CN117242186A - 细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于重组蛋白、特别是抗体的制造领域。更具体地，它涉及在商业规模制造过程中表达产量得到提高的蛋白质的细胞培养方法。

Description

细胞培养方法
发明领域
本发明属于重组蛋白、特别是抗体的制造领域。更具体地，它涉及在商业规模制造过程中表达产量得到提高的蛋白质的细胞培养方法。
发明背景
重组蛋白作为治疗性蛋白质(如治疗性抗体)的开发需要以工业规模生产重组蛋白。为了实现这一目标，可以使用不同的表达***，包括原核和真核***。然而，在过去的二十年中，大多数被批准作为治疗剂的蛋白质是通过哺乳动物细胞培养物制造的，并且这种***仍然是生产大量供人使用的重组蛋白的首选表达***。
在过去的30年中，一直致力于建立细胞培养和重组蛋白表达的基本参数，研究的重点在于通过改变细胞培养基的组成(参见例如Hecklau C.等人，2016年；Zang Li.等人，2011年)和操作条件以及开发大型生物反应器来实现最佳细胞生长。
虽然产量仍然是哺乳动物细胞培养的一个非常重要的方面，但近年来，重点已转向在开发和生产规模的各个阶段控制产品质量和工艺一致性。哺乳动物细胞培养产生的治疗性蛋白质表现出不同程度的异质性。这种异质性包括但不限于不同的糖基化模式、脱酰胺或氧化引起的差异、不同的电荷或尺寸变体。近年来，皮下递送治疗性蛋白质的趋势稳步下降，这需要配制高浓度的治疗性蛋白质。高浓度与聚集水平增加有关(Purdie J.等人，2016年)。增加的电荷变体，例如酸性物质水平的增加可能会影响蛋白质的稳定性(BanksD.D.等人，2009年)。细胞培养条件，例如培养基的组成(Kshirsagar R.等人，2012年；US20130281355；WO2013158275；Ben Yahia B.等人，2016年；Ben Yahia B.等人，2016年)和生长条件，包括进料策略(WO2018219968；Pan等人，2017年)，pH和温度(US8765413)已被证明会影响治疗性蛋白质的产量和质量属性。
然而，仍然存在需要提供这样的细胞培养方法，其提高生产治疗性蛋白质的产量，同时对蛋白质异质性的影响最小。
发明概述
在第一方面，本发明提供一种用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量(exceptional bolus)的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
在第二方面，本发明提供一种用于生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
在第三方面，本发明提供一种用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力(Qp)的方法，其中所述哺乳动物细胞表达重组蛋白，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
在这些方面中任一方面的情况下，在添加所述特殊大剂量之后，在细胞培养物中存在的Cys、Trp和Tyr的总浓度分别为：Cys为至少约2.45mM；Trp为至少约1.50mM；和Tyr为至少约2.75mM。
在这些方面中任一方面的进一步优选实施方案中，控制Cys、Tyr和Trp的总浓度，以在达到最大活细胞浓度峰值之前至少一天在细胞培养物中分别达到至少约2.45mM、至少约2.75mM和至少约1.50mM。
优选地，同时或按顺序达到这些高浓度。Cys、Try和Trp可以是同一进料培养基的一部分或不同进料培养基的一部分。
定义
在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本文主题所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。提供本文所用的以下定义是为了便于理解本发明。
本说明书和权利要求书中所用的用于例如本文的短语“A和/或B”中的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。
本说明书和权利要求书中所用的术语“细胞培养”或“培养”是指细胞在体外即生物体或组织之外的生长与增殖。哺乳动物细胞的合适的培养条件是本领域已知的，例如在Ozturk&Hu(2005)中所教导的。哺乳动物细胞可以在悬浮液中培养或贴壁至固体基底上的情况下培养。
术语“细胞培养基”、“培养基(culture medium)”、“培养基(medium)”及其任意复数形式是指其中可以培养任何类型的细胞的任何培养基。“基础培养基”是指含有对细胞代谢有用的所有必需成分的细胞培养基。这包括例如氨基酸、脂质、碳源、维生素和矿物盐。DMEM(杜氏改良伊格尔培养基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium)或F12培养基(Ham's F12培养基)是市售可得基础培养基的实例。已在例如WO98/08934和US2006/0148074(两者均以其全文并入本文)中描述其它合适的培养基。进一步合适的市售可得培养基包括但不限于AmpliCHO CD培养基、DynamisTM培养基、EX-AdvancedTM CHOFed-batch System、CD FortiCHOTM培养基、CP OptiCHOTM培养基、Minimum EssentialMedia(MEM),/>CHO Growth A培养基、ActiProTM培养基、DMEM-杜氏改良伊格尔培养基和RPMI-1640培养基。或者，所述基础培养基可以是专有培养基，本文也称为“化学成分确定的培养基”，其中所有成分都可以用化学式来描述并且以特定浓度存在。培养基优选不含蛋白质和血清，并且可以根据培养细胞的需要补充任何其他化合物，例如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子。
术语“进料培养基”(及其复数形式)是指以分批补料模式培养过程中用作补充的培养基，以补充所消耗的营养物质。进料培养基可以是市售可得进料培养基或专有进料培养基。合适的市售可得进料培养基包括但不限于Cell BoostTM补充剂、EfficientFeedTM补充剂、ExpiCHOTM进料。或者，所述进料培养基可以是专有进料培养基，本文也称为“成分确定的进料培养基”或“化学成分确定的料培养基”，其中所有成分都可以用化学式来描述并且以特定浓度存在。进料培养基通常是浓缩的，以免将培养物的总体积增加到高水平。这种进料培养基可以含有细胞培养基的大部分成分，例如，在基础培养基中含有其正常量的约1.5X、2X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100X、200X或甚至500X的细胞培养基的大多数成分。专有进料培养基通常为粉末形式。市售培养基是液体或粉末形式。根据进料说明书，当进料已经是液体形式时，就这样使用它们。粉末形式的进料在使用前需要溶解，例如溶解在水中。它们应该溶解在给定量的水中(例如，100g溶解在1L水中，参见图1A)。但是，粉末形式的进料可以进一步被浓缩。在这种情况下，它们将使用比正常所需的所述量更少的液体(例如，200g溶解在1L水中，参见图1B)溶解。根据标准方案制备的液体市售进料或粉末形式的进料在本文中也称为“正常”进料。根据浓缩方法制备的液体市售进料或粉末形式的进料在本文中称为“浓缩进料”或“浓缩主进料”。
在整个培养过程中可以添加不同组成的不同进料培养基。例如，在同一过程中可以使用三种不同的进料培养基：一种由碳源(例如葡萄糖)组成的进料培养基，一种由消耗的大部分营养物质组成的进料培养基(该进料也称为主进料培养基)，以及另一种包含一些其他营养物质的进料培养基，例如当这些营养物质存在聚集/稳定性问题时。
术语“生物反应器”是指其中可以培养细胞的任何***。它包括但不限于培养瓶、静态培养瓶、旋转培养瓶、试管、摇动管、摇瓶、波浪袋、生物反应器、纤维生物反应器和带或不带微载体的搅拌罐生物反应器。或者，该术语还包括微量滴定板、毛细管或多孔板。可以使用任何尺寸的生物反应器，例如1毫升(1mL，非常小的规模)至20000升(20000L或20KL，非常大的规模)，例如1mL、5mL、0.01L、0.1L、1L、2L、5L、10L、50L、100L、500L、1000L(或1KL)、2000L(或2KL)、5000L(或5KL)、10000L(或10KL)、15000L(或15KL)或20000L(20KL)。
术语“补料分批培养”是指这样的培养细胞的方法，其中有大剂量(bolus)(通常多次大剂量)或连续进料培养基(或复数形式的进料培养基)补充，以补充消耗的营养物质，而无需去除任何培养基。可以根据预定的时间表添加进料，例如，每天、每两天一次、每三天一次等。或者，如果进料是连续的，则可以在整个培养过程中改变进料速率。取决于培养基配方、细胞系和其他细胞生长条件，该细胞培养技术有可能获得大约大于10x 106至30x 106个细胞/ml的高细胞密度。可以通过各种进料策略和培养基配方创建和维持双相培养条件。
或者，可以使用灌注培养。灌注培养是指细胞培养物在去除废培养基的同时接受新鲜灌注进料培养基。灌注可以是连续的、逐步的、间歇的，或者其中任何一种或全部的组合。灌注速率可以每天小于一个工作体积至许多工作体积。优选地，将细胞保留在培养物中，并且去除的废培养基基本上没有细胞或具有比培养物少得多的细胞。灌注可以通过许多细胞保留技术完成，包括离心、沉降或过滤(例如参见Voisard et al.,2003)。当在哺乳动物细胞中使用本发明的工艺、方法和/或细胞培养技术时，重组蛋白通常直接分泌到培养基中。所述蛋白质分泌到培养基中之后，可以首先澄清来自这种表达***的上清液，以便在纯化和配制之前开始分离感兴趣的蛋白质并浓缩。
根据本发明的术语“生产阶段”包括细胞表达(即生产)重组多肽时制造重组蛋白过程中的细胞培养阶段。生产阶段从所需产品的滴度增加开始，到收获细胞或细胞培养液或上清液结束。通常，在生产阶段开始时，细胞培养物被转移到生产容器中，例如生物反应器中。收获是从生产容器中取出细胞培养液的步骤，以便在后续步骤中回收和纯化重组蛋白(例如重组抗体)。
“半胱氨酸”是一种分子量为121.16g/mol的氨基酸。优选L对映异构体(即L-半胱氨酸)。该术语还涵盖其任何盐或其衍生物，例如(但不限于)半胱氨酸水合物、半胱氨酸二水合物、半胱氨酸盐酸盐、半胱氨酸二盐酸盐、半胱氨酸盐酸盐一水合物、半胱氨酸S-硫酸盐(也称为S-磺基半胱氨酸)、乙酰半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸。或者，可以使用在WO2019106091中公开的任何半胱氨酸/胱氨酸类似物。
“胱氨酸”是一种分子量为240.3g/mol的氨基酸。优选L对映异构体(即L-胱氨酸)。该术语还涵盖其任何盐或其衍生物，例如胱氨酸盐酸盐、胱氨酸二盐酸盐、N,N'-二乙酰基-L-胱氨酸、N,N′-二乙酰基-L-胱氨酸二甲酯或L-胱氨酸二甲酯。
细胞培养基中的“半胱氨酸”和“胱氨酸”处于恒常平衡状态，其中两个半胱氨酸分子氧化成一个胱氨酸分子，后者还原回两个半胱氨酸分子。虽然在本文档中它主要被称为半胱氨酸(或者它被称为Cys)，为了便于阅读，对半胱氨酸没有限制。因此，术语“Cys”是指半胱氨酸、胱氨酸、其盐、其衍生物或其任意组合。例如，当它被称为“Cys为约2.45mM”时，本领域技术人员理解它涵盖约2.45mM的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、其盐、其衍生物或例如半胱氨酸和胱氨酸的组合。当以g/L表示时，“Cys为约2.45mM”对应于例如约0.30g/L的L-半胱氨酸或约0.60g/L的L-胱氨酸。
“酪氨酸”，本文也称为“Tyr”，是一种分子量为181.19g/mol的氨基酸。优选L对映异构体(即L-酪氨酸)。该术语还涵盖其任何盐或其衍生物，例如(但不限于)酪氨酸二钠盐、酪氨酸二钠水合物、酪氨酸二钠二水合物、N-乙酰基-L-酪氨酸或磷酸酪氨酸钠。当以g/L表示时，“Tyr为约2.75mM”对应于例如约0.50g/L的L-酪氨酸。
“色氨酸”，本文也称为“Trp”，是一种分子量为204.23g/mol的氨基酸。优选L对映异构体(即L-色氨酸)。该术语还涵盖其任何盐，例如(但不限于)色氨酸钠。当以g/L表示时，“Trp为约1.50mM”对应于例如约0.30g/L的L-色氨酸。
术语Cys、Trp或Tyr中的任一种的“高浓度”是指这样的浓度：半胱氨酸(或胱氨酸或其任何盐)为2.0mM或2.0mM以上，Tyr为1.7mM或1.7mM以上或者Trp为1mM或1mM以上(参见例如Pan et al.,2017)。
本文所用的“细胞浓度”(也称为“细胞密度”)是指给定体积培养基中的细胞数。
术语“活细胞浓度”(或“VCC”)是指给定体积培养基中的活细胞数。这是通过标准活力测定确定的。应该理解，本领域技术人员知道如何确定每个具体细胞系的最大VCC：这通常由于一个或多个初始实验而进行。在知晓在给定条件下表达给定蛋白质的一个细胞系达到最大VCC的日子之后，可以设计根据本发明的方法。无需为个个实验确定VCC。
术语“IVCC”是指活细胞计数的积分，可以通过找到细胞培养生长曲线下的面积来确定
术语“活力”或“细胞活力”是指活细胞总数与培养细胞总数之间的比率。尽管与培养开始时相比，只要不低于60％的阈值，存活率通常是可以接受的，但可以根据具体情况确定可接受的阈值。活力通常用于确定收获时间。例如，在补料分批培养中，一旦活力达到至少60％或在培养中约14天(通常为14天+/-1天)后，就可以进行收获。标准方法可用于确定细胞活力或VCC，例如通过使用VI-XR自动细胞计数装置(Beckman-CoulterInc.)。
术语“滴度”是指感兴趣的蛋白质在溶液中的浓度。这是通过标准滴度测定来确定的，例如连续稀释结合检测方法(比色法、色谱等)、结合CEDEX或蛋白A高压液相色谱(HPLC)、Biacore或ForteBIO/>方法，如实施例部分所使用的。
术语“比生产力”，也称为“qp”，是指每个细胞每天生产的感兴趣的蛋白质的量。
术语“较高滴度”或“较高生产力”及其等效物意味着与对照培养条件相比，滴度或生产力至少提高了10％。如果滴度或比生产力与对照培养条件相比在-10％至10％的范围内，则认为滴度或比生产力得到保持。术语“较低滴度”或“较低生产力”及其等效物意味着与对照培养条件相比，滴度或生产力至少降低10％。
本文所用的术语“异质性”是指由同一制造工艺生产或在同一制造批次内的分子群中的单个分子(例如重组蛋白)之间的差异。异质性可能是由于重组多肽的不完全或不同质修饰引起的，例如由于多肽的翻译后修饰或转录或翻译过程中的错误掺入。翻译后修饰可以是例如脱氨基反应和/或氧化反应和/或共价添加小分子例如糖化反应和/或异构化反应和/或碎裂反应和/或其他反应的结果，还包括糖化模式的变化。这种异质性的化学物理表现导致所得重组多肽制剂中的各种特征，包括但不限于电荷变体谱、颜色或颜色强度和分子量谱。
电荷异质性的降低优选通过测量细胞培养物中产生的重组蛋白群中的酸性峰基团(APG)物质来定义。测量APG降低的一种可能方法是通过Imaged CapillaryElectrophoresis(例如ProteinSimple iCE3)确定在有或没有半胱氨酸/半胱氨酸类似物的细胞培养基中产生的重组蛋白的酸性(APG指酸性峰基团)亚型的相对百分比，该重组蛋白在测量时优选纯化。当测量重组蛋白的亚型时，除了APG之外，还测量碱性亚型(碱性峰基团(BPG))和主要电荷物质，其中主要电荷物质代表人们希望获得的重组蛋白的亚型。优选的是，当APG降低时，BPG基本上没有增加。优选地，当APG降低时，主要电荷物质水平增加。
本文所用的术语“蛋白质”包括肽、多肽和蛋白质，并指包含两个或多个氨基酸残基的化合物。根据本发明的蛋白质包括但不限于细胞因子、生长因子、激素、融合蛋白、抗体或其片段。治疗性蛋白质是指可用于或用于治疗的蛋白质。
术语“重组蛋白”是指由重组技术生产的蛋白质。重组技术完全在本领域技术人员的知识范围内(例如参见Sambrook et al.,1989和更新)。
本文所用的术语“抗体”包括但不限于由本领域已知的重组技术产生的单克隆抗体、多克隆抗体和重组抗体。“抗体”包括任何物种的抗体，特别是哺乳动物物种的抗体；如任何同种型的人抗体，包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE、IgD和作为该基本结构的二聚体产生的抗体，包括IgGA1、IgGA2或五聚体(如IgM)及其修饰变体；非人灵长类动物抗体，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴的抗体；啮齿类动物抗体，例如来自小鼠或大鼠的抗体；兔、羊或马抗体；骆驼科抗体(例如来自骆驼或美洲驼，如NanobodiesTM)及其衍生物；鸟类物种的抗体，如鸡抗体；或鱼类物种的抗体，如鲨鱼抗体。术语“抗体”也指“嵌合”抗体，其中至少一条重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，该重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如Old-World Monkey，例如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区域序列。“人源化”抗体是嵌合抗体，其含有源自非人抗体的序列。在大多数情况下，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中来自受体高变区域的残基被来自非人物种(供体抗体)的超变区[或互补性决定区(CDR)]的残基所取代，所属非人物种例如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物，具有所需的特异性、亲和力和活性。在大多数情况下，CDR之外的人(受体)抗体残基；即在框架区(FR)中，被相应的非人残基另外取代。此外，人源化抗体可能包含受体抗体中或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步完善抗体特性。人源化降低了非人抗体在人体中的免疫原性，从而促进了抗体在人疾病治疗中的应用。人源化抗体和来产生它们的若干不同技术是本领域众所周知的。术语“抗体”也指人抗体，可以作为人源化的替代品产生。例如，有可能生产出能够在没有产生内源性鼠抗体的情况下，在免疫后产生完整的人类抗体库的转基因动物(例如小鼠)。体外获得人抗体/抗体片段的其他方法基于噬菌体展示或核糖体展示技术等展示技术，其中使用至少部分人工或从供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库产生的重组DNA文库。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术是本领域众所周知的。人抗体也可以从分离的人B细胞中产生，这些B细胞用感兴趣的抗原离体免疫，随后融合以产生杂交瘤，然后可以筛选最佳人抗体。术语“抗体”是指糖基化和无糖基化的抗体。此外，本文所用的术语“抗体”不仅指全长抗体，而且还指抗体片段，更具体地说指其抗原结合片段。抗体片段包含本领域已知的至少一个重链或轻链免疫球蛋白结构域，并与一种或多种抗原结合。根据本发明的抗体片段的实例包括Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-Fv-Fv、scFv和Bis-scFv片段。所述片段还可以是双特异性抗体、三特异性抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、单结构域抗体(dAb)如sdAb、VL、VH、VHH或骆驼科抗体(例如来自骆驼或美洲驼如NanobodyTM)和VNAR片段。根据本发明的抗原结合片段还可以包括与一个或两个scFv或dsscFv连接的Fab，每个scFv或dsscFv结合相同或不同的靶标(例如，一个scFv或dsscFv结合治疗靶标和一个scFv或dsscFv通过结合例如白蛋白来增加半衰期)。这种抗体片段的示例性是FabdsscFv(也称为)或Fab-(dsscFv)2(也称为/>例如参见WO2015197772)。如上所述定义的抗体片段是本领域已知的。
发明详述
本公开内容涉及在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法和培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法。具体而言，本发明基于本发明人的以下发现即通过控制：1)由进料培养基带来的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的量和2)添加时机，而具有以下出乎意料的效果：降低细胞生长同时提高细胞的比生产力并且提高产量而不影响重组蛋白的质量。具体而言，通过实施本文所述的方法，可以减少与产物相关的变体(例如电荷变体、脱氨变体或氧化物质)的形成。
本文所述的方法依赖于在生产感兴趣的重组蛋白期间控制细胞培养物中Cys、Trp和Tyr的浓度。确实出乎意料地发现，通过按时间顺序(例如培养开始之后一天至七天和/或在预计达到VCC的日子之前至少一天)添加包含高且受控浓度Cys、Tyr和Trp的特殊大剂量进料，可以在培养基中达到这些氨基酸中每种的更高浓度，并提高培养细胞的具体单克隆抗体生产力。
本公开内容描述了如何控制这些参数以最大化生物反应器生产产量，最小化细胞生长并最小化所生产的重组蛋白的微异质性。本公开内容提供将这些参数控制在要求保护范围内的方法(特别是分批补料方法)的具体实例，并提供了添加半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸的可能模式的具体实例(特殊大剂量及其与连续/半连续等相比的时机)。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物细胞，并且在培养开始之后的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
在进一步的实施方案中，本文所述的是一种用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力(Qp)的方法，其中所述哺乳动物细胞表达重组蛋白，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
在本发明整体的背景下，用于生产重组蛋白的方法、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法或用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力的方法，包括以下主要步骤：
i)在生物反应器(例如生产生物反应器)中的培养基中接种哺乳动物细胞，其中培养基任选地包含初始量的半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸
ii)在培养基中培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞(或者称为细胞培养物)，
iii)进一步添加至细胞培养物：
a.在培养的第1天至第7天，特殊大剂量，所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸，
b.定期将主进料添加至细胞培养物，
c.进一步的一个或多个大剂量的半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸，以防止细胞培养过程中Cys、Tyr和Trp中任一种的耗尽，
iv)任选地从细胞培养液(CCF)中回收重组蛋白。
或者，用于生产重组蛋白的方法、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法或用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力的方法，包括以下主要步骤：
(i)在生物反应器(例如生产生物反应器)中的培养基中接种哺乳动物细胞，其中培养基任选地包含初始量的半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸，
(ii)根据补料分批方法，通过生产阶段推进培养，其中重组蛋白由哺乳动物细胞产生，其中，在所述生产阶段，细胞培养物：
a)在培养的第1天至第7天用特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)进行补充，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp，
b)用至少一种主进料培养基定期补充至细胞培养物，并且
c)进一步用一个或多个进料的半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸进行补充，以防止细胞培养过程中Cys、Tyr和Trp中任一种的耗尽。
iii)任选地从细胞培养液(CCF)中回收重组蛋白。
本领域技术人员将理解，术语“培养的第1天至第7天”是指“培养开始之后的一天至七天”或者替代地“在生物反应器中接种哺乳动物细胞之后的一天至七天”。实际上，培养开始或哺乳动物细胞在生物反应器中接种的日子对应于第0天。本领域技术人员还将理解，“培养的第1天和第7天”是指培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天或第7天的任一天。
可以同时或按顺序添加半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸。当同时添加三种氨基酸时，它们可以通过以下方式提供：(a)全部合并在单一溶液中，(b)在单独的溶液中，每种溶液包含Cys、Tyr或Trp中的一种；或(c)一种溶液和第二溶液的组合，其中两种氨基酸在一种溶液中，而第二溶液包含剩余的氨基酸。当氨基酸按顺序添加时，可以按任何顺序添加，最好在2小时的窗口期内添加(例如，如果在H0添加Cys，可以在H+1添加Tyr，在H+2添加Trp，或者如果在H0添加Tyr，可以在H+0.5添加Trp，在H+1.5添加Cys)。
在本发明整体的背景下，在添加特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp之后，在细胞培养物中达到高浓度的Cys、Tyr和Trp。在一个方面，其中在添加所述特殊大剂量之后，在细胞培养物中存在的Cys、Trp和Tyr的总浓度分别为：
a.Cys为至少约2.45mM；
b.Trp为至少约1.50mM；和
c.Tyr为至少约2.75mM。
或者，在添加所述特殊大剂量之后，在细胞培养物中存在的Cys、Trp和Tyr的总浓度分别为：
a.Cys为约2.45mM至约6.6mM；
b.Trp为约1.50mM至约2.9mM；和
c.Tyr为约2.75mM至约6.2mM。
本领域技术人员知道如何调整特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp的浓度，以在添加所述特殊大剂量之后达到细胞培养物中的这些高总浓度。
根据本发明整体的方法可以进一步包括以下初步步骤：进行至少一个初始实验来确定培养开始之后细胞培养基中Cys、Trp和Tyr的每日浓度，以根据待添加特殊大剂量的日子确定待通过所述特殊大剂量添加的Cys、Trp和Tyr的量。必须理解，该初始实验不需要在每次进行本发明的方法时重复。换言之，对于一个具体克隆，在给定的条件下，一旦在至少一个初始实验中确定了待通过特殊大剂量添加的Cys、Trp和Tyr的量，就不需要在每次待进行本发明的方法时控制这些浓度。
根据本发明整体的方法的情况下，在添加特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp之后，优选在达到最大VCC的日子之前(或者在预期达到最大VCC的日子之前)，在细胞培养物中达到高浓度的Cys、Tyr和Trp。在一个方面，在添加特殊大剂量之后，在达到最大VCC的日子之前(或者在预期达到最大VCC的日子之前)，在细胞培养物中存在的Cys、Tyr和Trp的总浓度由以下组成：Cys为至少约2.45mM；Trp为至少约1.50mM；和Tyr为至少约2.75mM。在另一个方面，在添加特殊大剂量之后，在达到最大VCC的日子之前(或者在预期达到最大VCC的日子之前)，在细胞培养物中存在的Cys、Tyr和Trp的总浓度由以下组成：Cys为约2.45mM至约6.6mM；Tyr为约2.75mM至约6.2mM；和Trp为约1.50mM至约2.9mM。在具体方面，控制Cys、Tyr和Trp的浓度，以在达到(或预期达到)最大VCC之前至少一天在细胞培养基中同时(或按顺序)分别达到至少约2.45mM、至少约2.75mM和至少约1.50mM。由于在达到(或预期达到)最大VCC前至少一天添加了特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp，因此可以达到这些浓度。在这种情况下，优选最迟在达到(或预期达到)最大VCC的日子之前一天开始添加Cys、Tyr和Trp。或者，优选在最大VCC的日子之前(或在预期的最大VCC的日子之前)两天、三天、四天、五天、六天或七天开始添加Cys、Tyr和Trp。甚至优选在最大VCC的日子之前(或在预期的最大VCC的日子之前)两天、三天或四天开始添加Cys、Tyr和Trp。例如，如果在第8天达到(或预期达到)最大VCC，可以在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天或第7天进行Cys、Tyr和Trp的添加。在另一个实例中，如果在第5天达到(或预期达到)最大VCC，可以在第1天、第2天、第3天或第4天进行Cys、Tyr和Trp的添加。
根据本发明整体的方法还可进一步包括以下初始步骤：进行至少一个初始实验来确定培养中哺乳动物细胞达到最大活细胞浓度(VCC)的日子。必须理解，该初始实验不需要在每次进行本发明的方法时重复。换言之，对于一个具体克隆，在给定的条件下，一旦在至少一个初始实验中确定了达到(或预期达到)最大VCC的日子，就不需要在每次待进行本发明的方法时控制它。
在本发明整体的背景下，如果要进行任何初始步骤(例如来确定最大活细胞浓度(VCC)的日子或来确定待通过特殊大剂量添加的Cys、Trp和Tyr的量)，用于生产重组蛋白的方法、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法或用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力的方法，包括以下主要步骤：
i)任选地进行至少一个初始实验来确定培养开始之后细胞培养基中Cys、Trp和Tyr的每日浓度，以根据待添加特殊大剂量的日子确定待通过所述特殊大剂量添加的Cys、Trp和Tyr的量，
ii)任选地进行至少一个初始实验来确定培养中哺乳动物细胞达到最大活细胞浓度(VCC)的日子，
iii)在生物反应器(例如生产生物反应器)中的培养基中接种哺乳动物细胞，其中培养基任选地包含初始量的半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸
iv)在培养基中培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞(或者称为细胞培养物)，
v)进一步添加至细胞培养物：
a.在培养的第1天至第7天，特殊大剂量，所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸，
b.定期将主进料添加至细胞培养物，
c.进一步的一个或多个大剂量的半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸，以防止细胞培养过程中Cys、Tyr和Trp中任一种的耗尽，
vi)任选地从细胞培养液(CCF)中回收重组蛋白。
或者，如果要进行任何初始步骤(例如来确定最大活细胞浓度(VCC)的日子或来确定待通过特殊大剂量添加的Cys、Trp和Tyr的量)，用于生产重组蛋白的方法、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法或用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力的方法，包括以下主要步骤：
i)任选地进行至少一个初始实验来确定培养开始之后细胞培养基中Cys、Trp和Tyr的每日浓度，以根据待添加特殊大剂量的日子确定待通过所述特殊大剂量添加的Cys、Trp和Tyr的量，
ii)任选地进行至少一个初始实验来确定培养中哺乳动物细胞达到最大活细胞浓度(VCC)的日子，
iii)在生物反应器(例如生产生物反应器)中的培养基中接种哺乳动物细胞，其中培养基任选地包含初始量的半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸，
iv)根据补料分批方法，通过生产阶段推进培养，其中重组蛋白由哺乳动物细胞产生，其中，在所述生产阶段，细胞培养物：
a)在培养的第1天至第7天用特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)进行补充，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp，
b)用至少一种主进料培养基定期补充至细胞培养物，并且
c)进一步用一个或多个进料的半胱氨酸/胱氨酸、酪氨酸和色氨酸进行补充，以防止细胞培养过程中Cys、Tyr和Trp中任一种的耗尽。
v)任选地从细胞培养液(CCF)中回收重组蛋白。
如本文所述，本发明人已经证明本发明的重要方面(特别是为了促进(boost)细胞的比生产力)是以适时(timely)的方式添加的特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp，以在细胞培养物中达到这三种氨基酸的特定最小浓度。但是，如果该特殊大剂量要被整合到已经准备就绪的生产工艺中以生产具有已经确定的产品品质属性(PQA)的重组蛋白，为了不冒这些大量氨基酸对PQA产生负面影响的风险，建议在整个培养过程中保持提供相同总量的Cys、Tyr和Trp(与已经准备就绪的工艺相比)。在这种情况下，可以调整在特殊大剂量之后待添加的额外的大剂量中Cys、Tyr和Trp的量。对于在一种给定哺乳动物细胞系中表达的一种给定重组蛋白，如果有必要保持在一定的产品质量属性范围内，则在此过程中提供的Cys、Tyr和Trp的总量优选保持与没有特殊大剂量添加Cys、Tyr和Trp的标准工艺相当(参见图2)。然后，在进行特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp的添加之后，当特殊大剂量过程中的添加的Cys、Tyr和Trp的累积的量等于没有特殊大剂量添加Cys、Tyr和Trp的标准工艺的累积的量时，进行下一次添加Cys、Tyr和Trp，以在接下来的日子里然后适应标准工艺进料策略。例如，如果在第1天添加特殊大剂量并且以特殊大剂量添加的Cys、Tyr和Trp的量对应于标准工艺中四天期间添加的Cys、Tyr和Trp的量，那么将在第五天恢复进料。在另一实例中，如果在第3天添加特殊大剂量并且以特殊大剂量添加的Cys、Tyr和Trp的量对应于标准工艺中三天期间添加的Cys、Tyr和Trp的量，那么将在第六天恢复进料。类似的策略可以应用于生产尚未具有待满足的一定范围的产品质量属性的重组蛋白。在这种情况下，本领域技术人员将了解如何调整标准工艺或平台工艺，它们用于生产重组蛋白。
虽然在本文档中它主要被称为半胱氨酸，为了便于阅读，对半胱氨酸本身没有限制，即“半胱氨酸”和“胱氨酸”是可以互换的。如在定义部分中所解释的，细胞培养基中的半胱氨酸和胱氨酸处于恒常平衡状态，其中两个半胱氨酸分子氧化成一个胱氨酸分子，后者还原回两个半胱氨酸分子。如果更喜欢使用胱氨酸而不是半胱氨酸，在添加特殊大剂量之后必须达到至少约2.45mM的胱氨酸。或者，可以使用半胱氨酸和胱氨酸的组合。此外，可以使用其任何盐。
在本发明整体的背景下，Cys、Tyr和Trp是同一进料培养基的一部分。优选地，包含Cys、Tyr和Trp的进料培养基不含其他任何营养物质(即优选地，进料培养基由Cys、Tyr和Trp组成)。这意味着细胞正确生长所需的其他营养物质是通过其他进料培养基(例如主进料培养基)带来的。或者，Cys、Tyr和Trp是不同进料培养基的一部分，例如包含或由Cys组成的第一进料培养基，包含或由Tyr组成的第二进料培养基，以及包含或由Trp组成的第三进料培养基。其他营养物质可以通过这三种进料培养基之一(如果其中一种进料培养基是主进料)补充或通过至少第四进料培养基带来以满足细胞需求。
在本发明整体的背景下，在培养开始(第0天)至添加特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp(在达到最大VCC之前至少一天或者不晚于第7天)，不添加Cys、Tyr和Trp。相反，例如当特殊大剂量过程中的添加的Cys、Tyr和Trp的累积的量等于没有特殊大剂量添加Cys、Tyr和Trp的标准工艺的累积的量时，随着特殊大剂量(在培养的第1天至第7天和/或在预期达到最大VCC之前至少一天)一次性(at once)添加本来根据标准进料策略会通过每日大剂量或连续进料添加的至少一定量的Cys、Tyr和Trp，然后恢复“正常”进料策略，以在接下来的日子里然后适应标准工艺进料策略(参见图2)。例如，如果在第1天以特殊大剂量添加的Cys、Tyr和Trp的量对应于标准工艺中四天期间添加的Cys、Tyr和Trp的量，那么将在第五天恢复进料(参见图2)。必须理解，不需要在每次进行根据本发明的方法时控制达到(或预期达到)最大VCC的日子。实际上，如本领域技术人员众所周知的，根据至少一个初始实验确定该最大VCC的日子。以上是非限制性实例。如果希望在整个培养过程中保持与标准工艺相比添加的相同总量的Cys、Trp和Tyr，本领域技术人员将知道如何调整Cys、Trp和Tyr的全局进料策略，无论特殊大剂量的日子和恢复正常进料的日子(即特殊大剂量之后一天或更长时间)。作为非限制性实例，如果希望在整个为期10天的培养中提供每升细胞培养体积5mmol的Cys、Tyr和Trp总量，包括基础培养基中提供的0.5mM的每种氨基酸，则可以设计一个在第2天加入特殊大剂量的方法，在细胞培养物中提供2.45mM的Cys、1.50mM的Trp、2.75mM的Tyr，然后在第4天、第6天和第8天添加进一步的进料，每次进料分别在细胞培养物中提供0.85mM的Cys、1.17mM的Trp、0.75mM的Tyr。在另一非限制性实例中，如果希望在整个为期14天的培养过程中提供每升细胞培养体积10mmol的Cys、Tyr和Trp总量，包括基础培养基中提供的1mM的每种氨基酸，并考虑第6天的最大VCC，则可以设计一个在第4天加入特殊大剂量的方法，在细胞培养物中提供3mM Cys、2mM Trp、3mM Tyr，然后从第7天到第12天每天添加进一步的进料，每次进料分别提供1mM的Cys、1.17mM的Trp、1mM的Tyr。
应当理解，本领域技术人员知道如何：
-确定每个具体细胞系/克隆达到最大VCC的日子：这通常由于一个或多个初始实验而进行。在知晓在给定条件下表达给定蛋白质的一个细胞系达到最大VCC的日子之后，可以设计根据本发明的方法。无需为个个实验或批次确定VCC。
-测量在具体阶段(例如生产阶段)添加到细胞培养物中和/或在细胞培养物中存在的半胱氨酸(和/或胱氨酸)、酪氨酸和色氨酸的浓度。这种确定通常由于一个或多个初始实验而进行。例如，这可以如本文实施例所述而完成(尽管不限于这些方法)。在知晓在给定条件下表达给定蛋白质的一个细胞系的各自的量之后，可以设计根据本发明的方法。无需为个个实验或生产批次确定半胱氨酸(和/或胱氨酸)、酪氨酸和色氨酸的量。
-测量在给定条件下表达给定蛋白质的一种细胞系产生的重组蛋白的总量，并因此应用本发明的教导以达到所需的技术效果。这也可以如本文实施例所述而完成，如使用ForteBio Octet模型分析仪(ForteBio,Inc.)或蛋白A高压液相色谱(HPLC),细胞培养上清样品在分析前存储于-80℃。在知晓在给定条件下表达给定蛋白质的一个细胞系的通过细胞培养生产的重组蛋白的总量之后，可以设计根据本发明的方法。无需为个个实验或批次确定这种总量。
在本发明整体的背景下，培养开始时的培养基(或者本文称为基础培养基)优选为不含蛋白质和不含血清的培养基。所述不含蛋白质和不含血清的培养基可以是市售可得的培养基或化学成分确定的培养基。所述培养基可包含初始量的半胱氨酸(和/或胱氨酸)、酪氨酸和色氨酸。如果所述培养基没有包含初始量的半胱氨酸(和/或胱氨酸)、酪氨酸和色氨酸，则可以在生物反应器中培养之前或开始时添加初始量的半胱氨酸(和/或胱氨酸)、酪氨酸和色氨酸。
在本发明整体的背景下，主进料培养基可以是标准主进料培养基或浓缩主进料培养基，例如浓缩的成分确定的主进料培养基。优选地，这种主进料培养基不含Cys(既不含半胱氨酸也不含胱氨酸)、Trp和Tyr。
在本发明整体的背景下，表达重组蛋白的哺乳动物细胞优选以补料分批方法培养。在实施方案中，生产阶段的持续时间为至少7天，优选至少10天，更优选至少12天，例如12天、13天、14天或15天。尽管根据本发明以特殊大剂量添加Cys、Trp和Tyr，但是也可以用包含剩余所需营养物质(例如除了Cys、Trp和Tyr之外的氨基酸、盐、糖)的一种或多种进料(例如主进料)定期(例如每天或每隔一天)或者按需补充培养物，直到收获前1或2天。
在本发明整体的背景下，在培养基中培养所述哺乳动物细胞的步骤优选发生在生产阶段过程中。
在本发明整体的背景下，在生物反应器(例如生产生物反应器)中进行生产阶段，优选生物反应器(例如生产生物反应器)的体积等于或大于50L、等于或大于100L、等于或大于500L、等于或大于1000L、等于或大于2,000L、等于或大于5,000L、等于或大于10,000L或等于或大于20,000L。换言之，在生物反应器(例如生产生物反应器)中培养产生重组蛋白的哺乳动物细胞，优选生物反应器(例如生产生物反应器)的体积等于或大于50L、等于或大于100L、等于或大于500L、等于或大于1000L、等于或大于2,000L、等于或大于5,000L、等于或大于10,000L或等于或大于20,000L。
在本发明整体的背景下，合适的哺乳动物宿主细胞(也称为哺乳动物细胞)包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、淋巴细胞系，例如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、骨髓瘤或杂交瘤细胞。在优选实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。合适类型的CHO细胞可以包括CHO-K1、CHOK1-SV、dhfr-CHO，例如CHO-DG44、CHO-DXB11、CHO-DXB1或还包括CHO-S细胞。宿主细胞优选用编码感兴趣的重组蛋白的表达载体稳定转化或转染。
在本发明整体的背景下，重组蛋白是细胞因子、生长因子、激素、融合蛋白或抗体等蛋白质。如果蛋白质是抗体，它可以是例如嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体，并且优选IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。或者，根据本文给出的定义，它可以是任何种类。优选地，根据本发明的方法、用途和方法的蛋白质是抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。根据本发明的方法还可以包括回收包含重组蛋白的细胞培养液(CCF)的步骤(收获步骤)。收获后，重组蛋白可以被纯化，例如，如果蛋白质是抗体，则使用蛋白A色谱和其他色谱/过滤步骤。所述方法进一步任选地包括配制纯化的重组蛋白的步骤，例如配制成具有高蛋白质浓度的制剂，例如浓度为10mg/ml或更高，例如50mg/ml或更高，例如100mg/ml或更高，150mg/ml或更高或又为200mg/mL或更高。不受任何限制，制剂可以是液体制剂、冻干制剂或喷雾干燥制剂。
在另一实施方案中，由于初始培养基(或基础培养基)的Cys、Tyr和Trp可能耗尽，那么通过特殊大剂量在细胞培养物中提供的Cys、Tyr和Trp的浓度可以由以下组成：Cys为至少约2.45mM；Trp为至少约1.50mM；和Tyr为至少约2.75mM。或者，通过特殊大剂量在细胞培养物中提供的Cys、Tyr和Trp的浓度可以由以下组成：Cys为约2.45mM至约6.6mM；Trp为约1.50mM至约2.9mM；和Tyr为约2.75mM至约6.2mM。在进一步的实施方案中，如果初始培养基(或基础培养基)含有Cys、Tyr和Trp，因为细胞可能会非常快速地消耗这三种氨基酸，则通过特殊大剂量在细胞培养物中提供的Cys、Tyr和Trp的浓度可以由以下组成：Cys为至少约2.45mM；Trp为至少约1.50mM；和Tyr为至少约2.75mM。或者，通过特殊大剂量在细胞培养物中提供的Cys、Tyr和Trp的浓度可以由以下组成：Cys为约2.45mM至约6.6mM；Trp为约1.50mM至约2.9mM；和Tyr为约2.75mM至约6.2mM。因此，本文提供的用于生产重组蛋白的方法、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法或用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力的方法，包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中通过特殊大剂量在细胞培养物中提供的Cys、Tyr和Trp的浓度由以下组成：Cys为至少约2.45mM；Trp为至少约1.50mM；和Tyr为至少约2.75mM。或者本文提供的用于生产重组蛋白的方法、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法或用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力的方法，包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中通过特殊大剂量在细胞培养物中提供的Cys、Tyr和Trp的浓度由以下组成：Cys为约2.45mM至约6.6mM；Trp为约1.50mM至约2.9mM；和Tyr为约2.75mM至约6.2mM。
附图说明：
图1：A)从粉末制备“正常”进料。B)从粉末制备“浓缩”进料。
图2：标准进料策略与根据本发明的进料策略。每个峰(pick)对应于大剂量添加Cys、Tyr和Trp。
图3：生产Mab-1的CHO细胞系的活细胞浓度曲线。
图4：Mab-1滴度曲线。
图5：比生产力曲线。
图6：mAb-1的主要电荷。
图7：mAb-1的药物颜色强度.
图8：比生产力等值线图。
图9：生产Mab-2的CHO细胞系的累积积分活细胞计数等值线图。
图10：mAb-2的比生产力。
图11：A)生产Mab-3的CHO细胞系的VCC，B)mAb-3的滴度和C)生产Mab-3的细胞系的比生产力。
图12：mAb3的表征曲线(酸性物质、主要物质和碱性物质)
图13：mAb-4的比生产力。
实施例
细胞系、细胞培养和实验程序
使用四种不同的生产CHO-DG44细胞系，分别产生：mAb-1(pI为7.3-7.95的完整IgG4抗体)，mAb-2(pI为8.6-9.2的Trybe抗体)，mAb-3(pI为8.1-8.4的完整IgG4抗体)，mAb-4(pI为6.1-6.3的完整IgG4抗体)。
在由多发酵控制***(MFCS，Sartorius Stedim Biotech)控制的具有供应塔(C-DCUII，Sartorius Stedim Biotech)的2L搅拌罐玻璃生物反应器(STR)中，或在摇瓶中培养细胞。反应器配备有3段式叶片叶轮。调整培养开始体积以确保培养结束体积最佳。以目标接种密度(TSD)接种生产生物反应器。生产生物反应器的pH控制控制为约7.0。为了将pO2控制在指定范围内，使用预定义的混合物曲线，基于级联控制器将空气、氮气和氧气喷射到培养容器中。将温度控制在约37℃。生产以分批补料模式运行了14天。在该阶段过程中，单克隆抗体(mAb)分泌到培养基中。每天抽取样品以确定VCC、活力、离线pH、pCO2、渗量(osmolality)、葡萄糖-乳酸浓度、氨基酸浓度和mAb浓度(储存在-80℃)。消泡剂是按需手动添加的。接种后72小时，用进料培养基1(主进料；包括除Cys、Tyr和Trp以外的所需营养物质)以预定速率开始连续营养物质进料。当葡萄糖浓度降至一定阈值以下时，根据需要将葡萄糖(进料培养基2)添加到培养物中(每日测量)。除非另有说明，否则从第3天(对于接种0.35x106个细胞/mL的生物反应器)或从第0天(对于以较高细胞密度接种的生物反应器)开始，添加作为每日大剂量的含有Cys、Tyr和Trp的进料培养基3，直到生产的第12天。在添加进料培养基3之前采集用于氨基酸分析的样品。根据进料培养基3的组成和在添加进料培养基3之前测量的营养物质浓度或根据基础培养基组成来计算进料后的细胞外浓度。
分析方法
使用基于台盼蓝排除的VI-XR(Beckman-Coulter)自动细胞计数装置对细胞进行计数。使用NOVA 400BioProfile自动分析仪(Nova Biomedical)或Cedex Bio HT(Roche)测定培养基中的葡萄糖和乳酸水平。还每天使用CedexBioHT***(Roche)测定代谢物浓度。用ForteBio Octet模型分析仪(ForteBio,Inc.)或用CEDEX或蛋白A高压液相色谱(HPLC)进行产物滴度分析，细胞培养上清样品在分析前存储于-80℃。在使用AmiconUltra-0.5mL离心过滤器(Merck Millipore)超滤之后通过反相UPLC(Waters AccQ·Tagultra法)分析氨基酸。收获细胞培养上清样品并用在/>Xpress***上蛋白A纯化进行纯化。通过Imaged Capillary Electrophoresis(ProteinSimple iCE3)确定纯化的mAb的主要、酸性(APG指酸性峰基团)和碱性(BPG指碱性峰基团)亚型的相对百分比。通过体积排阻色谱(SE-UPLC)或蛋白A HPLC梯度确定纯化的mAb的聚集体(HMWS)、单体和片段(LMWS)水平。使用分光光度计通过透射(UltrascanPro)测量浓缩蛋白A洗脱液中浓缩抗体组合物的颜色强度，并与CIE(Commission Internationalede l’Eclairage)量表进行比较。数值结果归一化至40mg/mL浓度。使用SAS软件/>进行统计分析。
实施例1
对于该实验，使用生产mAb-1的CHO细胞以0.35x106个细胞/mL的接种密度接种2L生物反应器。如实验程序中所述，以分批补料方法测试三种条件。生物反应器(BR)ID 1和2的进料策略相同(每天添加Cys、Trp和Tyr并且在第3天添加第一大剂量)，但是在BR ID 2中，Cys、Tyr和Trp的浓度低了两倍。BR ID 3与条件2具有相同的进料培养基组成(即与BRID 1相比，Cys、Tyr和Trp的浓度低了两倍)。但是，不是每天进料Cys、Trp和Tyr并且在第3天开始，而是在第3天添加对应于应当在生物反应器ID 2的第3天至第7天添加的Cys、Tyr和Trp的量的作为特殊大剂量(或者称为高大剂量)的含有Cys、Tyr和Trp的进料。第3天之后直到包括第7天，不再用进料培养基将Cys、Tyr和Trp添加到生物反应器ID 3的细胞培养生产中。截至第8天，进料策略类似于生物反应器ID 2(即恢复Cys、Trp和Tyr的进料)。目标是评估高浓度的Cys、Tyr、Trp以及添加时机对重组mAb-1的细胞生长和比生产力的影响(估计该表达mAb-1的细胞系的最大VCC在初始实验的第10天，并在本实施例中BR ID 1和2(即在没有特殊大剂量的条件下)的每个生物反应器运行中得到证实)。
表1：实验条件
(a)根据加入特殊大剂量之前在生物反应器中测得的氨基酸的量和该进料所带来的所述氨基酸的量，估计的特殊大剂量之后该氨基酸的最大浓度。
图3所示的结果表明，在达到最大VCC之前(BR ID 3；即第8天之前)，达到高浓度的半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸(在细胞培养物中)的条件下，细胞生长较低。尽管生物反应器ID3的VCC曲线低，但是该条件下的最终滴度高于生物反应器ID 2(参见图4)。从比生产力的角度(图5)可以看出，生物反应器ID 3的Qp显著增加。最后，生物反应器ID 2和3的如实验程序部分策略的主要电荷(图6)是相等的，这证实如果就生产的mAb的总量而言在整个生产过程中添加的Cys、Tyr和Trp的总量不变，则高浓度的Cys、Tyr和Trp对重组蛋白电荷变体没有影响。在颜色强度上也观察到了类似的趋势(图7)。此外，尽管BR ID2和BR ID3的Cys、Tyr和Trp的总量相同，但根据特定时机并且一次性以特殊大剂量添加所述量对抑制细胞生长同时提高比生产力具有积极影响
实施例1的结论：根据具体时机并且一次(同时或伴随)添加大量Cys、Tyr和Trp抑制细胞生长并提高比生产力(mAb1)。实际上，从本实施例中呈现的实验中得出的结论是，在最大VCC的日子之前，在细胞培养生产过程中达到高浓度的Cys、Tyr和Trp，即至少0.34g/L、0.37g/L和0.98g/L(在细胞培养物中)，导致比生产力的提高。
实施例2
对于该实验，如上文实验程序中所述，以分批补料方法使用生产mAb-2的CHO细胞以3.75x106个细胞/mL的接种密度接种15x2L生物反应器。在该实验中，测试了多个具有在最大VCC的日子之前的不同时间点(在细胞培养物中)达到各种最大浓度的Cys、Tyr和Trp的条件(表2)。对于所有条件，在整个生产运行过程中添加相同总量的Cys、Tyr和Trp(通过基础培养基以及通过不同进料带来的总量)。估计表达mAb-2的细胞系的最大VCC在初始实验的第7天并且在本实施例中的每个生物反应器运行中得到证实。
表2：实验条件
(a)根据加入特殊大剂量之前在生物反应器中测得的氨基酸的量和该进料所带来的所述氨基酸的量，估计的特殊大剂量之后该氨基酸的最大浓度。
在达到最大VCC之前(即之前2或4天)添加特殊大剂量的半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的情况下，对于特殊大剂量之后(在细胞培养物中)达到的最高浓度、对于浓度分别高于或等于0.32g/L、0.33g/L和0.51g/L，比生产力(图8)增强。在最大VCC当日(在细胞培养物中)达到高浓度的半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的情况下，没有观察到对比生产力的影响。
在达到最大VCC的日子之前2或4天进行特殊大剂量的半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的情况下，对于特殊大剂量之后(在细胞培养物中)达到的最高浓度即对于浓度分别高于或等于0.32g/L、0.33g/L和0.51g/L，累积IVCC(图9)也降低。
在比较在最大VCC的日子之前(在细胞培养物中)达到低浓度的Cys、Tyr和Trp的对照条件的比生产力(对照条件)和在达到最大VCC的日子(在细胞培养物中)达到高浓度的Cys、Tyr和Trp的条件的情况下，没有观察到显著差异(图10)。
实施例2的结论：以适时的方式添加特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp(在细胞培养基中导致高总浓度的Cys、Tyr和Trp)抑制细胞生长并提高比生产力(mAb2)。添加这种特殊大剂量的Cys、Trp和Tyr(在细胞培养基中导致高总浓度的Cys、Tyr和Trp)对Qp的好处似乎只有当在达到最大VCC的日子之前在细胞培养物中进行所述添加的情况下才能观察到。在细胞培养基中必须同时或伴随达到高总浓度的Cys、Tyr和Trp。
实施例3
对于该实验，如上文实验程序中所述，以分批补料方法使用生产全长抗体(mAb-3)的CHO细胞以3.75x106个细胞/mL的接种密度接种5x2L生物反应器。在该实验中，测试了两个具有在最大VCC的日子(对于该细胞系在第8天观察到最大VCC)之前4天(在细胞培养物中)达到各种最大浓度的Cys、Tyr和Trp的条件(表3)。对于所有条件，在整个生产运行过程中添加相同总量的Cys、Tyr和Trp(通过基础培养基以及通过不同进料带来的总量)。图11C中描绘的平均比生产力显示，在生产过程中达到最高浓度的Cys、Tyr和Trp即分别为0.80g/L、1.08g/L和0.58g/L(BR ID 19&BR ID 20)的生物反应器导致最高的比生产力。本实施例证实了在生产其他mAb的其他细胞系中观察到的情况，即在达到最大VCC的日子之前，细胞培养生产过程中(在细胞培养物中)高浓度的Cys、Tyr和Trp导致比生产率的提高。这些高浓度是由于以适时的方式添加特殊大剂量而达到的。如图12所示，无论条件如何，mAb3的表征谱(中性形式、酸性物质和碱性物质)是类似的(小于1个点的变化)。因此，高的大剂量的时机对于抗体的质量没有影响(除了应在达到VCC之前至少一天进行之外)。
表3：实验条件
(a)根据加入特殊大剂量之前在生物反应器中测得的氨基酸的量和该进料所带来的所述氨基酸的量，估计的特殊大剂量之后该氨基酸的最大浓度。
实施例3的结论：本实施例再一次证实了在达到最大VCC的日子之前在细胞培养物中达到高总浓度的Cys、Tyr和Trp(由于添加特殊大剂量的Cys、Trp和Tyr)对提高比生产力的积极影响。
实施例4——三种氨基酸的协同作用
设计本实施例来评估(在细胞培养物中)高浓度的Cys、Tyr和Trp对比生产力的影响是否是由于三种氨基酸的协同作用或者是否是由于仅一种或两种氨基酸。
对于本实施例，如在材料与方法中所述，以分批补料方法使用生产mAb-4的CHO细胞以0.35x106个细胞/mL的接种密度接种19个摇瓶。测试了多个具有在达到最大VCC的日子之前4天(即第8天)达到各种最大浓度的Cys、Tyr和Trp的条件(表4)并且分离(decouple)三种氨基酸的作用。对于所有条件，在整个生产运行过程中添加相同总量的Cys、Tyr和Trp(通过基础培养基以及通过不同进料带来的总量)。就在添加特殊大剂量之后(在细胞培养物中)达到Cys、Tyr和Trp的最大浓度分别为0.48g/L、0.71g/L和0.41g/L。
图13中描绘的所有条件的平均比生产力显示了用高浓度的Cys、Tyr和Trp的组合获得的比生产力的出乎意料的协同增加。
结论：本实施例证实，尽管采用的是另一种细胞系(表达抗体mAb-4)，在最大VCC之日之前在细胞培养物中存在高总浓度的Cys、Tyr和Trp(即至少由于添加特殊大剂量，Cys为至少约2.45mM；Trp为至少约1.50mM和Tyr为至少约2.75mM)，这导致比生产力(Qp)的提高。必须同时或伴随达到高总浓度的Cys、Tyr和Trp。同时或伴随高浓度的Cys、Tyr和Trp的作用是协同的，而不是相加的。
表4：实验条件
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Claims (19)

1.一种用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量(exceptionalbolus)的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
2.一种用于生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
3.一种用于提高培养中哺乳动物细胞的比生产力(Qp)的方法，其中所述哺乳动物细胞表达重组蛋白，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，并且在培养的第1天至第7天添加特殊大剂量的半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，其中所述特殊大剂量在细胞培养物中提供高浓度的Cys、Tyr和Trp。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在添加所述特殊大剂量之后，在细胞培养物中存在的Cys、Trp和Tyr的总浓度分别为：
a.Cys为至少约2.45mM；
b.Trp为至少约1.50mM；和
c.Tyr为至少约2.75mM。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中调整特殊大剂量中Cys、Try和Trp的浓度，以达到细胞培养物中高浓度的Cys、Try和Trp，其中待达到的高浓度的Cys、Try和Trp由以下组成：
a.Cys为至少约2.45mM；
b.Trp为至少约1.50mM；和
c.Tyr为至少约2.75mM。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下初步步骤：进行至少一个初始实验来确定所述哺乳动物细胞达到最大活细胞浓度(VCC)的日子，和/或，所述方法进一步包括以下初步步骤：进行至少一个初始实验来确定培养开始之后细胞培养基中Cys、Trp和Tyr的每日浓度，以确定待通过特殊大剂量添加的Cys、Trp和Tyr的量。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在达到最大活细胞浓度(VCC)的日子之前，在细胞培养物中添加特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中在达到最大VCC之前至少一天在细胞培养物中添加特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中在添加所述特殊大剂量之后，在细胞培养物中存在的Cys、Trp和Tyr的总浓度分别为至少2.45mM、1.50mM和2.75mM，并且其中在达到最大VCC之前至少一天达到所述总浓度。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中在达到最大VCC的日子之前1至7天在细胞培养物中添加特殊大剂量的Cys、Tyr和Trp。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过以下方式以所述特殊大剂量的形式，添加Cys、Tyr和Trp：
(i)以以下任一种方式同时添加：
(a)合并在单一溶液中；
(b)在单独的溶液中，每种溶液包含Cys、Tyr和Trp中的一种；或
(c)一种溶液和第二溶液的组合，其中两种氨基酸在一种溶液中，而第二溶液包含剩余的氨基酸；或
(ii)以任意顺序按顺序添加。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在培养基中培养所述哺乳动物细胞发生在生产阶段过程中。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据补料分批方法进行细胞培养。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在整个培养过程中，在添加特殊大剂量之后，进一步添加Cys、Tyr和Trp，以防止Cys、Tyr和Trp中任一种的耗尽。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向细胞培养物添加主进料培养基的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述主进料培养基不含Cys、Tyr或Trp。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是细胞因子、生长因子、激素、抗体或融合蛋白。
19.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过特殊大剂量在细胞培养物中提供的高浓度的Cys、Tyr和Trp由以下组成：
a.Cys为至少约2.45mM；
b.Trp为至少约1.50mM；和
c.Tyr为至少约2.75mM。
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