CN117229548A - 一种颗粒凝胶生物墨水及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种颗粒凝胶生物墨水及其制备方法和应用。制备方法包括以下步骤：(1)将双键改性的聚乙二醇、改性的天然高分子和活性功能单体进行聚合反应，得到凝胶；(2)对凝胶进行粉碎，得到凝胶颗粒；(3)将凝胶颗粒与酶进行酶解反应，得到具有反应活性的水凝胶颗粒；(4)将具有反应活性的水凝胶颗粒与巯基功能化高分子共孵育，浓缩，得到颗粒凝胶生物墨水；双键改性的聚乙二醇具有双键和聚乙二醇链段，改性的天然高分子具有巯基或双键，活性功能单体选自巯基功能化或双键功能化的生物粘附肽，酶为所述天然高分子对应的酶。本发明的制备方法工艺简单，可以大规模化生产，生物墨水的可打印性和机械性能优异，生物兼容性和安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物墨水技术领域，尤其涉及一种颗粒凝胶生物墨水及其制备方法和应用。
背景技术
生物3D打印是基于离散—堆积成形原理，以活细胞、生物活性因子及生物材料的基本成形单元，设计制造具有生物活性的人工器官、植入物或细胞三维结构的技术，融合了制造科学与生物医学，是一项具有交叉性和前沿性的新兴技术。生物打印技术可实现个性化、非均质的复杂生物结构成形制造，可应用于体外医学仿生模型、个性化植入器件、组织工程多孔支架以及细胞三维结构体的制造或构建过程，并在个性化诊断与治疗、定制式医疗器械、再生医学治疗以及病理/药理研究、药物开发和生物制药等领域发挥重要作用。
生物墨水的开发一直是生物三维打印技术中的核心问题，生物墨水的开发要兼顾可打印性、生物相容性、机械性能等方面。目前常用的生物墨水体系主要包括有明胶、海藻酸钠、透明质酸等天然材料以及聚乙二醇、聚乙烯醇等合成材料，这些体系具有剪切稀化，良好的生物相容性。其中，生物打印法构建的支架材料的孔隙结构特征是影响其内部细胞增殖、分化和迁移的重要因素。目前，常用于制备大孔结构的支架材料的主要方法为使用模板法或者冷冻法制备，工艺过程繁杂，并可能导致支架结构的坍塌，降低了支架材料的稳定性以及打印结构的保真度。
发明内容
本发明的目的是制备一种无毒、稳定、可打印大孔隙支架的生物墨水，该制备工艺简单，可以实现大规模化生产，且制备得到的生物墨水的可打印性和机械性能优异，生物兼容性和安全性高，且生物墨水在生理条件下可自发交联。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种颗粒凝胶生物墨水的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将双键改性的聚乙二醇、改性的天然高分子和活性功能单体进行聚合反应，得到凝胶；
(2)对所述凝胶进行粉碎，得到凝胶颗粒；
(3)将所述凝胶颗粒与酶进行酶解反应，得到具有反应活性的水凝胶颗粒；
(4)将所述具有反应活性的水凝胶颗粒与巯基功能化高分子共孵育，浓缩，得到所述颗粒凝胶生物墨水；
所述双键改性的聚乙二醇具有双键和聚乙二醇链段，所述改性的天然高分子具有巯基或双键，所述活性功能单体选自巯基功能化的生物粘附肽或双键功能化的生物粘附肽，所述酶为所述天然高分子对应的酶。
本发明中，步骤(1)得到的凝胶具有未反应完全的双键或者其他活性基团，该凝胶为交联状态，大部分未完全反应的双键或者其他活性基团位于凝胶交联结构内部，步骤(3)采用天然高分子对应的酶对凝胶中的天然高分子链段进行酶解和切割，可以使得步骤(1)中未完全反应的双键或者其他活性基团暴露于水凝胶颗粒表面，使得水凝胶颗粒具有高反应活性，该高反应活性的水凝胶颗粒在步骤(4)中与巯基功能化高分子可以进行二次交联，形成颗粒凝胶生物墨水。
在一些实施方式中，所述巯基功能化高分子选自巯基化透明质酸、巯基化海藻酸钠、巯基化明胶或巯基化海藻酸中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，所述巯基功能化高分子的巯基取代基为20％～60％，分子量为100kDa～400kDa。
在一些实施方式中，所述双键改性的聚乙二醇选自多臂聚乙二醇、树枝状聚乙二醇或超支化聚乙二醇二丙烯酸酯中的一种或多种的组合，所述多臂聚乙二醇选自二臂聚乙二醇马来酰亚胺、三臂聚乙二醇马来酰亚胺、四臂聚乙二醇马来酰亚胺或六臂聚乙二醇马来酰亚胺，所述树枝状聚乙二醇为(mPEG)4-(PEG)2-MAL；所述超支化聚乙二醇二丙烯酸酯由聚乙二醇二丙烯酸酯通过RAFT聚合制备得到，优选地，所述聚乙二醇二丙烯酸酯的数均分子量为575。
在一些实施方式中，所述超支化聚乙二醇二丙烯酸酯的结构式为：
在一些实施方式中，所述天然高分子选自胶原蛋白、壳聚糖、明胶、海藻酸钠和透明质酸中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，所述改性的天然高分子中巯基或双键的取代度为20％～60％，分子量为100kDa～400kDa。
在一些实施方式中，所述改性的天然高分子的结构为：
在一些实施方式中，所述活性功能单体选自Cys-RGD、GRGDSPC(RGD-SH)、巯基丙酸-RGD、环肽c(RGDfC)、(Ac)2-KYIGSRG、GIKAVAK-Ac、YIGSRC、CYIGSR中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，步骤(1)中所述聚合反应在水或PBS缓冲液中进行，所述双键改性的聚乙二醇在水或PBS缓冲液中的质量体积浓度为2～20％，所述改性的天然高分子在水或PBS缓冲液中的质量体积浓度为0.5～20％，所述活性功能单体在水或PBS缓冲液中的质量体积浓度为0.1～20％。
在一些实施方式中，所述双键改性的聚乙二醇、改性的天然高分子活性功能单体的摩尔比(或者质量比)为5：1.5：0.5。
在一些实施方式中，步骤(4)中所述共孵育的温度为15～35℃，优选26℃。
在一些实施方式中，步骤(4)中所述共孵育的时间为10-40min，优选30min。
在一些实施方式中，步骤(4)中所述浓缩包括离心的步骤。
在一些实施方式中，所述改性的天然高分子具有巯基，所述聚合反应为迈克尔加成聚合，所述聚合反应的温度为15～30℃。
在一些实施方式中，所述改性的天然高分子具有双键，所述聚合反应为自由基聚合，所述聚合反应在光引发剂的存在下进行。
在一些实施方式中，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)。
在一些实施方式中，步骤(2)中所述粉碎选自挤压破碎，研磨破碎或冲击破碎。
优选地，步骤(2)中所述粉碎为研磨破碎。
进一步地，所述研磨破碎的次数为1-5次。研磨次数越多，最终得到的水凝胶颗粒的粒径越小。
进一步地，每次所述研磨破碎的时间为1-10min，优选5min。
在一些实施方式中，所述具有反应活性的水凝胶颗粒的粒径为30μm～300μm。
优选地，所述具有反应活性的水凝胶颗粒的粒径为100μm～150μm。
在一些实施方式中，步骤(1)中所述聚合反应在pH为7～8下进行。
优选地，步骤(1)中所述聚合反应在pH为7.2～7.4下进行。
在一些实施方式中，步骤(3)中所述酶选自透明质酸酶、海藻酸钠裂解酶、壳聚糖酶或胶原酶中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将双键改性的聚乙二醇、改性的天然高分子、巯基功能化高分子分别配置成溶液；
(2)将活性功能单体溶于双键改性的聚乙二醇的溶液中，孵育；
(3)将改性的天然高分子的溶液与步骤(2)孵育后的溶液进行聚合反应，得到凝胶；
(4)对所述凝胶进行粉碎，得到凝胶颗粒；
(5)将所述凝胶颗粒与酶进行酶解反应，得到具有反应活性的水凝胶颗粒；
(6)将巯基功能化高分子的溶液与所述具有反应活性的水凝胶颗粒共孵育，离心，得到颗粒凝胶生物墨水。
本发明还提供了由上述制备方法制备得到的颗粒凝胶生物墨水。该生物墨水的可打印性和机械性能优异，生物兼容性和安全性高，且生物墨水在生理条件下可自发交联。
本发明还提供了前述颗粒凝胶生物墨水用于细胞培养、组织工程、生物支架或生物打印的用途。
本发明先通过双键改性的聚乙二醇与具有巯基或双键的改性的天然高分子、活性功能单体进行聚合，制备得到凝胶块体，再对其进行粉碎，得到微米级别的凝胶颗粒，再对凝胶颗粒间进行酶裁剪，使双键和活性功能单体暴露在表面，得到活性水凝胶颗粒，再添加生物相容性好的巯基化高分子与活性水凝胶颗粒的表面双键进行迈克尔加成反应，使巯基化高分子接枝在水凝胶微颗粒表面，水凝胶微颗粒表面的巯基化高分子在碱性条件下，形成二硫键进行二次交联；使得颗粒凝胶与颗粒凝胶间形成大孔间隙，并且间隙大小可以通过改变活性水凝胶颗粒的尺寸进行调控，因而有利于为各类细胞的增长、分化和迁移提供适宜的空间。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
(1)本发明的生物墨水的制备方法简单，可大批量制备，避免了现有技术制备活性凝胶时的复杂工艺，也不涉及添加表面活性剂或者乳化等工艺。该生物墨水可直接打印，并且构成生物墨水的微球单元间可以在生理条件下发生自交联形成自支撑结构。
(2)本发明的生物墨水的原料成分均无毒，对细胞损伤小，非常利于细胞培养或者作为支架打印材料；并且，该生物墨水在生理条件下，颗粒凝胶间可以通过双硫键可控自交联，不需要引入有毒的固化剂或额外的光照高温等固化方式，比现有技术中的生物墨水更为安全。
(3)本发明的生物墨水的制备原料中含有活性功能单体，制备得到的生物墨水可以为细胞黏附生长提供活性位点。
(4)本发明的生物墨水用于打印支架材料时，得到的支架材料具有大孔隙，可以为各类细胞的增长、分化和迁移提供适宜的空间。
(5)本发明的生物墨水具备优异的可打印性和机械性能，具有孔隙大、自支撑性以及生物相容性好、细胞粘附能力强。
附图说明
图1为超支化聚乙二醇二丙烯酸酯的核磁氢谱图；
图2为本发明的颗粒凝胶生物墨水的制备流程图；
图3为通过酶裁剪水凝胶表面暴露活性功能单体和双键机理，及后续自发交联的示意图；
图4为实施例1和对比例1的生物墨水的细胞黏附生长图；
图5为酶处理3h生物墨水交联前后剪切稀化的剪切率-粘度曲线；
图6为酶处理3h生物墨水交联前后生物墨水的应变-模量曲线；
图7为活性颗粒凝胶在酸性及碱性条件下与巯基化大分子共孵育后30min内的模量变化；
图8为生物墨水挤出和生物支架实物图；
图9为实施例1的生物墨水材料的MTT毒性实验结果；
图10为酶处理3h前后颗粒胶表面接枝巯基罗丹明荧光强度变化图；
图11为巯基化透明质酸的核磁氢谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
制备例1
制备超支化聚乙二醇二丙烯酸酯(HB-PEGDA)：
以DS为RAFT试剂，以2′-偶氮二(2-甲基腈)(AIBN)为引发剂，以聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA(平均Mn＝575)(0.4mol·L-1)为单体，在丁酮中在70℃下用进料进行RAFT聚合；[PEGDA]：[DS]：[AIBN]的摩尔比例为25：1：1.4。
得到的HB-PEGDA的结构式为：
其核磁表征图如图1所示。
实施例1
本实施例提供一种生物墨水，其制备方法如下：
(1)前驱液的制备：将100mg制备例1制备得到的超支化聚乙二醇二丙烯酸酯(HB-PEGDA)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为10％(质量体积浓度w/v)前驱体溶液A；
将30mg巯基化透明质酸(HA-SH，其结构和核磁氢谱图如图11所示)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为3％(质量体积浓度w/v)前驱体溶液B，再添加1M氢氧化钠溶液将前驱体溶液B的pH值调至7.2；
将20mg巯基化透明质酸(HA-SH，其结构和核磁氢谱图如图11所示)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为3％(质量体积浓度w/v)的溶液C；添加1M氢氧化钠溶液将溶液C的pH值调至7.2；
(2)颗粒凝胶制备：将5mg RGD-SH(七肽)(序列为GRGDSPC，结构为)加入到步骤(1)的前驱体溶液A中，在37℃下孵育2h，得到前驱体溶液D，将前驱体溶液D和前驱体溶液B按照体积比1：1充分混合成2mL凝胶前躯液，加到5毫升离心管中，静置成胶；待成胶后，使用100目筛网进行研磨3次，每次研磨时间为5min，使颗粒胶平均直径在100μm；将研磨得到的颗粒凝胶收集到5mL离心管中；
(3)活性颗粒凝胶的制备：将得到的颗粒凝胶溶液离心(离心条件：8000rpm，3min)去除上清液。在颗粒凝胶中添加500U/mL的透明质酸酶，置于37℃下处理3h。处理完成后，离心去除上清液；
(4)生物墨水的制备：将得到的活性颗粒凝胶与2mL溶液C进行孵育30min，离心(离心条件：8000rpm，3min)得到颗粒凝胶生物墨水。
对比例1
本对比例提供一种生物墨水，其制备方法基本同实施例1，区别仅在于：步骤(3)中不添加500U/mL的透明质酸酶进行酶解处理。
将实施例1制备得到的颗粒凝胶生物墨水和对比例1制备得到的生物墨水进行细胞粘附性测试。为表征生物墨水表面的活性单体暴露情况，对得到的颗粒凝胶生物墨水进行了细胞粘附性生长测试，结果如图4所示。可见，细胞在生物墨水材料上培养了72h后，酶处理过的水凝胶(实施例1的)与未酶解处理(对比例1的)相比，细胞可以更好的黏附生长，活性单体暴露更多。
力学表征和毒性表征分析：
(1)为表征实施例1制备得到的生物墨水的可打印性，对生物墨水做了相关的流变学表征，其中测试温度为25℃，转子尺寸为8mm，转子离样品的距离为2mm；在控制频率1Hz，在0.1-1000％应变条件对比了步骤(3)得到的活性颗粒凝胶(GH-3h)与步骤(4)二次交联后的颗粒凝胶生物墨水(交联GH-3h)的应变-模量数据图，为了表征与巯基功能化高分子共孵育后的交联情况，对孵育30min后的颗粒胶进行30min内的模量变化表征，结果如图5所示，可见，步骤(4)二次交联前颗粒凝胶的储能模量在500-600Pa，而步骤(4)二次交联后模量上升至3000-4000Pa，该模量的上升对于细胞生长提供了良好的支撑性。
如图6所示，生物墨水具有剪切变稀特性，具备良好的可打印性。
如图7所示，在pH＝7.5时，孵育30min后，模量在30min持续上升，表明在碱性条件下，颗粒胶表面巯基大分子间形成二硫键进行二次交联(图7中pH＝6.5,7.5分别指步骤(4)的孵育pH)。
如图8所示，本实施例制备的生物墨水可挤出，同时能构建生物支架；且交联后可以拿起，具有自支撑性。
(2)采用MTT法对生物墨水的材料进行了毒性实验，如图9所示，生物墨水具有良好的生物相容性。
实施例2
基本同实施例1，区别仅在于，步骤(1)前驱体溶液A中用六臂聚乙二醇马来酰亚胺替换超支化聚乙二醇二丙烯酸酯(HB-PEGDA)，前驱体溶液B中用巯基化壳聚糖(CS-SH，结构为)替换巯基化透明质酸(HA-SH)；步骤(3)中用500U/mL的壳聚糖酶替换透明质酸酶。
细胞黏附性测试：测试步骤同实施例1，结果发现，酶处理过后的水凝胶更有利于细胞黏附生长，活性单体暴露更多；
力学表征和毒性表征分析：测试步骤同实施例1，结果发现，本实施例制备的生物墨水在可打印性、生物相容性的表现都与实施例1相似。
实施例3
基本同实施例1，区别仅在于，步骤(2)中在前驱体溶液A中加入5mg GRGDSPC替换为加入10mg Cys-RGD(序列为Cys-Arg-Gly-Asp)，前驱体溶液B用巯基化明胶(Gel-SH，其结构式为：)替换巯基化透明质酸(HA-SH)；溶液C用巯基化海藻酸钠(SA-SH，结构为/>)替换巯基化透明质酸(HA-SH)；步骤(3)中用500U/mL的胶原酶替换透明质酸酶；
细胞黏附性测试：测试步骤同实施例1，结果发现，酶处理过后的水凝胶更有利于细胞黏附生长，活性单体暴露更多；
力学表征和毒性表征分析：测试步骤同实施例1，结果发现，本实施例制备的生物墨水在可打印性、生物相容性的表现都与实施例1相似。
实施例4
基本同实施例1，区别仅在于，步骤(1)前驱体溶液A中用(mPEG)4-(PEG)2-MAL替换超支化聚乙二醇二丙烯酸酯(HB-PEGDA)，步骤(3)中用500U/mL透明质酸酶处理3h改为用1000U/mL处理1h。
细胞黏附性测试：测试步骤同实施例1，结果发现，酶处理过后的水凝胶更有利于细胞黏附生长，活性单体暴露更多；
力学表征和毒性表征分析：测试步骤同实施例1，结果发现，本实施例制备的生物墨水在可打印性、生物相容性的表现都与实施例1相似。
实施例5
基本同实施例1，区别仅在于，步骤(1)前驱体溶液A中用四臂聚乙二醇马来酰亚胺替换超支化聚乙二醇二丙烯酸酯(HB-PEGDA)，步骤(2)中在前驱体溶液A中加入5mgGRGDSPC更改为加入10mg环肽c(RGDfC)(序列为Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)，步骤(3)中用500U/mL透明质酸酶处理3h改为用200U/mL处理12h。
细胞黏附性测试：测试步骤同实施例1，结果发现，酶处理过后的水凝胶更有利于细胞黏附生长，活性单体暴露更多；
力学表征和毒性表征分析：测试步骤同实施例1，结果发现，本实施例制备的生物墨水在可打印性、生物相容性的表现都与实施例1相似。
实施例6
将100mg制备例1制备得到的超支化聚乙二醇二丙烯酸酯(HB-PEGDA)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为10％(质量体积浓度w/v)前驱体溶液A；
将30mg双键功能化透明质酸(HA-MA，结构为溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为3％(w/v)前驱体溶液B；
将20mg巯基化透明质酸(HA-SH，其结构和核磁氢谱图如图11所示)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为3％(w/v)溶液C，添加1M氢氧化钠溶液将溶液C的pH值调至7.2；
在前驱体溶液A中添加5mg RGD-SH，37℃下孵育2h，孵育后，与前驱体溶液B体积比1：1混合，并添加1mg光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂LAP在蓝光条件下成胶，物理研磨，再用500U/mL透明质酸酶处理3h，最后与溶液C共孵育30min，离心，得到颗粒凝胶墨水；
细胞黏附性测试：测试步骤同实施例1，结果发现，酶处理过后的水凝胶更有利于细胞黏附生长，活性单体暴露更多；
力学表征和毒性表征分析：测试步骤同实施例1，结果发现，本实施例制备的生物墨水在可打印性、生物相容性的表现都与实施例1相似。
实施例7
表面双键暴露程度测试：
(1)前驱液的制备：将100mg制备例1制备得到的超支化聚乙二醇二丙烯酸酯(HB-PEGDA)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为10％(质量体积浓度w/v)前驱体溶液A；
将30mg巯基化透明质酸(HA-SH，其结构和核磁氢谱图如图11所示)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为3％(质量体积浓度w/v)前驱体溶液B，再添加1M氢氧化钠溶液将前驱体溶液B的pH值调至7.2；
将20mg巯基化透明质酸(HA-SH，其结构和核磁氢谱图如图11所示)溶于pH＝7.4的1mL 1×PBS缓冲溶液中，配置成浓度为3％(质量体积浓度w/v)的溶液C；添加1M氢氧化钠溶液将溶液C的pH值调至7.2；
(2)颗粒凝胶制备：将5mg RGD-SH(序列为GRGDSPC)加入到步骤(1)的前驱体溶液A中，在37℃下孵育2h，得到前驱体溶液D，将前驱体溶液D和前驱体溶液B按照体积比1：1充分混合成2mL凝胶前躯液，加到5毫升离心管中，静置成胶；待成胶后，使用100目筛网进行研磨3次，每次研磨时间为5min，使颗粒胶平均直径在100μm；将研磨得到的颗粒凝胶收集到5mL离心管中；
(3)活性颗粒凝胶的制备：将得到的颗粒凝胶溶液离心(离心条件：8000rpm，3min)去除上清液。在颗粒凝胶中添加500U/mL的透明质酸酶，置于37℃下处理3h。处理完成后，离心去除上清液；
(4)将上述活性颗粒凝胶与1mg/mL的巯基罗丹明在37℃下共孵育30min，PBS清洗3次，利用酶标仪测试水凝胶颗粒的荧光强度，结果如图10所示(图10中酶解时间为3h)。
与之对比的，步骤(3)中不进行酶处理(图10中酶解时间为0)，可见，酶处理后的活性颗粒凝胶荧光强度更强，表面双键暴露更多，颗粒凝胶的反应活性更高。
Claims (10)
1.一种颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)将双键改性的聚乙二醇、改性的天然高分子和活性功能单体进行聚合反应，得到凝胶；
(2)对所述凝胶进行粉碎，得到凝胶颗粒；
(3)将所述凝胶颗粒与酶进行酶解反应，得到具有反应活性的水凝胶颗粒；
(4)将所述具有反应活性的水凝胶颗粒与巯基功能化高分子共孵育，浓缩，得到所述颗粒凝胶生物墨水；
所述双键改性的聚乙二醇具有双键和聚乙二醇链段，所述改性的天然高分子具有巯基或双键，所述活性功能单体选自巯基功能化的生物粘附肽或双键功能化的生物粘附肽，所述酶为所述天然高分子对应的酶。
2.根据权利要求1所述的颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：所述巯基功能化高分子选自巯基化透明质酸、巯基化海藻酸钠、巯基化明胶或巯基化海藻酸中的一种或多种的组合；和/或，所述双键改性的聚乙二醇选自多臂聚乙二醇、树枝状聚乙二醇或超支化聚乙二醇二丙烯酸酯中的一种或多种的组合，所述多臂聚乙二醇选自二臂聚乙二醇马来酰亚胺、三臂聚乙二醇马来酰亚胺、四臂聚乙二醇马来酰亚胺或六臂聚乙二醇马来酰亚胺，所述树枝状聚乙二醇为(mPEG)4-(PEG)2-MAL；所述超支化聚乙二醇二丙烯酸酯由聚乙二醇二丙烯酸酯通过RAFT聚合制备得到。
3.根据权利要求2所述的颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：所述巯基功能化高分子的巯基取代基为20％～60％，分子量为100kDa～400kDa；和/或，所述超支化聚乙二醇二丙烯酸酯的结构式为：
4.根据权利要求1所述的颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：所述天然高分子选自胶原蛋白、壳聚糖、明胶、葡聚糖、海藻酸钠和透明质酸中的一种或多种的组合；和/或，所述改性的天然高分子中巯基或双键的取代度为20％～60％，分子量为10kDa～2000kDa；和/或，所述活性功能单体选自Cys-RGD、GRGDSPC、巯基丙酸-RGD、环肽c(RGDfC)、(Ac)2-KYIGSRG、GIKAVAK-Ac、YIGSRC、CYIGSR中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1所述的颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述共孵育的温度为0～35℃；和/或，步骤(4)中所述共孵育的时间为10min～24h；和/或，步骤(4)中所述浓缩包括离心的步骤；和/或，步骤(1)中所述聚合反应在水或PBS缓冲液中进行，所述双键改性的聚乙二醇在水或PBS缓冲液中的质量体积浓度为2～20％，所述改性的天然高分子在水或PBS缓冲液中的质量体积浓度为0.5～20％，所述活性功能单体在水或PBS缓冲液中的质量体积浓度为0.1～20％。
6.根据权利要求1所述的颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：所述改性的天然高分子具有巯基，所述聚合反应为迈克尔加成聚合，所述聚合反应的温度为0～30℃；或者，所述改性的天然高分子具有双键，所述聚合反应为自由基聚合，所述聚合反应在光引发剂的存在下进行。
7.根据权利要求1所述的颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述粉碎选自挤压破碎，研磨破碎或冲击破碎；和/或，所述具有反应活性的水凝胶颗粒的粒径为30μm～300μm。
8.根据权利要求1所述的颗粒凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述聚合反应在pH为7～8下进行；和/或，步骤(3)中所述酶的浓度为1U/mL-2000U/mL；和/或，步骤(3)中所述酶选自透明质酸酶、胰酶、海藻酸钠裂解酶、壳聚糖酶或胶原酶中的一种或多种的组合。
9.权利要求1-8任一项所述颗粒凝胶生物墨水的制备方法制备得到的颗粒凝胶生物墨水。
10.权利要求9所述颗粒凝胶生物墨水用于细胞培养、组织工程、生物支架或生物打印的用途。
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