CN117223604B - 一种防风组织培养快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及植物组织培养领域，公开了一种防风组织培养快繁的方法。本申请所述方法首次选择防风二级花薹嫩芽为防风组织培养较为理想的外植体材料，通过优化诱导愈伤组织、诱导丛生芽以及生根阶段的培养基组成，使培养过程中出愈率达到89.3％，生根率达到87.5％，再生苗移栽成活率为100％，同时根部的药用指标成分含量得到明显提升，由此建立了有效的防风组织培养再生体系，为防风利用优良无性系进行快繁提供理论参考与技术补充。

Description

一种防风组织培养快繁的方法

技术领域

本申请涉及植物组织培养领域，尤其涉及一种防风组织培养快繁的方法。

背景技术

防风[Saposhnicovia divaricata(Turcz.)Schisck.]为伞形科防风属多年生草本植物，药用部位是防风未抽花茎植株的干燥根。

植物组织培养技术相比传统繁殖技术具有占用空间小、培养周期短、扩繁速度快和人为可控性更高等优点，是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径。

关于防风组织培养，前人已经进行了相关研究，常规使用的外植体一般为根、叶片和茎段，培养基组成和配比彼此有所差异，但普遍使用了6-BA等细胞***素，目前已报道的快繁方法生根率普遍不高，最高仅为65％左右，而且培养周期较长。

因此，针对防风的生产栽培中存在种子发芽率低、出苗缓慢、出苗不齐、生根效果不佳等问题，应用组织培养方法繁殖和保存防风优良种质已成为防风优良单株快繁的一项必要技术。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于提供一种防风组织培养快繁的方法，使得所述方法能够显著提高防风再生苗的生根率和生根效果；

本申请的另外一个目的在于提供一种防风组织培养快繁的方法，使得所述方法能够显著提高防风再生苗的根部的药用指标成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。

为了解决上述技术问题/达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题/达到上述目的，作为本申请的第一方面，提供了一种防风组织培养快繁的方法，包括：

步骤1、以防风二级花薹嫩芽为外植体，接种至愈伤培养基诱导愈伤组织；所述愈伤培养基由MS、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)和KT(激动素)组成；

步骤2、将步骤1获得的愈伤组织接种至生芽培养基中诱导丛生芽；所述生芽培养基由MS、NAA(萘乙酸)和6-BA组成；

步骤3、将步骤2获得的丛生芽接种至生根培养基中诱导再生苗；所述生根培养基由1/2MS、1/2蔗糖和0-0.3mg/L的NAA组成。

可选地，步骤1还包括对获得的愈伤组织采用相同的愈伤培养基进行继代培养。

进一步可选地，所述愈伤培养基由MS、1mg/L的2,4-D、1mg/L的6-BA和1mg/L的KT组成；所述继代培养的条件为12h/d光照，25℃恒温。

可选地，所述生芽培养基由MS、0.6mg/L的NAA和1.0mg/L的6-BA组成。

可选地，所述诱导愈伤组织、诱导丛生芽以及诱导再生苗的培养条件为暗培养7d后再光培养，12h/d光照，25℃。

可选地，在步骤3获得再生苗后还包括对其进行驯化移栽。

进一步可选地，所述驯化移栽包括：

当苗高至5cm以上，根长至4cm以上，主根上生出侧根时可将再生苗驯化2-3d，并加入少许水保持湿润；

驯化后取出再生苗用流水轻轻洗掉苗根部粘连的多余培养基即可移栽至基质中，每盆栽1-3株。

进一步可选地，所述基质包括营养土和蛭石。

作为本申请的第二方面，提供了防风二级花薹嫩芽作为外植体在防风再生苗快繁中的应用。

本申请首次选择防风二级花薹嫩芽为防风组织培养较为理想的外植体材料，通过优化诱导愈伤组织、诱导丛生芽以及生根阶段的培养基组成，使培养过程中出愈率达到89.3％，生根率达到87.5％，再生苗移栽成活率为100％，同时根部的药用指标成分含量得到明显提升，由此建立了有效的防风组织培养再生体系，为防风利用优良无性系进行快繁提供理论参考与技术补充。

附图说明

图1所示为防风不同外植体刚接种及在相应愈伤培养基上培养25d的效果，其中图A1-D1分别是外植体二级花薹嫩芽、一级花薹切段、幼根和展开嫩叶，图A2-D2是二级花薹嫩芽、一级花薹切段、幼根和展开嫩叶刚接种至愈伤培养基时，图A3-D3分别为二级花薹嫩芽、一级花薹茎段、幼根、展开嫩叶在各自出愈率最高的培养基上(依次对应D、C、D、C培养基)培养25d诱导愈伤的情况；

图2所示为继代培养25d后防风愈伤组织的增殖情况，其中图A、B均为愈伤组织在培养基D中继代培养25d后的增殖情况，图C、D均为愈伤组织在培养基C中继代培养25d后的增殖情况；

图3所示为防风愈伤组织诱导丛生芽情况，其中图A为防风愈伤组织刚接种到生芽培养基，图B、C、D为防风愈伤组织进行丛生芽培养10d的生长情况，图E是愈伤组织进行丛生芽培养15d的生长情况，图F-H是由图D中的丛生芽转移至相同的生芽培养基进行分株培养，图I是由防风愈伤组织进行丛生芽培养20d的生长情况，图J-L是由图E-G分株培养20d后的生长情况；

图4所示为防风三类组培再生苗刚接种时的外观性状和根性状，其中图A、B、C依次为防风第一类、第二类、第三类组培再生苗刚接种到生根培养基时的根部性状和外观性状；

图5所示为防风三类组培再生苗分别在六种生根培养基上培养30d后的生根情况，其中图A1-F1分别为第一类防风再生苗在1-6号培养基上培养30d后的生根情况，图A2-F2分别为第二类防风再生苗在1-6号培养基上培养30d后的生根情况，图A3-F3分别为第三类防风再生苗在1-6号培养基上培养30d后的生根情况；

图6所示为防风第三类组培再生苗不同时期根部性状的生长变化，其中图A-E分别为第三类防风组培再生苗在接种至2号培养基上第0、15d、20d、25d、30d的根部形态变化情况，图F为第30d防风组培苗的地上部分形态；

图7所示为不同生根培养基下防风第三类组培再生苗开盖炼苗情况，其中图A-F分别为在1-6号培养基上开盖炼苗的情况；

图8所示为不同生根培养基下防风第三类组培再生苗移栽15d、30d的生长情况，其中图A1-F1分别为来自1-6号培养基上的第三类防风组培苗移栽15d的生长情况，图A2-F2分别为来自1-6号培养基上的第三类防风上移栽30d的生长情况；

图9所示为防风一级花薹和二级花薹嫩芽的指示图，图中红色箭头所示为一级花薹，黄色箭头所示为二级花薹嫩芽。

具体实施方式

本申请公开了一种防风组织培养快繁的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本申请。本申请所述产品、工艺和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本申请内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本申请技术。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，在本文中，如若出现诸如“第一”和“第二”、“步骤1”和“步骤2”以及“(1)”和“(2)”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。同时，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在本申请的第一个方面中，提供了一种防风组织培养快繁的方法，包括：

步骤1、以防风二级花薹嫩芽为外植体，接种至愈伤培养基诱导愈伤组织；所述愈伤培养基由MS、2,4-D、6-BA和KT组成；

步骤2、将步骤1获得的愈伤组织接种至生芽培养基中诱导丛生芽；所述生芽培养基由MS、NAA和6-BA组成；

步骤3、将步骤2获得的丛生芽接种至生根培养基中诱导再生苗；所述生根培养基由1/2MS、1/2蔗糖和0-0.3mg/L的NAA组成。

在本申请中，所述二级花薹嫩芽指取自防风抽薹阶段一级花薹上新抽出的二级花薹芽，一般取样时间为抽出后3-5天，而一级花薹指抽薹阶段防风靠近花序一侧的一级花薹(质地偏柔软)，具体参见图9所示，所述二级花薹嫩芽外植体一般取1cm长。

在本申请某些实施方式中，诱导愈伤组织之前还包括对外植体的消毒环节，通常采用乙醇、升汞、无菌水进行消毒；在本申请另外一些实施方式中，所述消毒环节包括：

用水清洗外植体杂质，用70％乙醇消毒30s，无菌水洗3次，再用0.1％升汞消毒15min，无菌水洗6次。

在本申请某些实施方式中，为保证充足的愈伤组织诱导丛生芽，步骤1还包括对获得的愈伤组织采用相同的愈伤培养基进行继代培养，培养条件为12h/d光照，25℃恒温，培养周期在本申请某些实施方式中为25d。

在本申请另外一些实施方式中，所述愈伤培养基以MS为基本培养基，添加1mg/L的2,4-D、1mg/L的6-BA和1mg/L的KT；所述生芽培养基以MS为基本培养基，添加0.6mg/L的NAA和1.0mg/L的6-BA；其中，所述MS培养基为固体MS培养基，pH值5.8-6.0，一般包含蔗糖和琼脂，例如蔗糖含量为30g/L，琼脂含量为8-9g/L。

在本申请某些实施方式中，所述生根培养基以1/2MS为培养基，添加1/2蔗糖和0-0.3mg/L的NAA；所述1/2MS培养基为固体培养基，包含8-9g/L琼脂，pH值为5.8-6.0。所述1/2MS和1/2蔗糖为本领域术语，指代浓度在正常MS培养基和蔗糖浓度基础上减半。

在本申请某些实施方式中，所述诱导愈伤组织、诱导丛生芽以及诱导再生苗的培养条件为暗培养7d后再光培养，12h/d光照，25℃。在本申请另外一些实施方式中，所述诱导愈伤组织的周期为25d，诱导丛生芽的周期为35d，诱导再生苗(生根)的周期为30d。

在本申请某些实施方式中，丛生芽如果出芽数较多，为避免培养空间狭小，不利于丛生芽继续伸长和生长，可将长势良好的丛生芽转移到相同的生芽培养基中进行分株培养，培养条件不变。

在本申请某些实施方式中，在步骤3获得再生苗后还包括对其进行驯化移栽。在本申请另外一些实施方式中，所述驯化移栽包括：

当苗高至5cm以上，更优选为8cm以上，根长至4cm以上，主根上生出侧根时可将再生苗驯化2-3d，并加入少许水保持湿润；

驯化后取出再生苗用流水轻轻洗掉苗根部粘连的多余培养基即可移栽至基质中，每盆栽1-3株。

在本申请另外一些实施方式中，所述基质包括营养土和蛭石，两者比例为1:1；所述移栽的培养条件为暗培养7d后再光培养，12h/d光照，25℃恒温

在本申请的第二个方面中，本申请同时选择新鲜防风幼嫩一级花薹、二级花薹嫩芽、幼根、展开嫩叶等营养器官为外植体，在相同培养条件下进行组织培养，结果显示，二级花薹嫩芽做为外植体培养的愈伤组织可以在出愈率和愈伤组织质地上同时保持较高水平，而其他外植体无法同时达到较高水平；同时，以二级花薹嫩芽做为外植体在后续培养阶段，与相适宜的培养基相配合，可以获得较高的生根率、根长以及药用成分含量。基于上述的优异效果，本申请提供了防风二级花薹嫩芽作为外植体在防风再生苗快繁中的应用。

在本申请提供的各组对比实验中，如未特别说明，除各组指出的区别外，其他实验条件、材料等均保持一致，以便具有可对比性。

以下就本申请所提供的一种防风组织培养快繁的方法做进一步说明。

实施例1：本申请防风组织培养快繁的方法

(1)外植体的消毒

以河北农业大学创新实验园直播的两年生防风为试验材料，经鉴定为伞形科植物防风[S divaricata]。二级花薹嫩芽取自两年生抽薹植株。

自来水洗掉杂质。用70％乙醇消毒30s，无菌水洗3次，再用0.1％升汞消毒15min，无菌水洗6次。然后将二级花薹嫩芽取1cm长，备用。

(2)愈伤组织的诱导

将上述外植体分别接种到诱导防风愈伤组织的MS培养基(蔗糖含量为30g/L，琼脂含量为9g/L，1mg/L 2,4-D，1mg/L 6-BA，1mg/L KT，pH为5.8-6.0)上。每瓶接种4-5个外植体。培养条件为暗培养7d后再光培养，12h/d光照，25℃恒温，培养周期25d。

(3)愈伤组织的继代培养

为保证充足的愈伤组织诱导丛生芽实验，利用(2)中的培养基对已诱导出的愈伤组织进行继代培养。培养条件为12h/d光照，25℃恒温，培养周期25d。

(4)丛生芽的诱导

将继代所得的防风愈伤组织转移到生芽培养基中进行丛生芽的诱导培养，每瓶培养基接种5-7块愈伤组织，培养基组成为MS+NAA 0.6mg/L+6-BA 1.0mg/L，培养条件同(2)中条件，培养周期35d。

丛生芽的分株培养：由于愈伤组织接种至生芽培养基后长出的丛生芽数较多，导致瓶内空间狭小，不利于丛生芽继续伸长和生长，因此将长势良好的丛生芽转移到相同的生芽培养基中进行分株培养，培养条件不变。

(5)根的诱导(再生苗)

经过丛生芽的诱导和分株培养，将丛生芽接种至1/2MS+1/2蔗糖+0-0.3mg/L的NAA的生根培养基上，培养基琼脂含量为9g/L，pH值为5.8-6.0。每瓶接种1-2株丛生芽，培养条件同(2)中条件，培养周期30d。

(6)驯化移栽

当苗高至8cm、根长至4cm、主根上生出侧根时将培养基的封口膜打开，于25℃、12h/d光照的温室内炼苗2-3d后可移栽，从培养基中取出生根的小苗，用自来水轻轻洗掉苗根部粘连的培养基后移栽至盆里，移栽基质为营养土和蛭石，比例为1:1，培养条件同(2)中条件，三个月后移至大田。

实施例2：不同外植体的愈伤组织对比

采集新鲜防风幼嫩一级花薹、二级花薹嫩芽、幼根、展开嫩叶等营养器官，所有外植体全部采集自同一实验园区的长势一致的两年生防风，其中幼根材料取自两年生未抽薹植株，一级花薹和二级花薹嫩芽取自两年生抽薹植株，展开嫩叶材料取自两年生未抽薹植株(注：愈伤组织诱导预实验发现已抽薹植株的根和嫩叶为外植体在培养基内培养容易褐化，无法诱导愈伤，取未抽薹植株的根和嫩叶因株龄较小而更幼嫩，所以作外植体其愈伤组织诱导发生能力更强)。

幼根和一级花薹切段在超净工作台内切成1cm小段，二级花薹嫩芽取1cm长，嫩叶切成1cm²大小；

参照实施例1的诱导愈伤组织的方法，统计不同外植体在表1不同愈伤培养基下的出愈率和质地；

出愈率(％)＝外植体诱导出的愈伤组织个数/接种外植体总数×100％；

表1防风外植体诱导愈伤组织的培养基

将一级花薹切段、二级花薹嫩芽、幼根及展开幼叶(图1-A1-D1)分别接种在四种愈伤培养基上(图1-A2-D2)，25d后四种外植体在四种诱导愈伤组织的培养基上均能产生愈伤组织，但出愈率和愈伤生长情况有较大差异(表2)，不同外植体在出愈率较高的培养基上诱导的愈伤组织情况见图1-A3-D3。

表2不同外植体在四种培养基下的出愈率

一级花薹切段培养25d后在C培养基下出愈率最高，为90％，愈伤组织在花薹两端的切口处膨大，质地稍紧密，体积较大(图1-B3)，但多呈淡黄白色；二级花薹嫩芽诱导25d后在D培养基下出愈率最高，为89.3％，芽向上翘起，底部长出团状黄绿色愈伤组织，质地较紧密，体积较花薹诱导出的愈伤组织稍小(图1-A3)；展开幼叶培养25d后在培养基C下出愈率最高，为91.3％，但叶片易发黄变枯，仅有颗粒状淡黄色愈伤组织出现，体积较小(图1-D3)，且在A、B培养基下均未诱导出愈伤组织；幼根在培养基D上出愈率最高，为15％(图1-C3)，经25d诱导后幼根形态基本未发生变化，也几乎无愈伤组织形成。

综上所述，以一级花薹切段和二级花薹嫩芽作外植体在四种培养基下的出愈率较高，其中二级花薹嫩芽在D培养基下生长的愈伤质地最好、为黄绿色且体积较大；一级花薹切段在培养基C上诱导出的愈伤组织质地次之、颜色发白，体积最大；展开幼叶虽然在C、D培养基下出愈率较高，但诱导出的愈伤质量不佳，幼根诱导愈伤组织出愈率最低。

实施例3：防风愈伤组织的继代培养对比

利用表1中的C、D培养基对实施例2采用二级花薹嫩芽为外植体的已诱导出的愈伤组织进行继代培养，方法同实施例1。每种培养基接种10瓶，培养条件为12h/d光照，25℃恒温，25d后观察C、D培养基下愈伤组织的继代增殖情况。

将诱导出的生长旺盛的防风愈伤组织分别转移至C、D培养基中进行继代培养25d，愈伤组织在两培养基下的继代情况差异较明显。以D培养基上增殖的愈伤组织生长情况较好，淡黄绿色，质地较为紧密，体积较大(图2-A、B)；而C培养基上增殖的愈伤组织体积较小，颜色较深为黄褐色，质地稍紧密(图2-C、D)。因此，培养基D：MS+1mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA+1mg/L KT(3％蔗糖+0.9％琼脂)为防风愈伤组织继代培养的最适培养基。

实施例4：防风愈伤组织诱导丛生芽的统计观察

将继代所得的防风愈伤组织转移到生芽培养基中进行丛生芽的诱导培养，每瓶培养基接种5-7块愈伤组织，方法同实施例1，定期观察丛生芽的生长情况。

丛生芽的分株培养：由于愈伤组织接种至生芽培养基后长出的丛生芽数较多，导致瓶内空间狭小，不利于丛生芽继续伸长和生长，因此将长势良好的丛生芽转移到相同的生芽培养基中进行分株培养，培养条件不变。

将愈伤组织经过1次继代培养后得到生长良好的愈伤组织接种到诱导丛生芽的分化培养基(MS+NAA 0.6mg/L+6-BA 1.0mg/L)上(图3-A)，培养10d后分化出浅绿色丛生芽(图3-B-D)，培养15d后丛生芽数量增加(图3-E)原培养基空间狭小，因此将每个瓶中相互缠绕的丛生芽转移至若干个相同生芽培养基中分株培养(图3-F-H)，分株的每个芽约1-2cm，2-3片小叶。原培养基培养20d后每个芽能长至2-4cm，2-5片小叶，且部分丛生芽有细小白根出现，叶基部出现新丛生芽(图3-I)；分株培养20d后每个芽能长至3-6cm，3-7片小叶，小叶基部又冒出大量新的丛生芽(图3-J-L)，可进行下一步生根试验。

实施例5：防风丛生芽诱导生根的对比

经过丛生芽的诱导和分株培养，得到长势不均匀的防风再生苗，将再生苗根据叶片数、株高和根长等外观性状分为三类(表3)。三种类别分别接种到6种生根培养基上(表4)，6种培养基琼脂含量均为9g/L，pH值为5.8-6.0。每种培养基分别接种每类苗10瓶，每瓶接种1-2株小苗，培养条件同1.2.2。每天观察组培苗的生根情况，30d后统计生根率和根长。

生根率(％)＝(生根的不定芽数/接种的不定芽总数)×100％

表3防风组培苗外观性状分类

表4防风生根培养基组合

在生芽培养基中长出的防风苗参差不齐，根据外观性状不同将苗分为三类，分别转移至不同生根培养基上进行生根培养(图4)。30d后三类组培苗在不同生根培养基上的生根情况不同(图5)，生根率和根长(表5)也不同。

第一类防风苗在3、6号培养基即NAA浓度为0时生根率最高，为100％，但新长的根较卷曲细长或呈网状，白色，质量不佳(图5-C1、F1)。在1、4号培养基即NAA浓度为0.6mg/L时生根率次之，分别为85.71％和71.43％，其中在1号培养基上根长约6.6cm，呈簇状展开，底部较粗，顶端较细，但颜色为***(图5-A1)，而在4号培养基根长最短约4.8cm，颜色为黄绿色(图5-D1)，因此NAA为0.6mg/L时防风苗的生根情况也不理想。当NAA浓度为0.3mg/L时新长的根较为健壮(图5-B1、E1)，根数为3-4条且长度均匀，直径较粗，在2号培养基即1/2蔗糖和1/2MS时的根长最长为10.8cm，显著高于其余培养基苗的根长，此外根直径也较5号培养基即蔗糖和MS浓度正常时的根粗，颜色为黄绿色，质量较好。因此综合根长、颜色及生根率等指标，确定第一类防风组培苗生根的最佳培养基为2号培养基。

第二类防风苗在1号和3号培养基上即1/2MS、1/2蔗糖，NAA浓度为0.6mg/L和0时生根率最高为100％，当NAA浓度为0.3mg/L时即2号培养基，生根率次之，为87.5％。而当培养基为MS、蔗糖时即4、5、6号培养基，生根率均低于1/2MS、1/2蔗糖时。生根质量方面，2号和5号培养基下防风苗产生的根更为健壮，直径较粗，颜色为黄绿色(图5-B2、E2)。其中2号培养基的根平均根长最长，为9.8cm。因此第二类防风组培苗在2号培养基上的生根情况最好，根长最长、直径较粗、生根率较高、颜色为黄绿色。第三类防风组培苗在培养基为1/2MS、1/2蔗糖时即1、2、3号培养基上的生根率均高于MS、蔗糖即4、5、6号培养基，以3号培养基生根率最高，为83.33％。但生根质量结果同第一类和第二类防风苗，表现为2号培养基下再生苗生根效果最好(图5-B3)，因此也选择2号培养基。

综上所述，三类防风苗当NAA浓度为0时，长出的根均表现为较卷曲细长或呈网状，颜色为白色或黄白色，质量不佳；当NAA浓度为0.6mg/L时，在1/2MS、1/2蔗糖培养基下产生的根表现为***，在MS、蔗糖培养基下产生的根颜色较正常，为黄绿色；在NAA浓度为0.3mg/L，1/2MS、1/2蔗糖时，其产生的根最为健壮，平均根长最长，与其它培养基下苗的根长差异显著，直径也较粗，颜色为黄绿色，质量较好，并且2号培养基MS和蔗糖用量减半更为经济，因此防风最适生根培养基为2号培养基(1/2MS、1/2蔗糖、0.3mg/L NAA)。

表5三类防风组培苗在不同培养基上的生根率及根长

注：P＜0.05，a、b、c表示差异显著

此外，以第三类无根的防风组培苗为例，其在2号培养基上随时间推进的生根情况如图6所示。培养15d，开始长出4-5个0.5cm的黄绿色小根，尖端为白色；培养20d后，黄绿色小根长至1.5cm，又新长出1-2条0.3cm小根；培养25d后，5条黄绿色根长至5.5cm，主根上又新长出0.5cm的须根整齐排列；培养30d后，黄绿色根生长较为粗壮，长度为10cm，直径增粗，主根上长出的白色须根为0.5-1.5cm，叶片由浅绿变为深绿色。

实施例6：防风组培再生苗的驯化移栽对比

以第三类防风组培再生苗为实验对象，当苗高至8cm，根长至4cm，主根上生出侧根时可将封口膜打开先驯化2-3d(图7)，并往瓶中加入少许自来水保持湿润。驯化后可移栽，移栽基质为营养土和蛭石，比例1:1混匀后浇透水，取出小苗用流水轻轻洗掉苗根部粘连的多余培养基即可移栽，每盆栽2-3株，移栽完成后再浇少量水，于温度25℃，光照12h/d的环境中进行培养，移栽15d和30d后各培养基下的组培苗生长情况如图8所示，其中来自2号培养基的防风组培苗长势良好，叶片数较多，约6-8片，无枯叶。

实施例7：防风组培再生苗的药用成分检测

将实施例6中再生苗在温室培养4个月，之后带盆转移至旱棚里，6个月后采挖根部取样，检测对应于表4中1-6号生根培养基的样品的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量，结果见表6；

表6

升麻素苷含量：不同生根培养基下防风根部升麻素苷含量差异显著，其中3号培养基下含量最高，且该培养基用料最为经济，NAA浓度为0，MS和蔗糖浓度均减半；而当NAA为0，MS和蔗糖浓度正常时，根部升麻素苷含量最低，可见MS和蔗糖的浓度对防风根部升麻素苷含量的合成影响较大，过高会有抑制作用。

5-O-甲基维斯阿米醇苷含量：不同培养基下防风根部5-O-甲基维斯阿米醇苷含量差异显著，以2号培养基含量最高，1号次之，而5号培养基含量最低，可见NAA浓度为0.3mg/L，MS和蔗糖浓度均减半的情况下更有利于防风根部5-O-甲基维斯阿米醇苷的合成。

两者含量之和：不同培养基下防风根部升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷含量之和差异显著，且防风根部两种成分含量和均以MS和蔗糖浓度减半时较高，即1、2、3号培养基。其中，根部两种药用成分含量和最高的样品来自3号培养基，此时NAA浓度为0，并随着NAA浓度增大，药用成分含量和逐渐降低。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种防风组织培养快繁的方法，其特征在于，包括：

步骤1、以防风二级花薹嫩芽为外植体，接种至愈伤培养基诱导愈伤组织；所述愈伤培养基由MS、1mg/L的2,4-D、1mg/L的6-BA和1mg/L的KT组成；

步骤2、将步骤1获得的愈伤组织接种至生芽培养基中诱导丛生芽；所述生芽培养基由MS、NAA和6-BA组成；

步骤3、将步骤2获得的丛生芽接种至生根培养基中诱导再生苗；所述生根培养基由2.37g/L的MS、15g/L的蔗糖和0-0.3mg/L的NAA组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1还包括对获得的愈伤组织采用相同的愈伤培养基进行继代培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述继代培养的条件为12h/d光照，25℃恒温。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生芽培养基由MS、0.6mg/L的NAA和1.0mg/L的6-BA组成。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导愈伤组织、诱导丛生芽以及诱导再生苗的培养条件为暗培养7d后再光培养，12h/d光照，25℃。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤3获得再生苗后还包括对其进行驯化移栽。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述驯化移栽包括：

当苗高至5cm以上，根长至4cm以上，主根上生出侧根时可将再生苗驯化2-3d，并加入少许水保持湿润；

驯化后取出再生苗用流水轻轻洗掉苗根部粘连的多余培养基即可移栽至基质中，每盆栽1-3株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基质包括营养土和蛭石。

9.防风二级花薹嫩芽作为外植体在防风再生苗快繁中的应用，其特征在于，包括：

步骤1、以防风二级花薹嫩芽为外植体，接种至愈伤培养基诱导愈伤组织；所述愈伤培养基由MS、1mg/L的2,4-D、1mg/L的6-BA和1mg/L的KT组成；

步骤2、将步骤1获得的愈伤组织接种至生芽培养基中诱导丛生芽；所述生芽培养基由MS、NAA和6-BA组成；

步骤3、将步骤2获得的丛生芽接种至生根培养基中诱导再生苗；所述生根培养基由2.37g/L的MS、15g/L的蔗糖和0-0.3mg/L的NAA组成。