物1a(0.5mM)和实施例2中获得的ChKRED20-M3C1(1mol％)分散于异丙醇(10％)中，然后在37℃的条件下反应48h制得手性内酯化合物1e。
实施例5
本实施例中手性内酯化合物的合成方法与实施例4中相同，不同之处在于:
步骤2中的ChKRED20-M3C1替换为突变体M2(即，第97位和第153位上的氨基酸同时进行突变，其中，第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第153位的丝氨酸突变为亮氨酸)。
对比例1
本实施例中手性内酯化合物的合成方法与实施例4中相同，不同之处在于：
步骤2中的ChKRED20-M3C1替换为突变体M1B(第97位上的氨基酸进行突变，第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸)。
对比例2
本实施例中手性内酯化合物的合成方法与实施例4中相同，不同之处在于：
步骤2中的ChKRED20-M3C1替换为突变体M1A(第153位上的氨基酸进行突变，第153位的丝氨酸突变为亮氨酸)。
对比例3
本实施例中手性内酯化合物的合成方法与实施例4中相同，不同之处在于：
步骤2中的ChKRED20-M3C1替换为WT(野生型ChKRED20)。
测试分析：
1、将实施例3中底物化合物2a进行氢谱和碳谱测试分析，测试结果详见图2和图3，从图3和图4中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物2a。
利用高效液相色谱(HPLC)对实施例3中制备的手性内酯化合物2e的手性值进行测定，其测试结果详见图5和图6所示，其中，图5为消旋体2e标样液相光谱图，图6为手性内酯化合物2e液相光谱图，结合图5和图6可以看出，本实施中制备的手性内酯化合物2e为R构型内酯化合物。
将底物化合物1a进行氢谱测试分析，测试结果详见图8，从图8中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物1a。
将底物化合物5a进行氢谱测试分析，测试结果详见图9，从图9中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物5a。
将底物化合物10a进行氢谱测试分析，测试结果详见图10，从图10中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物10a。
将底物化合物12a进行氢谱测试分析，测试结果详见图11，从图11中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物12a。
将底物化合物15a进行氢谱测试分析，测试结果详见图11，从图11中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物15a。
将底物化合物16a进行氢谱测试分析，测试结果详见图12，从图12中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物16a。
将手性内酯化合物5e进行氢谱测试分析，测试结果详见图14，从图14中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物5e。
将手性内酯化合物10e进行氢谱测试分析，测试结果详见图15，从图15中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物10e。
将手性内酯化合物17e进行氢谱测试分析，测试结果详见图16，从图16中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物17e。
将手性内酯化合物26e进行氢谱测试分析，测试结果详见图17，从图17中可以看出，本发明中成功的合成了底物化合物26e。
2手性值和产率检测
利用高效液相色谱(HPLC)检测实施例4～7以及对比例1中手性内酯化合物的手性值和产率，其结果详见表1。
表1.手性值和产率检测结果
从表1中可以看出，野生型ChKRED20不能催化γ-酮酸酯的还原，突变株M2(Q97L-S153L)，并且以M2为母体的突变株M3C1(Q97L-S153L-Y188S)能够高效地合成具有高对映选择性的手性内酯化合物。即，本发明成功的扩展了底物谱，并且突变株M3C1具有较好的底物普适性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于手性内酯化合物合成的羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于，以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第97位、第153位和第188位中的至少两位上的氨基酸进行突变；
其中，以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第97位的谷氨酰胺突变为亮氨酸；
以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第153位的丝氨酸突变为亮氨酸；
以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第188位的酪氨酸突变为丝氨酸。
2.权利要求1中所述的羰基还原酶ChKRED20突变体在手性内酯化合物合成中的应用。
3.采用权利要求1中的羰基还原酶ChKRED20突变体合成手性内酯化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、在保护气体氛围下，将醛类化合物和结构式如Ⅱ所示的化合物溶于溶剂中，加入光催化剂四丁基铵十聚钨酸盐，然后在光反应器中反应10～14h，制得底物化合物a；
步骤2、将底物化合物a、羰基还原酶ChKRED20突变体分散于溶剂中进行酶催化反应制得手性内酯化合物；
其中，所述式Ⅱ的结构式为：其中，R1为/> 中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述醛类化合物的
结构式如式Ⅰ所示，所述式Ⅰ的结构式为：其中R为 中的任意一种；所述R2为H、F、NC、Cl、Br、Me、MeO、CF3、Et、tBu、CF3O、CF3S和EtO中的任意一种；
所述R3为F、Me、CN、Br和Cl中的任意一种；
所述R4为Me或CF3。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述步骤1中醛类化合物与结构式如Ⅱ所示的化合物的摩尔比为1:1～5:4；所述保护气体为氮气；所述光催化剂与结构式如Ⅱ所示的化合物的质量比为3:2～2:1。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤2中的酶催化反应的条件为：35～38℃下反应42～54h。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述光催化剂四丁基铵十聚钨酸盐的制备方法如下：
将钨酸盐和四丁基溴化铵溶于溶剂后进行加热，并调节其pH值为2～3后继续反应20～40min制得光催化剂。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述钨酸盐与四丁基溴化铵的摩尔比为25～32:10～17；所述钨酸盐为钨酸钠；所述溶剂为去离子水；所述加热后的温度为85～95℃。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |