CN117280210A

CN117280210A - 选择细胞的方法

Info

Publication number: CN117280210A
Application number: CN202280032948.8A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·亨利·艾萨克; 埃玛·黑德; 马切伊·索斯纳; 内莱·玛丽·戈德特·迪克曼; 克莱尔·玛丽·米尔佐; 伊万吉丽娅-涅菲勒·阿萨纳索普洛; 安德鲁·瓦贝尔; 卡梅伦·弗莱林; 保罗·勒芬
Original assignee: Optical Discovery Ltd
Current assignee: Optical Discovery Ltd
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2023-12-22
Also published as: US20240159736A1; CA3213822A1; AU2022241077A1; EP4308924A1; GB202103609D0; JP2024512508A; WO2022195281A1; KR20230157450A

Abstract

提供了用于在EWOD或oEWOD装置中基于至少一个特征来选择细胞和/或细胞的一部分的方法。所述方法包括：i.提供微滴的测试组，所述微滴包括至少培养基或培养基和至少一个细胞；ii.提供微滴的至少一个报告子组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；iii.将所述测试组的微滴与所述至少一个报告子组的微滴合并以形成合并的测定微滴组；和iv.使用能够基于至少一个特征的存在检测所述报告子实体的变化的检测***来监测所述测定微滴组，以及v.基于报告子实体的变化从组中选择微滴的子集，所述子集包含所选择的细胞；其中通过将包含至少一个细胞和培养基的微滴组***，来创建包含至少培养基的微滴的测试组，进一步创建包含至少一个细胞的微滴的参考组；和/或进一步地，其中在步骤(i)至(v)中的任一个之前或之后，将包括至少一个细胞的微滴的测试组***成至少两个微滴组，所述组是：包括至少培养基或培养基和至少一个细胞的适于与报告子组的微滴合并的微滴测试组；以及包含至少一个细胞的微滴的参考组。

Description

选择细胞的方法

技术领域

本发明涉及基于所需特征使用装置选择细胞的方法。然后可以扩增这些选择的细胞用于治疗或制造用途。该方法可用于过继细胞疗法(ACT)，特别是细胞免疫疗法，但也有其他用途，特别是在来自群体的细胞的表征中，通常群体中的细胞已被遗传改造。此外，该方法可用于基于细胞产生所需分子(例如免疫球蛋白或免疫治疗药物)的能力来选择细胞。合成生物学是一个发展迅速的领域，可以利用细胞生产药物、燃料、食品和饮料，或者生产可以降解塑料和其他污染物的酶。本发明的装置属于微流体领域，并且涉及能够操纵微滴的微流体装置。

背景技术

细胞的快速和高通量处理是研究、开发和制造过程中的一项重大挑战。对于细胞疗法和细胞衍生疗法等生物治疗药物的产生尤其如此，其中需要识别和选择细胞，同时保留细胞以供进一步扩增或测试。尽管微流体装置已经发展起来了，但现有的细胞分选、测定和选择方法仍然缓慢而繁琐。

基于细胞的疗法的批准正在增加，至关重要的是要确保输注到患者体内的细胞具有所需的特征，而且不具有可能对患者造成任何风险的特征。已知从患者身上取出、遗传改造(基因疗法)并替换到患者中的细胞用于许多疾病，包括免疫***遗传性疾病、血红蛋白病、代谢性疾病和癌症。基于细胞的基因疗法在眼部疾病和病症中的其他用途是已知的。

在一个实例中，基因工程为T细胞配备了一种称为嵌合抗原受体(CAR)的细胞表面受体。这种CAR-T细胞在能够通过表达的细胞表面标记物与癌细胞结合并引发特异性抗肿瘤反应方面具有关键优势。虽然目前获得许可的治疗方法涉及自体再输注T细胞，但未来使用同种异体T细胞是可能的。然而，重要的是，仅使用具有稳定表型的CAR-T细胞，具有稳定表型的CAR-T细胞在其表面无修饰地表达正确的CAR，并且这种CAR不显示出“靶向非肿瘤(on target/off-tumour)”以及实际上“脱靶”的结合能力，从而使患者的健康细胞被靶向。此外，在输注前确定CAR-T对其靶点具有疗效是有用的。目前批准的两种CAR-T细胞疗法在剂量一致性、患者安全性和生产过程影响方面存在许多已知的缺陷。据了解，这些缺陷在过继细胞疗法和基因疗法领域都有。

重要的潜在因素包括：

·治疗和生产剂量之间的产量存在巨大差异，给患者带来不可预测的疗效。

·已知的脱靶效应(例如中枢神经***脱靶和心脏靶标)会对一些患者产生严重的不良反应。

·白细胞分离法的可变产量要求保持最大的细胞成活力，并需要仔细选择输入细胞亚群。

·污染物(如B细胞)会破坏培养物。

·由于没有直接的自动化方法来测量针对肿瘤靶标的T细胞活性，因此很难或不可能预测患者的反应。

此外，细胞可用于制造或生产用于多种用途，包括治疗适应症、测定、研究、食品和饮料、农业以及作为原材料的产品。这有效地利用细胞产生产物，这些产物可以作为分泌产物例如免疫球蛋白从细胞中收获，或者通过裂解细胞来回收细胞内产物，例如药物分子而收获。

特别令人感兴趣的是从杂交瘤和淋巴细胞制造免疫球蛋白。通常需要鉴定产生具有特定抗原结合能力的免疫球蛋白的细胞，从而如果确定了特定抗原结合特征，则可以扩增或分析该细胞。这种免疫球蛋白通常是抗体，例如单克隆抗体，并且可以用于治疗或用于测定和研究。在选择具有这种特征的一个或多个细胞时，可能需要筛选数千个细胞。由于收获和鉴定产生所需产物的细胞之间的中间步骤可能会导致损失和/或降低的性能，因此最好将细胞直接装载到装置上并减少处理步骤。在没有先前FAC分选的情况下，期望的细胞与不期望的细胞的比率大大降低。这里需要大的液滴处理和筛选能力。

选择具有生产产物的所需特征的细胞可能导致细胞在测试过程中受损或被破坏，这在选择生产所需产物的细胞时是不希望的。

因此，需要一种稳健的方法，该方法简化了筛选细胞以获得所需特征的劳动密集型过程，允许对这种细胞进行选择和随后的扩增或进一步测试，弃去具有不期望特征的特定细胞，并减少总时间和成本。因此，重要的是，不仅可以测试细胞，还可以回收细胞。已经提出了微流体平台来解决这种需求，但是迄今为止还没有方法被证明在临床环境中是实用和可靠的。特别是，对多个细胞同时进行多重测定的能力已被证明是困难的，此外，以高通量形式同时处理许多细胞的能力也是困难的。事实上，这种装置的大部分工作是由固定结构的使用决定的，例如隔离栏(sequestration pens)，这不允许对细胞进行多次测定的灵活性。一些平台不允许在单个细胞水平上进行研究，而是在多个细胞上进行测定。此外，不灵活的***意味着只能对细胞进行单一的测定，因为没有机制允许进行连续的测定发生，或者一旦测定完成无法保留细胞以进行进一步扩增。测定的小型化减少了测定步骤中消耗的试剂量，从而降低了耗材的成本。

本公开提供了用于细胞选择的方法，其中细胞被放置到微滴中，并且其中用于操纵微流体芯片表面上的包含细胞的微滴的致动机构是介质电润湿(EWOD)，可选地是光学介导的介质电润湿(oEWOD)。

这种基于芯片的装置的使用有利地允许在宽尺寸范围内操纵微滴，并且被数字控制，提供了动态可重新编程的操作步骤。与传统方法相比，这种装置结构允许更精细和集成的工作流程，例如微滴的独立控制，以及允许在微流体芯片表面的区域控制更大密度的微滴。

发明内容

本公开提供了其中利用EWOD或oEWOD微流体芯片的灵活性来实现微滴的高通量处理的方法，从而解决了在筛选应用中对多路处理的需要。如本文所要求保护的用于选择细胞的方法包括如本文所公开的一个或多个细胞、一个或多个细胞的一部分和/或细胞衍生物种。

本文提供了选择细胞的方法，特别是选择用于治疗用途或制造的细胞，本公开的方法尤其在过继细胞疗法、基因疗法和基于细胞的制造中是有用的。所选择的细胞可以是较大细胞群的子集，其中细胞通常是相同类型或相同物种。所选择的细胞可能不是相同类型或相同物种的。可以选择细胞以在细胞群体内提供异质性。这些细胞可能在基因上是相同的，但可能有某些基因被打开或关闭。

本文提供了用于选择细胞以研究细胞与其他实体(例如(生物)化学/(生物)分子实体)或其他细胞(细胞-细胞相互作用)的相互作用的方法。例如，所述方法可以包括靶向的细胞-细胞相互作用，其中将两个或多个选择的细胞聚集在一起。

本文提供了用于选择细胞以研究来自单细胞或细胞-细胞相互作用的分泌的方法。例如，所述方法可以包括靶向的细胞-细胞相互作用，其中将两个或多个选择的细胞聚集在一起。

根据本公开的一个方面，提供了用于在EWOD或oEWOD装置中选择细胞的方法，所述方法包括：

i.提供微滴的测试组，所述微滴包含至少培养基或培养基和至少一个细胞；

ii.提供微滴的至少一个报告子组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

iii.将所述测试组的微滴与所述至少一个报告子组的微滴合并以形成合并的测定微滴组；和

iv.使用能够基于至少一个特征的存在检测所述报告子实体的变化的检测***来监测所述测定微滴组，以及

v.基于报告子实体的变化从组中选择微滴的子集，所述子集包含所选择的细胞；

其中通过将包含至少一个细胞和培养基的微滴组***，来创建包含至少培养基的微滴的测试组，进一步创建包含至少一个细胞的微滴的参考组；

和/或进一步地，其中在步骤(i)至(v)中的任意一个之前或之后，将包括至少一个细胞的微滴的测试组分成至少两个微滴组，所述组是：包括至少培养基或培养基和至少一个细胞的适于与报告子组的微滴合并的微滴的测试组；以及包含至少一个细胞的微滴的参考组。

因此，可以基于一个或多个特征来选择细胞。

本文所述的方法可包括至少一个***操作，例如，使得在步骤(i)之前，最初***微滴组以提供包含至少培养基的微滴的测试组和包含至少一个细胞的微滴的参考组。

如果步骤(i)中的微滴组包含一个或多个细胞，则不必在步骤(iii)之前进行***操作。

备选地或附加地，可以在该方法中的任何适当步骤包括一个或多个进一步的***操作。***可以产生包含至少培养基的微滴的测试组，和/或包含至少培养基和至少一个细胞的微滴的测试组。

可以执行***操作，使得如果细胞能够产生分泌物，则任何分泌物都包括在培养基中。可以执行***步骤，使得产生多个可以具有不同浓度的所述分泌物的子液滴(childdroplet)。备选地或附加地，可以在不同的时间执行***操作，使得子微滴可能含有不同浓度的分泌物。

***操作可导致形成包含至少一个细胞的微滴的一个或多个参考组，以及包含培养基且具有或不具有至少一个细胞的微滴的一个或多个测试组。

根据目标特征，所述方法可以设想包括涉及包含至少一个细胞的微滴的测试组和包含至少培养基的微滴的测试组两者的步骤。

这种***操作的目的是生成包含至少一个细胞的微滴的参考组。

备选地，提供了用于在EWOD或oEWOD装置中选择细胞的方法，所述方法包括：

i.提供微滴组，所述微滴包含一个或多个细胞和培养基；

ii.将所述微滴组分成至少两个微滴组，至少一个包含一个或多个细胞的微滴的参考组，以及至少一个包含至少所述培养基的微滴的测试组；

iii.提供微滴的至少一个报告子组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

iv.将所述测试组的微滴与所述至少一个报告子组的微滴合并以形成合并的测定微滴组；和

v.使用能够基于至少一个特征的存在检测所述报告子实体的变化的检测***来监测所述测定微滴组，以及

vi.基于相应测定微滴组中的报告子实体的变化，从参考组中选择微滴的子集，所述子集包含所选择的细胞。

本公开的方法涉及检测或确定细胞的一个或多个特征。如本文所用，细胞的特征可以是任何合适的特征，例如以下中的任意一个或多个：一种或多种细胞表面分子的存在；一种或多种细胞活动的存在；细胞形态；一种或多种细胞分泌物的存在；和/或一种或多种细胞内产物的存在。

根据本文所述的方法，可以根据任何合适的手段来确定细胞的特征。该方法可以使用能够确定或检测特征的存在的一个或多个报告子实体。这种报告子实体可以在微滴内提供，用于与正在进行所述特征测试的微滴合并。

如本文所述的方法可涉及细胞的选择，其中包含至少一个细胞的微滴组被***，从而产生在本文中被定义为参考组的包含至少一个细胞的微滴组。该***步骤或***操作可以在该方法中的任何适当的点或步骤进行，使得在适当的点构建参考组。根据进行选择的细胞，可以在方法中的不同点/步骤构建该参考组。因此，参考组可以包含最初考虑的细胞的子集。

***步骤还导致微滴的至少一个测试组的产生。微滴的测试组可以包含来自祖微滴的培养基。如果细胞能够分泌，则培养基也可以含有来自所述细胞的分泌物。测试组和参考组是相关的，使得对测试组的询问和所需特征的选择的结果可以导致包含至少一个细胞的相应参考微滴的选择。因此，测试组的询问结果可以与祖细胞相关，并且选择相同的祖细胞。

在***步骤之前，含有至少一个细胞的微滴组可以在允许细胞***的条件下培养，任选地克隆扩增。这样的条件可以包括通过将含有培养基的微滴组与含有至少一个细胞的微滴组合并来向细胞提供额外的培养基。其他条件可以包括通过将含有补充培养基的微滴组与含有至少一个细胞的微滴组合并，向细胞提供补充剂如生长因子、营养物质、细胞信号传导分子、化学物质等。

如果微滴组中的细胞被允许***，则微滴的参考组和测试组可以被分开，使得参考组或微滴包含与包含在微滴测试组中的细胞相对应的细胞的至少一个克隆拷贝。因此，测试组的询问结果可以与祖细胞相关，并且选择相同的祖细胞。

根据一个方面，包含至少一个细胞的微滴的测试组可以与包含用于裂解所述细胞的试剂的微滴组合并。如果要确定的细胞的特征是细胞内产物的存在，则可能需要这样的步骤。或者，细胞内产物可能能够使用能够进入细胞的报告子实体进行直接检测。

因此，可以允许形成组的微滴中的细胞在暴露于特定报告子实体之前进行细胞***。一旦细胞经历***，组中的每个微滴都可以***，从而形成至少两个子微滴组，并且其中的微滴包括至少一个细胞。可以保留至少一个微滴组作为参考组，并且在本发明的方法中可以使用至少一个其他组(“测试组”)。因此，参考组和测试组包含对应或相关的细胞，并且测试组的结果可以导致在参考组中鉴别其对应的细胞。可以描述的是，微滴的测试组和微滴的参考组各自包含源自原始祖细胞的细胞，因此在遗传上相同或是克隆。

根据本公开的任何方面，可以检查包含至少一个细胞的任何微滴组中的细胞的形态特征，并且所述形态特征可以用于选择细胞的子集。该检查可以发生在该方法的步骤(ii)之前，也可以发生在该方法的任何步骤之前或之后。形态特征可以包括大小、形状、粘附状态、细胞膜特征(如泡)和/或细胞内特征(如空泡)的存在。

根据任何方面的细胞的选择意味着定义细胞的子集，并丢弃或不考虑(discounting)剩余的细胞。选择可以是正的(基于特征的存在的细胞选择)或负的(基于负特征的不存在的细胞选择)。丢弃/不考虑的微滴可以从装置中分配(dispensed)，或者保留在组内，并不予考虑。

根据一些方面，在步骤(i)之前，可以对含有至少一个细胞的微滴组进行至少一次测定以确定细胞的特征，所述测定是通过将包含至少一个细胞的所述微滴组与包含至少一种报告子实体的至少一个微滴组合并并基于所述特征的存在确定所述至少一种报告子实体的变化来进行的。因此，在任何***步骤之前，可以执行初始检查或询问。

根据一个方面，一旦被选择，细胞就可以从装置中分配(dispensed)，用于扩增或用于进一步测试。

根据本公开的另一个方面，提供了使用EWOD或oEWOD装置选择细胞的方法，其包括以下步骤：

i)提供微滴组，所述微滴包含至少一个细胞和培养基；

ii)提供微滴的至少一个报告子组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

iii)将包括至少一个细胞的组的微滴与所述至少一个报告子组的微滴合并，以形成合并的微滴组；

iv)使用能够基于所述细胞的一个或多个特征检测所述报告子实体中的变化的检测***来监测所述合并的微滴组，并且基于所述报告子实体中的所述变化来选择微滴子集以形成所选择的包含细胞的微滴组；

v)取出所选择的包含细胞的微滴组，并任选地在其上重复步骤(ii)至(iv)一次或多次，其中在步骤(ⅱ)中使用一种或多种不同的报告子实体；

vi)基于在步骤(v)中选择的最终的微滴组来选择细胞；

其中在步骤(iii)和/或步骤(v)之前，将包含至少一个细胞的微滴组***成至少两个微滴组，所述组为：

a.微滴的测试组，所述微滴包含至少培养基，适合于与报告子实体组的微滴合并；和

b.微滴的参考组，所述微滴包含至少一个细胞。

在一个方面，在***包含至少一个细胞的微滴组之前，可以培养细胞以允许细胞***，使得微滴的测试组可以包含细胞，任选地是来自参考组的细胞的克隆细胞拷贝。

或者，根据一个方面，本发明提供：

使用EWOD或oEWOD装置选择细胞的方法，其包括以下步骤：

i)提供第一微滴组，所述微滴包含至少一个细胞；

ii)提供至少一个报告子组微滴，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

iii)将第一组的微滴与至少一个报告子组的微滴合并以形成第一组合并的测定微滴；

iv)使用能够基于所述细胞的一个或多个特征检测所述报告子实体中的变化的检测***来监测所述测定微滴组，并且基于所述报告子实体中的所述变化来选择第一微滴子集以形成第一选择的微滴组；

v)提供微滴的至少一个另外的报告子组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

vi)将来自所选择的微滴组的微滴与来自另外的微滴的报告子组的微滴合并，以形成第二组合并的测定微滴；

vii)使用能够基于细胞的一个或多个特征检测所述报告子实体中的变化的检测***监测第二组测定微滴，并基于报告子实体中的所述变化选择第二微滴子集以形成第二选择的微滴组；所述子集包含所选择的细胞；

其中在步骤(iii)和/或步骤(v)之前，将包含细胞的微滴组***成至少两个微滴组，所述组为：

a.微滴组，所述微滴包含至少培养基，适于与报告子组的微滴合并；和

b.微滴的参考组，所述微滴包含至少一个细胞。

以下特征可以应用于本文公开的方法的任何变体：

微滴的***可以是相等的或不相等的，使得微滴可以***成2个或更多个微滴，2个或多个各自具有相同或不同的尺寸的微滴。

根据本文公开的方法的实施方案，步骤(i)中的微滴组可以包含至少一个细胞，或者如果原始细胞已经经历细胞***，则可以包含多于一个的细胞。本发明方法的目的是表征特定的细胞类型，其中细胞在待测定的相同类型的整个细胞群上的特征可以是可变的。该方法可以包括处理或丢弃微滴的步骤，该微滴包含没有由于细胞***而产生的多个相同类型的不同细胞。

根据本文公开的方法的实施方案，步骤(i)中的微滴组可以包含至少培养基。所述含有至少培养基的微滴先前已从在所述培养基中含有细胞的微滴中分开或***。在***步骤之前，含有至少一个细胞的微滴组可以与含有培养基的微滴组合并，所述培养基可以任选地包含信号传导分子或细胞以促进细胞产生分泌物。因此，微滴测试组中的培养基可能含有来自细胞的分泌物，所述分泌物将暴露于报告子实体以定义细胞的特征。该方法可以包括处理或丢弃不包含目标分泌物的微滴的步骤。含有培养基的液滴可以与含有细胞的液滴具有不同的体积。

此外，任选地，用于细胞选择的报告子组允许鉴定具有所需特征的细胞，例如细胞表面特征，例如特定细胞表面标记物的表达或所需分子的分泌。这种轮次中的报告子实体可以是与细胞表面分子或分泌的分子结合或相互作用的实体。

任选地，选择步骤允许鉴定具有所需细胞-细胞相互作用特征的细胞，例如细胞结合、活化、细胞融合、细胞摄取或细胞死亡。在这些选择轮次中的报告子实体可以是细胞，例如肿瘤细胞。

任选地，选择步骤可以包括测定以观察成活力、活化和/或扩增特征或能力。

任选地，微滴测试组中的细胞(如果存在)被裂解以释放细胞内容物。如果细胞已经经历了细胞***事件，并且已经创建了每个微滴包括至少一个细胞的微滴的参考组，则可以考虑这样的步骤。

如果确定不需要进一步分析，则可以在该方法期间的任何点从组中去除微滴。例如，如果细胞不包括所需特征，不经历细胞***，并且不具有所需特征(例如促进报告子实体细胞中的细胞死亡或释放能够结合抗原的抗体)，则可以丢弃微滴。

可能希望使用本发明的方法分析任何种类的细胞，但是细胞可以是相同类型的，例如它们是B细胞或T细胞(淋巴细胞)，并且本发明的方法可以用于选择具有特定特征的细胞，其可以固有地存在于所述细胞中，或者可以在所述细胞内进行遗传改造。该细胞也被描述为生物细胞。可能需要分析共培养物，其中液滴内的细胞是不同类型的，例如报告子细胞和原代细胞的组合，或者将不同表型的上皮细胞组合以形成组织样结构的培养物。细胞可能是天然的。细胞可能是人工的。细胞可以是微细胞。本发明的方法可以是无细胞的并且使用细胞的一部分，例如细胞核和/或线粒体。本发明的方法可以使用脂质体。

本发明的方法可用于选择具有所需特征的细胞用于治疗。

本发明的方法可用于选择具有所需特征的细胞用于研究。

本发明的方法可用于选择具有所需特征的细胞用于制造所需产品，例如分子/化合物/化学物质。在这样的用途中，细胞可以是基因工程细菌细胞等。

附图说明

图1：显示了一种示例性方法，其中从患者采集血液，并在大量扩增和回输到患者体内之前分离、转导、分选和选择T细胞。还显示了我们CAR-T工作流程所针对的该制造过程中的部分。

图2：显示了在示例性CAR-T工作流程中，在剂量测定和分析之前的初始阶段的概述，其中从患者血液中分离的T细胞被乳化成微滴，进行分选和转导。丢弃不需要的微滴，并对剩余微滴的细胞进行多报告子细胞表面标记物测定。在该测定的基础上，选择了一组微滴。

图3：显示了在示例性CAR-T工作流程中后期的概述，其中在多报告子细胞表面标记物测定之后，评估所选微滴组的细胞的细胞成活力、活化和耗竭行为。微滴组可以被***，这样CAR-T细胞被保留在参考组中，克隆的CAR-T细胞用于进一步的选择步骤。例如，激活评估包括将含有T细胞的微滴与含有癌细胞的微滴合并，并定量癌细胞杀伤活性。然后选择最终的微滴组；将T细胞从装置中分配来，用于大量扩增和回输到患者体内。

图4：概述了示例性免疫肿瘤学工作流程，其中：A)对CHO细胞进行修饰以产生免疫治疗药物，并装载到微滴中；B)根据***的时间点，将微滴***成含有相同或不同剂量药物的子液滴；C)在第一合并操作中将含有T细胞的微滴与含有癌细胞的微滴成对合并，然后在第二合并操作中将合并的微滴和含有药物剂量的微滴合并；D)通过定量癌细胞死亡来确定阳性命中，并选择对应于阳性命中的CHO细胞；和E)将选择的CHO细胞分配到孔板中并扩增。

图5：显示了产生含有T细胞或肿瘤细胞和TCR药物的微滴的示例性制备方案。

图6：显示了一组微滴，每个微滴含有不同T细胞/肿瘤细胞比例的T细胞和肿瘤细胞。对于每个液滴，在每个框中肿瘤细胞的数量在左侧指示，在每个框中T细胞的数量在右侧指示。液滴I、K和L是仅含有肿瘤细胞的阴性对照。

图7：显示了以小时为单位的时间与癌细胞与T细胞接触时凋亡的百分比的图。给出了与仅肿瘤对照组的比较。在这种情况下，细胞凋亡在测试条件下充当T细胞抗肿瘤杀伤活性的报告子，这可以用作T细胞后期扩增或对其进行取样以进行进一步分析的选择标准。

图8：8A显示了在36小时内周期性拍摄的包含T细胞和两个肿瘤细胞的微滴的明视场图像。显示T细胞连续杀死两个肿瘤细胞。图(8B)通过在相同时间线上定量每个肿瘤细胞的胱天蛋白酶荧光强度来证实这种肿瘤细胞杀伤活性。

图9：9(A)：在36小时实验的前～13小时内周期性拍摄的含有T细胞和两个肿瘤细胞的微滴的近距离明视场和深红(Deep Red)染色图像，显示在相同时间线上定量的胱天蛋白酶荧光强度；以及9(B)在实验的最后～10小时内周期性拍摄的同一微滴的近距离明视场和深红染色图像，也显示了在相同时间线上定量的胱天蛋白酶荧光强度。T细胞的系列肿瘤细胞杀伤活性可以在这里看到。

图10：显示了以相对于时间的百分比表示的杂交瘤细胞成活力，其中细胞在装置中或在液滴中。细胞成活力在液滴中保持100％达5.3小时，在装置中保持100％达3.6小时，在液滴中保持>90％达20.3小时，在装置中保持>90％达18.6小时。

图11：左图)显示了含有杂交瘤细胞和珠粒或仅珠粒或仅杂交瘤细胞的一组微滴的图像。珠粒用正方形表示，而细胞用圆圈表示。C1和C2各自仅包含珠粒，C3仅包含细胞，D1至D3各自包含2个细胞和1个珠粒，D4和D5各自包含1个细胞和1个珠粒。右图)显示了同一组的图像，同样显示了珠粒荧光。在D1至D5中出现不同程度的荧光聚集体。在仅含有细胞或仅含有珠粒(对照)的微滴中未检测到荧光。

图12：显示了在Y轴上显示过滤的AF488荧光并且在X轴上显示游离抗靶标抗体浓度的曲线图。在最右侧，绘制了不相关杂交瘤群体和靶标杂交瘤群体的平均过滤荧光。可以看出，对于分泌靶标杂交瘤细胞，测量到接近于游离抗靶抗体观察到的最大水平的荧光。

图13：显示了呈现多路加标测定的数据的曲线图，其中靶标珠粒过滤的AF488荧光显示在Y轴上，时间显示在X轴上。靶标珠粒过滤的AF488荧光是针对微滴群体随时间测量的，每个微滴包含靶标或不相关的杂交瘤细胞和报告子。还包括阴性对照。含有不相关杂交瘤细胞的D2保持黑暗并且与阴性对照无法区分。所有靶标杂交瘤均显示阳性信号。

图14：显示了使用10x物镜的SolR1、R3、R5珠粒的荧光和明视场(插图)图像。该图显示了多路测量的SolR1、R3和R5珠粒的群体的过滤的荧光，这使得珠粒易于区分。

图15：上图)呈现多路珠粒测定的数据的图，在Y轴上显示珠粒过滤的荧光并且在X轴上显示AF488过滤的荧光。对于含有靶标杂交瘤或不相关杂交瘤和报告子的微滴群体，在每个珠粒上测量过滤的AF488荧光。珠粒由检测***解码(R5人靶标，R3脱靶和R1 cyno靶标)。还测定了阳性(25nM游离靶标抗体)和阴性(仅抗小鼠AF488)对照微滴。可以看出，阴性对照微滴保持黑暗，而阳性对照微滴证实了游离靶标抗体与两种靶抗原(R1和R5)的结合。含有分泌抗体的微滴也结合两种靶标抗原。下图)显示了在Y轴上显示过滤的AF488荧光并且在X轴上显示微滴类别的条形图，其中每个类别被进一步划分为R1、R3和R5子类别。

图16：概述了示例性单克隆抗体发现工作流程，其中：将B细胞装载到微滴中，并与含有细胞培养基的微滴成对合并以增加体积，促进随后的***步骤；将合并的微滴***成子液滴，以获得每个细胞产生的多剂量的分泌抗体；将含有B细胞的微滴分选到参考组中，同时将含有抗体剂量的微滴分选到测试组中；测试组与微滴的报告子组成对合并；光学检测***用于确定合并的报告子mAb组中的阳性命中；并且将包含对应于所述阳性命中的B细胞的参考组的微滴分配到孔板中并使其扩增。

图17：概述了示例性细菌细胞工作流程，其中：将细菌细胞装载到微滴中，并与含有细胞培养基的微滴成对合并，以增加体积，促进随后的***步骤；允许合并的微滴进行细胞***，然后***成克隆集落；一组含有克隆细菌细胞的微滴被保留作为参考组，而另一组含有克隆细菌细胞的微滴或一组含有所述细菌细胞的分泌物的微滴被分选到微滴的测试组中；微滴的测试组与微滴的报告子组成对合并；可以裂解细菌细胞以释放其内容物；光学检测***用于确定合并的报告子-细菌细胞组中的阳性命中；并且将含有对应于所述阳性命中的细菌细胞的参考组的微滴分配到孔板中并使其扩增。

图18显示了oEWOD配置。

图19A提供了液滴对平行合并的液滴合并操作的图像。

图19B提供了在合并之前成对的微滴一起移动的图像。

图19C提供了合并的微滴的图像。

图20A显示了液滴平行***的液滴***操作。

图20B显示了***操作中途拉伸的液滴。

图20C显示了液滴***成成对的子液滴。

图21提供了在单细胞占据时封装在微滴中的酿酒酵母(S.cerevisiae)生物颗粒(加热灭活酵母)的图像。

图22提供了细胞因子分泌细胞与细胞因子报告子珠粒共同封装在油中细胞培养基乳液中的微滴中的图像。在分泌的细胞因子存在的情况下，报告子珠粒通过使用荧光标记抗体的夹心ELISA机制发出荧光。明视场图像(a)显示了液滴内细胞和珠粒的分布。荧光图像指示b)哪些报告子珠粒在分泌的细胞因子存在下给出阳性反应，c)具有完整膜整体性的所有细胞的位置，d)所有珠粒的位置，以及e)通过碘化丙啶染色指示的死细胞。

图23是一个灵活而独特的微滴工作流程操作，包括加载、分选、合并、***等微滴操作。可编程决策可以在整个工作流程的任何点上实施，这可以偏离原始顺序和/或仅将操作应用于选定的液滴。

图24：分泌抗体的细胞与报告子珠粒共同封装在油中的细胞培养基乳液中的液滴中。在分泌抗体存在的情况下，报告子珠粒通过使用荧光标记抗体的夹心ELISA机制发出荧光。明视场图像(a)显示了液滴内细胞和珠粒的分布。荧光图像指示b)在分泌的抗体存在下哪些报告子珠粒给出阳性反应，c)具有完整膜整体性的所有细胞的位置，以及d)死细胞。

图25：用于监测细胞分泌物或细胞-细胞相互作用的多种检测模式。

图26：显示典型微滴操作的工作流程。可以对包含细胞的微滴进行操作，例如***、合并、分选操作。微滴也可以包含报告子。

图27：描述分选选项和/或合并和分配操作的组合的工作流程。

图28A至28D：包封在微滴中的细胞的各种图像，在细胞内钙的染料的存在下孵育。

发明详述

发明人已经发现，通过使用本文公开的方法，可以克服现有技术中选择细胞的方法中的缺陷。本文公开的方法的使用导致更好的产品质量、可预测性和更高数量的有利细胞选择。

本公开的方法是独特的，因为它们尤其提出测试细胞的多种特征，使得可以选择具有期望特征和最佳特性的细胞，并且就细胞疗法而言，这可能是最佳安全特性。所公开的方法允许选择具有所需特征的细胞，所述细胞的形式允许在选择后进一步扩增或测试。所需的细胞特征包括但不限于特定细胞表面分子的存在/不存在、分泌物的存在/不存在、细胞内产物的存在/不存在、细胞形态、成活力、增殖能力和/或所需细胞:细胞相互作用活性的存在等。

本公开的方法在能够操作微滴的微流体装置上进行，其中存在至少一个细胞或细胞的一部分。细胞可能是天然的。细胞可以是人工的。细胞可以是微细胞。可以存在至少一种脂质体。

装置

本发明涉及能够在微滴操作装置(例如EWOD或oEWOD装置)上进行的方法。可以采用允许根据本文所述方法操纵微滴的任何合适的装置。

用于操纵液滴或磁珠的装置先前已在本领域中描述；参见例如US6,565,727,US2013-0233425和US2015-0027889。在液滴的情况下，这通常是通过使液滴(例如在不混溶的载体流体存在的情况下)行进通过由筒或微流体管的两个相对壁限定的微流体通道来实现的。嵌入筒或管的壁中的是覆盖有介电层的电极，每个电极都连接至A/C偏置电路，该偏置电路能够以一定间隔快速接通和断开，以改变该层的电润湿场特征。这会产生局部定向毛细管力，可用于沿给定路径操纵液滴。

介质电润湿(EWOD)是一种众所周知的效应，其中在液体和基板之间施加的电场使液体在表面上比自然状态更润湿。电润湿的效果可用于通过在基板上施加一系列空间变化的电场来操纵(例如，移动、分割或变形)流体，以在序列中的空间变化之后增加表面润湿性。在基于电润湿的装置中操作的液滴通常夹在两个平行板之间，并由数字电极驱动。

基于光学介导的电润湿的这种方法的变体已经在例如US6,958,132、US2015-0298125和US9,815,056中公开。WO2018/234445中描述了这种方法的改进版本，该方法能够同时操纵成千上万个通常尺寸范围小于10μm的微滴，其通过引用纳入本文。在这种oEWOD装置中，微滴通过由容纳壁限定的微流体空间进行转移；例如在其间具有微流体空间的一对平行板。至少一个容纳壁包括所谓的“虚拟”电润湿电极位置，其通过选择性地照射埋在壁内的半导体层的区域而产生。通过用来自单独光源的光选择性地照射该层，可以瞬时产生虚拟电润湿电极位置的虚拟路径，可以使微滴沿着该虚拟路径移动。此外，在WO2020/104769中描述了一种合适的oEWOD装置，其也通过引用纳入，该装置可能与该方法特别相关，因为当微滴含有细胞时它特别相关。WO2020/169965中描述了其他oEWOD装置，其通过引用纳入本文。

oEWOD的另一个公开是Park,Sung Yong,Michael A.Teitell和Eric PY Chiou,"Single-sided continuous optoelectrowetting(SCOEW)for droplet manipulationwith light patterns."Lab on a Chip 10.13(2010):1655-1661的单侧开放配置平台。

适用于操纵微滴的装置可以任选地包括以下特征中的一个或多个：

第一复合壁，其由以下组成：

■第一透明基板

■基板上的第一透明导体层，其厚度在70至250nm的范围内；

■在导体层上通过波长范围为400-1000nm的电磁辐射激活的光活性层，其厚度在300-1000nm的范围内，以及

■在导体层上的第一介电层，其厚度在120至160nm的范围内；

第二复合壁，其由以下组成：

■第二基板；

■基板上的第二导体层，其厚度在70至250nm的范围内，以及

■任选地，所述导体层上的第二介电层，其厚度在120至160nm的范围内，

使得所述第一介电层和所述第二介电层的所述暴露表面被布置为相距至少10μm，优选50-100μm，以限定适于容纳微滴的微流体空间；并且所述介电层中的任一介电层涂覆有生物相容性涂层或防污涂层。

任选地，在介电层和防污/生物相容性涂层之间可以存在厚度为1-10nm的二氧化硅填隙层；

A/C源，用于在连接第一和第二导体层的第一和第二复合壁上提供电压；

至少一个第二电磁辐射源，其具有比所述光可激发层的带隙更高的能量，适于撞击在所述光活性层上以在所述第一介电层的表面上引起对应的虚拟电润湿电极位置，以及

用于操纵所述电磁辐射在所述光活性层上的撞击点以改变所述虚拟电润湿电极位置的布置从而产生至少一个光介导的电润湿路径的装置，所述微滴可沿着所述至少一个光介导的电润湿路径移动。

在共同待审的申请PCT/GB2021/050148中描述了用于高通量微滴操作的方法和装置，并且这样的装置和技术将适合于执行本公开的方法。其中公开的装置包括两个单独可控的光学组件，这两个光学组件都能够在oEWOD芯片的表面上产生固定的和可切换的光斑阵列。这样的配置被优化以促进微滴的高通量、灵活装载和处理。第一光学组件可以在芯片的表面上形成多个oEWOD阱，以使芯片表面上的多个微滴形成对应于oEWOD阱的第一阵列的微滴阵列；并且第二光学组件可以在芯片的表面上形成oEWOD阱的第二阵列。第二阵列的oEWOD阱中的一个或多个与第一阵列的oEWOD阱对齐。该方法可以包括检查微滴阵列的内容物并对第一光学组件进行调整，同时一个或多个微滴由第二阵列的oEWOD阱保持在适当位置。PCT/GB2021/050148通过引用纳入本文。

在一些实施方案中，提供了一种用于使用光学介导的电润湿来操纵微滴的装置，所述装置包括：

·第一复合壁，所述第一复合壁包括：

·第一基板；

·在所述基板上的第一导体层；

·在所述导体层上的光活性层；和

·在所述光活性层上的第一介电层，其厚度小于20nm；

·第二复合壁，所述第二复合壁包括：

·第二基板；

·在所述基板上的第二导体层；和

·在所述第二导体层上的第二介电层，其厚度小于20nm。

第一介电层和第二介电层可以是连续层。可以通过原子层沉积将第一介电层沉积到光活性层上。另外地或替代地，第二介电层可以沉积在光活性层上。

令人惊讶地发现，通过提供连续层的厚度小于20nm的第一和/或第二介电层，使得液滴更加稳定，因此，液滴在基板上是固定的。相反，本发明人已经发现，将第一和/或第二介电层增加到20nm以上的厚度可以导致基板上更不受控制的液滴运动，因此，液滴更有可能表现出偏离照明区域的不受控制的运动。因此，不受控制的液滴会使准确有效的oEWOD操作更加困难，例如液滴的合并或***。

在一些实施方案中，第一和/或第二介电层的厚度可以在1nm至20nm之间，或者其可以是2nm至20nm、3nm至20nm、4nm至20nm、5nm至20nm、6nm至20nm、7nm至20nm、8nm至20nm、9nm至20nm、10nm至20nm、12m至20nm、14nm至20nm、15nm至20nm或18nm至20nm。它也可以是1至15nm、1至10nm、1至5nm、5至10nm，5至15nm或10至15nm。

第一基板和第一导体层和/或第二基板和第二导体层可以是透明的。

该装置可以进一步包括A/C源，以在连接第一导体层和第二导体层的第一复合壁和第二复合壁上提供电压；至少一个电磁辐射源，所述电磁辐射源具有比所述光可激发层的带隙更高的能量，适于撞击在所述光活性层上以在所述第一介电层的表面上引起相应的短暂电润湿位置；以及微处理器，用于操纵电磁辐射在光活性层上的撞击点以改变短暂电润湿位置的布置，从而产生至少一个电润湿路径，微滴可以沿着所述至少一个电润湿路径移动。

该装置可以进一步包括氧化硅的填隙层。填隙层的优点在于，它可以用作抗污或防污层的结合层。填隙层设置在介电层和疏水层之间。填隙层的厚度可以在0.1nm至5nm之间。填隙层的厚度可以大于0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或4.5nm，或者可以小于5nm、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.75、0.5或0.25nm。

第一介电层和第二介电层的暴露表面可以间隔小于200μm布置，以限定适于容纳微滴的微流体空间。微流体空间的宽度可以在2至50μm之间。在一些实施方案中，微流体空间大于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48μm。在一些实施方案中，微流体空间可以小于50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6或4μm。

第一介电层和第二介电层的暴露表面可以包括一个或多个间隔件，用于将第一壁和第二壁保持隔开预定量以限定适于容纳微滴的微流体空间。间隔件的物理形状可用于帮助装置中微滴的***、合并和延伸。在一些实施方案中，微滴可以包含一个或多个细胞。微滴还可以包含培养基，例如细胞培养基和/或缓冲溶液。

A/C源可以被配置为在连接第一导体层和第二导体层的第一复合壁和第二复合壁之间提供0V至100V之间的电压。在一些实施方案中，A/C源可以被配置为提供大于0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90V的电压，或者其可以小于90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5V。

第一复合壁和第二复合壁可以进一步包括分别在第一介电层和第二介电层上的第一防污层和第二防污层。第二介电层上的防污层可以是疏水的。电磁辐射源可以包括从这种阵列反射或透射通过这种阵列的光的像素阵列。电润湿位置在微滴的行进方向上可以是新月形的。该装置还可以包括光电检测器，用于检测位于该装置内或下游的微滴中的光信号。光信号可以是荧光信号。该装置可以进一步包括上游入口，以产生由不混溶载体流体中的含水微滴的乳液组成的介质。

该装置可以进一步包括上游入口，以诱导由不混溶载体流体中的含水微滴的乳液组成的介质经由进入微流体空间的入口通过微流体空间。

限定第一和第二复合壁之间的微流体空间的第一和第二复合壁可以形成筒或芯片的***。该装置还可以包括彼此同时运行的多个第一电润湿路径。该装置还可以包括多个第二电润湿路径，所述多个第二电润湿路径适于与第一电润湿路径相交以产生至少一个微滴聚结位置。

该装置还可以包括上游入口，用于将微滴引入微流体空间，其中微滴的直径比微流体空间的宽度大20％以上。

第二复合壁可以进一步包括第二光激发层，并且电磁辐射源也可以撞击在第二光可激发层上以产生短暂电润湿位置的第二图案，所述短暂电润湿位置也可以变化。

电磁辐射源可以是LED光源，其可以提供0.005至0.1Wcm^-2水平的电磁辐射。在一些实施方案中，电磁辐射源处于0.005至0.1Wcm^-2的水平，或者其可以大于0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05或0.075Wcm^-2。在一些实施方案中，电磁辐射源的水平可以小于0.1、0.075、0.05、0.025、0.01、0.0075、0.005或0.0025Wcm^-2。

基板上的第一透明导体层的厚度可以在70至250nm的范围内。光活性层可以通过导体层上波长范围为400至100nm的电磁辐射激活，其厚度可以在300至1000nm的范围内。在一些实施方案中，光活性层可以由无定形硅制成。

在一些实施方案中，微滴可以穿过由两个相对的壁限定的微流体空间，其中每个壁包括介电层，所述介电层具有施加在介电层上的足够低的电压，从而低于介电层的介电击穿电压。使用在介电层上具有足够低电压的两个介电层不仅防止了导电液滴的破坏性电离，而且基本上消除了介电针孔缺陷对液滴的不利影响，这意外地提高了性能，尽管由于使用两个电介质而导致电润湿力减小。因此，可以使用低功率的照明源来实现光介导的电润湿，例如，产生低至0.01W/cm²的LED，用于同时操纵数千个液滴。在包括面积大于1cm×1cm的大面积微流体装置的实施方案的情况下，该装置适用于平行操纵超过10,000个液滴，在非常大面积装置的情况下适用于操纵超过50,000个液滴、超过100,000个液滴或超过1,000,000个液滴。

在一些实施方案中，大面积装置可用于处理成千上万个液滴。发明人之前曾试图使用单个介电层来构建更大的装置，用于平行处理液滴，然而发明人遇到了液滴不能移动的缺陷区域。通过实验和测试，发明人发现针孔缺陷是装置性能的重要限制，尤其是当装置变得更大时。

介电层总是有稀疏的针孔缺陷，因此它们在一个小的、孤立的区域中导电。已知的优化工艺可以给出每cm²大约38个针孔的密度。针孔缺陷会捕获液滴，使其无法移动。当使用导电介质例如缓冲溶液的液滴时，影响更为深远。

在一些实施方案中，提供了可在介电击穿下方使用的双介电层结构。当在击穿电压以下运行时，双面介电层结构可以产生很大程度上抵消针孔缺陷影响的新效果。在电介质设置在液滴的顶部和底部的情况下，只有在第一介电层中的针孔缺陷与第二介电层中的针孔缺陷直接对准的情况下才能形成导电路径。这种情况发生的可能性非常非常小。通过第二介电层的存在实现的这种针孔减轻特征是允许在相对大的区域内同时操纵数千个液滴的关键。

在适用于平行操作超过100,000个液滴或甚至超过1,000,000个液滴的大面积装置或非常大面积装置的情况下，针孔缺陷的数量成为装置性能的重要限制，因为单个液滴接触针孔缺陷的概率变得异常高。针孔缺陷上捕获的单个液滴可能会阻挡装置中其他液滴的运动，从而损害或中断***的运行。因此，本发明在消除针孔缺陷的影响方面的优点在包含大量微滴的非常大面积装置的操作中是特别重要的。

参考图18，提供了一种微流体装置，特别是oEWOD装置100。如图18所示的oEWOD装置包括：第一复合壁102，所述第一复合壁102包括：由玻璃制成的第一基板104、基板104上的第一透明导体层106，第一透明导电层106的厚度在70至250nm范围内；在导体层106上由波长范围为400-850nm的电磁辐射激活的光活性层108，所述光活性层108具有在300-1500nm范围内的厚度，以及在光活性层108上的第一介电层110。第一介电层110形成为厚度小于20nm的连续层。层厚度的下限将至少部分地由提供这种必须连续的薄层的方法来规定。然而，理论上它可以具有在0.1nm到20nm之间的厚度。

装置100还包括第二复合壁112，第二复合壁112包括可由玻璃制成的第二基板114和基板114上的第二透明导体层116。第二导体层116可以具有在70至250nm范围内的厚度。第二介电层118可以在透明第二导体层116上，其中第二介电层118具有小于20nm的厚度。与第一介电层一样，第二介电层必须是连续的，并且厚度的实际下限由制造限制规定，尽管它可以在1nm到20nm之间。第一连续介电层110和第二连续介电层118的暴露表面间隔20至180μm布置，以限定适于容纳微滴122的微流体空间121。光活性层108由无定形硅制成。第一导体层和第二导体层由ITO制成。

填隙结合层124设置在第一介电层110上，也可以设置在第二介电层118上。填隙层的厚度可以在0.1nm至5nm之间。填隙层的厚度可以大于0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或4.5nm，或者可以小于5nm、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.75、0.5或0.25nm。填隙层的优点在于，它可以用作抗污或防污层的结合层，抗污或防污层可以是疏水的。

疏水层126设置在填隙结合层124上。疏水层的实例可以是氟硅烷。填隙结合层124是可选的，并且通道壁120可以由SU8制成，或者它们可以是玻璃结构的一部分。填隙层124设置在介电层110、118和疏水层126之间。

如图18所示，入射光130可用于提供光精灵(sprite)图案131，其中入射光130将光提供到光活性材料110的一部分上，以将微滴122保持在微流体空间121内的静止位置。可以通过装置中的孔136将油载体相134提供给微滴122，以补充关键营养物质和成分，从而保持微滴122内的内容物(例如一个或多个存活且健康的细胞)。在一些情况下，油相134可以为细胞生长、成活力和/或生产力提供关键的营养物质、培养基和内容物。

第一基板104和第二基板114由机械强度强的材料制成。例如，第一基板和第二基板可以由玻璃、金属或工程塑料形成。在一些实施方案中，基板可以具有一定程度的柔性。在一些实施方案中，第一基板是硅、熔融二氧化硅或玻璃。在一些实施方案中，第二基板是熔融二氧化硅和玻璃。

第一导体层106和第二导体层116位于第一基板104和第二基板114的一个表面上，并且通常具有在70至250nm范围内的厚度，优选70至150nm。这些层中的至少一个由诸如铟锡氧化物(ITO)的透明导电材料、诸如银的导电金属的非常薄的膜或诸如PEDOT的导电聚合物等制成。这些层可以形成为连续片材或一系列离散结构，例如导线。或者，导体层可以是导电材料的网格，其中电磁辐射被引导在网格的填隙之间。

光活性层108由半导体材料形成，该半导体材料可以响应于电磁辐射源的刺激而产生局部电荷区域。实例包括厚度在300至1500nm范围内的氢化无定形硅层。在一些实施方案中，通过使用可见光来激活光活性层。该层的介电性质优选包括>10^7V/m的高介电强度和>3的介电常数。在一些实施方案中，介电层选自氧化铝、二氧化硅、二氧化铪或薄的不导电聚合物膜。

或者，至少第一介电层，优选两者，可以涂覆有抗污层，以帮助在各种虚拟电润湿电极位置建立期望的微滴/载体流体/表面接触角。抗污层另外用于防止微滴的内容物粘附在表面上，并在微滴穿过芯片时减少。为了获得最佳性能，抗污层应有助于建立微滴/载体流体/表面接触角，当在25℃下作为气液表面三点界面测量时，该接触角应在50°-180°范围内。在一些实施方案中，这些层具有小于10nm的厚度，并且通常形成为单分子层。或者，这些层可以由丙烯酸酯的聚合物组成，例如甲基丙烯酸甲酯或其被亲水基团取代的衍生物；例如烷氧基硅烷基。抗污层中的一个或两个都是疏水的，以确保最佳性能。在一些实施方案中，厚度小于20nm的二氧化硅填隙层可以介于抗污涂层和介电层之间，以便提供化学相容的桥。

第一介电层和第二介电层，以及因此第一壁和第二壁，限定了微流体空间，该微流体空间的宽度至少为10μm，并且优选地在20至180μm的范围内，并且微滴包含在所述微流体空间中。优选地，在它们被容纳之前，微滴本身具有比微滴空间的宽度大10％或大20％的固有直径。因此，在进入芯片时，使微滴经历压缩，导致球形微滴变形，这通过例如更好的微滴合并能力导致增强的电润湿性能。在一些情况下，第一介电层和第二介电层可以涂覆有疏水涂层，例如氟硅烷。

在一些实施方案中，微流体空间包括一个或多个间隔件，用于将第一壁和第二壁保持为隔开预定量。间隔件的选择包括珠粒或柱子，由通过光图案化产生的中间抗蚀层形成的脊。备选地，可以使用诸如氧化硅或氮化硅的沉积材料来形成间隔件。备选地，包括具有或不具有粘合剂涂层的柔性塑料薄膜的薄膜层可用于形成间隔层。各种间隔件几何形状可用于形成由柱线限定的窄通道、锥形通道或部分封闭的通道。通过仔细设计，可能使用这些间隔件来帮助微滴的变形，随后对变形的微滴执行微滴***和效果操作。类似地，这些间隔件可用于物理分离芯片的区域，以防止液滴群体之间的交叉污染，并在液压下加载芯片时促进液滴沿正确方向流动。

使用附着到导体层的A/C电源来偏置第一壁和第二壁，以在它们之间提供电压电势差；适当地在0至50伏的范围内。这些oEWOD结构通常与波长在400-850nm范围内(例如550、620和660nm)和能量超过光活性层的带隙的电磁辐射源结合使用。适当地，光活性层将在虚拟电润湿电极位置被激活，其中所采用的辐射的入射强度在0.005至0.1Wcm^-2的范围内。电磁辐射源的水平为0.005至0.1Wcm^-2，或者可以大于0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05或0.075Wcm^-2。在一些实施方案中，电磁辐射源的水平可以小于0.1、0.075、0.05、0.025、0.01、0.0075、0.005或0.0025Wcm^-2。

在电磁辐射源被像素化的情况下，它们被适当地直接或间接地使用反射屏幕来提供，例如由来自LED或其他灯的光照明的数字微镜装置(DMD)来提供。这使得能够在第一介电层上快速创建和破坏虚拟电润湿电极位置的高度复杂的图案，从而使得微滴能够使用紧密控制的电润湿力沿着基本上任何虚拟路径被精确地操纵。这种电润湿路径可以被看作是由第一介电层上的虚拟电润湿电极位置的连续介质构成的。

第一和第二介电层可以由单种介电材料组成，或者可以是两种或多种介电材料的复合物。介电层可以由但不限于Al₂O₃和SiO₂制成。

可以在第一介电层和第二介电层之间提供结构。第一和第二介电层之间的结构可以由但不限于环氧化物、聚合物、硅或玻璃，或它们的混合物或复合物制成，具有直的、成角度的、弯曲的或微结构的壁/面。第一和第二介电层之间的结构可以连接到顶部和底部复合壁，以形成密封的微流体装置并限定装置内的通道和区域。该结构可以占据两个复合壁之间的间隙。备选地或附加地，导体和电介质可以沉积在已经具有壁的成形基板上。

微滴

本发明的方法需要在装置内操纵至少一个微滴，该微滴通常指含有例如一个或多个细胞、报告子实体或两者的组合的液体例如含水液体的液滴。微滴提供了可以在其中分离物种或反应的隔室。它们允许与单细胞一起工作的可能性，并且适合于高通量实验。微滴允许细胞和/或报告子实体的封装，保持相同的分离，直到需要合并。

微滴可以是任何形状或大小，但优选地，微滴是球形或圆柱形。微滴的尺寸可以在20至600μm之间，但可以大于20、30、40、50、60、80、100、120、140、150、160、180、200、220、240、250、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、550、560或580μm。在一些实施方案中，微滴的尺寸可以小于600、580、560、550、540、520、500、480、460、440、420、400、380、360、340、320、300、280、260、250、240、220、200、180、160、150、140、120、100、80、60、50、40或30μm。多个微滴可以合并在一起以形成较大的液滴。或者，可以根据情况将大液滴划分为较小尺寸的微滴(子微滴)。

如果液滴相对于微流体装置的高度太小，则液滴不与微流体室内的壁的两侧接触，因此液滴不能通过oEWOD移动。相比之下，相对于装置几何形状的大液滴在微流体装置内移动可能很难和/或很慢，并且简单地通过阻碍其他正确尺寸的液滴或通过与正确尺寸的液滴合并而阻碍其他操作。

一般来说，微滴通常由含有微滴内容物的水相组成(例如一个或多个细胞、营养物质、报告子实体、测定试剂、水凝胶珠聚合物)。在某些情况下，微滴由围绕进一步的水性材料的不混溶流体的额外内部相组成，形成多重乳液，如双乳液和液滴-中-液滴(droplet-in-droplet)乳液。

在微流体装置中，微滴通过不混溶的载体相或流体彼此分离。合适的载体相可以包括油，例如硅油、矿物油或氟碳化合物油。示例性氟碳化合物油包括HFE7500、HFE7700或FC-40。载体相可以适当地进一步包含表面活性剂和其他添加剂以保持微滴稳定性。表面活性剂可以定位在微滴/载体相间，因此通过降低表面张力来稳定微滴。在含水微滴与载体的重量比低的情况下，微滴有随时间收缩的趋势；这种现象可能导致它们内部的反应性损失。抵消这种影响的一种方法是使用已经水合的载体相。由于上述载体通常不具有高的溶解水的能力，因此通过在载体相中产生水或水性缓冲液的胶束或次级微滴来适当地实现水合。该缓冲液可以具有与微滴本身相同或不同的组成。在一些实施方案中，这些胶束或次级微滴可以含有高达微滴本身的盐含量的五倍的盐含量并且任选地含有甘油。通常，这些胶束和次级微滴要小一个数量级。在一些情况下，载体相可能含有亲脂性化合物，其可以在分散相液滴中扩散进来和扩散出来。

本公开的方法中使用的微滴包括各种成分，这取决于它们存在于哪个组中。微滴本质上是水性的，并且可能包含另外的成分，例如用于提供支撑结构的成分，如凝胶或涂层微球。它们可以进一步包括细胞培养基，所述细胞培养基具有可以包括营养物质、能量源(例如碳水化合物)、缓冲剂等的制剂。

本公开的方法包括使用包含至少单个细胞的微滴。所述细胞是任选地基于所述细胞的特征进行分析或测试以供选择的细胞。考虑到要针对的是细胞的特征，第一微滴通常包含单个细胞。因此，本公开的方法可以包括仅选择包括单个细胞的组的微滴，以及处理空的或多占位细胞的步骤。在该步骤之后，细胞能够***，使得微滴可以包含至少一个细胞。

包含至少一个细胞的微滴形成微滴组。

微滴组由多个微滴形成。微滴组是微滴的集合、组或阵列，每个微滴具有微滴相似的内容物。例如，在包括细胞的微滴组中，所述微滴中的每一个可以包括至少一个细胞，任选地为相同类型(例如B细胞)。微滴组备选地可包括细胞培养基、报告子实体、选择的细胞、扩增的细胞、核酸等。例如，微滴组可能包括50-700,000个微滴。

在本公开的方法中，提供了包括至少一个报告子实体的微滴组。这样的微滴可以包含本文进一步定义的至少一个报告子实体。

本公开的方法涉及微滴组的子集的选择。该选定的子集然后可以形成新的微滴组，以在本公开的方法中进一步使用。

使用真实或虚拟的电润湿电极在装置中操纵微滴。微滴可以***纵成阵列，以便于安排合并、***和检测事件。合并和***事件可以使用真实的或虚拟的电润湿电极来执行。可以使用任何合适的布局来操纵微滴以实现期望的方法。微滴也可以使用诸如声学的替代方法来操纵。

微滴通常通过用所需的组分(如细胞、报告子实体)包封水性制剂来制备。微滴是通过乳化技术形成的。在一个实施例中，乳化是涡旋乳化。在另一个实施例中，乳化是分步乳化。微滴可以在微流体装置上产生，或者可以在其附近产生。

细胞

本公开的方法用于选择具有特定或期望特征的细胞。为避免疑义，所述细胞是生物细胞。细胞可以是天然的。细胞可以是人工的。细胞可以是微细胞。本发明的方法可以是无细胞的并且使用细胞的一部分，例如细胞核和/或线粒体。本发明的方法可以使用脂质体。所述细胞可以取自任何合适的来源，例如来自人或动物、植物或微生物的细胞样品。

细胞可以是来自人或动物任选地哺乳动物的细胞。细胞可以是植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞或ameobal细胞。细胞可以是细胞融合体，例如杂交瘤。

细胞可以取自细胞培养物，例如干细胞、多能细胞、基因工程细胞等的培养物。

如果细胞来源于样品/生物样品，则可能是任何含有至少一种细胞类型的人、动物、环境(天然、人工或改良)或食品样品。样品/生物样品可选自：粪便、外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、***、***液、库珀氏液(cowper's fluid)或***前液、女性***、汗液、粪便物、头发、眼泪、囊肿液，胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、***分泌物、乳腺分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、鼻窦腔灌洗液、支气管肺吸出物、胚泡腔液和脐带血。备选地，样品可以来自组织样品。

细胞可以从患者或个体中分离出来。本文描述的方法可用于筛选此类细胞并将其返回给患者(自体细胞转移)。细胞可以从一个个体中分离出来，并选择施用至患者(同种异体细胞转移)。

对于一些实施方案，含有至少一个细胞的微滴组含有相同类型的细胞，例如淋巴细胞如T细胞。因此，可以在将细胞纳入微滴之前对其进行预选。然而，任何生物细胞都可能发生一些污染，其中不同类型的细胞也可能包括在微滴中，例如，当T细胞是所需类型时，B细胞包括在微滴中。本公开的方法将快速识别这样的微滴，使得它们不被选择至微滴的子集。

对于一些实施方案，微滴组中可能包括不同的细胞类型群体，例如如果环境样品正在用存在的未知细菌细胞进行筛选。

细胞可以是人或哺乳动物细胞。细胞可以是来自任何组织类型的任何合适类型，例如来自身体的器官或组织。

细胞可以是免疫***细胞。这类细胞包括单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞、中性粒细胞(多形核白细胞)树突细胞、小胶质细胞、肥大细胞、T细胞(包括辅助性T细胞、调节性T细胞，细胞毒性T细胞和自然杀伤T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞和造血干细胞。

细胞可以是通过培养技术分离或制备的多能细胞或干细胞。多能干细胞可以是经过重编程的成熟细胞类型。

细胞可以在包封到微滴中之前进行遗传改造。细胞可以在包封在微滴中之后进行遗传改造。

细胞的遗传改造可以通过任何合适的方法，包括转导(病毒基因转移)、基因编辑(使用核酸酶如锌指核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas9碱基和引物编辑)非病毒基因递送(如纳米颗粒递送)、基因敲除、基因敲入和使用RNA的基因操作，例如基因沉默或激活、或光遗传学。遗传改造通常包括通过任何合适的方式将遗传元件引入细胞。

遗传改造可能只是在细胞基因组中引入引起突变的实体，以观察随机突变是否会产生理想的细胞特征。本公开的方法允许筛选具有随机或有意突变的大量细胞，使得可以选择突变后具有期望特征的细胞。这允许优化细胞选择，特别是对于基于细胞的制造。这可以被描述为细胞的“定向进化”。

遗传元件任选地包括与启动子可操作地连接的核酸，其中核酸序列编码期望的产物，例如CAR。

遗传元件可以是包含期望在细胞中表达或包含的目标序列的病毒载体。核酸可以是非病毒“裸”载体，例如用于在细胞中表达的微环。核酸可以包括用于编辑细胞中的基因的基因编辑组分。遗传元件可以包括任何期望的序列，以允许对细胞进行任何期望的遗传改造，例如表达新的细胞表面分子。

在一个实施方案中，细胞可以被遗传改造，同时被封装到微滴中。在该实施方案中，提供了包括至少一个细胞的微滴组和包括至少一种遗传元件的微滴组。因此，本公开的方法可以包括将包括至少一个细胞的组的微滴与包括至少一种遗传元件的组的微滴合并以形成合并的微滴组的进一步步骤。这样的微滴含有至少一种可进行本文所述的选择方法的遗传改造的细胞。然后测定可以确定遗传改造的成功，并且可以丢弃未修饰的细胞。

遗传改造可能涉及在诱导型启动子下提供基因序列。这允许刺激改造的细胞以产生由基因序列编码的产物。

当制备含有细胞的微滴组时，一些微滴可能是空的，因为封装步骤可能只导致培养基的封装，或者细胞可能在封装和方法步骤之间死亡。备选地，***步骤可能导致微滴中缺乏细胞。在这个过程中，细胞的封装将导致液滴的群体，其占有情况通过Poissonian统计描述。

本公开的方法可以与主动控制的液滴生产方法一起使用，以提高单细胞包封的效率。任选地，封装过程提供了包含单个细胞的微滴组。单细胞包封允许在此过程中进行克隆扩增。

然而，可以使用的一些封装工艺可能没有那么有效；在这些***中，每个液滴封装的细胞数量由Poisson统计决定，从而减少了包含所需数量的细胞的液滴的比例，从而降低了单个细胞可以封装的有效速率。因此，由装置的用户选择的封装过程可能导致包含一个或多个细胞的少数细胞。然而，本领域的技术人员能够容忍这种情况，并且这些空的微滴可以经受相同的***和合并操作，并且为了选择的目的而不考虑(discounted)。因此，本文所述的选择方法是灵活的，并且可以与细胞封装的各种方法一起使用。

因此，在使用术语“包含至少一个细胞的微滴组”的情况下，本领域技术人员将理解，一定比例的微滴可能缺乏一个或多个细胞。本公开的方法可以在需要细胞的时候快速识别这种空的微滴，并丢弃空的微滴以供进一步考虑。因此，在包含至少一个细胞的微滴组中，基本上所有的微滴都可以包含至少一个细胞，但是一些或一部分可以是空的。微滴组也可以故意包含空的微滴作为对照或位置标记。

微滴组还可以包含对照微滴，例如含有具有已知特征的细胞或已知产物/分子(例如抗体)的微滴，使得它们可以为报告子实体提供阳性对照。阴性对照也可能包括在内；这可能是细胞或产物/分子，预计不会与报告子实体产生阳性结果，也可能是空液滴或培养基液滴。

类似地，其中使用术语“包含一个或多个报告子实体的微滴组”，本领域技术人员将理解，一定比例的微滴可能缺乏一个或多个报告子实体。本公开的方法可以识别这种空的微滴并去除任何不包含所需报告子实体的微滴；然而，一些不具有所需报告子实体的液滴可能仍然存在于测定中。在某些情况下，没有报告子实体的液滴可以被引入到组的子集中，作为阴性对照。基本上所有的组都可以包括报告子实体。

细胞特征

可以基于一个或多个特征来选择待选择的细胞。

这样的特征可以包括以下任意一个或多个性质和/或存在或不存在以下任意一个或多个：

细胞表面分子、活化概况、增殖能力、分泌能力、分泌产物的亲和力、分泌产物的功能行为、制造细胞内产物的能力、成活力、形态学和/或细胞与细胞相互作用能力(例如细胞杀伤或细胞活化或细胞聚集)。

可以基于任何期望的特征组合来选择细胞，这些特征可以基本上同时(多路)或顺序地进行测试。因此，可能需要多于一个的报告子实体，或者可能需要多于一组的包含至少一个报告子实体的报告子微滴。连续的选择轮可以允许选择包含至少一个细胞的微滴的子集。

在一个实施方案中，所确定的特征是一种或多种细胞表面分子或标记物的存在或不存在。所有细胞都表达可用于帮助区分细胞类型的特征分子标记物(例如：蛋白质、脂质、糖基化标记物)。细胞表面分子或标记物的特定组合可用于识别特定细胞。

在一个实施方案中，细胞表面标记物是CD分子。CD代表分化簇(也称为命名簇或分类决定簇，通常缩写为CD)。使用CD分子进行细胞表型分析是可能的。这些标志物通常但不完全与某些免疫功能相关。示例性地，可以通过CD3、CD4或CD8的存在来鉴定各种T细胞；通过CD19或CD20鉴定B细胞，通过CD56鉴定NK细胞。

在一个实施方案中，细胞表面分子或标记物是细胞表面受体、细胞表面转运蛋白、细胞粘附蛋白、细胞表面信号传导分子和负责细胞：细胞相互作用的细胞表面分子。

在一个实施方案中，细胞表面标记物是人工的、合成的或嵌合的细胞表面标记物，细胞已被遗传改造以产生细胞表面标记物。

任选地，人工细胞表面标记物是嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以由四个区域组成：抗原识别结构域、细胞外铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。抗原识别结构域暴露于细胞外部，与潜在的靶标分子相互作用，并负责将修饰的细胞靶向任何表达匹配分子的细胞。抗原识别结构域通常来源于作为单链可变片段(scFv)连接在一起的单克隆抗体的可变区，但也可以来源于工程化的单个结构域。非抗体方法也用于开发CAR，例如使用通常相互结合的配体/受体对。

细胞表面标记物(天然的或修饰的)可用于在选择期间选择细胞以定义细胞的第一子集或细胞的第二子集或另外的子集。

在一个实施方案中，细胞选择可以基于细胞表面标记物或分子。因此，报告子实体可以是与细胞表面标记物或分子相互作用的实体。

在一个实施方案中，所确定的特征是来自细胞的一种或多种分泌物的存在或不存在。许多细胞能够分泌，例如哺乳动物细胞不断将蛋白质分泌到细胞外基质中。不同的特化的细胞可能有专门的分泌物，例如免疫细胞可能表达分泌蛋白，如细胞因子、免疫球蛋白、配体和受体。细胞可以分泌蛋白质，包括糖蛋白或脂蛋白、化学物质、核酸、聚合物或分子。分泌是将物质从细胞内部转移到细胞外部的步骤，这可能使用取决于细胞类型的各种途径。例如，细胞外小泡可以包括在本发明的任何实施方案中。细菌细胞可能依赖分泌能力来适应和存活。

分泌可以是细胞的固有分泌，例如免疫球蛋白，例如来自B细胞的抗体，或者分泌可能是由于细胞的基因工程引入了用于分泌的基因或编码序列。在一个实施方案中，细胞是B细胞或杂交瘤，并且分泌物是单克隆抗体。

分泌物可以具有或可以不具有期望的特征，例如结合能力。这可能由一个或多个报告子实体进行询问。

在一个实施方案中，细胞选择可以基于来自细胞的分泌。因此，报告子实体可以是与细胞分泌相互作用的实体。细胞分泌可通过将微滴***成含有至少一个细胞的参考微滴和含有存在分泌的培养基的测试微滴而与细胞分离。

在一个实施方案中，确定的特征是由细胞产生的一种或多种细胞内产物的存在或不存在。大多数(如果不是全部的话)细胞能够用来生产蛋白质，包括糖蛋白和脂蛋白，但一些细胞，特别是细菌，能够制造化学物质、核酸和其他聚合物。基因工程细胞被改变以产生所需的产物，该产物可能不会分泌，但保留在细胞内，因此必须裂解细胞才能释放所需产物。

细胞内产物可以具有或可以不具有期望的特征，例如催化能力。这可能由一个或多个报告子实体进行询问。

产物可以是细胞的固有产物，或者产物可能是由于细胞的基因工程引入所述产物的基因或编码序列。

在一个实施方案中，细胞选择可以基于对细胞内产物的检测。因此，报告子实体可以是与所述产物相互作用的实体。产物可以由可以进入细胞的报告子实体原位检测，或者产物可以通过在测试微滴内的细胞裂解从细胞分离。

细胞内产物可以是任何合适的生物或化学分子。细胞内产物可以是蛋白质，例如激素、酶、细胞信号传导分子、信号转导分子、免疫球蛋白等。细胞内产物可以是核酸，例如RNA、DNA或其杂交体。细胞内产物可以是化学物质，例如杀虫剂、毒素、抗生素、燃料、药物、疫苗、抗病毒药物等。

在一个实施方案中，基于增殖能力来选择细胞。这种选择可以通过检测细胞***事件的存在(微滴中细胞数量的增加)或基于增殖标记物来确定。增殖标记物可以使用特异性的报告子实体来检测。

在一个实施方案中，基于形态学来选择细胞。这种选择可以通过例如使用适当的光学检测手段对细胞进行视觉检查来确定。细胞的形态包括大小、形状、细胞粘附特性的存在/不存在、细胞膜中突起如泡的存在/不存在、细胞内实体如液泡的存在或不存在中的任意一种或多种。

在一个实施方案中，基于与报告子实体的相互作用的结果来选择细胞，其中报告子实体是细胞。相互作用可以是细胞和报告子实体之间的相互作用，也可以是分泌物和报告子实体之间的相互作用。报告子实体细胞可以是任何细胞类型，例如肿瘤细胞、细胞系、类瘤、细菌细胞、免疫***呈递细胞(例如抗原呈递细胞)。响应于报告子实体细胞，待选择的细胞可以被活化，可以被诱导以分泌分子，和/或可以促进报告子实体细胞的细胞活化或死亡，或者分泌可以与其结合。

基于细胞与报告子实体细胞直接或间接(通过分泌)相互作用的结果来选择细胞可以允许适合确定治疗适应症的特征。

可以基于任何数量的期望特征和/或不存在不期望特征来选择细胞。这些可以基于本文描述的特征的任何组合。

报告子

本文所述的方法涉及至少一个包括至少一个报告子实体的微滴组的使用。可以使用任何合适数量的组，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多组。每个组可以包括一个或多个报告子实体，每个报告子实体是不同的。

包含至少一个报告子实体的任何微滴组可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个报告子实体。

报告子实体是能够与细胞、细胞产物或细胞分泌相互作用以提供可检测的变化的任何合适的实体。报告子实体可以是以下实体中的任意一个或多个或其衍生物：

i.抗体；

ii.抗原；

iii.受体；

iv.配体；

v.底物；

vi.酶；

vii.配体；

viii.核酸；

ix.细胞；

x.细胞的一部分；

xi.细胞外小泡；

xii.脂质体；

xiii.聚合物；

xiv.化学物质；

xv.药物；

xvi.FRET报告子；

xvii.化学发光材料；

xvii.组织样本；

xix.病毒或噬菌体；

xx.细胞因子；和/或

xxi.蛋白质。

报告子实体能够与细胞或其部分或衍生物(如产物或分泌物)相互作用，并且正是这种相互作用导致了报告子实体中可检测的变化。这种变化可以是结合、退火、聚集、分离、扩增、构象、活化和/或破坏。报告子实体可以适合于直接监测可检测的变化，例如在报告子实体细胞的情况下。报告子实体可以与结构结合/缀合，所述结构例如珠粒或标记，例如可见、发色、发光、荧光或磷光标记，蛋白质互补，例如***荧光、***发光或荧光配体。

备选地或附加地，报告子实体的变化可以由第二实体检测，第二实体可以被标记(例如可见、发光、荧光或磷光标记)。第二实体可以检测例如报告子实体与细胞的结合，并且是二抗或其衍生物。备选地或附加地，报告子实体可以与酶缀合或连接，并且该酶的底物可以作为第二实体加入，其引发用于检测的可见、发色或荧光信号。本领域技术人员将知道用于确定特定分析物的存在的多种测定手段。

通常，报告子实体将是抗体或其片段或衍生物(例如抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、小型化抗体或亲和体(affibodies))。

在一个实施方案中，微滴的测试组与包含多个报告子实体的微滴组接触。因此，可以对细胞进行“多元素报告子测定”或“多报告子细胞表面标记物测定”。这是由报告子实体***询问大量特征的测定，每个报告子实体都能够产生单独的可检测变化。

在一个实施方案中，报告子组中的至少一个包括至少一个报告子实体细胞。细胞可以是任何合适的细胞类型，包括肿瘤细胞、癌症细胞、细胞系、类肿瘤、呈递细胞、辅助细胞或不希望与之相互作用的“脱靶”细胞。检测到报告子实体细胞中的变化。这种变化可以是细胞死亡或破坏、细胞活化或细胞聚集。这些变化可以通过视觉观察(通过适当的放大倍数)或通过第二实体来观察，该第二实体检测微滴中适当的分析物，例如内部细胞成分、细胞信号传导分子例如细胞因子的存在或上调的细胞表面分子的存在。备选地或附加地，报告子实体细胞可以被基因工程化以包括与事件(例如受体活化)相关的至少一种报告子基因。一旦发生这种事件，细胞内信号传导级联活化报告子基因，报告子基因产生可测量的信号(例如，荧光素酶基因，当提供必要的底物时其产生光)。

在一个实施方案中，至少一个报告子组包括以下中的至少一个或多个：

i.抗原或配体缀合的珠粒和荧光染料缀合的二抗；

ii.二抗缀合的珠粒和荧光染料缀合的抗原或配体；或

iii.与载体表面缀合的抗原或配体和荧光染料缀合的二抗珠粒。

这种报告子实体可用于检测能够结合的分子，如抗体、受体、酶等。测定设计领域的技术人员将知道报告子实体的所有可能组合以及如何检测和报告特征。

对于CAR-T细胞，以下实体是合适的特征：CD4、CD8、CD19、scFv结构域标记物(用于特异性和/或亲和力筛选)、B细胞标记物(或用于其他不需要的污染物细胞的标记物)和/或分化标记物(选择相关的子组)。

检测

能够检测到报告子实体中的变化。如上所述，检测可以是对可见事件的简单观察，尽管需要放大(显微镜)。因此，检测事件可以是对变化的视觉检测。

几个实施方案的检测是光学的，例如所使用的标记可以是可视的、发色的、发光的、荧光的或磷光的。可以采用适合所有的检测技术。

检测***可用于筛选每个微滴的每个独立报告子实体的信号。在一个实例中，可以对一组合并的微滴进行成像，并且可以检测和定量其任何变化。这种测定的结果可用于确定细胞特征(表型)，从而允许通过它们表达的标记物、它们所具有的活性或它们可能或分泌的产物来筛选单个细胞。

例如，检测***可以使用高灵敏度相机实现广泛的高质量成像。在一些实施方案中，检测***可以支持多通道荧光检测，能够进行暗场成像、明视场成像和细胞形态的检测。高质量成像可以由多个物镜支持，包括高N.A.(60x)透镜。可以检测不同的报告子实体信号，并且可以对每个微滴的强度进行空间量化，从而促进细胞的高通量筛选。

选择

本文公开的方法允许根据细胞的特征来选择细胞的子集。微滴组中的细胞是基于某些特征，例如细胞表面标记物/分子、内部细胞产物或来自细胞的分泌物来选定或选择的。这些特征可能涉及分泌物或细胞内产物的特异性/活性。所选定的或所选择的细胞形成微滴组的子集。含有至少一个细胞的剩余微滴可以被丢弃或不考虑。可以对如此选择的微滴的子集进行另外的步骤，其中另外询问或测定细胞的特征，从而选择另外的子集。一旦进行了本文所述方法的最后步骤，包含至少一个细胞的微滴的最终子集包含所选择的细胞。

所选择的一个或多个细胞然后可以从该装置中分配。一旦从装置中选择并分配，细胞可以进行进一步的测定，或者可以进行培养以促进细胞维持和/或扩增。在分配之后，细胞可任选地被制备用于输注或再输注到患者中。在分配后，可以扩增细胞以用于生产治疗性实体，例如免疫球蛋白或药物。

在一个实施方案中，所选择的细胞存在于包含至少一个细胞的微滴的参考组中。参考组包括与测试组中的微滴相关的微滴，因为它们都来源于相同的祖微滴。在一个实施方案中，祖细胞微滴的***产生含有至少一个细胞的参考组微滴和含有至少培养基的测试组微滴。培养基可以包含来自细胞的分泌物，这是所述细胞的特征。在替代实施方案中，祖细胞微滴产生含有至少一个细胞的参考组微滴和含有至少一个细胞的测试组微滴。因此，所述参考组微滴包含作为含有经过测定以确定细胞特征的至少一个细胞的微滴组的克隆或克隆拷贝的细胞。选择步骤可能涉及裂解测试组中的细胞，这在选择用于进一步扩增的细胞时是不希望的。

因此，根据任何实施方案，从微滴的测试组上的测定获得的结果可以与参考组中的细胞直接相关；使得选择的是来自参考组的细胞。这样的步骤的优点是，参考组细胞可能没有暴露于某些报告子实体(例如暴露于肿瘤细胞)，这些报告子实体可能对细胞有害，或者在用于治疗目的的细胞制备中是不希望的。

可以基于特征的存在、特征的不存在或两者的混合物来选择细胞。因此，可以使用本文所述的方法测试或分析细胞、提取物或分泌物的多种特征。在一个实施方案中，在单个步骤中同时测试细胞的多种特征。如果使用不同的手段检测报告子实体中的变化，例如荧光、发光和磷光标记或事件，则可以实现这种多路测试。检测手段还可以包括蛋白质互补事件，例如***荧光、***发光或荧光配体。

所选择的细胞可以进一步从装置中分配，使得它们可以在进一步使用之前被培养并允许进行细胞***。在一个实施方案中，所述细胞用于输注到患者体内。在一些实施方案中，在分配所选择的微滴组之后，处理其中包含的细胞以增殖群体和/或培养克隆。

在从装置中分配后，可以对微滴子集中包含的细胞和/或非细胞实体(如分泌物、代谢物)进行进一步分析，包括但不限于以下任意一种或多种：

I.质谱法；

II.表面等离子体共振；

III.高效液相色谱法；和/或

IV.基因分析，包括核酸测序和PCR扩增。

培养基

将细胞封装在用于本公开的方法的微滴中。根据任何实施方案的细胞通常在培养基中供应，所述培养基通常为水性培养基。培养基只是培养细胞的物质。该培养基可以是基本培养基，其包含足够的材料来支持细胞，并且这种基本培养基的含量将取决于被封装的细胞类型。所需的成分将根据所研究的细胞类型而变化，并且本领域技术人员将理解如何鉴定用于该任务的正确培养基。

通常，细胞培养基可以含有碳源(例如糖如葡萄糖)、水、一种或多种盐、pH缓冲液、氨基酸和氮的来源。如果需要，培养基可以补充有帮助或促进细胞***或细胞存活的分子或试剂。这包括适当的营养物质、生长因子、信号传导分子(如细胞因子)、维生素、盐、血清蛋白、辅因子、碳水化合物、气体、微量元素和抗生素。

示例性培养基是Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)，其是基础培养基并且不含蛋白质或生长促进剂。因此，它需要补充成为一种“完整”的培养基。最常见的是补充5-10％的胎牛血清(FBS)。DMEM已被发现广泛应用于哺乳动物细胞培养，也可用于培养杂交瘤。另一种培养基是Eagle氏基本必须培养基(EMEM)。EMEM含有平衡盐溶液、非必需氨基酸和丙酮酸钠。由于EMEM是一种非复杂的培养基，它通常通过额外的补充剂或更高水平的血清进行强化，使其适用于广泛的哺乳动物细胞。RPMI是一种通用培养基，在哺乳动物细胞，尤其是造血细胞中广泛应用。RPMI是McCoy’s 5A的改良，是为外周血淋巴细胞的长期培养而开发的，支持多种细胞在悬浮液中生长。如果补充血清或血清替代物，这种培养基在哺乳动物细胞中广泛的应用，包括新鲜人淋巴细胞的培养、融合方案和杂交细胞(如用于抗体制备的小鼠杂交瘤细胞)的生长。它还经常用于保存/悬浮外周血单个核细胞。许多类型的细胞培养基是可用的，并且应该选择这样的培养基来优化细胞类型的存活以供选择。

本公开的方法可涉及将包含至少一个细胞的微滴组***成包含至少一个细胞的微滴参考组和包含至少培养基的微滴测试组。本领域技术人员将理解，一些测试组微滴也可以包含细胞，特别是如果细胞***已经在包含至少一个细胞的祖微滴中发生。

在一个实施方案中，包含至少一个细胞的微滴已经经历了***操作，其中已经创建了包含至少一个微滴的细胞的参考组。这导致细胞的克隆拷贝的保存，使得如果在任何后续步骤中刺激测试组中的细胞可能导致损伤细胞，则仍然可以选择来自参考组或微滴的细胞。特别地，这种损伤可能源于裂解细胞以获得遗传物质或细胞内产物的过程。

在使用这种***来分离细胞和培养基的情况下，可以在允许分泌物在培养基中积累的条件下培养含有至少一个细胞的祖微滴。这样的条件可以包括在培养基中提供促进分泌的试剂，例如刺激性或信号传导分子(例如细胞因子)，或者包括与细胞相互作用以诱导分泌物形成的细胞，例如抗原呈递细胞。或者，如果分泌物已经被基因工程化以由细胞产生，则可以应用该工程化以使分泌物的表达具有条件，从而在添加化学物质(例如乳糖)时激活表达。因此，可以提供适当的信号来启动表达。

一旦细胞被培养以促进分泌，微滴组就可能被***。可以使用真实的或虚拟的电润湿电极来进行***操作。在一个实施方案中，微滴组中的每个微滴被***以形成至少两个子液滴组。这些子液滴可能大小大致相同，或者***可能不对称，使得一组微滴具有更大的尺寸。当微滴被***时，一个子液滴可以接收至少一个细胞，并且这样的微滴形成参考组。当微滴被***时，一个子液滴可以与任何分泌物一起接收培养基，因此微滴形成测试组。

培养基内分泌物的存在可以如本文所述来确定。在测试组的微滴上采用一系列合并和***事件可能是有用的，例如合并一个或多个含水微滴组，使得微滴测试组内的分泌物可以被稀释或洗涤。

含有细胞和培养基的微滴可以保持在用于维持细胞的最佳条件下，条件例如环境和温度受到控制。如WO2020/104769中所述，维持细胞可涉及提供含有一种或多种饱和水平的营养物质、缓冲剂、氮、氧和/或二氧化碳的不混溶载体液体的流动流。

本领域技术人员将理解，含有至少一个细胞的微滴也将固有地包括培养基，因为微滴本质上是水性的。

细胞***

本公开的方法可以包括允许含有至少一个细胞的微滴组进行细胞***的步骤。细胞***是一个亲本细胞***成两个或多个子细胞的过程。在这种情况下，每个子细胞可能在基因上与亲本细胞相同(如果是真核细胞，则该细胞已经历有丝***)。原核生物(细菌和古细菌)可能会发生二***，它们的遗传物质被平均分离成两个子细胞。这些细胞可以被描述为克隆，因为遗传物质应该是相同的。

在一个实施方案中，允许含有至少一个细胞的微滴组进行克隆扩增。克隆扩增是子细胞从母体细胞中产生的过程，通常是应用于特定类型的细胞，如免疫细胞(例如NK细胞、B和T淋巴细胞)的术语。

对于本公开的方法，允许或鼓励在微滴组中进行细胞***或克隆扩增。可以向细胞提供允许所述细胞***的适当条件，包括在微滴内提供适当的培养基，添加相关的补充分子，例如营养物质、细胞因子、维生素、激活剂、激素或生长因子。本领域技术人员将意识到，细胞***所需的条件将根据所讨论的细胞类型而变化。

在一个实施方案中，存在于含有至少一个细胞的微滴组中的细胞是免疫细胞，例如淋巴细胞(NK细胞、B细胞或T细胞)。这种免疫细胞可能需要活化以触发克隆扩增。活化可能涉及信号传导分子，例如特异性细胞因子。活化可备选地或另外涉及与免疫细胞上的特异性细胞表面受体结合。这可以使用针对这些受体的抗体结合。或者，可以使用适当的细胞(例如抗原呈递细胞，APC)来提供活化。

在一个实施方案中，包含至少一个T细胞的微滴组可以包含或与包含至少一种T细胞激活剂(例如抗CD3抗体或抗CD28抗体)的微滴组合并。

在一个实施方案中，可以最低限度地刺激/活化细胞，使得在微滴内发生最低限度的细胞***。

如果细胞未能活化或经历细胞***，这种缺乏细胞(克隆)的进一步拷贝的情况可能导致无法选择微滴。因此，活化和/或***能力可以是在本公开的方法中选择的特征。

一旦细胞已经被培养以促进细胞***，就可以***组或微滴。可以使用真实的或虚拟的电润湿电极来进行***操作。在一个实施方案中，微滴组中的每个微滴被***以形成至少两个子液滴组。这些子液滴可能大小大致相同，或者***可能不对称，使得一组微滴具有更大的尺寸。当微滴被***时，每个子液滴都可以接收至少一个细胞。没有至少一个细胞的微滴可以被丢弃或从选择中忽略。***微滴中的细胞实际上在遗传上是相同的或是克隆。

在一个实施方案中，在细胞***之后，包含至少一个细胞的微滴组被分成两个组；微滴的参考组和测试微滴的组，其可进一步用于本文所述的方法中。本公开的方法允许基于对含有至少一个细胞的微滴组中的细胞特征的测定和/或测试来选择微滴参考组的细胞，因为两者都含有遗传上相同的细胞。

本文描述的方法是指对细胞进行“培养”以允许细胞***。这种技术只是细胞在微滴环境中的生长。可以使用有利于生长的条件，例如本文所讨论的合适的细胞培养基、营养物质等。本领域技术人员将了解促进细胞生长和***的细胞培养技术。

微滴的鉴定和追踪

本公开的微滴能够在本文所述的装置上被适当地操纵。微滴操作的控制可以是计算机实现的。微滴在装置上的位置允许鉴定所述微滴，从而鉴定相关或对应的微滴，例如源自祖微滴的***事件的微滴。当报告子实体在测试组中指示结果时，这允许从参考组中选择微滴。此外，当从微流体芯片中回收由***事件产生的微滴之一并将其分配到外部微孔板中时，***事件的原始祖微滴(保留在参考组中的芯片上)可以对应于芯片外测定的结果，例如对相关子液滴进行的DNA测序、PCR或质谱分析。

在一个实施方案中，不需要对任何组的微滴进行标记或打上条形码。

可以根据微滴在组内的位置来确定微滴的身份。微滴的位置和因此的身份可以由软件控制。一旦在与报告子实体微滴合并的微滴内确定了细胞的特征，就有可能将该结果与相应的参考组微滴相关联，该参考组微滴涉及同一细胞。

上述测定步骤的软件控制允许根据特定细胞类型或报告子测定的精确要求来调整和修改操作顺序。例如，在分泌缓慢的细胞的情况下，可以调整报告子组液滴合并之前的孵育期。可以执行软件算法以使分析步骤响应于芯片上发生的与时间相关的事件。在细胞***的情况下，图像识别软件可用于计算微滴中的细胞数量，并在细胞数量达到特定水平后触发***液滴的过程。在一些实施方案中，微滴是包含在微结构阱内的流体液滴，微结构阱例如微流体芯片内的微型阀结构或密封室结构内的流体保持笔。在一些实施方案中，通过应用机械结构或微结构的变形来执行***液滴的过程。在一些实施方案中，使用声学操作来***液滴。

在一些实施方案中，通过使用机械致动、电泳、声波或离心力使微滴彼此碰撞来进行合并微滴的过程。

方法

本公开涉及允许选择细胞的方法，特别是一旦选择完成就允许进一步使用细胞的选择细胞的方法。

在一个实施方案中，该方法如下：

和进一步地，其中在步骤(i)至(v)中的任一个之前或之后，将包括至少一个细胞的微滴的测试组***成至少两个微滴组，所述组是：包括至少培养基或培养基和至少一个细胞的适于与报告子组的微滴合并的微滴测试组；以及包含至少一个细胞的微滴的参考组。

因此，可以基于一个或多个特征来选择细胞。

i.提供微滴组，所述微滴包含一个或多个细胞和培养基；

ii.将所述微滴组***成至少两个微滴组，至少一个包含一个或多个细胞的微滴的参考组，以及至少一个包含至少所述培养基的微滴的测试组；

i)提供微滴组，所述微滴包含至少一个细胞和培养基；

ii)提供至少一个报告子微滴的组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

iv)使用能够基于所述细胞的一个或多个特征检测所述报告子实体中的变化的检测***来监测所述合并的微滴组，并且基于所述报告子实体中的所述变化来选择微滴的子集以形成所选择的包含细胞的微滴组；

vi)基于在步骤(v)中选择的最终的微滴组来选择细胞；

b.微滴的参考组，所述微滴包含至少一个细胞。

以下特征可应用于本文所述的任何方法：

任何组的微滴都可以进行多次合并和***操作，目的是稀释微滴的内容物，或“洗涤”微滴的内容物。这样的操作包括将微滴组与含有培养基、缓冲液或合适的水溶液的一个或多个微滴组合并，并将合并的微滴组***成至少两个子微滴组。该步骤可以连续进行以进一步稀释内容物。

在一个实施方案中，成对地合并各个组中的微滴；使得一对(两个)微滴被合并以形成新的微滴。该配对步骤可以执行不止一次，使得多个微滴被组合以形成合并的微滴。因此，合并微滴的步骤最终可能涉及2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个微滴。每一个可以被顺序地或基本上同时地合并。

当多组微滴有效地同时合并时，每个组中的一个微滴被合并以形成新的合并的微滴组。用于该合并操作的微滴集合可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个微滴，每个微滴来自单独的组。

在提供包含至少一个报告子实体的多个微滴组的情况下，每个组可以包括包含至少一个报告子实体的微滴。每个报告子实体都可以用于确定特定细胞特征的存在或不存在。或者，在合并步骤中可以采用包含多个报告子实体的单个微滴组。

在一个实施方案中，步骤(ii)涉及使用报告子实体来确定细胞的细胞表面特征，例如特定细胞标记物或分子的存在或不存在。微滴的测试组然后可以与另一个微滴的报告子组合并；然后可能涉及使用报告子实体来确定细胞：细胞的相互作用特征，例如活化或杀死另一种细胞类型的能力。

或者，在不同的实施方案中，这些步骤被颠倒，例如首先使用报告子实体来表征细胞，所述报告子实体用于确定细胞：细胞的相互作用特征，例如活化或杀死另一种细胞类型的能力，其次使用报告子实体进行表征，所述报告子实体用于确定所述细胞的细胞表面特征，例如特定细胞标记物的存在或不存在。

如果使用将微滴的测试组与微滴的报告子组合并的多个步骤，则可能在这种多个步骤之前、期间或之后采用***步骤，从而在该方法中的任何适当点构建包含细胞的微滴的参考组。因此，参考组可以表示最初提供的细胞的子集。

在一个实施方案中，在将包含至少一个细胞的微滴组与包含至少一个报告子实体的报告子实体组合并之前，将微滴***成至少两个微滴组，使得可以保留包括至少一个细胞的参考微滴组。然后，这些细胞不与可能对细胞有害的报告子实体接触，或阻止细胞在治疗等中的进一步使用。另一个构建的微滴组(“测试组”)可以包含培养基或培养基和至少一个细胞。在***步骤之前，可以在允许细胞***或细胞分泌的条件下培养细胞。

在特定实施方案中，所述方法包括：

使用EWOD或oEWOD装置选择免疫细胞如用编码CAR的核酸转染的T细胞的方法，其包括以下步骤：

i)提供微滴组，所述微滴包括用编码CAR的核酸转染的至少一个免疫细胞；

ii)提供至少一个报告子微滴组，所述报告子微滴包括对细胞表面标记物具有特异性的一个或多个报告子实体；

iii)将包括至少一个细胞的组的微滴与报告子组的微滴合并，以形成合并的微滴组；

iv)使用能够基于一个或多个细胞表面标记物的存在检测所述报告子实体中的变化的检测***来监测所述合并的微滴组，并且基于所述报告子实体中的所述变化来选择微滴子集以形成所选择的包含至少一个细胞的微滴组；

v)取出所选择的包含至少一个细胞的微滴组，并任选地在其上重复步骤(ii)至(iv)一次或多次，其中在步骤(ⅱ)中使用一种或多种不同的报告子实体，并且包括细胞；

vi)基于在步骤(iv)或(v)中选择的最终的微滴组来选择细胞；

其中在步骤(iii)和/或步骤(v)之前，培养包含至少一个细胞的微滴组以允许细胞***，并随后***成至少两个包含至少一个细胞的微滴组，所述组为：

a.微滴的测试组，所述微滴包含至少一个细胞；和

b.微滴的参考组，所述微滴包含至少一个细胞。

免疫细胞可以是T细胞。可检测的T细胞的合适标记物包括以下中的任意一种或多种：

CD4、CD8、CD19、scFv结构域标记物(用于特异性和/或亲和力筛选)、B细胞标记物(或用于其他不需要的污染细胞的标记物)和/或分化标记物(选择相关的子组)。

不能***、活化或具有必要细胞杀伤特性的细胞(T细胞)可以被丢弃。

在不同的实施方案中，该方法提供：

使用EWOD或oEWOD装置选择遗传修饰的造血干细胞的方法，其包括以下步骤：

i)提供微滴组，所述微滴包括至少一个遗传修饰的造血干细胞；

ii)提供至少一个报告子微滴组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

iv)使用能够基于所述细胞的一个或多个特征检测所述报告子实体中的变化的检测***来监测所述合并的微滴组，并且基于所述报告子实体中的所述变化来选择微滴子集以形成所选择的包含至少一个细胞的微滴组；

v)取出所选择的包含至少一个细胞的微滴组，并任选地在其上重复步骤(ii)至(iv)一次或多次，其中在步骤(ⅱ)中使用一种或多种不同的报告子实体；

vi)基于在步骤(iv)或(v)中选择的最终的微滴组来选择细胞；

a.微滴组，所述微滴包含至少一个细胞，适于与报告子组的微滴合并；和

b.微滴的参考组，所述微滴包含至少一个细胞。

在不同的实施方案中，该方法提供：

在EWOD或oEWOD装置中基于免疫球蛋白的产生来选择细胞的方法，所述方法包括：

i.提供微滴的测试组，所述微滴包括至少培养基或培养基和至少一个免疫细胞；

ii.提供至少一个微滴的报告子组，所述微滴包含一个或多个报告子实体；

iv.使用能够基于至少一个免疫球蛋白的存在检测所述报告子实体的变化的检测***来监测所述测定微滴组，以及

和/或进一步地，其中在步骤(i)至(v)中的任一个之前或之后，将包括至少一个细胞的微滴的测试组***成至少两个微滴组，所述组是：包括至少培养基或培养基和至少一个细胞的适于与报告子实体组的微滴合并的微滴测试组；以及包含至少一个细胞的微滴的参考组。

在不同的实施方案中，该方法提供：

在EWOD或oEWOD装置中基于药物的产生来选择基因工程细胞的方法，所述方法包括：

i.提供微滴的测试组，所述微滴包括至少培养基或培养基和至少一个基因工程细胞；

iv.使用能够基于至少一种药物的存在检测所述报告子实体的变化的检测***来监测所述测定微滴组，以及

和/或进一步地，其中在步骤(i)至(v)中的任一个之前或之后，将包括至少一个细胞的微滴的测试组***成至少两个微滴组，所述组是：包括至少培养基或培养基和至少一个细胞的适于与报告子实体组的微滴合并的微滴的测试组；以及包含至少一个细胞的微滴的参考组。

以下特征可应用于本文所述的任何方法：

使用真实的或虚拟的电润湿电极来实现对任何组内的微滴的操纵。当合并微滴时，这涉及多个单独的微滴的组合以形成单个微滴。

任选地，该方法可以包括在任何合并步骤之前允许在装置上进行分化的进一步步骤。报告子实体可以确定通过基因工程引入的转基因的活性，或者可以寻找特定的细胞表面标记物、细胞产物或细胞分泌物。

在备选实施方案中，该方法是基于遗传添加的转基因的表达来选择特定的遗传修饰细胞，其中该转基因可以用于生产产物(例如化学物质或蛋白质)。

使用EWOD或oEWOD装置选择遗传工程细胞的方法，包括以下步骤：

i)提供微滴组，所述微滴包括至少一个基因工程细胞；

vi)基于在步骤(v)中选择的最终的微滴组来选择细胞；

a.微滴的测试组，所述微滴包含至少一个细胞；和

b.微滴的参考组，所述微滴包含至少一个细胞。

任选地，该方法可以进一步包括在与微滴的报告子组合并之前裂解组的微滴中的细胞的步骤。这样的步骤通常在每个微滴包含至少一个细胞的参考组已经建立之后进行。

细胞可以是适合于基因修饰的任何类型的细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、细菌或真菌。

本文公开的方法的任何组合都是可考虑的，并且执行该方法的方法步骤和顺序将取决于所选细胞的性质和所需的特征。

微滴也可以称为液滴。

实施例

本发明的某些方面和实施方案现在将通过实施例的方式并参考上述附图来说明。本文所述的方法在专有的微流体装置(Lightcast Discovery LTD，UK)上进行。

实施例1–示例性CAR-T工作流程

该工作流程针对CAR-T细胞制造过程中的特定窗口，从T细胞的基因修饰开始，到选定的T细胞大量扩增和回输到患者体内之前结束(如图1所示)。

从根本上讲，CAR-T细胞的选择采用两部分筛选，包括：1)多报告子细胞表面标记物测定；以及2)活化评估，并且这些步骤可以按任意顺序执行。

采集患者血液并分离患者来源的T细胞(未修饰的)。通过常规方法将这些T细胞乳化成微滴，并装载到微流体平台上。然后转导T细胞——该步骤包括将一组所述微滴(每个微滴都包含T细胞)与一组微滴(每个都包含载体)成对合并，以形成第一组合并的微滴。所述载体包含可操作地连接到启动子的核酸，其中所述核酸序列编码嵌合抗原受体。在转导之后，T细胞进行第一筛选步骤。必要时丢弃空的或多占位的微滴(图2)。

多元件报告子测定可涉及使用检测***来分析转导的T细胞上的多种标记物，然后在此基础上选择微滴。例如，报告子方案可以包括以下标记物：CD4/CD8、CD19、scFv结构域标记物(用于特异性和/或亲和力筛选)、B细胞标记物(或用于其他不需要的细胞的标记物)和/或分化标记物(选择相关的亚组)。分析T细胞上的多种标记物涉及将含有转导的T细胞的微滴与含有报告子的微滴(例如一抗和荧光染料缀合的检测抗体)合并的步骤。次优细胞在扩增前的最早可能阶段被去除。这为以后的扩增和分析步骤提供了尽可能好的输入。从这里开始，选定的微滴进入剂量测定和分析阶段(如图2所示)。

CAR-T细胞的参考组可以通过在细胞被活化并允许***后***包含至少一个CAR-T细胞的微滴组来构建。

所选微滴的细胞在芯片上扩增，评估成活力以及活化和耗竭行为。例如，活性筛选可以包括抗肿瘤活性和效力的筛选。用于评估抗肿瘤细胞活性的详细方法描述于实施例3中。根据这些测定的结果，丢弃不需要的微滴，并选择最终的微滴组，其可以是参考组的子集。芯片上活性测定将例如涉及将含有一定剂量T细胞的微滴与含有不同T细胞/肿瘤细胞比例的肿瘤细胞或类肿瘤的微滴合并，并测量T细胞的癌细胞杀伤活性。在这个阶段可以评估剂量疗效和安全性概况。这些T细胞的基因组可以测序，单细胞基因组数据可以在这里获得(图3)。

可以将最终选择的微滴子组的T细胞从装置分配到孔板中，用于批量扩增，随后再注入患者体内(图3)。该方法允许所选细胞的尽可能好的一致性和成活力，并能够定量疗效和安全性概况信息。

实施例2-免疫肿瘤学工作流程

修饰中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以产生免疫治疗药物(例如TCR)，然后乳化成微滴并装载到微流体平台上。丢弃空的或多占位的微滴。将剩余的含有单个CHO细胞的微滴在芯片上孵育，以促进免疫治疗药物的生产。然后将含有CHO的液滴***，以获得每个细胞产生的多剂量药物。将T细胞和靶标肿瘤细胞分别乳化并装载到微流体平台上的阵列中，根据需要调节每个微滴的细胞占有情况。然后将T细胞和肿瘤细胞阵列合并。第二次合并操作用于添加一定剂量的免疫治疗药物，跟踪每个剂量来自哪个CHO细胞。孵育得到的测定微滴，并使用检测***通过检测胱天蛋白酶3/7荧光(细胞凋亡的荧光标记物)来监测T细胞杀伤行为。产生有效剂量测试药物的CHO细胞可以从装置分配到孔板中(图4)。

实施例3–泛T细胞杀伤测定

制备方案

将在EMEM(10％FCS，1％谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素)中以80％汇合度培养的肿瘤模型细胞系(传代59+1)在液滴培养基(RPMI 1640(10％FCS、1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素))中以3e6/mL的密度在5％CO₂和37℃下孵育2小时，该培养基补充有1μM胱天蛋白酶3/7、50μM Hoechst 33342和0.1nM TCR药物。同时，将人供体来源的泛T细胞解冻并在PBS中洗涤，然后在1μM深红中在5％CO₂和37℃下孵育30分钟，然后在液滴培养基(RPMI 1640)中以2e6/mL的密度孵育。然后将两种细胞悬浮液乳化成微滴(图5)。

液滴组

然后将含有泛T细胞的微滴分选到第一组中，并且将含有肿瘤细胞的微滴分选到第二组中。然后将两个组成对合并，以产生含有T细胞和肿瘤细胞两者的微滴，其具有不同的肿瘤细胞/泛-T细胞比例。也包括仅含有肿瘤细胞的微滴作为阴性对照(图6)。在t＝0小时对合并的微滴进行胱天蛋白酶3/7荧光扫描，以确认没有肿瘤细胞过早地凋亡。

结果

结果表明，50％的成活力窗口在大约28小时，这时间足以清楚的观察癌细胞杀伤行为(图7)。随着时间的推移，测量每个液滴的胱天蛋白酶强度，以定量与时间相关的肿瘤细胞凋亡。明视场显微镜用于成像每个微滴内的T细胞与肿瘤细胞相互作用并连续杀伤肿瘤细胞(图8，图9)。

实施例4-抗体发现

细胞成活力

用僵尸染色剂对不相关杂交瘤细胞进行染色，乳化成微滴并装载到微流体平台上。然后通过对微滴成像(10×透镜，僵尸绿/GFP(激发：457/50，发射：520/28)：暴露时间0.54s，100％灯功率，BF：暴露时间0.1s)来评估细胞的成活力。使用热杀死的不相关杂交瘤细胞作为阳性对照。细胞成活力在液滴中保持100％(33个细胞)达5.3小时，在装置中保持100％达3.6小时。此外，细胞成活力在液滴中保持>90％达20.3小时，在装置中保持>90％达18.6小时(28个细胞，1个液滴，5个细胞在整个测定过程中未保留)。因此，在测定窗口期间和之后证明了良好的成活力。这在一定程度上可以归因于该***中使用的气体再补给机制，该机制有助于观察到的持续成活力(图10)。

阴性对照

将含有杂交瘤细胞的微滴和含有报告子的微滴(抗原缀合的珠粒和二次检测抗体)装载到lightcast平台上，并成对合并以产生含有：1个珠粒/2个细胞、1个珠粒/1个细胞、仅珠粒和仅细胞的微滴(图11)。从仅含有杂交瘤细胞或报告子的阴性对照微滴中未检测到荧光。细胞也用僵尸绿染料染色——在实验过程中没有检测到细胞死亡。该测定运行长达16小时20分钟。荧光聚集体在t＝3小时20分钟时开始出现在含有杂交瘤和报告子的微滴中。

批量测定

将杂交瘤细胞乳化成微滴并装载到微流体平台上。含有报告子的杂交瘤培养基(例如抗原缀合的珠粒和AF488缀合的二抗)也被乳化成微滴并装载到装置上。将含有杂交瘤细胞的微滴分选到第一组中，将含有报告子的微滴分选到第二组中。将第一组和第二组成对合并以在杂交瘤培养基中产生含有0.5M/mL珠粒、0.5M/mL细胞和200nM AF488缀合的二抗的微滴，并在37℃下孵育2小时。对分泌的抗靶标抗体进行珠粒荧光成像(BB1，10倍物镜，2秒暴露时间)。

在室温下孵育4.5小时的杂交瘤培养基中产生含有2M/mL珠粒、200nM AF488缀合的二抗和10-100nM[游离抗靶标抗体(抗小鼠AF488)]的另外的微滴。在测试的游离抗靶标抗体的浓度范围内对珠粒荧光进行成像(BB1，10倍物镜，2s暴露时间)，以生成显示针对抗靶标抗体浓度的过滤荧光(a.u.)的曲线(图12)。

含有不相关杂交瘤细胞的微滴始终是深色的。相反，对于分泌靶标杂交瘤细胞，测量了接近观察到的游离抗靶标抗体最大水平的荧光(图12)。检测***扫描珠粒的增加的AF488荧光强度。

不相关/靶标杂交瘤

在乳化之前，将CellTracker深红荧光染料应用于不相关的杂交瘤，并用于在微流体装置上鉴别不相关杂交瘤。在这种情况下，不相关杂交瘤被定义为分泌不应被报告分子检测到的蛋白质的杂交瘤细胞。将含有杂交瘤细胞的微滴和含有报告子的微滴装载到微流体平台上，并成对合并以产生含有一系列不同的不相关或靶标杂交瘤细胞/珠粒比例的微滴。还制备了仅含有报告子的阴性对照微滴。阴性对照和与通过深红鉴定为不相关的细胞孵育的珠粒在实验持续时间(16小时)内似乎没有发光。与靶标杂交瘤(产生抗靶标抗原一抗的杂交瘤)孵育的珠粒在合并后2小时20分钟显示出清晰的AF488信号(图13)。

多路加标测定

多路加标测定用于分离微滴的混合群体，每个微滴包含不相关或靶标杂交瘤细胞。这种测定需要大量的微滴，所有这些微滴都以10倍或更好的分辨率成像。杂交瘤细胞的两种单独培养物(靶标细胞和不相关细胞)生长，然后收获到培养基中。然后将靶标细胞和不相关的杂交瘤细胞分别乳化成微滴并装载到微流体平台上。将每个含有靶标细胞或不相关杂交瘤细胞的微滴分选到第一组中。还将含有报告子的培养基(靶标抗原缀合的珠粒和[AF488缀合的抗小鼠二抗]200nM)乳化成微滴并分选到第二组中。将第一组和第二组成对合并以生成合并的微滴组。在加标运行中，随着时间的推移，对于每个合并的微滴测量在珠粒上的过滤荧光((激发457/50nm)/a.u.)(图13)，以产生每个杂交瘤细胞系的抗靶标抗体分泌曲线。来自不相关杂交瘤细胞系的AF488信号与阴性对照无法区分。所有靶标杂交瘤均显示阳性信号。聚集体在大约4小时后在液滴中形成，并且在9小时后开始损害分析。

还收集了单细胞分泌数据，并生成了显示单细胞抗体分泌的时间依赖性的单细胞分泌曲线。以128nM加载珠粒，并在7小时内测量珠粒荧光，从珠粒-抗体合并开始计算。在多次运行中重复了结果。为了收集单细胞数据，在合并第一组和第二组之前丢弃多占位杂交瘤细胞微滴。

多路珠粒

在微流体平台上在杂交瘤培养基中批量测试成像。将每个都含有高浓度珠粒(SolR1、R3和R5珠粒)的微滴装载到装置上。在不同的放大倍数(2×、4×和10×)下测试成像，以确定成像的最佳参数，同时在所有强度带(R1、R3和R5)之间实现良好的分离，从而使珠粒能够被正确地分辨以进行强度量化。在10×时实现了所有强度带之间的良好分离，在4×时实现了相当好的分离(图14)。

将彩色编码珠粒(solR1、R3和R5)分别与以下抗原缀合：cyno靶标抗原、脱靶抗原和人靶标抗原。然后将包含抗原缀合的珠粒和抗小鼠AF488检测抗体的细胞培养基乳化成微滴并装载到Lightcast平台上。还提供了各自含有单个靶标或不相关杂交瘤细胞的微滴，并对其进行***，产生各自含有分泌产物(例如，一抗)的微滴组和各自含有相应杂交瘤细胞(一个或多个)的参考微滴组，跟踪每剂分泌抗体来自哪个杂交瘤细胞。然后将含有报告子(珠粒和检测抗体)的微滴与含有分泌抗体的微滴成对合并。使用Lightcast检测***监测合并的微滴和对照微滴的特征，该检测***能够解码珠粒强度带(并因此鉴定抗原)和定量一致的AF488荧光(能够定量抗靶标一抗)。不含细胞的阴性对照微滴(仅报告子)和含有不相关杂交瘤细胞的合并微滴保持黑暗，证实不存在一抗。含有报告子和游离靶标抗体[25nM]的阳性对照微滴证实了游离靶标抗体与两种靶标抗原(R1和R5)的结合。含有分泌抗体的微滴也结合两种靶标抗原(图15)。

抗体发现工作流程

将B细胞乳化成微滴并装载到微流体平台上。丢弃空的或多占位的微滴。将含有单个B细胞的剩余微滴与含有细胞培养基的微滴成对合并，以增加体积以促进随后的***步骤。然后，将合并的微滴在芯片上孵育以促进单克隆抗体的产生，然后***成子液滴以获得每个细胞产生的多剂量抗体。然后将含有B细胞的微滴分选到参考组中，同时将含有抗体剂量的微滴分选到单独的组中，并与含有抗原缀合珠粒和检测抗体的微滴的报告子组成对合并。光学检测***用于确定合并的报告子mAb组中的阳性命中。将含有对应于所述阳性命中的B细胞的参考组的微滴分配到孔板中并扩增(图16)。

实施例5-细菌工作流程

将细菌细胞乳化成微滴并装载到Lightcast平台上。丢弃空的或多占位的微滴。将含有单个细菌细胞的剩余微滴与含有细胞培养基的微滴成对合并，以增加体积以促进随后的***步骤。扩增合并后的微滴，然后***成克隆集落。将一组含有克隆细菌细胞的微滴分选到参考组中，同时将另一组含有克隆细菌细胞的微滴或一组含有所述细菌细胞分泌物的微滴分选到微滴的测定组中。微滴的测定组与微滴的报告子组成对合并。在任何阶段，如果测定组分在细菌膜内部，则可以裂解细菌细胞以释放其内容物。光学检测***用于确定合并的报告子-细菌细胞组中的阳性命中。将含有对应于所述阳性命中的细菌细胞的参考组的微滴分配到孔板中并扩增(图17)。

实施例6-合并和/或***微滴的明视场成像

图19A至19C显示了示例性合并操作的明视场图像。成对的液滴在整个装置中平行合并。图19A显示了为合并操作选择的微滴对。图19B显示了移动到近距离准备合并的成对的微滴。图19C显示了合并后的微滴。

图20A至20C显示了示例性***操作的明视场图像。微滴被平行地***成成对的两个子微滴。图20A显示了阵列中等待***操作的液滴。图20B显示了***操作中途拉伸的微滴。图20C显示了微滴***成成对的子液滴。可以通过操作来保留历史信息，以提供关于祖液滴的完整信息。

参考图21，图中显示了单细胞占位时包封在液滴中的酿酒酵母(S.cerevisiae)生物颗粒(热灭活酵母)的明视场图像。

实施例7-在油中的细胞培养基乳液中的液滴内用报告子珠粒包封的细胞

参考图22，显示了细胞因子分泌细胞的图像，这些细胞已与细胞因子报告子珠粒共同封装在油中的细胞培养基乳液中的液滴中。在分泌的细胞因子存在的情况下，报告子珠粒通过使用荧光标记抗体的夹心ELISA机制发出荧光。如图22A所示，明视场图像显示了微滴内细胞和珠粒的分布。如图22B所示的荧光图像表明，在分泌的细胞因子存在的情况下，哪个报告子珠粒产生阳性反应。图22C显示了具有完整膜整体性的所有细胞的位置。图22D所示的荧光图像显示了所有珠粒的位置，图22E显示了碘化丙啶染色显示的死细胞。

参考图24，显示了抗体分泌细胞的图像，这些细胞与报告子珠粒共同封装在油中的细胞培养基乳液中的微滴中。在分泌的抗体存在的情况下，报告子珠粒通过使用荧光标记抗体的夹心ELISA机制发出荧光。图24A中的明视场图像显示了微滴中细胞和珠粒的分布。图24B所示的荧光图像说明了在分泌的抗体存在的情况下，哪个报告子珠粒产生阳性反应。图24C显示了具有完整膜整体性的所有细胞的位置，图24D显示了死亡的细胞。

实施例8-操作的微滴模块化设计

图23概述了操作的模块化设计，可以按照任何顺序灵活地全部或部分组合，以构建独特的工作流程。可编程决策可以在整个工作流程的任何点上实现，这可以从原始顺序偏离和/或基于决策树逻辑的导航将操作仅应用于微滴的选择。因此，可以动态地重新配置测定。示例性模块显示为包括但不限于装载和/或分选微滴、合并微滴、孵育、分析、***和排出。微滴分选的实例可以包括但不限于基于大小、内容物和/或占用情况的分选。合并液滴可以允许试剂和/或报告子的递送，并能够控制细胞的引入以促进细胞-细胞的相互作用。***液滴可以使材料回收到下游分析，或者在细胞回收的情况下，进一步扩增。

图25所示的工作流程举例说明了可用于监测细胞分泌物或细胞-细胞相互作用的各种检测模式。检测可以是但不限于荧光检测、发光、FRET或明视场检测。细胞内成像可以揭示细胞或细胞容器的一部分内的信号，实例包括细胞核、高尔基体和/或线粒体。

实施例9-合成生物学工作流程、哺乳动物细胞系开发和/或CRISPR筛选

图26概述了适用于合成生物学、哺乳动物细胞系开发和/或CRISPR筛选的示例性工作流程，但不限于这些筛选。将被改造用于产生目标产物的细胞装载到平台上并包含在液滴中，可以分选液滴的占用情况以选择单个细胞。可以孵育细胞以使其能够在平台上增殖一段时间。监测增殖可用于选择健壮的克隆。可以选择性地***微滴以控制液滴大小，或者收集产物或细胞用于下游分析，同时保留群体用于替代操作。群体的保留对于进行可能导致子微滴上的细胞降解的测定步骤特别有用，同时保留活细胞以在第二子微滴中进行进一步测试。合并允许控制液滴大小和将组分递送到细胞液滴，例如培养基以延长细胞寿命和/或报告子。报告子可以通过各种检测模式促进滴度读数，以评估细胞生产力。微滴可以从平台上分配并回收。细胞的回收可以实现进一步的扩增或下游分析。仅举例来说，产物的回收使得可以评估产物质量。操作顺序可以自由更改。微滴可以根据筛选过程中进行的评估进行分配，例如具有高生产力和良好增殖的顶级克隆。

实施例10–分选微滴操作工作流程

参考图27，提供了遵循模块化操作实例顺序的示例性工作流程，并指出了整个工作流程中可以选择性地对微滴进行分选的潜在点。分选可以基于多种因素，例如液滴大小、含量、占用情况、测定结果或其组合。明视场、荧光、发光、FRET是用于分选的检测模式的一些实例，其中信号可以在微滴内，定位于报告子或细胞内。

实施例11-包封在微滴中的细胞的明视场成像

参考图28A至图28D，提供了在细胞内钙的染料存在下孵育的微滴中封装的细胞的多个图像。图28A显示了液滴的明视场图像，并指示了每个液滴中细胞的位置和数量。图28B显示的荧光图像表明钙代谢活跃。图28C显示了细胞的核染色的荧光图像，图28D显示了碘化丙啶染色显示的死细胞。

鉴于本公开内容，本发明的各种进一步的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。

在本文中使用的“和/或”应被视为对两个特定特征或组件中的每一个的具体公开，具有或不具有另一个。例如，“A和/或B”将被视为对(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就好像每一个在本文中单独列出一样。

除非上下文另有说明，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

本领域的技术人员将进一步理解，虽然本发明已通过实例的方式参考若干实施方案进行了描述，但本发明不限于所公开的实施方案，并且可以在不背离本发明范围的情况下构建替代实施方案，如在所附权利要求中定义的发明。

Claims

1.用于在EWOD或oEWOD装置中基于至少一个特征来选择细胞和/或一个或多个细胞的一部分的方法，所述方法包括：

i.提供微滴的测试组，所述微滴包括至少培养基或培养基和至少一个细胞；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞的特征选自以下中的任一个或多个：一种或多种细胞表面分子的存在；一种或多种细胞活动的存在；细胞形态；一种或多种细胞分泌物的存在；和/或一种或多种细胞内产物的存在。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在***包含至少一个细胞的微滴组之前，在允许细胞***的条件下培养所述细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述条件包括将包含至少一个细胞的微滴组与包含培养基的微滴组合并。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述微滴的参考组和测试组被***，使得参考组或微滴包含与包含在微滴的测试组中的细胞相对应的细胞的至少一个克隆拷贝。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述包含至少一个细胞的微滴的测试组与包含用于裂解所述细胞的试剂的微滴组合并。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检查包含至少一个细胞的任何微滴组中的细胞的形态特征，并且所述形态特征用于选择细胞的子集。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述形态特征包括大小、形状、粘附状态、细胞膜状态和/或细胞内特征的存在。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之前，对含有至少一个细胞的微滴组进行至少一次测定以确定细胞的特征，所述测定是通过将包含至少一个细胞的所述微滴组与包含至少一个报告子实体的至少一个微滴组合并并基于所述特征的存在确定所述至少一个报告子实体的变化来进行的。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)之后，将至少一个含水微滴组与合并的微滴测定组合并，并且随后***合并的微滴组。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的任何阶段，丢弃不需要的或空的微滴。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述装置分配所述选择的微滴组的细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中在分配所述选择的微滴组之后，处理其中包含的细胞以扩增群体和/或培养克隆。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，在分配所述选择的微滴组之后，对其中包含的细胞和/或非细胞实体如分泌物、代谢物进行进一步分析，包括但不限于以下任意一种或多种：

I.质谱法；

II.表面等离子体共振；

III.高效液相色谱法；和/或

IV.基因分析，包括核酸测序和PCR扩增。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试组的微滴对应于所述参考组的微滴，使得可以基于所述微滴的测试组中所述报告子实体的变化来选择保留在所述参考组中的细胞。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是遗传改造的。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞在步骤(i)之前进行遗传改造，包括以下步骤：

a.提供微滴组，每个微滴包括至少一个细胞；

b.提供修饰微滴组；每个微滴包含能够修饰细胞的一个或多个遗传元件；

c.将含有细胞的微滴与含有一个或多个遗传元件的微滴合并，形成微滴组，每个微滴都含有遗传改造的细胞。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞的特征是成活力、细胞活化和/或细胞杀伤能力。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞的特征在于，它们能够制造以下产物中的任意一种或多种作为细胞内产物、细胞表面分子和/或分泌物，所述产物可以使用报告子实体检测：

i.蛋白质，其包括糖蛋白或脂蛋白；

ii.化学物质；

iii.聚合物；

iv.核酸；

v.化合物。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个报告子实体是以下实体中的任意一个或多个：

i.抗体；

ii.抗原；

iii.受体；

iv.底物；

v.酶；

vi.配体；

vii.核酸；

viii.细胞；

ix.细胞的一部分；

x.细胞外小泡；

xi.脂质体；

xii.聚合物；

xiii.化学物质；

xiv.药物；

xv.FRET报告子；

xvi.化学发光材料；

xvii.组织样本；

xviii.病毒或噬菌体；

xix.细胞因子；和/或

xx.蛋白质。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告子实体被标记用于直接检测变化，和/或还包括第二标记实体，其检测并报告报告子实体中的变化。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述标记是可见的、发光的、荧光的、磷光的、蛋白质互补的，例如***荧光、***发光或荧光配体。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测步骤是光学检测步骤。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞选自以下类型中的任意一种：

i.免疫细胞；

ii.细菌；

iii.真菌细胞；

iv.昆虫细胞；

v.多能细胞；

vi.癌细胞；

vii.杂交瘤细胞融合；

viii.细胞系；

ix.植物细胞；

x.人工细胞；

xi.微细胞；

xii.一个或多个细胞的一部分；

xiii.细胞外小泡；或

xiv.脂质体。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞为淋巴细胞。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞是B淋巴细胞并且能够分泌免疫球蛋白。

27.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述报告子实体是报告子细胞，任选地，其中所需的免疫球蛋白能够与报告子细胞结合并引起变化。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述一个或多个报告子实体选自：

i.抗原缀合的珠粒和荧光染料缀合的二抗；

ii.二抗缀合的珠粒和荧光染料缀合的抗原；或

iii.与载体表面缀合的抗原和荧光染料缀合的二抗珠粒

并且其中监测所述免疫球蛋白的特征包括测定抗原结合活性。

29.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述细胞经遗传改造以表达细胞表面受体或T细胞接合分子。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞，并且所述细胞表面受体是嵌合抗原受体。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法是选择CAR-T细胞。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞已从患者分离。

33.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述细胞是经遗传改造以产生药物的细菌细胞。

34.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述细胞能够产生免疫治疗药物。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微滴由不混溶液体包围。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述报告子组的每个微滴中存在多于一个的报告子实体，任选地，其中步骤(v)是多路测定的检测。

37.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞是通过细胞融合过程形成的杂交瘤细胞，并且能够分泌免疫球蛋白。