CN117285651A - 靶向c-MET的嵌合抗原受体、CAR-M及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种靶向c‑MET的嵌合抗原受体、CAR‑M及其用途。本公开提供了一种靶向c‑MET的构建体，并在体外验证了靶向c‑MET的CAR‑M细胞对高表达c‑MET的实体肿瘤的特异性结合及杀伤能力。

Description

靶向c-MET的嵌合抗原受体、CAR-M及其用途
技术领域
本公开涉及临床、生物学、肿瘤学领域。
背景技术
胰腺癌发病率呈明显升高趋势，其预后极差，总体5年生存率仅约为10％。到2030年，胰腺癌有可能成为第二大癌症死亡原因。以嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T)为代表的过继免疫细胞治疗以及以PD-L1以及CTLA4为代表的免疫检查点抑制治疗是肿瘤免疫治疗取得成功的里程碑事件，但是这两种治疗方法在胰腺癌中效果极其有限。CAR-T在实体肿瘤中的应用面临诸多困难，仍未能有效解决。
巨噬细胞(CAR-M)较CAR-T具有更强的肿瘤组织内浸润能力、吞噬及杀伤能力、抗原呈递能力以及微环境重塑能力，是细胞免疫治疗最前沿领域。巨噬细胞具有强大的向肿瘤组织中迁移的能力，从而解决了效应细胞不能进入肿瘤组织中的难题。CAR-M会同时具有特异性和非特异的广泛吞噬及杀伤能力。CAR-M细胞可以作为高效的抗原呈递细胞，继而激活效应T细胞。最后，作为肿瘤微环境调控的关键细胞，CAR-M可以改善肿瘤微环境的免疫抑制状态。
目前，仅有少量的CAR-M临床前研究报道。迄今，Clinicltrial.org仅有一项注册临床研究。Klichinsky等开发了人CAR-PBCM-HER2并发现其可以明显延长HER2阳性的荷小鼠的生存期以及减少转移的肿瘤负荷。迄今，国内外未见CAR-M在胰腺癌中的研究报道。
发明内容
c-MET被称为细胞间质上皮转换因子，其为受体酪氨酸激酶家族成员，在多种肿瘤中被异常激活，促进肿瘤生长。发明人发现，c-MET在胰腺癌中广泛高表达，促进胰腺癌进展，与患者预后呈负相关，可以成为CAR-M治疗的潜在靶点。
鉴于此，根据本申请的一些实施方案，提供了一种靶向c-MET的构建体，并在体外验证了靶向c-MET的CAR-M细胞(以下简称CAR-M-c-MET细胞)对高表达c-MET的实体肿瘤(如胰腺癌)的特异性结合及杀伤能力。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种靶向人c-MET的构建体。
靶标是指本公开的构建体所针对的客体；靶标可以是核酸(基因、mRNA等)，也可以是蛋白(前体、成熟蛋白、同种型、变体等)。在本公开中，靶标尤其是指人c-MET基因或其表达产物。
本公开中人c-MET应作做广泛的解读，是指人c-MET基因本身及其在各阶段中各种形式的表达产物，例如但不限于基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。
作为一个具体的示例，本公开中的靶标是人c-MET蛋白或肿瘤细胞表面表达的c-MET。
人c-MET的核苷酸或氨基酸信息是本领域公知的，例如但不限于可以从文献或数据库中获取。技术人员应当理解，人c-MET不限于特定数据库中的登录号，还意图涵盖现有技术中任何文献、书籍、数据库中的等同指代物。
根据本申请的一些实施方案，靶向人c-MET的构建体是式1所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-scFv-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域(式1)。
可以根据N-和C-末端结构域的位置，对跨膜蛋白进行分类。I、II、III型为一次跨膜蛋白，IV型是多次跨膜蛋白。I型跨膜蛋白用停止-传输锚定序列锚定到脂质膜上，其N-末端结构域在合成时瞄准于内质网腔，如果成熟形式是位于质膜上，则N-末端结构域则瞄准于细胞外间隙。
鉴于上述，原则上任何I型跨膜蛋白的信号肽均适用于本申请的信号肽。作为一个非限制性示例，信号肽是CD8信号肽或igk信号肽。一些具体的实施方案中，所述CD8信号肽是SEQ ID No：11所示。
一些实施方案中，所述scFv(single chain antibody fragment)特异性结合人c-MET。scFv是由抗体重链可变区VH和轻链可变区VL通过15-20个氨基酸的接头(linker)连接而成的单链抗体。在结构上，可以将VH的N端与VL的C端相连，也可以将VL的N端与VH的C端相连。尽管接头的序列差异很大，但CAR领域中常用的接头包含重复的甘氨酸和丝氨酸残基，以提供抗原结合位点改变构象所需的灵活性，并在水溶液中保持良好的稳定性。
接头长度会影响scFv的各种结构特征，例如大小、灵活性和化合价。大于12个残基的接头有助于可变结构域以自然方向折叠并形成单价抗原结合位点。相反，较短的接头限制可变结构域的灵活性，阻止了分子内可变链配对，有利于分子间的寡聚化和scFv多聚体的形成。在一些实施方案中，示例性的接头是SEQ ID No：23所示。
在一些实施方案中，靶向人c-MET的构建体是式1-1所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-VH-接头-VL-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域
(式1-1)。
在另一些实施方案中，靶向人c-MET的构建体是式1-2所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-VL-接头-VH-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域
(式1-2)。
一些具体的实施方案中，所述重链可变区包含：SEQ ID No：3所示的HCDR1、SEQ IDNo：4所示的HCDR2、SEQ ID No：5所示的HCDR3；所述轻链可变区包含：SEQ ID No：6所示的LCDR1、SEQ ID No：7所示的LCDR2和SEQ ID No：8所示的LCDR3。
一些具体的实施方案中，所述scFv包含SEQ ID No：1所示的重链可变区和SEQ IDNo：2所示的轻链可变区。
一些具体的实施方案中，所述scFv是SEQ ID No：9所示。
一些实施方案中，所述铰链区选自以下的任一项：CD8的铰链区、CD28的铰链区、IgG1的铰链区、IgG4的铰链区。
一些具体的实施方案中，所述铰链区是CD8的铰链区。
一些具体的实施方案中，所述铰链区是SEQ ID No：21所示。
跨膜结构域的功能是将本公开的构建体锚定在巨噬细胞细胞膜上，理论上CD8(如CD8a)、CD3ζ、CD4、CD28的跨膜结构域均适用。一些具体的实施方案中，所述CD8跨膜结构域是SEQ ID No：13所示。
一些实施方案中，所述细胞内激活信号结构域包含：FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域和CD19的Tyr-X-X-Met结构域(简称YXXM，如YEDM、YENM)。
选择FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域(如FCER1G第45-86aa)的理由在于；本申请出乎意料地发现引入该区域的CAR可触发SYK、CARD9和NF-kb的激活，从而介导巨噬细胞的活化。
B细胞表面表达的CD19，其包含一段Tyr-X-X-Met结构域，能够结合PI3K激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase)。本申请出乎意料地发现引入该区域的CAR促使CAR-M细胞中PI3K激酶的募集。
一些具体的实施方案中，所述FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域是SEQ ID No：15所示。
一些具体的实施方案中，所述Tyr-X-X-Met结构域是SEQ IDNo：17所示。
所述FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域和所述CD19的Tyr-X-X-Met结构域能够互换顺序。
在一些实施方案中，靶向人c-MET的构建体是式1-3所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-VH-接头-VL-铰链区-跨膜结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域-YXXM结构域
(式1-3)。
在另一些实施方案中，靶向人c-MET的构建体是式1-4所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-VL-接头-VH-铰链区-跨膜结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域-YXXM结构域(式1-4)。
在另一些实施方案中，靶向人c-MET的构建体是式1-5所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-VH-接头-VL-铰链区-跨膜结构域-YXXM结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域
(式1-5)。
在另一些实施方案中，靶向人c-MET的构建体是式1-6所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-VL-接头-VH-铰链区-跨膜结构域-YXXM结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域(式1-6)。
在具体的实施方案中，靶向人c-MET的构建体是SEQ ID No：19所示。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码前述任一靶向人c-MET的构建体。
在具体的实施方案中，所述多核苷酸是SEQ ID No：20所示。
除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种表达载体。
术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是质粒，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。
术语“表达载体”是指可对宿主细胞进行转化，且含有指导和/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。
原则上所有过表达质粒都可以用于表达本公开的构建体。作为一个示例，例如但不限于GV401、pET、pGEX、pMAL、pT7、CRISPR/Cas9***。
在一些实施方案中，表达载体包含前述多核苷酸。
在具体的实施方案中，表达载体是病毒载体。作为一个示例，病毒载体选自以下的任一项：慢病毒载体、逆转录病毒、腺病毒载体。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其表达前述靶向人c-MET的构建体。
在具体的实施方案中，宿主细胞是巨噬细胞。作为一个示例，所述巨噬细胞获自待治疗的受试者、或同种异体的受试者。
术语“受试者”或“个体”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。在具体的实施方案中，个体或受试者是人。
根据本申请的一些实施方案，提供了前述靶向人c-MET的构建体在制备CAR-M中的用途。
根据本申请的一些实施方案，提供了前述多核苷酸在制备CAR-M中的用途。
根据本申请的一些实施方案，提供了前述表达载体在制备CAR-M中的用途。
根据本申请的一些实施方案，提供了前述宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗高表达c-MET的实体肿瘤(如胰腺癌)。
附图说明
图1：CAR-M细胞的转染效率。
图2：通过流式细胞术，检测与PE标记的c-MET重组蛋白的结合能力，证实细胞表面的CAR分子与靶蛋白c-MET能够稳定高效结合。
图3：多种胰腺癌细胞系(AsPC-1、PaTu8988t、PANC-1、Bxpc-3、MIA PaCa2)的c-MET表达量的检测。
图4A至图4G：CAR-M-c-MET细胞的吞噬事件。
具体实施方式
实施例1.c-MET是胰腺导管腺癌的不良预后因子
c-MET是胰腺导管腺癌(也称PDAC)患者的不良预后因子，CD133是肿瘤干细胞的标志物，与胰腺癌的复发相关。
来源于不同数据库(TIME、OncoLnc、GEPIA、Kaplan-Meier plot)的生物信息数据表明，胰腺导管腺癌组织中c-MET表达水平与胰腺导管腺癌患者的总体生存、无病生存显著正相关。并且发现在胰腺导管腺癌癌组织中c-MET的表达显著高于癌旁组织(p<0.0001)，是胰腺导管腺癌患者的不良预后因素。来源于不同数据库的生物信息数据表明，胰腺导管腺癌组织中CD133表达水平与c-MET的表达水平呈正相关。并且发现在胰腺导管腺癌癌组织中CD133的表达显著高于癌旁组织(p<0.0001)，且与胰腺癌的复发有显著相关性(数据未显示)。
实施例2.靶向c-MET的构建体的设计
1.靶向c-MET的scFv设计
(1)scFv的氨基酸序列：
VH的氨基酸序列(SEQ ID No：1)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTSYGFSWVRQAPGQGLEWMGWISASNGNTYYAQKLQGRVTMTTDTSTSSAYMELRSLRSDDTAVYYCARVYADYADYWGQGTLVTVSS；
VL的氨基酸序列(SEQ ID No：2)：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLKSGVPSRFSGSGSGADFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK；
HCDR1的氨基酸序列：GYTFTSYG(SEQ ID No：3)
HCDR2的氨基酸序列：ISASNGNT(SEQ ID No：4)
HCDR3的氨基酸序列：ARVYADYADY(SEQ ID No：5)
LCDR1的氨基酸序列：QGINTW(SEQ ID No：6)
LCDR2的氨基酸序列：AAS(SEQ ID No：7)
LCDR3的氨基酸序列：QQANSFPLT(SEQ ID No：8)
(2)scFv的氨基酸序列(从N至C)：
粗体：VH；下划线：VL；
斜体部分GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID No：23)是接头。
(3)scFv的编码核苷酸序列(从5'至3')：
gacatccagatgacccagagccccagcagcgtgagcgccagcgtgggcgaccgggtgaccatcacctgccgggccagccagggcatcaacacctggctggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgaagagcggcgtgcccagccggtttagcggctctggctctggcgccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggccaacagcttccccctgacctttggcggcggaacaaaggtggagatcaagggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggccaggtgcagctggtgcagagcggagccgaggtgaagaagcctggcgcctccgtcaaggtgtcctgcgaggccagcggctacaccttcaccagctacggcttcagctgggtgcggcaggcaccaggccagggcctcgaatggatgggctggatcagcgccagcaacggcaacacctactacgcccagaagctgcagggcagggtcaccatgaccaccgacaccagcaccagcagcgcctacatggaactgcggagcctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccagggtgtacgccgactacgccgattactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID No：10)。
2.CAR-M的设计
CAR修饰的巨噬细胞(CAR-Macrophage，即CAR-M)被认为是一种有前途的细胞类型。
与CAR-T和CAR-NK细胞相似，CAR-M细胞包含：识别抗原的细胞外结构域(如scFv)、跨膜结构域和细胞内激活信号结构域组成。
(1)信号肽
CD8信号肽的氨基酸序列(从N至C)(SEQ ID No：11)：
MALPVTALLLPLALLLHAARP；
CD8信号肽的编码核苷酸序列(从5'至3')(SEQ ID No：12)：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg。
(2)跨膜结构域
CD8跨膜结构域的氨基酸序列(从N至C)(SEQ ID No：13)：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
CD8跨膜结构域的编码核苷酸序列(从5'至3')(SEQ ID No：14)：
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc。
(3)FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域
FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域的氨基酸序列(从N至C)(SEQ ID No：15)：
RLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ。
FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域的编码核苷酸序列(从5'至3')(SEQ ID No：16)：
cgactgaagatccaagtgcgaaaggcagctataaccagctatgagaaatcagatggtgtttacacgggcctgagcaccaggaaccaggagacttacgagactctgaagcatgagaaaccaccacag。
(4)Tyr-X-X-Met结构域
YXXM的氨基酸序列(从N至C)(SEQ ID No：17)：
YEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENM。
YXXM的编码核苷酸序列(从5'至3')(SEQ ID No：18)：
tatgaggatatgagaggaatcctgtatgcagccccccagctccgctccattcggggccagcctggacccaatcatgaggaagatgcagactcttatgagaacatg。
(5)铰链
铰链的氨基酸序列(从N至C)(SEQ ID No：21)：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD铰链的编码核苷酸序列(从5'至3')(SEQ ID No：22)：
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat。
3.构建体的设计
Scfv-CD8TM-FCER1G-CD19的氨基酸序列(从N至C)(SEQ ID No：19)：
Scfv-CD8TM-FCER1G-CD19按5'至3'端(SEQ ID No：20)：
下划线：信号肽；
粗体：scfv；
点划线：铰链；
斜体：跨膜结构域；
波浪线：FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域(NP_004097.1第45-86aa)；
常规字体：CD19的YXXM结构域；
框：终止密码子。
实施例3.质粒的设计和合成
将实施例2制备的Scfv-CD8TM-FCER1G-CD19构建体***GV401载体(市售获得)的适当位置(如酶切位点)。
实施例4.病毒载体的设计和转染
通过慢病毒转染THP-1细胞系获得稳定表达CAR分子的CAR-M细胞(以下称CAR-M-c-MET细胞)，转染效率能稳定保持在20％-25％(图1)。
实施例5.CAR-M-c-MET细胞和c-MET的结合能力测试
通过流式细胞术，检测与PE标记的c-MET重组蛋白的结合能力，证实细胞表面的CAR分子与靶蛋白c-MET能够稳定高效结合(图2)。
通过传代，获得稳定表达CAR的CAR-M细胞。通过对多种胰腺癌细胞系(AsPC-1、PaTu8988t、PANC-1、Bxpc-3、MIA PaCa2)的c-MET表达量的检测。发现Bxpc-3细胞系的c-MET表达量最高，而MIA PaCa2细胞系几乎不表达c-MET(图3)，利用这两种细胞系作为工具细胞进行后续实验。
实施例6.CAR-M-c-MET细胞对高表达c-MET的胰腺癌细胞的吞噬能力
为了检测CAR-M-c-MET细胞在体外对c-MET高水平表达的肿瘤细胞的特异性吞噬能力，将肿瘤细胞与CAR-M-c-MET细胞进行共培养效靶比设置为5：1，在不同时间点利用流式细胞技术进行分析，以双阳性细胞群为成功吞噬肿瘤细胞的CAR-M-c-MET细胞进行统计。
发现CAR-M-c-MET细胞与对照巨噬细胞(简称NC-M)相比，在不同时间点都有更高的吞噬效率。以效靶比5：1共培养24h后，利用流式细胞术检测剩余肿瘤细胞数，发现CAR-M-c-MET细胞与NC-M相比，剩余肿瘤细胞数目更少。
同样以10：1、5:1、3:1、1:1、0.5:1不同的效靶比共培养不同的时间，并通过检测培养体系LDH释放对肿瘤细胞杀伤情况进行评估以及生物发光检测剩余肿瘤细胞数量。发现在CAR-M-c-MET细胞与NC-M相比，在不同效靶比以及培养时间的共培养体系中均有更强的杀伤能力。并且，随着培养时间的延长以及效靶比的增加，这种差距逐渐增大。
在共聚焦显微镜下，对共培养体系进行拍照，每个培养孔随机拍摄5个视野，并以红绿色荧光叠加的细胞数目来代表吞噬事件，以单独存在的红色荧光来代表剩余肿瘤细胞，并统计这两个指标，发现CAR-M-c-MET细胞与NC-M相比，有更多的吞噬事件以及更少的剩余肿瘤细胞(图4A至图4G)。
综上，利用流式细胞技术、免疫荧光以及动态摄像等技术，本申请已经明确CAR-M-c-MET可以通过特异性结合c-MET对c-MET高表达的胰腺癌细胞的高效吞噬及杀伤能力。

Claims (11)

1.一种靶向人c-MET的构建体，其是式1所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-scFv-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域
(式1)；
其中：
所述信号肽是I型跨膜蛋白的信号肽，优选CD8信号肽、igk信号肽；
所述scFv特异性结合人c-MET，所述scFv包含重链可变区(VH)、接头和轻链可变区(VL)；
所述重链可变区包含：SEQ ID No：3所示的HCDR1、SEQ IDNo：4所示的HCDR2、SEQ IDNo：5所示的HCDR3；
所述轻链可变区包含：SEQ ID No：6所示的LCDR1、SEQ IDNo：7所示的LCDR2和SEQ IDNo：8所示的LCDR3；
所述重链可变区和所述轻链可变区能够互换顺序；
优选地，所述铰链区选自以下的任一项：CD8的铰链区、CD28的铰链区、IgG1的铰链区、IgG4的铰链区；
优选地，所述跨膜结构域选自以下的任一项：CD8跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD28跨膜结构域；
所述细胞内激活信号结构域包含：FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域和CD19的YXXM结构域；
所述FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域和所述CD19的YXXM结构域能够互换顺序。
2.根据权利要求1所述的靶向人c-MET的构建体，其是选自以下任一项所示：式1-1、式1-2、式1-3、式1-4、式1-5、式1-6所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：
信号肽-VH-接头-VL-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域(式1-1)；
信号肽-VL-接头-VH-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域(式1-2)；
信号肽-VH-接头-VL-铰链区-跨膜结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域-YXXM结构域
(式1-3)；
信号肽-VL-接头-VH-铰链区-跨膜结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域-YXXM结构域
(式1-4)；
信号肽-VH-接头-VL-铰链区-跨膜结构域-YXXM结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域
(式1-5)；或
信号肽-VL-接头-VH-铰链区-跨膜结构域-YXXM结构域-FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域
(式1-6)。
3.根据权利要求1或2所述的靶向人c-MET的构建体，其中：
优选地，所述接头是SEQ ID No：23所示；
优选地，所述scFv包含SEQ ID No：1所示的重链可变区和SEQID No：2所示的轻链可变区；更优选地，所述scFv是SEQ ID No：9所示；
优选地，所述铰链区是SEQ ID No：21所示；
优选地，所述CD8信号肽是SEQ ID No：11所示；
优选地，所述CD8跨膜结构域是SEQ ID No：13所示；
优选地，所述FCER1G的免疫受体酪氨酸激活结构域是SEQ IDNo：15所示；
优选地，所述YXXM结构域是SEQ ID No：17所示。
4.根据权利要求1至3任一项所述的靶向人c-MET的构建体，其是SEQ ID No：19所示。
5.一种多核苷酸，其编码权利要求1至4任一项所述的靶向人c-MET的构建体；
优选地，其是SEQ ID No：20所示。
6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸；
优选地，其是病毒载体；
更优选地，所述病毒载体选自以下的任一项：慢病毒载体、逆转录病毒、腺病毒载体。
7.一种宿主细胞，其表达权利要求1至4任一项所述的靶向人c-MET的构建体；
优选地，所述宿主细胞是巨噬细胞；
更优选地，所述巨噬细胞获自待治疗的受试者。
8.权利要求1至4任一项所述的靶向人c-MET的构建体在制备CAR-M中的用途。
9.权利要求5所述的多核苷酸在制备CAR-M中的用途。
10.权利要求6所述的表达载体在制备CAR-M中的用途。
11.权利要求7所述的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗高表达c-MET的实体肿瘤，优选胰腺癌。
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