CN117210551A - 用于检测牛10种遗传缺陷基因的arms-pcr引物组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS‑PCR引物组合及试剂盒。本发明试剂盒能够快速、低成本、高灵敏度地同时检测牛10种遗传缺陷基因HH1、HH2、HH3、HH4、HH5、HH6、HCD、BLAD、CVM、BS所对应的遗传缺陷位点，可在牛的育种与繁殖领域广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体地说，涉及用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合及试剂盒。
背景技术
近年来，奶牛的高强度选择，使得重要经济性状取得了显著的遗传进展。然而，育种过程中，仅在少数优秀家系中选择种公牛，导致后代近交程度增加，有害突变积累。科学家们在过去20多年里，在荷斯坦牛中先后发现了多种遗传缺陷基因，包括白细胞黏附缺陷(bovine leukocyte adhesion deficiency，BLAD；Shuster et al.1992)，脊柱畸形综合征(complex vertebral malformation，CVM；Agerholm et al.2001)，短脊柱畸形综合征(Brachyspina，BS；Charlier et al.2012)等。随着基因组检测技术发展，大量基因组数据分析显示，在荷斯坦牛群中存在一些频率较高但是从未纯合的单倍型，一旦纯合就会造成胚胎早期死亡或者初生犊牛死亡，其中包括荷斯坦牛遗传缺陷单倍型HH1、HH2、HH3(Holstein haplotype；VanRaden et al.,2011)，HH4(Fritz et al.,2013)，HH5(Cooperet al.,2013)、HH6(Fritz et al.,2018)和HCD(haplotype for cholesteroldeficiency；Kipp et al.,2015)。
上述10种遗传缺陷基因呈现隐性遗传模式，即携带者本身表现正常，但如果携带者公牛和携带者母牛交配，其1/4后代为缺陷基因纯合子，表现为胚胎早期死亡或者初生牛犊死亡。因此，为了实现牛群改良，需要及时检测和发现遗传缺陷携带者，逐步淘汰携带者，同时采用科学手段避免携带者之间的交配。
针对致因突变已知的遗传缺陷，基于变异类型特点，可通过多种检测方法在DNA水平检测其携带者。目前已报道多种遗传缺陷位点的检测方法，例如，采用PCR-RFLP方法检测HH4(Fritz et al.,2013；Kumar et al.,2020)，利用TaqMan探针和特异性引物进行实时PCR检测CVM和BLAD(Zhang et al.,2012)，通过PCR产物电泳的方法检测BS(Charlier etal.,2012；Fang et al.,2013)、HCD(Menzi et al.,2016；Schütz et al.,2016)和HH5(Schütz et al.,2016)。
除上述描述的针对单个致因突变位点的检测方法，KASP和ARMS-PCR方法可实现多位点联合检测方法。虽然两种方法均是基于PCR的基因分型技术，但相较于KASP，ARMS-PCR方法具备效率高、成本低、操作简便、准确性高等特点，更适用于大规模样本的基因分型检测。因此，利用ARMS-PCR方法实现一次反应筛选多个遗传缺陷位点，能够准确、快速鉴定出有害突变，为选育更健康的动物提供了可能。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合及试剂盒。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合，所述引物组合包括10组，其中，第一组引物如SEQ ID No：1-3所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点；第二组引物如SEQ ID No:4-6所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH2所对应的遗传缺陷基因位点；第三组引物如SEQ ID No:7-9所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点；第四组引物如SEQ IDNo:10-12所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点；第五组引物如SEQ ID No：13-15所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点；第六组引物如SEQ ID No：16-18所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH6所对应的遗传缺陷基因位点；第七组引物如SEQ ID No：19-21所示，用于检测胆固醇缺失症(HCD)所对应的遗传缺陷基因位点；第八组引物如SEQ ID No：22-24所示，用于检测奶牛白细胞粘附缺陷(BLAD)所对应的遗传缺陷基因位点；第九组引物如SEQ ID No：25-27所示，用于检测奶牛脊柱畸形综合征(CVM)所对应的遗传缺陷基因位点；第十组引物如SEQ ID No：28-30所示，用于检测奶牛短脊柱畸形综合征(BS)所对应的遗传缺陷基因位点。
第二方面，本发明提供含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的试剂盒，所述试剂盒包含所述引物组合、dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶和反应缓冲液等。
进一步地，所述引物组合中各组引物的浓度为0.15μM-0.4μM。
优选地，所述引物组合中第六组、第七组和第十组引物的浓度为0.15μM，第二组引物的浓度为0.18μM，第三组引物的浓度为0.2μM，第九组引物的浓度为0.24μM，第一组和第五组引物的浓度为0.3μM，第八组引物的浓度为0.36μM，第四组引物的浓度为0.4μM。
第四方面，本发明提供一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的方法，包括以下步骤：
(1)牛血液基因组DNA提取；
(2)以提取的DNA为模板，利用SEQ ID No:1-30所示引物进行PCR扩增反应；
(3)对扩增产物进行毛细管电泳检测。
配制反应体系：将各反应试剂(2×PCR Mix、引物混合液、无核酸酶纯水)震荡混合后按照体积比(DNA模板除外)配置PCR反应混合液，分装9μL于PCR反应管中，最后向各反应管加入1μL模板，离心后进行下一步。反应体系组成如下：
其中，PCR Mix的主要组成如下：DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+。
引物混合液中各组引物的浓度范围为0.15μM-0.4μM，其中HH6、HCD和BS引物终浓度为0.15μM，HH2引物终浓度为0.18μM，HH3引物终浓度为0.2μM，CVM引物终浓度为0.24μM，HH1和HH5引物终浓度为0.3μM，BLAD引物终浓度为0.36μM，HH4引物终浓度为0.4μM。
PCR反应程序：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火及延伸1分钟，30个循环；60℃延伸30分钟，最后4℃保存。
毛细管电泳检测方法如下：取1μL扩增产物(原液或稀释后的产物)，加入8.8μLHIDI(高度去离子甲酰胺，ABI公司)及0.2μL LIZ500分子量内标(ABI公司)，混合静置数分钟，95℃变性3分钟，立即冰浴3分钟，离心后放入ABI3730测序仪中，准备检测。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明通过优化引物序列，在ARMS引物序列中引入错配碱基，提高引物的特异性，使检测结果准确可靠。
(二)反复优化多重PCR体系，通过调整优化各位点PCR引物的浓度，优化PCR扩增程序，使10个位点可以在同一个体系中同时完成PCR扩增，大幅提高了检测效率，操作方法简单，检测耗时短。
(三)优化设计各位点的PCR产物长度，借助不同的荧光和PCR产物长度，使10个位点通过单次毛细管电泳即可区分基因型，实现了高效检测。
(四)检测灵敏度高，低至2ng的DNA模板量可以得到准确分型。
附图说明
图1是本发明试剂盒检测的HH1遗传缺陷位点携带者的结果。
图2是本发明试剂盒检测的HH2遗传缺陷位点携带者的结果。
图3是本发明试剂盒检测的HH3遗传缺陷位点携带者的结果。
图4是本发明试剂盒检测的HH4遗传缺陷位点携带者的结果。
图5是本发明试剂盒检测的HH5遗传缺陷位点携带者的结果。
图6是本发明试剂盒检测的HH6遗传缺陷位点携带者的结果。
图7是本发明试剂盒检测的HCD遗传缺陷位点携带者的结果。
图8是本发明试剂盒检测的BLAD遗传缺陷位点携带者的结果。
图9是本发明试剂盒检测的CVM遗传缺陷位点携带者的结果。
图10是本发明试剂盒检测的BS遗传缺陷位点携带者的结果。
图11是本发明试剂盒中ARMS引物的序列和位置，框中标识为错配碱基。
具体实施方式
本发明提供一种利用荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术检测奶牛10种遗传缺陷基因位点的试剂盒，通过一管式扩增，可同时检测奶牛10种遗传缺陷基因位点。与现有技术相比，检测方法简单快捷、成本低，且准确度高。
本发明还提供一种利用荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术检测奶牛10种遗传缺陷基因分型的方法。
本发明采用如下技术方案：
1、ARMS引物设计
所述的引物采用Primer Premier5和NCBI Blast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(60±2)℃的范围内。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。
2、奶牛血液基因组DNA提取
采用天根“血液基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
3、体系研究
选用奶牛血液提取的DNA及参考品作为模板，分别用上述10对引物进行单重扩增，通过毛细管电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到10对引物共同的扩增条件。通过多轮调整，综合体系均衡性、效率以及杂峰情况，体系在58℃时，扩增效果最佳，故选择58℃作为本试剂盒扩增的退火温度。
4、构建复合体系
将10对引物按照同等比例的引物量置于同一管中扩增，再根据复合扩增的毛细管电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致且同一个SNP位点检测结果无杂峰干扰，如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物，最终确定10对ARMS-PCR引物序列。
其中，第一组引物如序列表SEQ ID No:1-3所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点；第二组引物如序列表SEQ ID No:4-6所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH2所对应的遗传缺陷基因位点；第三组引物如序列表SEQ ID No:7-9所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点；第四组引物如序列表SEQ ID No:10-12所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点；第五组引物如序列表SEQ IDNo:13-15所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点；第六组引物如序列表SEQ ID No:16-18所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH6所对应的遗传缺陷基因位点；第七组引物如序列表SEQ ID No:19-21所示，用于检测胆固醇缺失症(HCD)所对应的遗传缺陷基因位点；第八组引物如序列表SEQ ID No:22-24所示，用于检测奶牛白细胞粘附缺陷(BLAD)所对应的遗传缺陷基因位点；第九组引物如序列表SEQ ID No:25-27所示，用于检测奶牛脊柱畸形综合征(CVM)所对应的遗传缺陷基因位点；第十组引物如序列表SEQ ID No:28-30所示，用于检测奶牛短脊柱畸形综合征(BS)所对应的遗传缺陷基因位点。
5、准确性研究
选取试剂盒扩增检测筛选出的突变样本，用金标准Sanger测序法对样本进行扩增测序，与本试剂盒检测结果进行对比，对试剂盒的检测结果进行验证，确认试剂盒的准确性。
6、重复性验证
利用上述试剂盒对2ng/uL样本进行重复扩增测试，使用ABI 3730测序仪对扩增产物进行检测，测试该试剂盒的重复性。通过实验数据分析，3次重复中各个SNP位点的峰型均能清晰检测，且分型一致，故可判断该试剂盒具有良好的重复性。
7、适用机型研究
利用BIO-RAD、ABI 9700PCR扩增仪对上述试剂盒进行扩增测试，利用ABI 3730测序仪对产物进行检测。通过数据分析，BIO-RAD的扩增效率高于ABI 9700。表明相同条件下，体系在BIO-RAD、ABI 9700PCR扩增仪上均能正常扩增，性能不受扩增仪器的影响，扩增产物在ABI 3730上均能清晰检测出，检测结果一致。
8、稳定性研究
将试剂盒-20℃±5℃以下避光保存至冷冻；分别于第3天、第7天、第15天、第30天进行融化和冷冻。通过反复冻融对8个测试样本进行扩增检测，检测结果均一致，第30天冻融后检测结果无异常。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例使用的PCR Mix购自北京启衡星生物科技有限公司。
实施例1利用荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术检测奶牛10种遗传缺陷基因试剂盒扩增奶牛血液提取的基因组DNA样本
1、引物设计
针对每个遗传缺陷基因变异位点的两个等位基因，分别设计两个特异性PCR引物，它们分别特异性地与两个等位基因的模板序列结合，此外设计1个通用引物(表1)。
表1 ARMS-PCR引物序列(5′-3′)
通过优化引物序列，在ARMS引物序列中引入错配碱基(图11)，提高引物的特异性，使检测结果准确可靠。
2、采集485头荷斯坦奶牛血液。
3、DNA提取：采用天根“血液基因组DNA提取试剂盒”制备DNA，作为模板。
4、配制反应体系：将各反应试剂(2×PCR Mix、引物混合液、无核酸酶纯水)震荡混合后按照体积比(模板除外)配置PCR反应混合液，分装9μL于PCR反应管中，最后往各反应管加入1μL模板，离心后进行下一步。反应体系组成如下：
其中，PCR Mix的主要组成如下：DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+。
引物混合液中各组引物的浓度范围为0.15μM-0.4μM，各引物终浓度如表2所示。
表2 ARMS-PCR引物混合液中各引物终浓度
5、将PCR反应管置于扩增仪上，并运行如下程序：第1步：95℃变性5分钟，第2步：95℃变性30秒，第3步：58℃退火及延伸1分钟，重复第2～3步30次，第4步：60℃延伸30分钟，最后4℃保存。
PCR程序运行完毕后，PCR产物可立即进行后续检测；或2～8℃保存，24小时内检测；或-20℃保存，三天内检测。尽量避免反复冻融，或冻融次数不超过3次。
6、毛细管电泳检测
取1μL扩增产物(原液或稀释后的产物)，加入8.8μL HIDI(高度去离子甲酰胺，ABI公司)及0.2μL LIZ500分子量内标(ABI公司)，混合静置数分钟，95℃变性3分钟，立即冰浴3分钟，离心后放入ABI3730测序仪上，准备检测。
7、数据分析
检测完成后运用genemapper6.0对分型结果进行判读。根据产物片段大小设置panel、bin，依据出峰的位置及荧光颜色判断每个位点的分型。
检测结果如表3所示，共检测485头母牛，除遗传缺陷位点HH6之外，其他9个位点均检测出杂合子，即遗传缺陷基因携带者母牛。
表3检测结果
本发明试剂盒检测HH1、HH2、HH3、HH4、HH5、HH6、HCD、BLAD、CVM、BS遗传缺陷位点携带者的结果分别如图1～图10所示。
实施例2荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术和KASP检测奶牛10种遗传缺陷结果的比较
1、采集484头荷斯坦奶牛血液和48头荷斯坦奶牛的毛囊样本。
2、DNA提取：血液、毛囊样本分别采用天根“血液基因组DNA提取试剂盒”、酚/氯仿法提取基因组DNA。
3、按照实施例1中的操作步骤完成荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术对10种遗传缺陷基因位点的检测。
4、按照已有的KASP方法(Zhang et al.2020；Yang et al.2021；Khan etal.2021)对10种遗传缺陷基因位点进行检测。
5、比较ARMS-PCR和KASP两种方法在遗传缺陷基因位点的检出率。
表4显示了两种方法在检测携带遗传缺陷基因位点的样本数目和占比。通过分析数据，两种方法检测结果非常相似，但是存在极少数个体在HH5、HH6、HCD、CVM和BS中的基因分型存在差异。经Sanger测序或琼脂糖凝胶电泳验证后，发现其中仅有一个BS携带者被ARMS-PCR判定为野生型，其他均为KASP基因分型错误，进一步证明ARMS-PCR检测的准确。
表4 ARMS-PCR和KASP在遗传缺陷基因位点检出率的比较
6、比较ARMS-PCR和KASP两种检测方法的准确性和可靠性
首先比对两种方法的检测结果，利用Sanger测序或琼脂糖凝胶对不一致的结果进行验证。将一致和验证后的结果作为参考，计算敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果见表5，ARMS-PCR的特异性和PPV在10个位点中均为100％，而敏感性和NPV除BS位点略低外，均为100％。KASP在HH5、HCD、CVM和BS中表现了较低的敏感性和略低的NPV，在HH5、HH6和HCD表现了略低的特异性和较低的PPV。综上表明，ARMS-PCR相对KASP在检测10种遗传缺陷位点更有效、准确。
表5比较ARMS-PCR和KASP的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括10组，其中，第一组引物如SEQ ID No:1-3所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点；第二组引物如SEQ ID No:4-6所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH2所对应的遗传缺陷基因位点；第三组引物如SEQ ID No:7-9所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点；第四组引物如SEQ IDNo:10-12所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点；第五组引物如SEQ ID No:13-15所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点；第六组引物如SEQ ID No:16-18所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH6所对应的遗传缺陷基因位点；第七组引物如SEQ ID No:19-21所示，用于检测胆固醇缺失症所对应的遗传缺陷基因位点；第八组引物如SEQ ID No:22-24所示，用于检测奶牛白细胞粘附缺陷所对应的遗传缺陷基因位点；第九组引物如SEQ ID No:25-27所示，用于检测奶牛脊柱畸形综合征所对应的遗传缺陷基因位点；第十组引物如SEQ ID No:28-30所示，用于检测奶牛短脊柱畸形综合征所对应的遗传缺陷基因位点。
2.含有权利要求1所述引物组合的检测试剂或试剂盒。
3.一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述引物组合、dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶和反应缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合中各组引物的浓度为0.15μM-0.4μM。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合中第六组、第七组和第十组引物的浓度为0.15μM，第二组引物的浓度为0.18μM，第三组引物的浓度为0.2μM，第九组引物的浓度为0.24μM，第一组和第五组引物的浓度为0.3μM，第八组引物的浓度为0.36μM，第四组引物的浓度为0.4μM。
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