CN117282120A - 一种酶解法辅助提取金花茶多糖的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物天然产物制备技术领域，具体涉及一种酶解法辅助提取金花茶多糖的工艺。主要包括以下步骤：（1）将金花茶粉碎过20目筛；（2）取金花茶粉末加入已调节好pH值的枸橼酸‑枸橼酸钠缓冲溶液，充分搅拌均匀；（3）在混入金花茶后的缓冲液中加入含纤维素酶：果胶酶的复合酶进行酶解；（4）酶解后转移至适应容器中，加热回流提取，过滤，滤液浓缩；（5）浓缩液中加入乙醇，搅拌均匀，4℃环境下静置，离心，收集沉淀物，挥去乙醇，真空干燥，即得。测定多糖含量并计算提取率，结果金花茶多糖提取率为4.93％‑5.23％，与传统的水提醇沉工艺相比，有效提高了金花茶粗多糖的提取率。
Description
技术领域
本发明属于金花茶多糖的提取技术领域，尤其涉及一种酶解法辅助提取金花茶多糖的工艺。
背景技术
金花茶(Camellia chrysantha ( Hu) Tuyama)为山茶科、山茶属常绿灌木或小乔木，以其茶花家族中唯一花瓣金黄色的珍稀物种而著名于世，其花金黄色，蜡质光泽，显得珍贵高雅，享有“茶族皇后”、“植物界大熊猫”之美誉。2010年金花茶被批准成为“新资源食品”，食用部位为叶。2021年，广西食品安全地方标准《金花茶花》颁布实施，金花茶产业标准体系得以健全，更进一步促进了金花茶产业的发展。
金花茶具有清热解毒，利尿消肿的功效，用于咽喉炎、痢疾、肾炎、水肿、***、黄疸型肝炎、肝硬化腹水、高血压、疮疡、预防肿瘤。研究表明金花茶的花、叶中含有黄酮、多糖、皂苷、茶多酚、维生素、氨基酸等多种生理活性物质，同时还含有丰富的天然有机锗、硒和锌等多种有益于人体健康的微量元素，其中金花茶多糖已被证实具有保肝、降血脂、抗氧化活性等功能。
由于金花茶叶片细胞壁的结构紧密，叶片有很厚的蜡质层，使得提取金花茶叶内活性成分变得比较困难，所以如何高效提高金花茶中活性成分的提取得率是近些年金花茶研究的热点之一。例如江南大学的王元凤等（王元凤，魏新林，王登良，等.金花茶叶酶法提取工艺条件的研究[J].无锡轻工业大学学报，2001,20(6):582-593.）研究金花茶中有效成分添加外源酶提取工艺，在料液比为1:100，0.4%的加酶量、pH值为5.0~5.5、温度50~55℃、时间120min的最佳提取工艺条件下，金花茶叶提取率提高了39.47%，有效成分可溶性糖和氨基酸含量增加了7.39%和1.84%，Fe、Zn、Se、Mn、等矿质元素的浸出率都在95%以上。韦璐等（韦璐，秦小明，黄日秋，等.超声波提取金花茶多糖的工艺研究[J].食品科技，2007，(11):100-102.）通过单因素和正交实验研究探讨了超声波提取金花茶多糖的最佳工艺，在超声波频率为53.2kHz、温度80℃、料液比1:50、时间1.0h的最佳提取工艺条件下，多糖的得率提高到3.1%，比时传统浸提法提高了1.0%。许子竞等（许子竞，廖敏富，陈海燕，等.金花茶叶多糖超声波辅助提取工艺优化和含量测定[J].食品科学，2010，31(4):53-58.）采用响应面分析法对金花茶叶多糖提取工艺进行了优化研究，最终确定最佳提取工艺条件为水料比46:1(mL/g)、温度87℃、提取时间54min、共提3次，测得金花茶叶多糖提取率为4.39%。
专利ZL 201510705138.6（金花茶多糖的提取方法）公开了一种金花茶多糖的提取方法，该方法主要步骤为采用水提醇沉法得沉淀物，用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物后加水溶解，使用蛋白酶进行酶解，超声处理酶解液，然后经截留分子量为18000～28000的透析袋透析，取保留液经截留分子量为400000～500000的透析袋透析，取透过液浓缩，经醇沉、洗涤、溶解、活性炭脱色、过滤、干燥，得金花茶多糖。经检测，终产物的纯度为98.8％以上。专利201510707904.2（从金花茶叶中提取多糖的方法）公开了一种金花茶多糖的提取方法，该方法主要步骤为采用水提醇沉法得沉淀物，用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物后加水溶解，使用蛋白酶进行酶解，超声处理酶解液，然后经截留分子量为14000的透析袋透析，取保留液经截留分子量为450000的透析袋透析，取透过液浓缩，经醇沉、洗涤、溶解、活性炭脱色、过滤、干燥，得金花茶多糖。经检测，终产物的纯度为 98.6％以上。上述两项工艺所得金花茶多糖纯度较高，但工艺过于复杂，不利于工业化生产。
综上所述，如何提供一种低成本、高效率的金花茶多糖制备方法已成为金花茶多糖制备领域亟待解决的问题之一。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种酶解法辅助提取金花茶多糖的工艺。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：
一种酶解法辅助提取金花茶多糖的工艺，其包括以下步骤：
（1）将金花茶粉碎；
（2）取金花茶粉末加入适量已调节好pH的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，充分搅拌均匀；
（3）在混入金花茶后的缓冲液中加入纤维素酶及果胶酶进行酶解；
（4）酶解后转移至适应容器中，加热回流提取，过滤，浓缩；
（5）浓缩液中加入乙醇，搅拌均匀，静置，离心，收集沉淀物，浓缩，干燥，即得金花茶粗多糖。
所述步骤（1）为取金花茶叶，粉碎过20目筛；
所述步骤（2）中枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液的pH为4.0～7.0，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:6～1:12；
所述步骤（2）优选为枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液的pH为5.0～6.0，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8～1:10；
所述步骤（2）进一步优选为枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液的pH为5.0，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；
所述步骤（3）的酶解条件为加入纤维素酶、果胶酶按1～:1～3组合的复合酶，酶解温度为30～50℃，酶解时间为1～5小时，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为1/1000～4/1000；
所述步骤（3）的酶解条件优选为为加入纤维素酶、果胶酶按2:1组合的复合酶，酶解温度为40～50℃，酶解时间为1～3小时，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为2/1000～3/1000；
所述步骤（3）的酶解条件优选为为加入纤维素酶、果胶酶按2:1组合的复合酶，酶解温度为50℃，酶解时间为2小时，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为3/1000；
所述步骤（4）加热回流提取时间为1～3小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.10～1.30（温度为60℃）；
所述步骤（4）优选为加热回流提取时间为1～2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.10～1.20（温度为60℃）；
所述步骤（4）优选为加热回流提取时间为2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.15～1.20（温度为60℃）；
所述步骤（5）加入乙醇使溶液含醇量达70～90%，搅拌均匀，于4℃环境中静置12h～24h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；60～80℃真空干燥，即得。
所述步骤（5）优选为加入乙醇使溶液含醇量达80～85%，搅拌均匀，于4℃环境中静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。
本发明的有益效果为：本发明具有操作简单、提取加液量少、易干燥、耗时短、提取率高的特点，有利于进一步进行有关药品、保健食品、食品、日化用品、高级饲料等的制备。
具体实施方式
实施例1，本实施例提供的一种酶解法辅助提取金花茶多糖的工艺。
1.1实验材料
金花茶叶，购自广西桂人堂金花茶产业集团股份有限公司；纤维素酶、果胶酶均购自南宁庞博生物工程有限公司；D-无水葡萄糖对照品购自中国食品药品检定研究院。
1.2实验方法与结果
1.2.1评价指标选择
1.2.1.1多糖的含量测定(紫外分光光度法)
多糖对照品溶液的制备取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每lml含90μg的溶液，即得。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置10ml具塞试管中，各加水补至1.0ml，精密加入5％苯酚溶液lml(临用配制)，摇匀，再精密加硫酸5ml，摇匀，置沸水浴中加热20分钟，取出，置冰浴中冷却5分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约1.0g，精密称定，加水80ml，加热回流2小时，放冷，转移至100ml量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml离心管中，精密加入20ml无水乙醇，摇匀后放于4℃冰箱中，冷藏4h，取出样品后用离心机以4000r/min离心5min，小心取出离心管舍弃上清液，余下沉淀加80％乙醇洗涤2次，每次25ml，离心，弃去上清液，剩余沉淀加热水溶解，转移至25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。
测定法精密量取供试品溶液1ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液lml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得。
多糖提取率=产品中多糖总量/原料中多糖总量
1.2.2提取方法
称取粉碎过20目筛的金花茶叶50g，置于1000ml锥形瓶中，加入400ml调节好pH值的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，加入由纤维素酶、果胶酶 组成的复合酶，于一定温度的摇床中恒温酶解，规定时间内取出，酶解结束后转移至1000ml圆底烧瓶中，回流提取2h，滤过(120目筛)，滤液浓缩，转移至200ml容量瓶中，加饮用水至刻度，备用。
1.2.3复合酶法提取金花茶多糖工艺筛选
主要对影响提取的复合酶组成、酶解PH、酶用量、酶解温度、酶解时间等因素进行单因素考察，优选复合酶法辅助提取金花茶多糖的工艺。
1.2.3.1不同复合酶对金花茶多糖提取率的影响
称取粉碎过20目筛的金花茶叶5份，每份50g，加入pH为5.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；加入不同比例纤维素酶、果胶酶 （3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）进行酶解，其用量为药材质量的3/1000，酶解温度为45℃，酶解时间为2小时，酶解结束后转移至1000ml圆底烧瓶中，回流提取2h,滤过(120目筛)，滤液浓缩，转移至200ml容量瓶中，加饮用水至刻度，测定多糖的提取率，结果如表1所示。
表1 不同比例复合酶对金花茶多糖提取率的影响
表1结果显示，纤维素酶︰果胶酶 为2:1时，金花茶多糖的提取率高于其余各组，因此选择纤维素酶︰果胶酶 (2:1)进行金花茶多糖的进一步提取研究。
1.2.3.3酶解pH对金花茶多糖提取率的影响
称取粉碎过20目筛金花茶叶7份，每份50g，分别加入pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；加入纤维素酶、果胶酶 按2：1组合的复合酶进行酶解，其用量为药材质量的3/1000，酶解温度为50℃，酶解时间为2小时；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为2小时，，酶解结束后转移至1000ml圆底烧瓶中，回流提取2h,滤过(120目筛)，滤液浓缩，转移至200ml容量瓶中，加饮用水至刻度，测定多糖的提取率，结果如表2所示。
表2 不同pH值对金花茶多糖提取率的影响
表2结果显示，pH对金花茶多糖的提取率具有较显著性的影响，复合酶在pH值为5.0时金花茶多糖的提取率最大，因此可以选择酶解的pH值为5.0。
1.2.3.5温度对对金花茶多糖提取率的影响
称取粉碎过20目筛金花茶叶7份，每份50g，分别加入pH为5.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；加入纤维素酶、果胶酶 按2：1组合的复合酶进行酶解，其用量为药材质量的3/1000，酶解温度分别调节为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，酶解时间为2小时；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为2小时，，酶解结束后转移至1000ml圆底烧瓶中，回流提取2h,滤过(120目筛)，滤液浓缩，转移至200ml容量瓶中，加饮用水至刻度，测定多糖的提取率，结果如表3所示。
表3 酶解温度对金花茶多糖提取率的影响
表3结果显示，温度低于50℃时，随着温度的提升，酶的活性也随着升高，金花茶多糖的提取率也随之提高；但温度超过50℃以后，金花茶多糖的提取率反而有所下降，这可能是当温度升高到一定程度时，使得酶的活性降低，从而降低了金花茶多糖的提取率，因此可以选择酶解的温度为50℃。
1.2.3.6酶解时间对金花茶多糖提取率的影响
称取粉碎过20目筛金花茶叶5份，每份50g，分别加入pH为5.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；加入纤维素酶、果胶酶 按2：1组合的复合酶进行酶解，其用量为药材质量的3/1000，酶解温度为50℃，酶解时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h、3h；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为2小时，，酶解结束后转移至1000ml圆底烧瓶中，回流提取2h,滤过(120目筛)，滤液浓缩，转移至200ml容量瓶中，加饮用水至刻度，测定多糖的提取率，结果如表4所示。
表4 酶解时间对金花茶多糖提取率的影响
| 酶解时间（h） | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 |
| 金花茶多糖提取率（%） | 5.06 | 5.57 | 5.97 | 6.03 | 5.98 |
表4结果显示，酶解时间在大于2h后对金花茶多糖的提取率无显著性影响，复合酶在酶解时间为2h后金花茶多糖的提取率基本达到平衡，不再增加，因此可以选择酶解的时间为2h。
1.3醇沉过程乙醇浓度考察
称取粉碎过20目筛金花茶叶250g，加入pH为5.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；加酶进行酶解，所述酶为纤维素酶、果胶酶 按2：1组合的复合酶，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为3/1000，酶解温度为50℃，酶解时间为2小时；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.20（温度为60℃）；将浓缩液平均分成5份，分别加入95%乙醇使终浓度达70%、75%、80%、85%、90%，4℃冰箱静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。测定多糖的提取率，结果如表5所示。
表5 醇沉浓度对金花茶多糖提取率的影响
| 醇沉浓度 | 70 | 75 | 80 | 85 | 90 |
| 金花茶多糖提取率（%） | 4.33 | 4.86 | 5.17 | 4.93 | 4.17 |
表5结果显示，金花茶多糖的提取率随醇沉浓度增加呈先增后减趋势，提取率为4.33～5.17%，其中醇沉浓度为80%时多糖提取率最高，85%时其次，90%时最低。在浓度为80%时，多糖提取率达最大，表明醇沉浓度以80%为宜。原因可能是一定范围内的醇沉浓度可以降低金花茶多糖的溶解度，利于金花茶多糖的沉淀；但而当醇沉浓度过高时，会使一些杂质一起沉淀造成包裹，从而影响提取率。
1.4最优验证实验
称取粉碎过20目筛金花茶叶3份，每份500g，分别加入pH为5.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；加入纤维素酶、果胶酶按2：1组合的复合酶进行酶解，其用量为药材质量的3/1000，酶解温度为50℃，酶解时间2h；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为2小时，酶解结束后分别转移至10L圆底烧瓶中，回流提取2h，滤液浓缩至相对密度1.20（温度为60℃）；加入95%乙醇使终浓度80%，4℃冰箱静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。测定多糖的提取率，结果如表6所示。
表6 优选工艺验证实验结果
| 1 | 2 | 3 | 平均 | |
| 金花茶多糖提取率（%） | 4.93 | 5.12 | 5.06 | 5.04 |
表6结果显示，3次验证试验结果基本相近，接近于优选过程中的各试验的最大值，说明优选的条件基本稳定、合理。
实施例2
称取粉碎过20目筛的金花茶叶500g，加入6倍量pH为4.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液；加入纤维素酶、果胶酶按2：1组合的复合酶进行酶解，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为3/1000，酶解温度为45℃，酶解时间为2小时；酶解后转移至5L圆底烧瓶中，加热回流提取时间2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.15（温度为60℃），加入95%乙醇使终浓度达80%，4℃冰箱静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。测定多糖含量并计算提取率，结果金花茶多糖提取率为5.09％。
实施例3
称取粉碎过20目筛的金花茶叶500g，加入8倍量pH为5.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液；加入纤维素酶、果胶酶按2：1组合的复合酶进行酶解，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为3/1000，酶解温度为50℃，酶解时间为1.5小时；酶解后转移至10L圆底烧瓶中，加热回流提取时间2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.20（温度为60℃），加入95%乙醇使终浓度达85%，4℃冰箱静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。测定多糖含量并计算提取率，结果金花茶多糖提取率为5.23％。
对比例1
称取粉碎过20目筛的金花茶叶500g至10L圆底烧瓶中，加入8倍量纯化水加热回流提取2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.15（温度为60℃），加入95%乙醇使终浓度达80%，4℃冰箱静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。测定多糖含量并计算提取率，结果金花茶多糖提取率为2.25％。
对比例2
称取粉碎过20目筛的金花茶叶500g至10L圆底烧瓶中，加入8倍量纯化水加热回流提取2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.20（温度为60℃），加入95%乙醇使终浓度达80%，4℃冰箱静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。测定多糖含量并计算提取率，结果金花茶多糖提取率为2.34％。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种酶解法辅助提取金花茶多糖的工艺，其特征在于；所述工艺包括以下步骤：
（1）将金花茶粉碎；
（2）取金花茶粉末加入适量已调节好pH的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，充分搅拌均匀；
（3）在混入金花茶后的缓冲液中加入纤维素酶及果胶酶 进行酶解；
（4）酶解后转移至适应容器中，加热回流提取，过滤，浓缩；
（5）浓缩液中加入乙醇，搅拌均匀，静置，离心，收集沉淀物，浓缩，干燥，即得金花茶粗多糖。
2.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于：取金花茶叶，粉碎过20目筛，加入pH为4.0～7.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:6～1:12；加酶进行酶解，所述酶为纤维素酶、果胶酶 按1～3:1～3组合的复合酶，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为1/1000～4/1000，酶解温度为30～50℃，酶解时间为1～5小时；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为1～3小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.10～1.30（温度为60℃）；加入乙醇搅拌均匀，使溶液含醇量达70～90%，4℃环境下静置12h～24h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；60～80℃真空干燥，即得。
3.根据权利要求2所述的提取工艺，其特征在于：取金花茶叶，粉碎过20目筛，加入pH为5.0～6.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8～1:10；加酶进行酶解，所述酶为纤维素酶、果胶酶按2：1组合的复合酶，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为1/1000～3/1000，酶解温度为40～50℃，酶解时间为1～2小时；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为1～2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.10～1.20（温度为60℃）；加入乙醇搅拌均匀，使溶液含醇量达75～85%，4℃环境下静置12h～18h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70～80℃真空干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的提取工艺，其特征在于：取金花茶叶，粉碎过20目筛，加入pH为5.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，金花茶与缓冲溶液的比例以g/mL计为1:8；加酶进行酶解，所述酶为纤维素酶、果胶酶按2:1组合的复合酶，酶用量与金花茶重量的比例以g/g计为3/1000，酶解温度为40～45℃，酶解时间为2小时；酶解后转移至适应容器中，加热回流提取时间为2小时，过滤，滤液浓缩至相对密度1.15～1.20（温度为60℃）；加入乙醇搅拌均匀，使溶液含醇量达80～85%，4℃环境下静置12h后，离心，收集沉淀物，挥去乙醇；70℃真空干燥，即得。
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