CN117248052B - 观赏羽衣甘蓝颜色相关的分子标记、引物组及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开观赏羽衣甘蓝颜色相关的分子标记、引物组及应用。本发明基于观赏羽衣甘蓝和其他甘蓝类蔬菜MYB2基因启动子上的结构变异位点开发了一种结构变异类型的分子标记，其是观赏羽衣甘蓝中特异的结构变异，通过分子标记检测甘蓝类蔬菜是否存在该结构变异，可快速鉴定检测材料是否为观赏羽衣甘蓝，进而可用于生物技术辅助育种。
Description
技术领域
本发明涉及分子育种领域，特别涉及观赏羽衣甘蓝颜色相关的分子标记、引物组及应用。
背景技术
观赏羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)是食用甘蓝(卷心菜)的园艺变种，属于十字花科芸苔属(Brassica L.)两年生的植物，兼具观赏和食用价值。观赏羽衣甘蓝叶色鲜艳，是冬季和早春重要的观叶植物，在长江流域及其以南地区，多用于布置花坛、花境，或者作为盆栽。观赏羽衣甘蓝具有很高的营养价值，含有丰富的维生素A、维生素B、维生素C、钾、铁、钙等物质，其嫩叶可炒食、凉拌、做汤，常用于搭配各色蔬菜制成色拉。
观赏羽衣甘蓝的株型、叶形和叶色丰富，多样性高，研究其及近缘物种的亲缘关系和遗传多样性对资源评价和创制以及新品种培育具有重要意义。分子标记分型技术因具有不受环境影响、测试周期短、供选择的标记数量多、可以进行高通量测序分析的优势，已经广泛用于遗传多样性和亲缘关系分析，新品种鉴定、种子纯度及品种真实性检测，分子标记辅助育种等研究和应用中。不过，目前仍缺少针对观赏羽衣甘蓝的准确、稳定可靠的分子标记。
发明内容
为了解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供了一种观赏羽衣甘蓝BoMYB2基因启动子结构变异(SV)的分子标记的特异性引物及应用，从而为观赏羽衣甘蓝分子辅助育种提供理论依据。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种与观赏羽衣甘蓝颜色相关的分子标记，其能够用于鉴定观赏羽衣甘蓝，所述分子标记为结构变异分子标记，其位于BoMYB2基因启动子上游293bp-580bp。
在某些实施方案中，根据本发明所述的与观赏羽衣甘蓝颜色相关的分子标记，其中，所述分子标记具有SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明的第二方面，提供一种引物组合，其用于扩增第一方面所述的分子标记。
在某些实施方案中，根据本发明所述的引物组合，其包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有SEQ ID NO.2所示的序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的引物组合，其中，所述反向引物具有SEQ IDNO.3所示的序列。
本发明的第三方面，提供一种用于鉴定观赏羽衣甘蓝的试剂盒，其包括上述的引物组合。
本发明的第四方面，提供本发明所述的分子标记、所述的引物组合，或所述的试剂盒在观赏羽衣甘蓝遗传学分析中的应用。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，其中，所述遗传学分析包括遗传多样性分析、种质鉴定或辅助育种。
本发明的第五方面，提供一种用于鉴定植物是否包含观赏羽衣甘蓝的方法，其包括在待鉴定植物的DNA中检测是否存在位于BoMYB2基因启动子上游293bp-580bp的分子标记的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于鉴定植物是否包含观赏羽衣甘蓝的方法，其包括以下步骤：
(1) 从待鉴定植物样品中提取样品DNA的步骤；
(2) 利用正向引物、反向引物通过PCR从所述样品DNA中扩增含有所述分子标记的核酸的步骤，其中所述正向引物具有SEQ ID NO.2所示的序列，所述反向引物具有SEQ IDNO.3所示的序列；和
(3) 通过电泳检测样品PCR产物的长度来鉴定所述植物。
本发明基于观赏羽衣甘蓝和其他甘蓝类蔬菜BoMYB2基因启动子上的结构变异位点开发出的一种SV分子标记，其是观赏羽衣甘蓝中特异的结构变异，通过对检测甘蓝类蔬菜是否存在该SV分子标记，可快速鉴定检测材料是否为观赏羽衣甘蓝。
附图说明
图1为观赏羽衣甘蓝和其他甘蓝类蔬菜的示意图。
图2为甘蓝类蔬菜BoMYB2启动子SV分子标记引物的PCR扩增电泳图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
除非另作说明，否则本发明中的基因位置是指相对于甘蓝T10而言的位置。
本发明的“观赏羽衣甘蓝”是指十字花科(Cruciferae)芸苔属(Brassica L.)的一种变种。术语“变种”是指一个种在学术期刊上最初被发表时，是没有种下等级(即变种、亚种、变型)的，后来随着人们对这个种的了解逐步全面、深入，发现在这个种内有一些植株个体或群体具有与最初发表这个种时所认识的该种的特征不同的变异，并且变异明显而稳定，值得把它们单独划分出来以示区别，植物学家便会给这个具有变异的类型命名，并根据不同情况，将其发表为这个种内的变种。相对而言，具有原来特征，没有发生明显变异的类型就称为这个变种的原变种。
分子标记
本发明的第一方面，提供一种特异性的分子标记，该分子标记具有区分观赏羽衣甘蓝与其它甘蓝类的特征序列，同时本发明验证了其与观赏羽衣甘蓝颜色紧密相关，从而能够区分观赏羽衣甘蓝，该分子标记为长度288bp的结构变异，其位于观赏羽衣甘蓝BoMYB2基因启动子上游293bp-580bp处。在一个具体的实施方案中，该序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明中的特征序列是指例如在甘蓝类蔬菜的所有亚种和变种中仅存在于观赏羽衣甘蓝蔬菜的基因片段。本发明中，其它甘蓝类旨在包括除观赏羽衣甘蓝外的任何十字花科，优选任何甘蓝属的物种，甘蓝属的物种的实例包括但不限于结球甘蓝、青花菜、花椰菜、芥蓝、苤蓝、食用羽衣甘蓝、抱子甘蓝等。
引物组合
本发明的第二方面，提供一种特异性引物组合，其用于扩增本发明所述的分子标记，包括正向引物和反向引物。在一个具体的实施方案中，正向引物和反向引物，正向引物具有SEQ ID NO.2所示的序列，反向引物具有SEQ ID NO.3所示的序列。
试剂盒
本发明还提供一种用于鉴定观赏羽衣甘蓝的试剂盒，其包括本发明所述的引物组合和可选的用于聚合酶链式反应的试剂。用于聚合酶链式反应的试剂包括那些常规PCR使用的任何试剂，例如聚合酶、缓冲液等。
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如组分的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合或试剂可为试剂盒中的组分。
用途
本发明进一步提供分子标记、能够检测所述分子标记的物质、引物组合以及试剂盒在观赏羽衣甘蓝遗传学分析中的应用，所述遗传学分析包括但不限于遗传多样性分析、种质鉴定、辅助育种等。
用于鉴定植物是否包含观赏羽衣甘蓝的方法
本发明提供一种用于鉴定植物是否包含观赏羽衣甘蓝的方法。优选地，本文所述的植物是指来自十字花科(Cruciferae)的植物，更优选地，本文所述的植物为来自芸苔属(Brassica)的植物，进一步优选地，本文所述的植物为来自甘蓝类蔬菜的植物。在某些实施方案中，本文的“植物”为一种类型植物，此时本发明的方法是指用于鉴定该植物是否为观赏羽衣甘蓝的方法。在某些实施方案中，此处的“植物”为多种类型的植物或其植物成分的混合物，此时本发明的方法是指用于鉴定植物中是否包含观赏羽衣甘蓝的方法。
本发明的方法包括在待鉴定植物的DNA中检测是否存在位于观赏羽衣甘蓝的BoMYB2基因的特征序列的步骤。关于特征序列已进行了说明，在此不再赘述。
本发明中，检测是否存在位于观赏羽衣甘蓝的BoMYB2基因的特征序列的方法可采用本领域已知的任何方法，其实例包括扩增包含特征序列的核酸的方法，还包括直接对植物基因组进行测序的方法等。
在某些实施方案中，本发明的用于鉴定植物是否包含观赏羽衣甘蓝的方法包括利用正、反向引物通过PCR从待鉴定植物样品的DNA中扩增含有特征序列的基因序列的步骤。
在示例性实施方案中，用于鉴定植物是否包含观赏羽衣甘蓝的方法包括以下步骤：
(1) 从待鉴定植物样品中提取样品DNA；
(2) 利用正向引物、反向引物通过PCR从所述样品DNA中扩增含有所述分子标记的核酸的步骤；
(3) 通过电泳检测样品PCR产物的长度来鉴定该植物是否为观赏羽衣甘蓝。
步骤(1)中，“待鉴定植物样品”是指植株整体或植株的一部分，例如，植物根、叶或植物茎等。
步骤(2)中，正向引物和反向引物比例为1:1。PCR反应程序：85-98℃ 1-5min、85-98℃，10-30s、40-70℃，10-30s、50-80℃，10-30s，共10-40个循环，50-80℃，1-10 min。还优选地，PCR反应程序：90-96℃ 1-3min、90-96℃，12-20s、50-65℃，15-20s、70-75℃，10-20s，共10-30个循环，65-75℃，1-5 min。
步骤(3)中，通过电泳检测样品PCR产物的长度中，观赏羽衣甘蓝为495bp。
实施例
以下示出了与观赏羽衣甘蓝颜色相关的BoMYB2基因启动子结构变异(SV)的分子标记的开发以及观赏羽衣甘蓝的鉴定。
利用27个不同甘蓝变种的高质量基因组，包括2个野生甘蓝，7个结球甘蓝，7个羽衣甘蓝，3个花椰菜，2个青花菜，2个苤蓝，2个芥蓝，1个抱子甘蓝，1个观赏甘蓝，构建基于SV的图形化泛基因组，具体如下。
以野生甘蓝T10为参考基因组，利用NUCmer(v4.0.0)(Marçais et al., 2018)将其他基因组与T10进行比对，设置参数为：-maxmatch-c100-l50，将比对结果进行过滤，使用delta-filters，参数为：-m-i90-l100，对过滤后的结果转换格式，使用show-coords，参数为：-T-H-r-d。
利用SyRI(Goel et al., 2019)从比对结果中鉴定SV，并对不同基因组之间的SV进行合并去冗余。
利用VG ToolKit (v1.33.0) (Garrison et al., 2018)将非冗余的SV与T10参考基因组，构建基于SV的图形化泛基因组。
对704份不同变种的甘蓝材料进行重测序，包括：36份野生甘蓝，310份结球甘蓝，153份花椰菜，63份青花菜，46份苤蓝，34份羽衣甘蓝，24份芥蓝，20份抱子甘蓝，18份观赏甘蓝，测序平台为Illumina HiSeq 2000，利用Trimmomatic v0.39对原始数据进行过滤，去除接头、poly-N和低质量片段，得到clean data。利用VG Index对基于SV的图形化泛基因组建立xg和gcsa格式的索引，然后用VG Map将clean data比对到图形化泛基因组上，将低质量的比对结果用VG Pack过滤，参数为：-Q5。利用VG Call获得每个样本的SV基因型，参数为：-a-s。
将SV与不同变种类型的甘蓝材料进行关联分析，发现了一个观赏羽衣甘蓝特有的SV，这个SV长度是288bp，在18份观赏羽衣甘蓝中均存在，在其他甘蓝材料中均不存在。该SV位于BoMYB2基因上游289bp的启动子区域。
对观赏羽衣甘蓝和结球甘蓝的幼苗提取基因组DNA，合成SV分子标记引物，序列如下：BoMYB2SV-F：GCCACGTGTCGAGATATTATTGG(SEQ ID NO.2)；BoMYB2SV-R：CTCTGCAATTGGGATGTCTTTTGTC(SEQ ID NO.3)。
以不同类型甘蓝类材料DNA为模板进行PCR反应，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示，观赏羽衣甘蓝材料所得产物为495bp，结球甘蓝材料所得产物为207bp。同时，将产物进行sanger测序，测序结果显示SV区域序列如SEQ ID NO.1所示，共288bp。
利用上述分子标记引物，对48份甘蓝材料进行鉴定，其中包括13份观赏羽衣甘蓝材料，35份其他甘蓝类材料，其他甘蓝类材料包括15份结球甘蓝，5份青花菜，5份花椰菜，3份芥蓝，3份苤蓝，2份食用羽衣甘蓝，2份抱子甘蓝。提取所有材料基因组DNA，进行PCR反应鉴定。
结果显示：13份观赏羽衣甘蓝材料均为495bp，鉴定准确率为100%；35份其他甘蓝材料中，34份为207bp，1份未检测出条带，准确率为97%。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
Claims (1)
1. 一种用于鉴定植物是否为观赏羽衣甘蓝的方法，其特征在于，在待鉴定植物的DNA中检测是否存在位于BoMYB2基因启动子上游结构变异的分子标记，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，包括以下步骤：
(1) 从待鉴定植物样品中提取样品DNA；
(2) 利用正向引物、反向引物通过PCR从所述样品DNA中扩增含有所述分子标记的核酸，其中所述正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示；和
(3) 通过电泳检测样品PCR产物的长度来鉴定所述植物，所得PCR产物的长度为495bp时，所述植物为观赏羽衣甘蓝。
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2023
- 2023-08-31 CN CN202311113706.4A patent/CN117248052B/zh active Active
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