CN117264852B - 一种仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其是一种能同时培养罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌的方法。现行的益生菌一般都是单菌株发酵，且不耐胃酸等胃肠道不良因素，难以有效保持活性到达肠道定殖，因此，构建一种模仿人体胃肠道环境并复合培养发酵体系非常必要。本方法可使以上精选的五种菌株在仿人体微生态环境中协同共生、进化培养，不但能使这五种菌株有效抵抗胃肠道环境中的胃酸等不良因素，保持更高活性到达肠道定殖，发挥罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌益生作用，而且能产生协同增效作用，增殖益生菌复合菌群，具有重大的产业价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，特别涉及一种能同时培养罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌的方法。
背景技术
普遍研究发现，益生菌参与人体肠道菌群微生态调节，提高机体免疫力，此外，它们还可以治疗急性肠胃炎、肠易激综合征；调节胆固醇含量；参与基因表达调控、脂质代谢；降低小鼠炎症反应等。其中，罗伊氏乳杆菌对婴儿疝气具有显著疗效；干酪乳杆菌具有高效降血压、降胆固醇，促进细胞***，预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用，干酪乳杆菌能缓解由DSS引起的小鼠结肠损伤，抑制APCmin/+小鼠结直肠腺瘤，减轻沙门菌对肠粘膜的损伤；鼠李糖乳杆菌促进人结直肠癌细胞的凋亡、改善氧化损伤、降血压等；植物乳杆菌肠道粘附能力强，能快速降糖、缓解溃疡性结肠炎；戊糖片球菌能抑制食源性致病菌,调节肠道免疫功能,降低胆固醇,抗肿瘤等。
当前，益生菌已被广泛应用于食品、医药、畜牧等行业。然而，益生菌在人体发挥益生作用的前提是进入胃肠道后能够存活并且增殖，由于胃肠道处于低酸性环境，并有大量消化酶的存在，因此，摄入益生菌后，受到胃肠道不良环境的胁迫，导致益生菌活菌数大幅下降，不能有效地发挥益生作用。为此，经过体外模拟胃肠道实验，让益生菌对胃肠液产生一定耐受作用，并通过调节培养成分，使得益生菌能在耐受酶与低酸环境下，同时具有较高的活菌数。《益生菌类保健食品申报与评定(征求意见稿)》及GB 7101—2015《食品安全标准饮料》规定标识活菌型的产品乳酸菌数应≥1×106CFU/mL(g)。目前，对于单一细菌的培养方法日趋完善，可通过高密度培养、流加补料等方法实现对单一益生菌高活菌数的目的。复合菌群具有1+1>2的效应，例如，枯草芽孢杆菌与乳酸菌之间存在协同作用，枯草芽孢杆菌作为需氧菌，消耗氧气为乳酸菌提供厌氧环境，促进乳酸菌的增殖。但对于复合菌群的培养，相关文献报道较少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法是将罗伊氏乳杆菌HBM11-69（保藏编号为GDMCC NO：63608）、戊糖片球菌MPL5（保藏编号为GDMCC NO：63606）、植物乳杆菌La-10（保藏编号为GDMCC NO：63605）、鼠李糖乳杆菌HBM11-35（保藏编号为GDMCC NO： 63607）、干酪乳杆菌C7-2（保藏编号为GDMCC NO：63609）分别连续传代2～3次，第2～3次传代培养时间为16～24h，按比例取最后一次传代的菌液接入如下的协同进化复合培养基中进行发酵培养，并进行仿人体肠道微生态体系培养：
（1）接种到A培养基中，35℃～37℃发酵培养0～24h后，加入仿人体肠道消化液，35℃～37℃培养0～8h或
（2）接种到B培养基中，35℃～37℃发酵培养0～24h后，加入仿人体肠道消化液,35℃～37℃培养0～8h或
（3）接种到C培养基中，35℃~37℃发酵培养0～24h后，加入仿人体肠道消化液, 35℃～37℃培养0～8h;
其中，所述的A培养基成分为：按1L计，蔗糖15-25g、麦芽糖17-30g、葡萄糖16-30g、酵母浸粉30-50g、大豆蛋白胨25-40g、磷酸氢二钾1-3g、柠檬酸氢二铵2-5g、无水乙酸钠5-10g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2-1g、胆盐0.1-1g、MnSO4 0.05-0.1g、MgSO4•7H2O 0.5-1g、吐温-80 0.5-2 mL、甘油5-15 Mmol/L；pH6.0～7.0，121℃灭菌15～30min；
所述的B培养基为含有5%～20%（v/v）水牛奶的A培养基；pH6.0～7.0，121℃灭菌15～30min；其中，水牛奶单独灭菌，60℃灭菌30min；
所述的C培养基为含有0.5%～5%（m/v）桃胶多糖的A培养基；PH6.0～7.0，121℃灭菌15～30min。
优选的，所述的益生菌复合菌群仿人体肠道微生态协同进化复合培养方法是将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别连续传代3次，第3次传代培养时间为22h。按比例取最后一次传代的菌液接入协同进化复合培养基中进行发酵培养。
进一步优选的，所述的益生菌复合菌群仿人体肠道微生态协同进化复合培养方法是将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别连续传代3次，第3次传代培养时间为22h。按总接种量为4%，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株按2:2:1:3:3的比例接入同一协同进化复合培养基中。
优选的，所述的将菌液按比例接入协同进化复合培养基中发酵培养，其培养时间为0～14小时。
进一步优选的，所述的将菌液按比例接入协同进化复合培养基中发酵培养，其培养时间为0～4小时。
最优选的，所述的将菌液按比例接入协同进化复合培养基中发酵培养，其培养时间为1小时。
优选的，所述的A培养基成分如下：按1L计，蔗糖18-21g、麦芽糖20-23g、葡萄糖18-21g、酵母浸粉40-45g、大豆蛋白胨30-35g、磷酸氢二钾2-3g、柠檬酸氢二铵2-4g、无水乙酸钠7-9g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2-0.6g、胆盐0.4-0.7g、MnSO4 0.08-0.1g、MgSO4•7H2O 0.6-0.9g、吐温-80 7-10 Mmol/L、甘油0.7-0.9g。
最优选的，所述的A培养基配方如下：按1L计，蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L.调节pH为6.5 121℃灭菌15min。
优选的，所述的B培养基为含有5%~20%（v/v）水牛奶的A培养基。
进一步优选的，所述的B培养基为含有10%（v/v）水牛奶的A培养基。
最优选的，所述的B培养基成分如下：按1.1L计，蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、水牛奶100ml。
优选的，所述的C培养基为含有0.5%~5%（m/v）桃胶多糖的A培养基。
进一步优选的，所述的C培养基为含有1%（m/v）桃胶多糖的A培养基。
最优选的，所述的C培养基成分如下：按1L计，蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、桃胶多糖10g。
优选的，所述的仿人体肠道消化液，其配比如下：
(1)模拟胃液:胃电解液:2.80-3.50g NaCl；0.70-1.40g KCl；0.05-0.2g CaCl2；0.50-1.00g NaHCO3，用去离子水定容至1000mL；在150mL胃电解液中添加 30.00-40.00mg胃蛋白酶，加入 1.5mL CH3COONa 缓冲液(1.0mol/L，pH5.0)，室温下磁力搅拌 10min，调至pH 4.5(0.5mol/L HCI)；
(2)模拟小肠液:小肠电解液:3.0-8.0g NaCl；0.50-1.00g KCl；0.10-0.50gCaCl2，去离子水定容至1000mL；将 25mL 小肠电解液、50mL4%胆汁盐溶液和 25mL 7%胰酸上清液混合，添加 13mg胰蛋白酶；
(3)模拟胃肠液:模拟胃液和模拟小肠液以1:1（v/v）比例混合。
进一步优选的，所述的仿人体肠道消化液配方如下：
(1)模拟胃液:胃电解液:3.10g NaCl；1.10g KCl；0.15g CaCl2；0.60g NaHCO3，用去离子水定容至1000mL；在150mL胃电解液中添加 35.40mg胃蛋白酶，加入 1.5mLCH3COONa 缓冲液(1.0mol/L，pH5.0)，室温下磁力搅拌 10min，调至pH 4.5(0.5mol/LHCI)；
(2)模拟小肠液:小肠电解液:5.40g NaCl；0.65g KCl；0.25gCaCl2，去离子水定容至1000mL；将 25mL 小肠电解液、50mL4%胆汁盐溶液和 25mL 7%胰酸上清液混合，添加13mg胰蛋白酶；
(3)模拟胃肠液:模拟胃液和模拟小肠液以1:1（v/v）比例混合。
优选的，所述的仿人体肠道微生态体系为：模拟胃肠液(10%～30%):协同进化复合培养基(70%～80%)。
进一步优选的，所述的仿人体肠道微生态体系为：模拟胃肠液（10%～20%）：协同进化复合培养基（80%～90%）。
最优选的，所述的仿人体肠道微生态体系为：模拟胃肠液(15%):协同进化复合培养基(85%)。
优选的，所述的益生菌复合菌群仿人体肠道微生态协同进化复合培养方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化：将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别进行划线（第一代），挑取长出的单菌落接入液体MRS培养基，37℃培养16-18h（第二代），再将菌液按3%接入新鲜液体MRS培养基中（第三代），37℃培养22h；
步骤2：总接种量为4%，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69：戊糖片球菌MPL5：植物乳杆菌La-10：鼠李糖乳杆菌HBM11-35：干酪乳杆菌C7-2按2:2:1:3:3的接种比例接入协同进化复合培养基A培养基，37℃培养1h后，加入A培养基15%体积的仿人体肠道消化液，37℃培养0、2、4、6、8h取样，涂布计数；或者
步骤2：总接种量为4%，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69：戊糖片球菌MPL5：植物乳杆菌La-10：鼠李糖乳杆菌HBM11-35：干酪乳杆菌C7-2按2:2:1:3:3的接种比例接入含有5%（v/v）水牛奶、10%（v/v）水牛奶、15%（v/v）水牛奶或者20%（v/v）水牛奶的A培养基协同进化复合培养基（B培养基），37℃培养1h后，加入B培养基15%体积的仿人体肠道消化液，37℃培养0、2、4、6、8h取样，涂布计数；或者
步骤2：总接种量为4%，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69：戊糖片球菌MPL5：植物乳杆菌La-10：鼠李糖乳杆菌HBM11-35：干酪乳杆菌C7-2按2:2:1:3:3的接种比例接入含有0.5%（m/v）桃胶多糖、1%（m/v）桃胶多糖、3%（m/v）桃胶多糖或者5%（m/v）桃胶多糖的A培养基的协同进化复合培养基（C培养基），37℃培养1h后，加入C培养基15%体积的仿人体肠道消化液，37℃培养0、2、4、6、8h取样，涂布计数。
进一步优选的，所述的菌种活化操作为：将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别进行划线（第一代），挑取长出的单菌落接入液体MRS培养基，37℃培养16～18小时（第二代），再将菌液按3%接入新鲜液体MRS培养基中（第三代），37℃培养22h。
益生菌复合菌群仿人体肠道微生态协同进化复合培养，通过以上方法制备得到。
益生菌复合菌群在益生菌制品领域中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：（1）提供一种协同进化培养基，让多种益生菌能协同共生，减少培养成本。2）经过体外模拟实验，结果很好的验证了复合菌群能在胃肠道中大量存活，说明复合菌群能有效抵抗胃肠道环境中的不良因素，到达结肠定植，以发挥益生作用。（3）通过对培养基进行改善后，活菌数远远提高，在经历不良环境胁迫后，仍然有较高的活菌数。
附图说明
图1是水牛奶对复合菌群活菌数的影响。
图2是水牛奶对复合菌群存活率的影响。
图3是桃胶多糖对复合菌群活菌数的影响。
图4是桃胶多糖对复合菌群存活率的影响。
图中*代表与对照组（CK）相比具有显著差异。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中采用的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株由本公司从华南农业大学食品学院林俊芳教授团队转让获得并贮藏于广东省微生物菌种保藏中心。实施例使用的其他试剂均采用商业途径购买，其中水牛奶为水牛生产的鲜奶，按照GB19301-2010（食品安全国家标准生乳）标准验收。桃胶多糖购自山东优索化工科技有限公司。
所述的植物乳杆菌La-10，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63605,保藏时间为2023年6月30日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所；戊糖片球菌MPL5，分类命名为Pediococcus pentosaceus，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63606，保藏时间为2023年6月30日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所；鼠李糖乳杆菌HBM11-35，分类命名为Lacticaseibacillus rhamnosus，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63607，保藏时间为2023年6月30日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所；罗伊氏乳杆菌HBM11-69，分类命名为Limosilactobacillus reuteri，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63608，保藏时间为2023年6月30日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所；干酪乳杆菌C7-2，分类命名为Lacticaseibacilluscasei，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63609，保藏时间为2023年6月30日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
下述实施例中采用的仿人体消化液具体配方如下：
(1)模拟胃液:(胃电解液:3.10g NaCl；1.10g KCl；0.15g CaCl2；0.60g NaHCO3；用去离子水定容至1000mL)。在150mL胃电解液中添加 35.40mg胃蛋白酶，加入 1.5mLCH3COONa 缓冲液(1.0mol/L，pH5.0)。室温下磁力搅拌 10min，调至pH 4.5(0.5mol/L HCI)
(2)模拟小肠液:(小肠电解液:5.40g NaCl；0.65g KCl；0.25gCaCl2；去离子水定容至1000mL)。将 25mL 小肠电解液、50mL4%胆汁盐溶液和 25mL 7%胰酸上清液混合，添加13mg胰蛋白酶。
(3)模拟胃肠液:模拟胃液和模拟小肠液以体积比1:1比例混合。
实施例1
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）水牛奶灭菌条件：60℃30min。
（3）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
B培养基：取灭菌后的A培养基42.5mL，加入2.125mL水牛奶（以培养基体积的5%计），总协同进化复合培养基体积为44.625mL （占仿人体肠道微生态体系85%）。
（4）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入B培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（5）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入7.875mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例2
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）水牛奶灭菌条件：60℃30min。
（3）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
B培养基：取灭菌后的A培养基42.5mL，加入4.25mL水牛奶（以培养基体积的10%计），总协同进化复合培养基体积为46.75mL （占仿人体肠道微生态体系85%）。
（4）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入B培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（5）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入8.25mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例3
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）水牛奶灭菌条件：60℃30min。
（3）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
B培养基：取灭菌后的A培养基42.5mL，加入6.375mL水牛奶（以培养基体积的15%计），总协同进化复合培养基体积为48.875mL （占仿人体肠道微生态体系85%）。
（4）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入B培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（5）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入8.625mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例4
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）水牛奶灭菌条件：60℃30min。
（3）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
B培养基：取灭菌后的A培养基42.5mL，加入8.5mL水牛奶（以培养基体积的20%计），总协同进化复合培养基体积为51mL （占仿人体肠道微生态体系85%）。
（4）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入B培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（5）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入9mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
上述实施例结果如图1、2，分别表示向培养体系中加入水牛奶对复合菌群活菌数的影响、培养2、4、6、8h后复合菌群的存活率。如图1所示，当向培养基中添加10%水牛奶，培养1h后，活菌数可达到108，但随着加入模拟消化体系，活菌数存在先下降后上升的趋势，培养8h后，仍有7.8×107，如图2所示，当加入10%水牛奶后，复合菌群存活率相对较低，为50%左右；通过未添加消化模拟体系对比，培养1h后，10%水牛奶显著增强菌群生长繁殖。说明水牛奶对复合菌群有一定的促生长作用，并且具有一定的抵御不良环境的效果。
实施例5
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
C培养基：取调节pH为6.5的A培养基42.5mL，加入0.213g（以培养基的0.5%（m/v）计）桃胶多糖，121℃灭菌15min。
（3）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入C培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（4）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入7.5mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例6
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
C培养基：取调节pH为6.5的A培养基42.5mL，加入0.425g（以培养基的1%（m/v）计）桃胶多糖，121℃灭菌15min。
（3）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入C培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（4）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入8.625mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例7
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
C培养基：取调节pH为6.5的A培养基42.5mL，加入0.85g（以培养基的2%（m/v）计）桃胶多糖，121℃灭菌15min。
（3）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入C培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（4）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入8.625mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例8
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
C培养基：取调节P pH为6.5的A培养基42.5mL，加入1.275g（以培养基的3%（m/v）计）桃胶多糖，121℃灭菌15min。
（3）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入C培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（4）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入7.5mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例9
（1）菌种活化：
在MRS固体培养基平板上，取保存的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液划线分离，37℃培养48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在MRS液体培养基中，37℃培养18h，再次按3%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，培养22h，得到活化的菌液。
（2）培养基的配制：
A培养基：蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1mL、甘油8Mmol/L、加水定容至1L，调节pH为6.5，121℃灭菌15min。
C培养基：取调节pH为6.5的A培养基42.5mL，加入2.125g（以培养基的5%（m/v）计）桃胶多糖，121℃灭菌15min。
（3）发酵培养：
取活化后的罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌液按2:2:1:3:3的接种比例接入C培养基中（总接种量为4%），37℃培养1h；
（4）仿人体肠道微生态环境培养：
培养1h后，向培养基中加入7.5mL仿人体肠道消化液（占仿人体肠道微生态体系15%），混匀，立即取样（为0h样品），培养2、4、6、8h取样。
取样进行稀释涂布，计算活菌数与存活率，结果如表1、表2所示。
实施例5~6结果如图3、4，分别表示向培养体系中加入桃胶对复合菌群活菌数的影响、培养2、4、6、8h后复合菌群的存活率。如图1所示，当向培养基中加入1%桃胶多糖时，加入消化模拟体系，培养2h后活菌数逐渐增加，培养8h活菌数达到6.6×107；如图2所示，复合菌群存活率在逐步增加，4h后存活率大于100%；说明桃胶能促进菌群生长，同时对于抵御不良环境有较好的效果。
实施例中的总接种量按总协同进化复合培养基体积计算，再根据接种比例调整将菌液接入各培养基。
对照组为42.5mL的A培养基，按2:2:1:3:3的接种比例将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2接入A培养基中，37℃培养1h后，加入7.5mL的仿人体肠道消化液，混匀，37℃培养0、2、4、6、8h取样，稀释涂布，计算活菌数与存活率。
对比例1
与实施例1-8相同，区别仅在于，A培养基中未添加水牛奶或桃胶多糖，培养1h后，加入仿人体消化液后，37℃培养0、2、4、6、8h取样，稀释涂布，计算活菌数与存活率。
实施例1-8与对比例1-3的复合菌群总活菌数测量结果如下表1、表2所示：
表1.复合菌种各小时总活菌数结果
| 添加组分 | 0h活菌数 | 2h活菌数 | 4h活菌数 | 6h活菌数 | 8h活菌数 | |
| 实施例1 | 5%水牛奶 | 5.24×107 | 5.14×107 | 4.29×107 | 4.18×107 | 4.05×107 |
| 实施例2 | 10%水牛奶 | 12.0×107 | 8.41×107 | 7.8×107 | 8.32×107 | 7.87×107 |
| 实施例3 | 15%水牛奶 | 6.08×107 | 5.23×107 | 4.16×107 | 5.98×107 | 4.36×107 |
| 实施例4 | 20%水牛奶 | 8.05×107 | 7.98×107 | 8.06×107 | 10.6×107 | 8.37×107 |
| 实施例5 | 0.5%桃胶多糖 | 5.52×107 | 5.68×107 | 4.87×107 | 4.75×107 | 5.6×107 |
| 实施例6 | 1%桃胶多糖 | 5.7×107 | 4.93×107 | 5.2×107 | 5.63×107 | 6.6×107 |
| 实施例7 | 2%桃胶多糖 | 6.77×107 | 6.0×107 | 5.57×107 | 5.12×107 | 6.97×107 |
| 实施例8 | 3%桃胶多糖 | 5.87×107 | 5.05×107 | 6.14×107 | 6.49×107 | 5.43×107 |
| 实施例9 | 5%桃胶多糖 | 6.33×107 | 4.45×107 | 4.88×107 | 5.1×107 | 5.98×107 |
| 对比例1（空白对照） | 5.14×107 | 3.93×107 | 4.05×107 | 3.59×107 | 3.47×107 |
表2.复合菌群经模拟胃肠液消化后的存活率
| 0~2h存活率 | 0~4h存活率 | 0~6h存活率 | 0~8h存活率 | |
| 实施例1 | 98.09% | 81.87% | 79.77% | 77.29% |
| 实施例2 | 70.08% | 65% | 69.33% | 65.58% |
| 实施例3 | 86.02% | 68.42% | 98.36% | 71.71% |
| 实施例4 | 99.13% | 100.12% | 131.68% | 103.98% |
| 实施例5 | 103.02% | 88.22% | 86.10% | 101.51% |
| 实施例6 | 86.49% | 91.23% | 98.77% | 115.79% |
| 实施例7 | 88.67% | 82.27% | 76.35% | 102.96% |
| 实施例8 | 86.02% | 104.72% | 110.63% | 92.61% |
| 实施例9 | 70.26% | 77.11% | 80.53% | 94.37% |
| 对比例1（空白对照） | 76.46% | 78.79% | 69.84% | 67.51% |
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于：将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别连续传代2～3次，第2～3次传代培养时间为16～24h，按比例取最后一次传代的菌液接入协同进化复合培养基中进行发酵培养，并进行仿人体肠道微生态体系培养，所述协同进化复合培养基为B培养基或C培养基：
（1）接种到B培养基中，35℃～37℃发酵培养0～24h后，加入仿人体肠道消化液, 35℃～37℃培养0～8h，或者;
（2）接种到C培养基中，35℃～37℃发酵培养0～24h后，加入仿人体肠道消化液, 35℃～37℃培养0～8h;
其中，所述的B培养基为含有5%～20% v/v 水牛奶的A培养基；pH6.0～7.0，121℃灭菌15～30min；其中，水牛奶单独灭菌，60℃灭菌30min；所述的C培养基为含有0.5%～5% m/v桃胶多糖的A培养基；pH6.0～7.0，121℃灭菌15~30min；
所述的A培养基成分为：按1L计，蔗糖15-25g、麦芽糖17-30g、葡萄糖16-30g、酵母浸粉30-50g、大豆蛋白胨25-40g、磷酸氢二钾1-3g、柠檬酸氢二铵2-5g、无水乙酸钠5-10g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2-1g、胆盐0.1-1g、MnSO4 0.05-0.1g、MgSO4•7H2O 0.5-1g、吐温-80 0.5-2mL、甘油5-15Mmol/L；pH6.0～7.0，121℃灭菌15～30min；
所述罗伊氏乳杆菌HBM11-69的保藏编号为GDMCC NO：63608，所述戊糖片球菌MPL5的保藏编号为GDMCC NO：63606，所述植物乳杆菌La-10的保藏编号为GDMCC NO：63605，所述鼠李糖乳杆菌HBM11-35的保藏编号为GDMCC NO： 63607，所述干酪乳杆菌C7-2的保藏编号为GDMCC NO：63609。
2.根据权利要求1所述的仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于：将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别连续传代3次，第3次传代培养时间为22h，按比例取最后一次传代的菌液接入培养基中进行发酵培养。
3.根据权利要求1或2所述的仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于：总接种量为4%，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别传代3次后，第3次传代培养时间为22h，罗伊氏乳杆菌HBM11-69：戊糖片球菌MPL5：植物乳杆菌La-10：鼠李糖乳杆菌HBM11-35：干酪乳杆菌C7-2按照2:2:1:3:3的接种比例接入协同进化复合培养基。
4.根据权利要求1或2所述的仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于：
将菌液接入协同进化复合培养基中进行发酵培养，其培养时间为1小时。
5.根据权利要求1或2所述的仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于：所述的A培养基成分为：按1L计，蔗糖19.32g、麦芽糖21.84g、葡萄糖20.07g、酵母浸粉42.53g、大豆蛋白胨32g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵3g、无水乙酸钠8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.46g、胆盐0.5g、MnSO4 0.096g、MgSO4•7H2O 0.71g、吐温-80 1 mL、甘油8Mmol/L；pH6.0~7.0，121℃灭菌15min；
所述的B培养基为含有5%～20% v/v 水牛奶的A培养基；pH6.0～7.0，121℃灭菌15min；其中，水牛奶单独灭菌，60℃灭菌30min；
所述的C培养基为0.5%～5% m/v 桃胶多糖的A培养基；pH6.0～7.0，121℃灭菌15min。
6.根据权利要求1或2所述的仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于：
所述的仿人体肠道消化液的制备方法如下：
(1)模拟胃液:胃电解液:2.80～3.50g NaCl；0.70～1.40g KCl；0.05～0.2g CaCl2；0.50～1.00g NaHCO3，用去离子水定容至1000mL；在150mL胃电解液中添加 30.00～40.00mg胃蛋白酶，加入 1.5mL 浓度为1.0mol/L、pH5.0的CH3COONa 缓冲液，室温下磁力搅拌 10min，加入浓度为0.5mol/L的HCI调至pH 4.5；
(2)模拟小肠液:小肠电解液:3.0～8.0g NaCl；0.50～1.00g KCl；0.10～0.50gCaCl2，去离子水定容至1000mL；将 25mL 小肠电解液、50mL4%胆汁盐溶液和 25mL 7%胰酸上清液混合，添加 13mg胰蛋白酶；
(3)模拟胃肠液:模拟胃液和模拟小肠液以1:1 v/v 比例混合。
7.根据权利要求1或2所述的仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于：
所述的仿人体肠道微生态体系为v/v 15%仿人体肠道消化液:85%协同进化复合培养基。
8.根据权利要求1或2所述的仿人体肠道微生态协同进化培养益生菌复合菌群的方法，其特征在于:
包括如下步骤：
步骤1：菌种活化：将罗伊氏乳杆菌HBM11-69、戊糖片球菌MPL5、植物乳杆菌La-10、鼠李糖乳杆菌HBM11-35、干酪乳杆菌C7-2菌株分别进行划线形成第一代，挑取长出的单菌落接入液体MRS培养基，37℃培养16-18h形成第二代，再将菌液按3%接入新鲜液体MRS培养基中，37℃培养22h形成第三代；
步骤2：总接种量为4%，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69：戊糖片球菌MPL5：植物乳杆菌La-10：鼠李糖乳杆菌HBM11-35：干酪乳杆菌C7-2按2:2:1:3:3的接种比例接入含有5% v/v 水牛奶、10% v/v 水牛奶、15% v/v 水牛奶或者20% v/v 水牛奶的A培养基的协同进化复合培养基B培养基，37℃培养1h后，加入B培养基15%体积的仿人体肠道消化液，37℃培养0、2、4、6、8h取样，涂布计数；或者
步骤2：总接种量为4%，将罗伊氏乳杆菌HBM11-69：戊糖片球菌MPL5：植物乳杆菌La-10：鼠李糖乳杆菌HBM11-35：干酪乳杆菌C7-2按2:2:1:3:3的接种比例接入含有0.5% m/v 桃胶多糖、1% m/v 桃胶多糖、3% m/v 桃胶多糖或者5% m/v 桃胶多糖的A培养基的协同进化复合培养基C培养基，37℃培养1h后，加入C培养基15%体积的仿人体肠道消化液，37℃培养0、2、4、6、8h取样，涂布计数。
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| 3种益生菌的混合发酵探索;王彦玲 等;《饲料研究》(第2期);摘要，第48-50页 * |
| Multi-Strain Probiotics: Synergy among Isolates Enhances Biological Activities;Iliya D. Kwoji 等;《Biology》;第10卷(第4期);摘要 * |
| 益生菌复合培养及发酵条件研究;崔美兰 等;《中国食品科学技术学会第十一届年会论文摘要集》;第281-282页 * |
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