CN117229970B - 一株抗多种植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株抗多种植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌lk5‑1及其应用。该菌株分类鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其保藏编号为：GDMCC No：63132。本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌lk5‑1对瓜类细菌性果斑病、水稻细菌性褐条病、柑橘溃疡病等3种植物病原菌具有明显的抑制作用，通过叶面喷施接种方式能够显著降低瓜类细菌性果斑病的病情指数，防治效果高达86.57％。因此，本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌lk5‑1能够高效预防细菌性果斑病的发生，可用于制备防治瓜类细菌性果斑病等多种植物病原菌的微生物制剂产品，减少农业生产中的化学药物使用。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一株抗瓜类细菌性果斑病等多种植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
背景技术
细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,BFB)是一种由西瓜食酸菌(Acidovoraxcitrulli)引起的严重危害西瓜、甜瓜、哈密瓜等多种葫芦科植物叶片和果实的毁灭性病害，具有发病迅速、传播快、爆发性强等特点。为防治细菌性果斑病，人们在生产中往往大量使用春雷霉素、硫酸链霉素、春雷王铜、噻霉铜等抗生素及铜制剂类化学药物，一方面造成了病原菌耐药性逐渐增强和防效下降，迫使加大药物用量，形成了恶性循环；另一方面农药残留严重影响了瓜类的品质安全，也对产地的生态环境造成了严重破坏，亟待开发更加绿色环保的防治技术。
基于生防微生物的防治技术具有低成本、高效、无污染等优势，对减少化学药物使用，提升农产品品质具有重要作用，在农业生产上受到越来越多的重视。目前已报道的防治细菌果斑病的微生物有酵母菌、假单胞菌、芽孢杆菌等类群。芽孢杆菌具有分布广、抗逆性强、繁殖快、效果稳定等特点，是农业生产中应用最为广泛的类群。其中的贝莱斯芽胞杆菌能够产生丰富多样的活性代谢产物，在防治不同类型的细菌和真菌植物病害方面均表现出了巨大的开发价值，而目前对于其在瓜类细菌性果斑病防治上的应用和研究仍处于起步阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一株对植物病害具有生物防治功效的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)lk5-1，其于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：63132。
本发明的第二个目的是提供上述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1在制备防治植物病害的生物制剂中的应用。
所述的生物制剂为微生物菌剂、微生物肥料、微生物农药或微生物添加剂。
所述的生物制剂以上述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1或其培养物或代谢物作为活性成分。
所述的植物病害的病原菌包括瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)、水稻细菌性褐条病菌(Acidovorax oryzae)和柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri)。
本发明的第三个目的是提供一种防治植物病害的方法，其包括使贝莱斯芽孢杆菌lk5-1或其培养物或代谢物与植物接触的步骤。
所述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1培养物或代谢物是将贝莱斯芽孢杆菌lk5-1接种至培养基中培养获得。
所述的植物病害包括瓜类细菌性果斑病、水稻细菌性褐条病和柑橘溃疡病。
本发明的第四个目的是提供一种生物制剂，其包含上述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1或其培养物或代谢物作为活性成分。
所述生物制剂的剂型包括粉剂、可湿性粉剂、可溶粉剂、乳油、水剂、悬浮剂、微乳剂、颗粒剂或水分散粒剂。
与现有技术相比，本发明有如下优势：
①菌株lk5-1是经过基因组精准鉴定的能产生多种抑菌活性代谢产物和具有促生潜力的贝莱斯芽孢杆菌新菌株；
②预接种贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对瓜类细菌性果斑病的防治效果高达86.57％，优于已报道的大多数同类菌株，该菌株具有巨大的开发应用价值。
因此，本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1可用于预防瓜类细菌性果斑病的发生，有效降低其发病率，在制备生防微生物制剂等方面具有重要的应用潜力。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)lk5-1，于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：63132。
附图说明
图1是利用软件UBCG构建的基于核心基因组的菌株lk5-1***进化树。
图2是贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对瓜类细菌性果斑病等3种植物病原菌的抑制效果。
图3是贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对瓜类细菌性果斑病的生防效果。
具体实施方式
以下实施例用于解释本发明，但不用来限制本发明的保护范围。以下实施方式除特殊说明外，均为本领域常规的试剂和方法步骤。
实施例1：菌株lk5-1的精准鉴定及基因组分析
16S rRNA基因分析：采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株lk5-1的总DNA。采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTA ACCCCAATCGC-3′)进行菌株的16S rRNA基因PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性30s,56℃退火30s,72延伸90s)；72℃延伸10min。采用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，后由金唯智公司完成测序。采用EzBiocloud在线平台(https://www.ezbiocloud.net/)进行菌株的16S rRNA基因序列相似度比对。16S rRNA基因测序获得了片段长度为1420bp的序列，相似度比对发现菌株lk5-1与芽孢杆菌属(Bacillus)的16个模式菌株具有较高的序列相似度(99.08％～99.65％)，表明菌株lk5-1为芽孢杆菌属的菌株，但该属内的菌株由于16S rRNA基因序列相似度过高，仅通过相似度或***进化分析无法准确判定其分类地位，需借助比较基因组等手段进行更加精准的鉴定。
基因组分析：利用基因组提取试剂盒提取的菌株lk5-1总DNA，将总DNA送由上海美吉生物医药科技有限公司进行PE文库构建和基因组测序，使用的测序平台为IlluminaHiseq2500。将下机数据采用软件SPAdes v3.15.0进行拼接组装，从GenBank数据库中下载已发表的芽孢杆菌不同种的模式菌株基因组序列，采用软件UBCG(Phylogenomic treeinference using bacterial core genes)构建基于核心基因组的***进化树，从而确定菌株lk5-1亲缘关系最近的芽孢杆菌属内不同种的模式菌株。分别利用在线软件ANICalculator(http://www.ezbiocloud.net/tools/ani)和GGDC 2.1(http://ggdc.dsmz.de/home.php)对菌株lk5-1及其近缘模式菌株进行比较基因组分析，计算平均核苷酸一致性(ANI)和模拟DNA-DNA杂交值(dDDH)。为更加深入了解和掌握菌株lk5-1的功能特性，分别利用在线软件antiSMASH 7.0.1(https://antismash.secondarymetabolites.org/#！/start)和RAST(https://rast.nmpdr.org/)对菌株lk5-1的基因组进行注释。
测序获得的菌株lk5-1基因组大小为3.89Mb，GC含量46.43mol％。基于核心基因组构建的UBCG***进化树清楚地表明菌株lk5-1与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensisNRRL B-41580T)具有最近的亲缘关系(图1)，其次为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensisKCTC13613T)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens DSM 7T)和中村芽孢杆菌(Bacillus nakamurai NRRL B-41091T)。比较基因组分析结果如表1所示，菌株lk5-1与亲缘关系最近的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis NRRL B-41580T)的ANI和dDDH值分别为98.25％和84.4％，与其他3个亲缘关系较近的物种的模式菌株ANI值为86.40％～94.36％，dDDH值为30.7％～56.6％。依据国际分类学公认的物种间区分阈值(ANI 95％～96％；dDDH 70％)作为判断标准，上述结果清晰表明菌株lk5-1应鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
基因组序列的antiSMASH注释结果表明菌株lk5-1具有表面活性素(surfactin)、艰难菌素(difficidin)、丰原素(fengycin)、芽孢杆菌溶素(bacilysin)、bacillaene、macrolactin H、bacillibactin等不同类型的活性次级代谢产物合成基因簇，在防治不同种类的病原菌上有着重要的应用潜力。基因组序列的RAST注释结果发现菌株lk5-1具有产铁载体bacillibactin，分泌植物生长素和溶解无机磷等植物促生能力，在制备促植物生长的微生物菌剂方面也具有一定的应用潜力。
因此，本发明的菌株lk5-1归属于Bacillus velezensis，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)lk5-1，其于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：63132，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070。
表1.菌株lk5-1与其近缘物种的模式菌株比较基因组分析
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对瓜类细菌性果斑病等多种植物病原菌的抑制效果选取瓜类细菌性果斑病(Acidovorax citrulli GDMCC 803619)、水稻细菌性褐条病(Acidovorax oryzae GMDCC 805499)和柑橘溃疡病(Xanthomonas citri KY1)等3种植物病原菌为靶标，将植物病原菌和贝莱斯芽孢杆菌lk5-1分别接种至TSA液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养48h。制备TSA固体培养基平板，分别将培养好的植物病原菌100μL均匀涂布于TSA平板上。采用打孔法测试贝莱斯芽孢杆菌lk5-1培养液对不同植物病原菌的抑制效果。将菌株lk5-1的培养液12000r/min离心10min，取上清液100μL注入不同涂布病原菌的TSA平板上打好的孔中，以未接种lk5-1的灭菌TSA培养液为对照，28℃静置培养72h，观察和测量贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对不同病原菌的抑菌圈大小。结果如表2和图2所示，贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对上述3种植物病原菌均表现出了较强的抑制效果，其中对瓜类细菌性果斑病(Acidovorax citrulli GDMCC 803619)的抑菌圈直径最大，为40.8±3.3mm，其次为柑橘溃疡病(抑菌圈直径39.8±2.1mm)和水稻细菌性褐条病(抑菌圈直径27.5±2.5mm)。
TSA培养基：蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，ddH2O1000mL，pH 7.3±0.2，将各成分混合均匀，121℃灭菌20min备用。
表2.贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对不同植物病原菌的平板抑菌效果
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对瓜类细菌性果斑病的防治效果
以细菌性果斑病病原菌—西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)GDMCC 803619为供试菌株，挑取纯化的单菌落接种于R2A液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养36h，用无菌水调节菌液浓度至108cfu/mL备用。挑取平板上培养好的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1单菌落于营养肉汤琼脂培养基(NA)中，30℃、200r/min振荡培养48h，用无菌水调节菌液浓度至108cfu/mL备用。
以哈密瓜为供试植物，将哈密瓜种子进行表面消毒和室温催芽后播种于育苗基质中，待幼苗长至两叶一心时移至大塑料盆(上口径Φ12cm，下口径Φ10cm，高度10cm)中种植，设置种植条件为光照16h，黑暗8h。采用正反叶面喷施接种方法将菌液均匀喷施于整株哈密瓜的叶片上，以无菌水作为不接种对照，每天观察和记录哈密瓜发病情况。本实验共设置4个处理，每个处理设5个重复。处理T1为先喷施5mL浓度调至108cfu/mL的病原菌，待24h晾干后喷施等体积浓度为108cfu/mL的生防菌lk5-1；处理T2为先喷施5mL浓度为108cfu/mL的生防菌lk5-1，待24h晾干后喷施等体积的108cfu/mL病原菌；处理T3为先喷施5mL浓度为108cfu/mL的生防菌lk5-1，待24h晾干后喷施等体积的无菌水；处理CK为先喷施5mL浓度为108cfu/mL的病原菌，待24h晾干后喷施等量的无菌水。喷施3天后植株开始发病，第5天进行不同处理下的病情观察和统计，分析其对细菌性果斑病的防治效果。
哈密瓜植株上细菌性果斑病分级标准：0级，无病斑；1级，病斑面积占整片叶片的5％以下；3级，病斑面积占整片叶片的5％～25％；5级，病斑面积占整片叶片的26％～50％；7级，病斑面积占整片叶片的51％～75％；9级，病斑面积占整片叶片的76％～100％。
盆栽实验的结果如图3和表3所示，仅接种生防菌lk5-1而未接种细菌性果斑病病原菌的处理T3哈密瓜叶片上未发现发病情况。喷施接种病原菌的不同处理中哈密瓜叶片上均出现了不同程度的发病情况，但不同处理间的病情指数存在较大差异，其中接种了生防菌lk5-1的两种处理(T1和T2)哈密瓜叶片上的发病斑点数、斑点面积等均明显小于不接种生防菌lk5-1的对照处理CK。先喷施接种生防菌lk5-1后接种病原菌的处理T2对哈密瓜上细菌性果斑病的防治效果高达86.57％，显著高于先喷施接种病原菌而后接种生防菌lk5-1的处理T1(防效仅7.47％)。这表明贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对瓜类细菌性果斑病的发生具有重要的预防效果，预喷施接种该菌株培养液能够显著降低细菌性果斑病的发生，最大程度保护地哈密瓜植株。而当哈密瓜感染了细菌性果斑病后再接种lk5-1，其防治效果大幅下降，远低于预喷施接种的处理方式。因此，建议在细菌性果斑病易发的生产季节，通过预喷施接种贝莱斯芽孢杆菌lk5-1来减少病害的发生，保护植株的健康生长。
R2A液体培养基：酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，丙酮酸钠0.3g，ddH2O 1000mL，pH 7.0，将各成分混合均匀，121℃灭菌20min备用。
NA培养基：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖2.5g，ddH2O 1000mL，pH 7.0，将各成分混合均匀，121℃灭菌20min备用。
表3.不同处理下贝莱斯芽孢杆菌lk5-1对瓜类细菌性果斑病的防治效果
注：CK，先喷施病原菌，后喷施无菌水；T1，先喷施病原菌，后喷施lk5-1；T2，先喷施lk5-1，后喷施病原菌；T3，先喷施生防菌lk5-1，后喷施无菌水。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）lk5-1，其保藏编号为：GDMCC No：63132。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1在制备防治植物病害的生物制剂中的应用；所述的植物病害是由Acidovorax citrulli引起的瓜类细菌性果斑病、由Acidovorax oryzae引起的水稻细菌性褐条病或由Xanthomonas citri引起的柑橘溃疡病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生物制剂为微生物菌剂、微生物肥料、微生物农药或微生物添加剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生物制剂以权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1或其培养物作为活性成分。
5.一种防治植物病害的方法，其特征在于，包括使权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1或其培养物与植物接触的步骤；所述的植物病害是由Acidovorax citrulli引起的瓜类细菌性果斑病、由Acidovorax oryzae引起的水稻细菌性褐条病或由Xanthomonas citri引起的柑橘溃疡病。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1培养物是将贝莱斯芽孢杆菌lk5-1接种至培养基中培养获得。
7.一种微生物菌剂、微生物肥料或微生物添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌lk5-1或其培养物作为活性成分。
8.根据权利要求7所述的微生物菌剂、微生物肥料或微生物添加剂，其特征在于，所述微生物菌剂、微生物肥料或微生物添加剂的剂型是粉剂、乳油、水剂、悬浮剂或颗粒剂。
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