CN117210551A - 用于检测牛10种遗传缺陷基因的arms-pcr引物组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS‑PCR引物组合及试剂盒。本发明试剂盒能够快速、低成本、高灵敏度地同时检测牛10种遗传缺陷基因HH1、HH2、HH3、HH4、HH5、HH6、HCD、BLAD、CVM、BS所对应的遗传缺陷位点,可在牛的育种与繁殖领域广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域,具体地说,涉及用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合及试剂盒。
背景技术
近年来,奶牛的高强度选择,使得重要经济性状取得了显著的遗传进展。然而,育种过程中,仅在少数优秀家系中选择种公牛,导致后代近交程度增加,有害突变积累。科学家们在过去20多年里,在荷斯坦牛中先后发现了多种遗传缺陷基因,包括白细胞黏附缺陷(bovine leukocyte adhesion deficiency,BLAD;Shuster et al.1992),脊柱畸形综合征(complex vertebral malformation,CVM;Agerholm et al.2001),短脊柱畸形综合征(Brachyspina,BS;Charlier et al.2012)等。随着基因组检测技术发展,大量基因组数据分析显示,在荷斯坦牛群中存在一些频率较高但是从未纯合的单倍型,一旦纯合就会造成胚胎早期死亡或者初生犊牛死亡,其中包括荷斯坦牛遗传缺陷单倍型HH1、HH2、HH3(Holstein haplotype;VanRaden et al.,2011),HH4(Fritz et al.,2013),HH5(Cooperet al.,2013)、HH6(Fritz et al.,2018)和HCD(haplotype for cholesteroldeficiency;Kipp et al.,2015)。
上述10种遗传缺陷基因呈现隐性遗传模式,即携带者本身表现正常,但如果携带者公牛和携带者母牛交配,其1/4后代为缺陷基因纯合子,表现为胚胎早期死亡或者初生牛犊死亡。因此,为了实现牛群改良,需要及时检测和发现遗传缺陷携带者,逐步淘汰携带者,同时采用科学手段避免携带者之间的交配。
针对致因突变已知的遗传缺陷,基于变异类型特点,可通过多种检测方法在DNA水平检测其携带者。目前已报道多种遗传缺陷位点的检测方法,例如,采用PCR-RFLP方法检测HH4(Fritz et al.,2013;Kumar et al.,2020),利用TaqMan探针和特异性引物进行实时PCR检测CVM和BLAD(Zhang et al.,2012),通过PCR产物电泳的方法检测BS(Charlier etal.,2012;Fang et al.,2013)、HCD(Menzi et al.,2016;Schütz et al.,2016)和HH5(Schütz et al.,2016)。
除上述描述的针对单个致因突变位点的检测方法,KASP和ARMS-PCR方法可实现多位点联合检测方法。虽然两种方法均是基于PCR的基因分型技术,但相较于KASP,ARMS-PCR方法具备效率高、成本低、操作简便、准确性高等特点,更适用于大规模样本的基因分型检测。因此,利用ARMS-PCR方法实现一次反应筛选多个遗传缺陷位点,能够准确、快速鉴定出有害突变,为选育更健康的动物提供了可能。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合及试剂盒。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一套用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合,所述引物组合包括10组,其中,第一组引物如SEQ ID No:1-3所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点;第二组引物如SEQ ID No:4-6所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH2所对应的遗传缺陷基因位点;第三组引物如SEQ ID No:7-9所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点;第四组引物如SEQ IDNo:10-12所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点;第五组引物如SEQ ID No:13-15所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点;第六组引物如SEQ ID No:16-18所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH6所对应的遗传缺陷基因位点;第七组引物如SEQ ID No:19-21所示,用于检测胆固醇缺失症(HCD)所对应的遗传缺陷基因位点;第八组引物如SEQ ID No:22-24所示,用于检测奶牛白细胞粘附缺陷(BLAD)所对应的遗传缺陷基因位点;第九组引物如SEQ ID No:25-27所示,用于检测奶牛脊柱畸形综合征(CVM)所对应的遗传缺陷基因位点;第十组引物如SEQ ID No:28-30所示,用于检测奶牛短脊柱畸形综合征(BS)所对应的遗传缺陷基因位点。
第二方面,本发明提供含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒。
第三方面,本发明提供一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的试剂盒,所述试剂盒包含所述引物组合、dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶和反应缓冲液等。
进一步地,所述引物组合中各组引物的浓度为0.15μM-0.4μM。
优选地,所述引物组合中第六组、第七组和第十组引物的浓度为0.15μM,第二组引物的浓度为0.18μM,第三组引物的浓度为0.2μM,第九组引物的浓度为0.24μM,第一组和第五组引物的浓度为0.3μM,第八组引物的浓度为0.36μM,第四组引物的浓度为0.4μM。
第四方面,本发明提供一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的方法,包括以下步骤:
(1)牛血液基因组DNA提取;
(2)以提取的DNA为模板,利用SEQ ID No:1-30所示引物进行PCR扩增反应;
(3)对扩增产物进行毛细管电泳检测。
配制反应体系:将各反应试剂(2×PCR Mix、引物混合液、无核酸酶纯水)震荡混合后按照体积比(DNA模板除外)配置PCR反应混合液,分装9μL于PCR反应管中,最后向各反应管加入1μL模板,离心后进行下一步。反应体系组成如下:
其中,PCR Mix的主要组成如下:DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+。
引物混合液中各组引物的浓度范围为0.15μM-0.4μM,其中HH6、HCD和BS引物终浓度为0.15μM,HH2引物终浓度为0.18μM,HH3引物终浓度为0.2μM,CVM引物终浓度为0.24μM,HH1和HH5引物终浓度为0.3μM,BLAD引物终浓度为0.36μM,HH4引物终浓度为0.4μM。
PCR反应程序:95℃变性5分钟;95℃变性30秒,58℃退火及延伸1分钟,30个循环;60℃延伸30分钟,最后4℃保存。
毛细管电泳检测方法如下:取1μL扩增产物(原液或稀释后的产物),加入8.8μLHIDI(高度去离子甲酰胺,ABI公司)及0.2μL LIZ500分子量内标(ABI公司),混合静置数分钟,95℃变性3分钟,立即冰浴3分钟,离心后放入ABI3730测序仪中,准备检测。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
(一)本发明通过优化引物序列,在ARMS引物序列中引入错配碱基,提高引物的特异性,使检测结果准确可靠。
(二)反复优化多重PCR体系,通过调整优化各位点PCR引物的浓度,优化PCR扩增程序,使10个位点可以在同一个体系中同时完成PCR扩增,大幅提高了检测效率,操作方法简单,检测耗时短。
(三)优化设计各位点的PCR产物长度,借助不同的荧光和PCR产物长度,使10个位点通过单次毛细管电泳即可区分基因型,实现了高效检测。
(四)检测灵敏度高,低至2ng的DNA模板量可以得到准确分型。
附图说明
图1是本发明试剂盒检测的HH1遗传缺陷位点携带者的结果。
图2是本发明试剂盒检测的HH2遗传缺陷位点携带者的结果。
图3是本发明试剂盒检测的HH3遗传缺陷位点携带者的结果。
图4是本发明试剂盒检测的HH4遗传缺陷位点携带者的结果。
图5是本发明试剂盒检测的HH5遗传缺陷位点携带者的结果。
图6是本发明试剂盒检测的HH6遗传缺陷位点携带者的结果。
图7是本发明试剂盒检测的HCD遗传缺陷位点携带者的结果。
图8是本发明试剂盒检测的BLAD遗传缺陷位点携带者的结果。
图9是本发明试剂盒检测的CVM遗传缺陷位点携带者的结果。
图10是本发明试剂盒检测的BS遗传缺陷位点携带者的结果。
图11是本发明试剂盒中ARMS引物的序列和位置,框中标识为错配碱基。
具体实施方式
本发明提供一种利用荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术检测奶牛10种遗传缺陷基因位点的试剂盒,通过一管式扩增,可同时检测奶牛10种遗传缺陷基因位点。与现有技术相比,检测方法简单快捷、成本低,且准确度高。
本发明还提供一种利用荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术检测奶牛10种遗传缺陷基因分型的方法。
本发明采用如下技术方案:
1、ARMS引物设计
所述的引物采用Primer Premier5和NCBI Blast等软件设计而成,设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(60±2)℃的范围内。设计完成后,用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用,如果有相互作用可产生非特异产物或二聚体的需要重新设计,直至得到符合要求的引物序列。
2、奶牛血液基因组DNA提取
采用天根“血液基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
3、体系研究
选用奶牛血液提取的DNA及参考品作为模板,分别用上述10对引物进行单重扩增,通过毛细管电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到10对引物共同的扩增条件。通过多轮调整,综合体系均衡性、效率以及杂峰情况,体系在58℃时,扩增效果最佳,故选择58℃作为本试剂盒扩增的退火温度。
4、构建复合体系
将10对引物按照同等比例的引物量置于同一管中扩增,再根据复合扩增的毛细管电泳结果来调整各自的浓度,使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致且同一个SNP位点检测结果无杂峰干扰,如果有引物满足不了上述条件,则重新设计引物,最终确定10对ARMS-PCR引物序列。
其中,第一组引物如序列表SEQ ID No:1-3所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点;第二组引物如序列表SEQ ID No:4-6所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH2所对应的遗传缺陷基因位点;第三组引物如序列表SEQ ID No:7-9所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点;第四组引物如序列表SEQ ID No:10-12所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点;第五组引物如序列表SEQ IDNo:13-15所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点;第六组引物如序列表SEQ ID No:16-18所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH6所对应的遗传缺陷基因位点;第七组引物如序列表SEQ ID No:19-21所示,用于检测胆固醇缺失症(HCD)所对应的遗传缺陷基因位点;第八组引物如序列表SEQ ID No:22-24所示,用于检测奶牛白细胞粘附缺陷(BLAD)所对应的遗传缺陷基因位点;第九组引物如序列表SEQ ID No:25-27所示,用于检测奶牛脊柱畸形综合征(CVM)所对应的遗传缺陷基因位点;第十组引物如序列表SEQ ID No:28-30所示,用于检测奶牛短脊柱畸形综合征(BS)所对应的遗传缺陷基因位点。
5、准确性研究
选取试剂盒扩增检测筛选出的突变样本,用金标准Sanger测序法对样本进行扩增测序,与本试剂盒检测结果进行对比,对试剂盒的检测结果进行验证,确认试剂盒的准确性。
6、重复性验证
利用上述试剂盒对2ng/uL样本进行重复扩增测试,使用ABI 3730测序仪对扩增产物进行检测,测试该试剂盒的重复性。通过实验数据分析,3次重复中各个SNP位点的峰型均能清晰检测,且分型一致,故可判断该试剂盒具有良好的重复性。
7、适用机型研究
利用BIO-RAD、ABI 9700PCR扩增仪对上述试剂盒进行扩增测试,利用ABI 3730测序仪对产物进行检测。通过数据分析,BIO-RAD的扩增效率高于ABI 9700。表明相同条件下,体系在BIO-RAD、ABI 9700PCR扩增仪上均能正常扩增,性能不受扩增仪器的影响,扩增产物在ABI 3730上均能清晰检测出,检测结果一致。
8、稳定性研究
将试剂盒-20℃±5℃以下避光保存至冷冻;分别于第3天、第7天、第15天、第30天进行融化和冷冻。通过反复冻融对8个测试样本进行扩增检测,检测结果均一致,第30天冻融后检测结果无异常。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例使用的PCR Mix购自北京启衡星生物科技有限公司。
实施例1利用荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术检测奶牛10种遗传缺陷基因试剂盒扩增奶牛血液提取的基因组DNA样本
1、引物设计
针对每个遗传缺陷基因变异位点的两个等位基因,分别设计两个特异性PCR引物,它们分别特异性地与两个等位基因的模板序列结合,此外设计1个通用引物(表1)。
表1 ARMS-PCR引物序列(5′-3′)
通过优化引物序列,在ARMS引物序列中引入错配碱基(图11),提高引物的特异性,使检测结果准确可靠。
2、采集485头荷斯坦奶牛血液。
3、DNA提取:采用天根“血液基因组DNA提取试剂盒”制备DNA,作为模板。
4、配制反应体系:将各反应试剂(2×PCR Mix、引物混合液、无核酸酶纯水)震荡混合后按照体积比(模板除外)配置PCR反应混合液,分装9μL于PCR反应管中,最后往各反应管加入1μL模板,离心后进行下一步。反应体系组成如下:
其中,PCR Mix的主要组成如下:DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+。
引物混合液中各组引物的浓度范围为0.15μM-0.4μM,各引物终浓度如表2所示。
表2 ARMS-PCR引物混合液中各引物终浓度
5、将PCR反应管置于扩增仪上,并运行如下程序:第1步:95℃变性5分钟,第2步:95℃变性30秒,第3步:58℃退火及延伸1分钟,重复第2~3步30次,第4步:60℃延伸30分钟,最后4℃保存。
PCR程序运行完毕后,PCR产物可立即进行后续检测;或2~8℃保存,24小时内检测;或-20℃保存,三天内检测。尽量避免反复冻融,或冻融次数不超过3次。
6、毛细管电泳检测
取1μL扩增产物(原液或稀释后的产物),加入8.8μL HIDI(高度去离子甲酰胺,ABI公司)及0.2μL LIZ500分子量内标(ABI公司),混合静置数分钟,95℃变性3分钟,立即冰浴3分钟,离心后放入ABI3730测序仪上,准备检测。
7、数据分析
检测完成后运用genemapper6.0对分型结果进行判读。根据产物片段大小设置panel、bin,依据出峰的位置及荧光颜色判断每个位点的分型。
检测结果如表3所示,共检测485头母牛,除遗传缺陷位点HH6之外,其他9个位点均检测出杂合子,即遗传缺陷基因携带者母牛。
表3检测结果
本发明试剂盒检测HH1、HH2、HH3、HH4、HH5、HH6、HCD、BLAD、CVM、BS遗传缺陷位点携带者的结果分别如图1~图10所示。
实施例2荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术和KASP检测奶牛10种遗传缺陷结果的比较
1、采集484头荷斯坦奶牛血液和48头荷斯坦奶牛的毛囊样本。
2、DNA提取:血液、毛囊样本分别采用天根“血液基因组DNA提取试剂盒”、酚/氯仿法提取基因组DNA。
3、按照实施例1中的操作步骤完成荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术对10种遗传缺陷基因位点的检测。
4、按照已有的KASP方法(Zhang et al.2020;Yang et al.2021;Khan etal.2021)对10种遗传缺陷基因位点进行检测。
5、比较ARMS-PCR和KASP两种方法在遗传缺陷基因位点的检出率。
表4显示了两种方法在检测携带遗传缺陷基因位点的样本数目和占比。通过分析数据,两种方法检测结果非常相似,但是存在极少数个体在HH5、HH6、HCD、CVM和BS中的基因分型存在差异。经Sanger测序或琼脂糖凝胶电泳验证后,发现其中仅有一个BS携带者被ARMS-PCR判定为野生型,其他均为KASP基因分型错误,进一步证明ARMS-PCR检测的准确。
表4 ARMS-PCR和KASP在遗传缺陷基因位点检出率的比较
6、比较ARMS-PCR和KASP两种检测方法的准确性和可靠性
首先比对两种方法的检测结果,利用Sanger测序或琼脂糖凝胶对不一致的结果进行验证。将一致和验证后的结果作为参考,计算敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果见表5,ARMS-PCR的特异性和PPV在10个位点中均为100%,而敏感性和NPV除BS位点略低外,均为100%。KASP在HH5、HCD、CVM和BS中表现了较低的敏感性和略低的NPV,在HH5、HH6和HCD表现了略低的特异性和较低的PPV。综上表明,ARMS-PCR相对KASP在检测10种遗传缺陷位点更有效、准确。
表5比较ARMS-PCR和KASP的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.用于检测牛10种遗传缺陷基因的ARMS-PCR引物组合,其特征在于,所述引物组合包括10组,其中,第一组引物如SEQ ID No:1-3所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点;第二组引物如SEQ ID No:4-6所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH2所对应的遗传缺陷基因位点;第三组引物如SEQ ID No:7-9所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点;第四组引物如SEQ IDNo:10-12所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点;第五组引物如SEQ ID No:13-15所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点;第六组引物如SEQ ID No:16-18所示,用于检测奶牛缺陷单倍型HH6所对应的遗传缺陷基因位点;第七组引物如SEQ ID No:19-21所示,用于检测胆固醇缺失症所对应的遗传缺陷基因位点;第八组引物如SEQ ID No:22-24所示,用于检测奶牛白细胞粘附缺陷所对应的遗传缺陷基因位点;第九组引物如SEQ ID No:25-27所示,用于检测奶牛脊柱畸形综合征所对应的遗传缺陷基因位点;第十组引物如SEQ ID No:28-30所示,用于检测奶牛短脊柱畸形综合征所对应的遗传缺陷基因位点。
2.含有权利要求1所述引物组合的检测试剂或试剂盒。
3.一种同时检测牛10种遗传缺陷基因的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1所述引物组合、dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶和反应缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述引物组合中各组引物的浓度为0.15μM-0.4μM。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述引物组合中第六组、第七组和第十组引物的浓度为0.15μM,第二组引物的浓度为0.18μM,第三组引物的浓度为0.2μM,第九组引物的浓度为0.24μM,第一组和第五组引物的浓度为0.3μM,第八组引物的浓度为0.36μM,第四组引物的浓度为0.4μM。
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