CN117285627B - 抗ccr8抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种特异性结合人CCR8的抗体或其抗原结合片段。本发明还提供编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述载体的宿主细胞、生成所述抗体的方法以及包含所述抗体的组合物。

Description

抗CCR8抗体及其用途
技术领域
本发明提供一种特异性结合人CCR8的抗体或其抗原结合片段。本发明还提供编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述载体的宿主细胞、生成所述抗体的方法以及包含所述抗体的组合物。
背景技术
CCR8(C-C基序趋化因子受体8)主要在Treg细胞和Th2细胞上表达，但是不在Th1细胞上表达。已经证明，表达CCR8的CD4+Foxp3+Treg细胞(CCR8+Treg细胞)子集是免疫抑制的主要驱动因素，并且对Treg功能和抑制至关重要。此外，CCR8是一种在若干肿瘤类型中被肿瘤驻留Treg细胞选择性上调的特异性标志物。许多报道表明，CCR8+Treg细胞的增加对肿瘤逃逸机制有益。在临床上，乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌和许多其他癌症类型的肿瘤微环境中Treg细胞的增加与预后不良相关。就机制而言，Treg细胞不仅抑制广泛的抗肿瘤免疫反应，而且还促进肿瘤微环境血管的再生。肿瘤微环境中的癌细胞和免疫细胞分泌CCL1(CCR8的特异性配体)，从而将CCR8+Treg细胞募集到肿瘤微环境中。CCR8还在肿瘤微环境中的Treg增殖和扩增中发挥作用。已经表明，CCR8抑制剂可减少肿瘤浸润的Treg细胞，从而防止肿瘤生长。因此，CCR8被认为是癌症的潜在治疗靶标。
总而言之，本领域需要包含抗CCR8抗体的治疗剂。
发明内容
本发明提供了一种特异性结合人CCR8的抗体或其抗原结合片段满足了本领域的需求。
一方面，本发明提供一种特异性结合人CCR8的抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区(VH)，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：4所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：5所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：6所示的CDR-H3；和轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO：7所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：8所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：9所示的CDR-L3。
在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：10所示的VH和如SEQ ID NO：11所示的VL；或与SEQ ID NO：10所示的VH具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的VH和与SEQ ID NO：11所示的VL具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的VL。
在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含来自SEQ ID NO:10所示VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和来自SEQ ID NO:11所示VL的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，例如根据Kabat定义、Chothia定义或IMGT定义。
在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：14所示的重链恒定区和如SEQ ID NO：15所示的轻链恒定区。
在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含α重链、δ重链、ε重链、γ重链或μ重链。在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区来自λ轻链或κ轻链。在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段为全长抗体。在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段为选自Fv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和xFab的抗体片段。在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段为多特异性抗体，例如双特异性抗体。
在一个实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段具有下述一项或多项特性：
(1)能够特异性结合huCCR8蛋白；
(2)能够特异性结合表达huCCR8蛋白的细胞，例如293T细胞；
(3)能够以小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.9、1.8、1.7、1.6或1.55nM的EC50值特异性结合表达huCCR8蛋白的293T细胞；
(4)能够特异性结合cynoCCR8蛋白；
(5)能够特异性结合表达cynoCCR8蛋白的细胞，例如293T细胞；
(6)能够以小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.9、1.8、1.7、1.6或1.55nM的EC50值特异性结合表达cynoCCR8蛋白的293T细胞；
(7)不能与huCCR1蛋白交叉反应；
(8)不能与表达huCCR1蛋白的细胞，例如293T细胞交叉反应；
(9)不能与huCCR4蛋白交叉反应；
(10)不能与表达huCCR4蛋白的细胞，例如293T细胞交叉反应；
(11)能够实现ADCC；
(12)能够实现NK细胞介导的ADCC；
(13)能够以小于1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05nM的EC50值实现NK细胞介导的ADCC；和/或
(14)能够以大于30、35、40、45、50、55或60％的Emax值实现NK细胞介导的ADCC。
一方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述多核苷酸进行密码子优化以适应在哺乳动物中表达。
在一个实施方案中，本发明多核苷酸包含：SEQ ID NO：12和/或13。
一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的多核苷酸。在一个实施方案中，所述载体为质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒或病毒。
一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
一方面，本发明提供一种生成抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：(a)在适合于表达该抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的宿主细胞，并(b)任选地，回收该抗体或其抗原结合片段。
一方面，本发明提供一种缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述缀合物还包含效应分子。在另一个实施方式中，所述缀合物还包含连接所述抗体或抗原结合片段与效应分子的接头。
一方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、或本发明的缀合物。
一方面，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的缀合物、或本发明的组合物，其用作药物。
一方面，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的缀合物、或本发明的组合物，其用于治疗CCR8相关疾病。
一方面，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的缀合物、或本发明的组合物制备用于治疗CCR8相关疾病的药物的用途。
一方面，本发明提供一种治疗个体中的CCR8相关疾病的方法，其包括对该个体施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的缀合物、或本发明的组合物。
在一个实施方式中，CCR8相关疾病为癌症，例如表达CCR8的癌症。在一个实施方式中，所述癌症为头颈癌、鼻咽癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、***、膀胱癌、肾癌、结直肠癌、食道癌、卵巢癌、肝癌、非小细胞肺癌、或小细胞癌细胞肺癌。在另一个实施方式中，将CCR8抗体或其抗原结合片段与其他治疗剂，例如PD-1抗体(例如Tislelizumab)组合施用以治疗CCR8相关疾病。
一方面，本发明提供一种检测生物学样品中的CCR8的方法，其包括使该生物学样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物接触。
一方面，本发明提供一种诊断个体中的CCR8相关疾病的方法，其包括使来自该个体的生物学样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物接触。
一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括装有本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物的容器。
附图说明
图1显示通过抗人CCR8嵌合抗体，Ch308NK细胞介导的细胞毒性。其中，使用原代人NK细胞作为效应细胞，使用CHO-K1-NanoLuc-CCR8作为靶细胞，测量NK细胞介导的细胞毒性。
具体实施方式
术语
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有如说明书中阐述的含义。
必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种”、“一个/一种”和“所述”包括复数指示物。
除非另外陈述，否则任何数值(诸如本文所述的浓度或浓度范围)都应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值通常包括列举值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括此类范围内的整数和所述值的分数。
除非另外指示，否则在一系列要素之前的术语“至少”应被理解为是指所述系列中的每个要素。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在被本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、或“含有”或其任何其他变型将被理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但是不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含一系列要素的组合物、混合物、过程、方法、物品或设备不一定仅限于那些要素，而是可以包括其他未明确列出或这种组合物、混合物、过程、方法、物品或设备所固有的要素。此外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而不是排他性的或。例如，条件A或B满足以下中的任一种：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)并且B为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。
如本文所用，多个列举要素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独和组合选项两者。例如，在两个要素通过“和/或”连接的情况下，第一选项是指第一要素适用而第二要素不适用。第二选项是指第二要素适用而第一要素不适用。第三选项是指第一要素和第二要素一起适用。这些选项中的任一个都被理解为落入所述含义内，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。所述选项中的多于一个同时适用也被理解为落入所述含义内，因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，如在整个说明书和权利要求书中所用的术语“由……组成”或变型指示包括任何列举的整数或整数组，但是没有另外的整数或整数组可以添加到指定方法、结构或组合物中。
如本文所用，如在整个说明书和权利要求书中所用的术语“基本上由……组成”或变型指示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质性改变指定方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。
如本文所用，“受试者”或“个体”意指任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选人。
还应当理解，本文所用的术语“约”、“大约”、“大体上”、“基本上”和类似术语在指代优选发明的部件的尺寸或特征时指示所描述的尺寸/特征不是严格的边界或参数，并且不排除功能相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的。至少，包括数字参数的此类指代将包括使用本领域接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他***误差、制造公差等)不会改变最低有效数字的变化。
在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，抗CCR8抗体和编码它们的多核苷酸、CCR8多肽和编码它们的CCR8多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指在比较和比对以获得最大对应时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，如使用以下序列比较算法中的一种或通过目视检查所测量的。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与其进行比较。在使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于所指定的程序参数来计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可以进行序列的最佳比对以供比较，例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(威斯康星州麦迪逊科学大道575号(575Science Dr.)的Genetics Computer Group的威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过目视检查(一般参见Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编辑,CurrentProtocols,Greene Publishing Associates,Inc.与John Wiley&Sons,Inc.之间的合资公司,(1995年增刊)(Ausubel))。
适合确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定询问序列中长度W的短字码来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字码在与数据库序列中相同长度的字码比对时匹配或符合某个正值阈值得分T。T被称为相邻字码得分阈值(Altschul等人,同上)。这些初始相邻字码命中用作开始搜索的种子，以发现含有它们的较长HSP。然后沿每个序列在两个方向上延长字码命中，只要可以增加累积比对得分即可。
对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最大达成值下降数量X时；在累积得分由于一个或多个负评分残基比对的积累而变为零或以下时；或在到达任一序列的末端时，停止每个方向上的字码命中延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认设置。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10以及BLOSEIM62评分矩阵作为默认设置(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.ETSA 89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat.Acad.Sci.ETSA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性量度是最小总和概率(P(N))，它提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则核酸被认为与参考序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的进一步指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性，如下所述。因此，例如，在一个多肽和第二多肽的区别仅在于保守取代的情况下，这两个肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。
如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有如下常识，即核酸是多核苷酸，多核苷酸可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段(即，使用普通克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列)和通过合成手段。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体的短链以及在本领域中通常称为蛋白质的有许多类型的长链。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用的术语“抗原结合片段”是指含有与目标抗原结合的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段，在本文所述的特别优选的实施方案中，所述抗原是C-C基序趋化因子受体8(CCR8)。在这方面，本文所述的抗体的抗原结合片段可以包含来自结合CCR8的抗体的本文阐述的VH和/或VL序列的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个CDR。本文所述的CCR8特异性抗体的抗原结合片段能够与CCR8结合。在其他实施方案中，抗原结合片段的结合防止或抑制一种或多种CCR8配体与CCR8受体的结合，从而中断原本将由配体与受体结合引起的生物学反应。在某些实施方案中，抗原结合片段与CCR8特异性结合和/或抑制或调节CCR8的生物学活性。
术语“抗原”是指如下分子或分子的一部分，其能够被选择性结合剂(诸如抗体)结合并且另外能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何决定簇，优选多肽决定簇。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，说所述抗体特异性结合抗原。根据某些实施方案，在抗体-抗原结合的平衡解离常数小于或等于10-6M或小于或等于10-7M或小于或等于10-8M时，可以说抗体特异性结合抗原。在一些实施方案中，平衡解离常数可以小于或等于10- 9M或小于或等于10-10M。
使用术语“载体”来指代用于将编码信息转移到宿主细胞中的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适合转化宿主细胞并且含有指导和/或控制***的异源核酸序列的表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于诸如转录、翻译和RNA剪接(如果存在内含子的话)等过程。
C-C基序趋化因子受体8(CCR8)
CCR8(以前也称为Cy6、CKR-L1或TER1)是一种在胸腺、脾脏等中表达的G蛋白偶联的7次跨膜CC趋化因子受体蛋白。编码该蛋白质的基因位于人类染色体3p21上。“人CCR8”由355个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。已知CCL1是CCR8的内源性配体。人CCR8 cDNA由GenBank ACC编号M_005201.3表示的核苷酸序列构成，并且小鼠CCR8 cDNA由GenBank ACC编号NM_007720.2表示的核苷酸序列构成。
本发明的CCR8包括来源于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猪和灵长类哺乳动物(包括猴和人)的那些。人CCR8是优选的。
抗体
本发明总体上涉及分离的抗CCR8抗体、编码所述抗体的核酸和表达载体、含有所述载体的重组细胞以及包含所述抗体的组合物。还提供了制备所述抗体的方法以及使用所述抗体治疗包括癌症在内的疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种期望的功能特性，包括但不限于与CCR8的高亲和力结合、对CCR8的高特异性以及当单独施用或与其他抗癌疗法组合施用时在有需要的受试者和动物模型中抑制肿瘤生长的能力。
在一个一般方面，本发明涉及特异性结合CCR8的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”在广义上使用并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括单克隆或多克隆的人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及抗体片段。一般来讲，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是熟知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，免疫球蛋白可以被归为五个主要类别(即，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG被进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以属于五种主要类别或相应亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于恒定结构域的氨基酸序列，脊椎动物物种的抗体轻链可以被归为两种明显不同的类型(即κ和λ)中的一种。因此，本发明的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构域。根据特定实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，所述轻链可变区和重链可变区各自含有三个结构域(即，互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域可替代地被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且重链可变区结构域可替代地被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
另外，本公开的抗体的范围还包括多种形式，例如选自Fv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和xFab等抗体片段。本公开的抗体的范围还包括其衍生形式，例如多特异性抗体，或抗体进一步与其他试剂连接的抗体衍生物例如抗体-药物缀合物(ADC)，等。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与CCR8特异性结合的分离的抗体基本上不含不与CCR8结合的抗体)。另外，分离的抗体基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的各个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变外。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组DNA方法来制备。例如，单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(诸如转基因小鼠或大鼠)获得的B细胞。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如像双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv1)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体部分形成的多特异性抗体、驼源化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段所结合的相同抗原结合。根据实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd区段。根据其他实施方案，抗原结合片段包括Fab和F(ab')。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域的常规单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单结构域抗体”是指本领域的常规单结构域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指如下非人抗体，其经过修饰以增加与人抗体的序列同源性，使得保留抗体的抗原结合特性，但是其在人体内的抗原性降低。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链的可变区通常都对应于来源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区对应于来源于另一个哺乳动物物种(例如，人)的抗体的序列，以避免在该物种中引发免疫反应。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚蛋白的不同亚基))上。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两种抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚蛋白的不同亚基))上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方案中，第一表位位于CCR8上，并且第二表位位于PD-l、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD47、CD73、爱帕琳肽(apelin)、DLL3、密封蛋白l8.2、TIP-l、CD3和/或其他肿瘤相关免疫抑制因子或表面抗原上。
如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”意指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体也可以与来自一个或多个物种的该抗原结合。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个例子中，与抗原特异性结合的抗体也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”可以用于指代抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以意味着所述相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合至特定蛋白质结构，而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A(或游离的未标记的A)的分子的存在将减少与所述抗体结合的标记的A的量。
在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括分别***在重链与轻链框架区(FR)组之间的重链和轻链CDR组，所述框架区为CDR提供支持并限定CDR相对于彼此的空间关系。如本文所用，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包括来自重链和轻链V区各自的CDR集。包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。对许多抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明，CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛的接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
如本文所用，术语“FR组”是指作为重链或轻链V区的CDR组的CDR的框架的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，特别是直接与CDR相邻的FR残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列都含有约90个氨基酸残基的内部二硫化物环。在V区折叠成结合位点时，CDR显示为形成抗原结合表面的突出环基序。通常公认的是，存在FR的保守结构区，其影响CDR环折叠形状成某些“典范”结构，而不管精确的CDR氨基酸序列如何。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链和轻链的相互作用的非共价结构域间接触。
免疫球蛋白可变区的结构和位置可以通过参考以下来确定：Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,USDepartment of Healthand Human Services,1987及其更新版(现在可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得)，Chothia、AbM和IMGT(参见例如Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997)ImMunoGenTics(IMGT)numbering(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。抗原结合位点的定义还描述于以下文献中：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121-153(1991)；和Rees等人,SternbergM.J.E.(编辑),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。例如，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基被编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基被编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基被编号为大约26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基被编号为大约27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据Kabat编号)。根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align来确定抗体的CDR区。除非另外指定，否则根据IMGT编号方案确定本文公开的CDR和框架区的位置。
如本文所用的“抗体重链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中的较大者。来自任何脊椎动物物种的重链都可以被归为五种不同类别(或同种型)中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别也分别被指定为α、δ、ε、γ和μ。基于序列和功能的差异，IgG和IgA类别被进一步分为亚类。人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
如本文所用的“抗体轻链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用的术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由如本文所述的噬菌体表达的抗体。所述术语还应当被解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子(并且所述DNA分子表达抗体蛋白)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用本领域可用且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
本发明的抗体可以在其N末端或C末端与另外的蛋白质融合(Clinical CancerResearch,2004,10,1274-1281)。待融合的蛋白质可以由本领域技术人员适当地选择。
在优选实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的多肽序列分别如SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9所示，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR8、优选人CCR8，其中根据Kabat编号方案确定CDR的位置。
根据另一个特定方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:10至少约85％、优选至少约90％、更优选至少约95％或更多(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO:11至少约85％、优选至少约90％、更优选至少约95％或更多(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守变体，保守变体意指与本发明的抗体的氨基酸序列相比，有最多10个、优选最多8个、更优选最多至5个、最优选最多3个氨基酸被具有相似或相似特性的氨基酸替换以形成多肽。优选地通过根据表A的氨基酸取代产生这些保守变体多肽。
表A
本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员将理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下改变(例如，替换、缺失、***等)蛋白质的编码序列。因此，本领域技术人员将理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
多核苷酸、载体、宿主细胞和制备方法
本发明还提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码本文公开的任何一种抗体。在一些实施方案中，本文公开了编码与CCR8结合的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或抗体片段包含具有SEQ ID NO:7、8和9中所示的氨基酸序列的三个轻链CDR；和/或具有SEQ ID NO:4、5和6中所示的氨基酸序列的三个重链CDR。在一些实施方案中，本文公开了编码与CCR8结合的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或抗体片段包含具有SEQ ID NO:7、8和9中所示的氨基酸序列的三个轻链CDR；和具有SEQ ID NO:4、5和6中所示的氨基酸序列的三个重链CDR。在一些实施方案中，本文公开了编码与CCR8结合的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或抗体片段包含具有选自以下的多肽序列的重链可变区和轻链可变区：SEQ ID NO:10和11。
本发明还提供了载体，所述载体包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。可以使用本领域技术人员鉴于本公开文本已知的任何载体，诸如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可以包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够将核酸递送至细胞的许多表达载体是本领域已知的并且可以在本文中用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可以用于产生根据本发明的实施方案的重组表达载体。此类技术是本领域技术人员鉴于本公开文本熟知的。
本发明还提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。本领域技术人员鉴于本公开文本已知的任何宿主细胞都可以用于本发明的抗体或其抗原结合片段的重组表达。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44细胞、293F细胞、CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据实施方案，通过常规方法(诸如化学转染、热激或电穿孔)将重组表达载体转化到宿主细胞中，在所述宿主细胞中，它被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得有效表达重组核酸。
本发明还提供了产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或细胞培养物(例如，从上清液)中回收所述抗体或其抗原结合片段。可以从细胞中收获表达的抗体或其抗原结合片段，并且根据本领域已知的常规技术且如本文所述进行纯化。
如本领域技术人员将理解的，多核苷酸可以包括表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等的基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及较小工程化基因区段。此类区段可以是天然分离的或由技术人员合成修饰。
如技术人员也将认识到的，多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包括含有内含子并以一对一方式对应于DNA分子的hnRNA分子和不含有内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于根据本公开文本的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其他分子和/或支持材料连接。多核苷酸可以包含天然序列或可以包含编码这样的序列的变体或衍生物的序列。
通常，多核苷酸变体将含有一个或多个取代、添加、缺失和/或***，优选地使得由变体多核苷酸编码的抗体的结合亲和力相对于由本文具体阐述的多核苷酸序列编码的抗体基本上不减弱。
本文所述的多核苷酸或其片段(无论编码序列本身的长度如何)可以与其他DNA序列(诸如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等)组合，使得它们的总长度可能相差很大。因此，预期可以采用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受到制备和在预期的重组DNA方案中使用的容易性的限制。例如，预期总长度为约10000、约5000、约3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有中间长度)的说明性多核苷酸区段是有用的。
位点特异性诱变允许通过如下方式来产生突变体：使用编码所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸，以提供大小和序列复杂性足够的引物序列，从而在被穿过的缺失连接的两侧形成稳定的双链体。可以在所选择的多核苷酸序列中采用突变以改善、改变、减少、修饰或以其他方式改动多核苷酸本身的特性，和/或改变编码的多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是指非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应。在优选实施方案中，此类细胞是人细胞。虽然不希望限于任何特定的作用机制，但这些介导ADCC的细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)中。为了评估分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和NK细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如，在动物模型中，诸如Clynes等人,PNAS(USA),95:652-656(1998)中公开的动物模型)评估目标分子的ADCC活性。
“效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。在优选实施方案中，效应细胞是人细胞。
使用术语“Fc受体”或“FcR”来描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在其胞质结构域方面不同的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetech和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods,4:25-34(1994)；和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来要鉴定的那些。所述术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人,Immunol.,117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.,24:249(1994))。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
补体依赖性细胞毒性(CDC)是指分子在补体的存在下启动补体激活和裂解靶标的能力。通过使补体***的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如，抗体)结合来启动补体激活途径。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如如Gazzano-Santaro等人,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
抗体-药物缀合物(ADC)
本发明还提供了基于根据本发明的抗体的抗体-药物缀合物(ADC)。
通常，抗体-药物缀合物包含抗体和效应分子，其中所述抗体与所述效应分子缀合，并且化学缀合是优选的。优选地，效应分子是治疗活性药物。另外，效应分子可以是毒性蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
根据本发明的抗体和效应分子可以通过偶联剂偶联。偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链和利用二硫键的偶联剂中的任何一种或多种。非选择性偶联剂是指使效应分子与抗体之间经由共价键连接的化合物，诸如戊二醛等。利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐偶联剂(诸如顺乌头酸酐)和酰腙偶联剂(偶联位点为酰腙)中的任何一种或多种。
使用抗体上的某些残基(诸如Cys或Lys等)来连接多种官能团，包括显像剂(诸如发色团和荧光团)、诊断剂(诸如MRI造影剂和放射性同位素)、稳定剂(诸如聚(乙二醇))和治疗剂。抗体可以与功能剂缀合以形成抗体-功能剂的缀合物。功能剂(例如，药物、检测试剂、稳定剂)与抗体缀合(共价连接)。功能剂可以直接或经由接头间接与抗体连接。
抗体可以与药物缀合以形成抗体-药物缀合物(ADC)。通常，ADC包含药物与抗体之间的接头。接头可以是可降解或不可降解接头。通常，可降解接头在细胞内环境中容易降解，例如，接头在靶位点处降解，从而从抗体中释放药物。合适的可降解接头包括例如酶可降解接头，包括可以被细胞中的蛋白酶(例如，溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)降解的含肽基接头；或糖接头，例如可以被葡糖醛酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括例如二肽，诸如缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸或缬氨酸-丙氨酸。其他合适的可降解接头包括例如pH敏感接头(例如，在低于5.5的pH下水解的接头，诸如腙接头)和在还原条件下降解的接头(例如，二硫键接头)。不可降解接头通常在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
在连接到抗体之前，接头具有能够与某些氨基酸残基反应的反应基团，并且通过反应基团实现连接。硫醇特异性反应基团是优选的，其包括例如马来酰亚胺化合物、卤化(例如，碘、溴或氯取代)酰胺、卤化(例如，碘、溴或氯取代)酯、卤化(例如，碘、溴或氯取代)甲基酮、苄基卤化物(例如，碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、汞衍生物(诸如3,6-二-(汞甲基)二噁烷，其中抗衡离子为CH3COO-、Cl-或NO3 -)和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括例如经由硫代琥珀酰亚胺与抗体连接的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制药物。在一个实施方案中，抗体经由接头与药物连接，并且药物具有可以与接头形成键的官能团。例如，药物可以具有可与接头形成键的氨基、羧基、硫醇基、羟基或酮基。在药物直接与接头连接时，药物在与抗体连接之前具有反应基团。
有用的药物包括例如抗微管蛋白药物、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂、抗生素、叶酸拮抗剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物的例子包括例如DNA小沟结合剂、DNA烷化剂和微管蛋白抑制剂；典型的细胞毒性药物包括例如澳瑞他汀(auristatin)、喜树碱、多卡霉素(docamycin/duocarmycin)、依托泊苷、美登素和美登素类化合物(例如，DM1和DM4)、紫杉烷、苯二氮卓或含有苯二氮卓的药物(例如，吡咯并[1,4]苯二氮卓(PBD)、吲哚啉并苯二氮卓(indolinobenzodiazepine)和噁唑烷并苯二氮卓(oxazolidinobenzodiazepine))和长春花生物碱。
在本发明中，药物-接头可以用于在简单的步骤过程中形成ADC。在其他实施方案中，双功能接头化合物可以用于在两步或多步过程中形成ADC。例如，在第一步骤中使半胱氨酸残基与接头的反应部分反应，然后在随后的步骤中使接头上的官能团与药物反应，从而形成ADC。
一般来讲，这样选择接头上的官能团使得其可以与药物部分上的合适反应基团特异性反应。作为非限制性例子，基于叠氮化物的部分可以用于与药物部分上的反应炔基特异性反应。药物通过叠氮化物与炔基之间的1,3-偶极环加成与接头共价结合。其他有用的官能团包括例如酮和醛(适合与酰肼和烷氧基胺反应)；膦类化合物(适合与叠氮化物反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺和醇反应)；和活化酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺和醇反应)。这些和其他连接策略(例如，描述于Bioconjugation Technology(第2版(Elsevier))中的那些)是本领域技术人员熟知的。本领域技术人员可以理解，在选择互补对的反应官能团用于药物部分与接头之间的选择性反应时，互补对的每个成员都可以用于接头，并且也可以用于药物。
本发明进一步提供了用于制备ADC的方法，所述方法可以进一步包括：在足以形成抗体-药物缀合物(ADC)的条件下，使抗体与药物-接头化合物结合。
在某些实施方案中，根据本发明的方法包括：在足以形成抗体-接头缀合物的条件下，使抗体与双功能接头化合物结合。在这些实施方案中，根据本发明的方法进一步包括：在足以经由接头将药物部分与抗体共价连接的条件下，使抗体-接头缀合物与药物部分结合。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物(ADC)具有如下的式：Ab-(L-D)p，
其中：
Ab是抗体；
L是接头；
D是药物；且
p是载荷，选自1至8的值(例如整数)。
药物组合物和其他用途
CCL1/CCR8信号传导是包括癌症、炎性疾病和糖尿病性神经病等在内的几种疾病的发病机制中的重要途径。特别地，本文所述的抗体以出乎意料的高亲和力与CCR8特异性结合。已知CCR8+Treg细胞对肿瘤逃逸机制有益。在一些方面，本文提供了通过抑制由CCR8+Treg细胞等介导的免疫抑制来降低受试者体内存在的肿瘤中肿瘤浸润性调节性T细胞(TITR)的数量或活性的方法，并且提供了用于经由这种机制治疗癌症的药物组合物。这样的癌症包括但不限于与预后不良相关的乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌和许多其他癌症类型。在一些方面，本文提供了通过向受试者施用抗CCR8抗体来增加受试者肿瘤中T效应细胞的量的方法。细胞毒性可以是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。药剂可以是抗体(例如，肽)小分子、蛋白质药物缀合物或干扰核酸。另外，本发明还可以调节CCL1/CCR8轴，从而可能治疗诸如糖尿病性神经病、脊髓损伤和IgG4相关疾病(诸如硬化性胆管炎(ISC))等疾病。说明性抗体或其抗原结合片段或它们的互补决定区(CDR)的氨基酸序列。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂。如本文所用的术语“药物组合物”意指包含本发明的活性成分以及药学上可接受的载剂的产品，其中活性成分选自：第一方面中的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二方面中的重组蛋白、第三方面中的分离的核酸(尤其是DNA或RNA)、第四方面中的载体、第六方面中的抗体缀合物、第七方面中的免疫细胞或它们的组合。本发明的活性成分和包含它们的组合物还可用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。
如本文所用的术语“治疗”疾病是指降低受试者所经历的疾病或障碍的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
所施用的量将取决于诸如待治疗的疾病或适应证的类型和程度、患者的整体健康状况、抗体的体内效力、药物配制品、抗体的血清半衰期和施用途径等变量。
施用频率可以根据诸如施用途径、剂量、抗体或融合蛋白的血清半衰期和所治疗的疾病等因素而变化。
在一些实施方案中，本发明的抗体用于非治疗目的，诸如诊断测试和测定。例如，抗体可用于确定来自受试者的样品中的CCR8水平。提供了通过使样品与本发明的CCR8特异性抗体接触并检测样品中抗体与CCR8之间的免疫反应性的方法。
检测应用和试剂盒
根据本发明的抗体或其ADC可以用于检测应用中，例如用于在检测样品中使用以提供诊断信息。
在本发明中，所使用的标本(样品)包括细胞、组织样品和活检标本。在本发明中使用的术语“活检”应当包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此，在本发明中使用的活检标本可以包括例如肿瘤的切除样品以及通过内窥镜方法或器官的穿刺或针穿刺活检制备的组织样品。
在本发明中使用的样品包括固定或保存的细胞或组织样品。
本发明进一步提供了试剂盒，所述试剂盒仅包含根据本发明的抗体(或其片段)；在本发明的一个优选例子中，所述试剂盒进一步包括容器、说明书、缓冲液等。在优选例子中，根据本发明的抗体可以固定在测试板上。
根据本发明的另一方面，通过检测样品中CCR8蛋白的存在或量来诊断受试者的CCR8介导的疾病。
本发明提供了用于预测或诊断癌症预后的试剂盒，所述试剂盒包含抗CCR8抗体。本发明的试剂盒可以进一步包含本领域已知的用于ELISA的工具和/或试剂。如果需要，本发明的试剂盒可以进一步包含用于混合各种组分的管、孔板、描述如何使用的说明手册等。
实施例
通过参考以下实施例来进一步描述本发明。应当理解，以下实施例仅用于描述本发明，而不是限制本发明的范围。以下实施例中的未指示具体条件的实验方法通常根据常规条件来进行，所述常规条件例如Sambrook等人,Molecular Cloning:Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件或制造商推荐的条件。
实施例1：小鼠抗CCR8抗体的生成
小鼠免疫
为了生成针对CCR8的抗体，给来自不同品系(BALB/c、C57BL/6、SJL和MRL/lpr)的总共50只成年雌性小鼠免疫接种不同免疫原组合(包括：人CCR8表达的质粒，huCCR8 DNA；过表达人CCR8的L929细胞，L929-huCCR8；和过表达食蟹猴CCR8的L929细胞，L929-cynoCCR8)。人、食蟹猴和小鼠CCR8蛋白序列如表1中SEQ ID NO:1至3所示。如先前所述(Jiang et al.,J.Virol.2017Apr 13；91(9):e02052-16)，人CCR8表达质粒(huCCR8 DNA)(每只小鼠50μg)使用EPT-I递送装置(TERESA，中国上海)通过体内电穿孔进行肌肉内递送。L929-huCCR8和L929-cynoCCR8细胞(每只小鼠5×106个细胞)进行腹膜内注射。通常，进行间隔三周的5-7次免疫接种以诱发有力的抗CCR8体液免疫应答。在每次免疫接种后第14天，收集血液，并通过FACS测定针对过表达人CCR8的293T细胞(293T-huCCR8)和过表达食蟹猴CCR8的293T细胞(293T-cynoCCR8)的血清滴度。选择具有足够水平的抗CCR8血清抗体的动物进行最终强化。
用Beacon Optofluidic***筛选浆细胞
在最终强化后3-5天，收集脾脏并捣碎成单细胞悬浮液。依照制造商的说明书，用小鼠CD138阳性选择试剂盒(STEMCELL)分离血浆细胞。依照制造商的说明书，将密度为6.25×106/ml的富集浆细胞导入通道并放入OptoSelect 14K芯片的NanoPen室(BerkeleyLights)。为了筛选huCCR8特异性浆细胞，将密度为1×108/ml的293T-huCCR9细胞和浓度为5μg/ml的Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch)导入通道。导入后，打开冷冻阀，并将Alexa Fluor 647荧光团的CY5通道的暴露时间设置为3000ms。通过设置为6分钟时段和10个周期的延时成像捕获花样阳性信号。在用293T-huCCR8细胞完成huCCR8特异性浆细胞筛选后，用293T-cynoCCR8细胞筛选cynoCCR8特异性浆细胞。将针对293T-huCCR8和293T-cyoCCR8细胞二者显示阳性信号的浆细胞分别输出到填充有裂解缓冲液的96孔板中。
实施例2：抗体VH和VL基因克隆、测序和嵌合抗体表达
依照制造商的说明书，使用Opto Plasma B Discovery cDNA合成试剂盒(Berkeley Lights)合成cDNA第一链并扩增总cDNA。依照制造商的说明书，使用OptoPlasma B Discovery Sanger Prep试剂盒(Berkeley Lights)扩增抗体VH和VL基因。将扩增的VH和VL基因分别克隆到含有人IgG1和κ恒定区基因的哺乳动物表达载体中。嵌合抗体Ch308的3个HCDR、3个LCDR、VH和VL的氨基酸序列以及VH和VL的DNA序列如表1中SEQ ID NO:4-13所示。用Expi293TM细胞表达嵌合抗体，并通过亲和层析进行纯化。
表1：序列
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实施例3：抗CCR8抗体的结合亲和力和特异性的测定
为了测定结合亲和力，将纯化的抗CCR8嵌合抗体在EasySepTMBuffer(购自STEMCELL Technologies)连续稀释，抗体首浓度200nM，经4倍梯度稀释，浓度分别200nM、50nM、12.5nM、3.125nM、0.781nM、0.195nM、0.0488nM、0.0122nM。将上述抗CCR嵌合抗体与293T-huCCR8或293T-cynoCCR8细胞一起于4℃温育30分钟，以50μL/孔上述梯度稀释抗体加入1E5/孔的上述细胞中。用FACS缓冲液清洗两次后，每孔添加1:1000稀释的Alexa Fluor647TM山羊抗人IgG二抗50μl(购自Jackson ImmunoResearch，Cat.Log.No.109-605-098)，并在黑暗中于4℃温育30分钟。用FACS缓冲液清洗两次后，用FACS缓冲剂重悬浮细胞(细胞密度是1E6/mL)，并在LSR FortessaTM细胞分析仪(Beckton Dickinson)上采集数据。使用来自GraphPad(1995-2022 GraphPad Software,LLC，版本号：Prism 9)的非线性拟合的S型剂量-应答生成滴定曲线。嵌合抗体Ch308的EC50如表2所示。
表2：抗CCR8抗体针对293T-huCCR8和293T-cynoCCR8细胞的EC50(nM)
克隆 针对293T-huCCR8的EC50 针对293T-cynoCCR8的EC50
Ch308 1.54 1.53
为了测定非特异性结合，将纯化的抗CCR8嵌合抗体在EasySepTMBuffer中稀释至50nM，并将50μl/孔的上述稀释抗体与1E5/孔的293T-huCCR1、293T-huCCR4和293T亲本细胞一起于4℃温育30分钟。用FACS缓冲液清洗两次后，每孔添加1:1000稀释的Alexa Fluor647TM山羊抗人IgG二抗50μl，并在黑暗中于4℃温育30分钟。用FACS缓冲液清洗两次后，用FACS缓冲剂重悬浮细胞(细胞密度是1E6/mL)，并在LSR FortessaTM细胞分析仪上采集数据。嵌合抗体Ch308未显示针对293T-huCCR1、293T-huCCR4或293T亲本细胞的非特异性结合。
实施例4：抗CCR8抗体增强NK细胞介导的细胞毒性
建立了基于Nano-Glo萤光素酶测定法的ADCC测定法，用来探索抗CCR8抗体是否能杀死表达CCR8的靶细胞。
简言之，从PBMC中分离原代NK细胞作为效应细胞。通过将CCR8和NanoLuc萤光素酶基因共转导到CHO-K1细胞系(ATCC)中，产生CHO-K1-NanoLuc-CCR8细胞系作为靶细胞。将100微升/200,000个效应细胞与11.1微升的10倍的抗CCR8抗体的稀释系列(最高终浓度100nM，4倍稀释，共7个浓度点)或11.1微升的10倍的对照人IgG(最高终浓度100nM，4倍稀释，共7个浓度点)一起于37℃预温育2小时。然后，添加100微升/4000个靶细胞并充分混合(效应细胞：靶细胞＝50：1)。设置单独的靶细胞孔(4000个靶细胞，222.2微升)，单独的效应细胞孔(200000个效应细胞，222.2微升)以及单独的培养基孔(222.2微升)作为对照。温育5小时后，将10X裂解缓冲液(普洛麦格，货号G1821)24.6微升添加到靶细胞对照孔(即靶细胞最大裂解孔)以及培养基对照孔(即培养基裂解孔)中，并于37℃温育45分钟。将细胞混合物于4℃以2000rpm离心5分钟，并使用萤光素酶测定***(Promega)评估细胞毒性。
如表3所示，测试的抗CCR8嵌合抗体具有有力的ADCC活性，EC50小于1nM。
结果是使用以下公式计算的：
表3：抗CCR8抗体的细胞毒性的比较
抗体 EC50(nM) Emax(％)
Ch308 0.03 60.29
hIgG ＞100 -
应当理解，在阅读本发明所教导的内容后，本领域技术人员可以对本发明进行各种修改和改变，并且这些等效方案也落入权利要求所限定的范围内。

Claims (24)

1.一种特异性结合人CCR8的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区（VH），所述重链可变区包含如SEQ ID NO：4所示的CDR-H1，如SEQ ID NO：5所示的CDR-H2，如SEQ ID NO：6所示的CDR-H3；和
轻链可变区（VL），所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：7所示的CDR-L1，如SEQ ID NO：8所示的CDR-L2，和如SEQ ID NO：9所示的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：与SEQ ID NO：10具有至少95%序列同一性的VH和与SEQ ID NO：11具有至少95%序列同一性的VL。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：如SEQ ID NO：10所示的VH和如SEQ ID NO：11所示的VL。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
如SEQ ID NO：14所示的重链恒定区和如SEQ ID NO：15所示的轻链恒定区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链恒定区，所述重链恒定区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链恒定区，所述轻链恒定区来自λ轻链或κ轻链。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为全长抗体。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为选自Fv、scFv、Fab、Fab'和F(ab')2的抗体片段。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体或人源化抗体。
10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为多特异性抗体。
11.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其包含：SEQ ID NO：12和/或13。
13.一种载体，其包含根据权利要求11或12所述的多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的载体，其为质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒或病毒。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求11或12所述的多核苷酸或根据权利要求13或14所述的载体。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其为真核细胞。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其为CHO细胞。
18.根据权利要求15所述的宿主细胞，其为原核细胞。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。
20.一种生成抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(a)在适合于表达该抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求15-19任一项所述的宿主细胞，并
(b)任选地，回收该抗体或其抗原结合片段。
21.一种缀合物，其包含根据权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
22.一种组合物，其包含根据权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求11或12所述的多核苷酸、根据权利要求13或14所述的载体、根据权利要求15-19任一项所述的宿主细胞、或根据权利要求21所述的缀合物。
23.一种检测生物学样品中的CCR8的非诊断方法，其包括使该生物学样品与根据权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求21所述的缀合物接触。
24.一种试剂盒，其包括装有根据权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求21所述的缀合物的容器。
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