CN117205368A - 一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料 - Google Patents
一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117205368A CN117205368A CN202311103498.XA CN202311103498A CN117205368A CN 117205368 A CN117205368 A CN 117205368A CN 202311103498 A CN202311103498 A CN 202311103498A CN 117205368 A CN117205368 A CN 117205368A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- product
- treatment
- soaking
- centrifugal
- centrifuge
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 123
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000011164 ossification Effects 0.000 title abstract description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 170
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims abstract description 100
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 98
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 98
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 77
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims abstract description 67
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 31
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 22
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 60
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 37
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 27
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 15
- BUCIWTBCUUHRHZ-UHFFFAOYSA-K potassium;disodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[K+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O BUCIWTBCUUHRHZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 12
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 12
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 12
- 230000001089 mineralizing effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 6
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 abstract description 19
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 239000012567 medical material Substances 0.000 abstract description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 90
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 26
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 24
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 19
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 13
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 10
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 7
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 7
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 7
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N Cobalt-60 Chemical compound [60Co] GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 239000004902 Softening Agent Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000009991 scouring Methods 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明提供一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料，属于医用材料领域，包括：S1、采用表面活性剂对一定尺寸的离体骨骼浸泡处理，结束后进行清洗；S2、采用脂肪酶和表面活性剂对S1的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗；S3、采用碱性溶液对步骤S2的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗；S4、对S3的产物进行中和、清洗、冷冻干燥和灭菌，即得脱细胞骨材料；上述S1‑S3中至少一个浸泡处理在负压环境中进行，且所述至少一个浸泡处理结束后的清洗包括：对相应产物进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水至少一次。本发明通过引入负压和离心脱水，降低酶解过程和碱液处理的强度，提高脱细胞骨材料的成骨效应。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料。
背景技术
理想的骨移植替代物应该具备以下条件：(1)良好的生物相容性，有利于种子细胞的黏附、增殖、骨传导和骨诱导活性；(2)可生物降解，且降解速度与新骨生成相协调；(3)三维多孔网状结构，能提供一定的支撑强度，为骨传导和血管化提供通道和空间；(4)适宜的表面物理、化学和生物特性，进一步调控细胞黏附、增殖和分化，改善免疫环境，促进成骨。
异种脱细胞骨材料取材于天然骨组织，通过一系列化学试剂制得最终的脱细胞产品，组分主要有羟基磷灰石和胶原蛋白，植入体内后具有生物降解以及诱导组织再生的作用，是一种优异的骨移植替代物。公开号为CN104174066B的中国发明专利公开了一种天然生物骨材料及其制备方法，所描述的生物骨材料就属于异种脱细胞骨材料。
作为脱细胞产品，脱细胞工艺的不断优化是获得生物相容性提升的途径之一，而脱细胞工艺一般是通过酸碱处理、表面活性剂、酶消解等工序来实现，而这些工序在获得脱细胞工艺提升的情况下，往往会破坏产品的耐降解性能，使其不满足理想的骨移植替代物；因此，寻求最佳的工艺条件来不断优化脱细胞工艺，不破坏产品的耐降解性能是异种脱细胞骨材料工艺研究的主要方向。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料，通过在脱细胞工艺中加入负压和离心脱水工序，配合脂肪酶酶解作用和碱液的处理，可降低酶解过程和碱液处理的强度，提高脱细胞骨材料的成骨效应。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，其特征在于，包括：S1、采用表面活性剂对一定尺寸的离体骨骼浸泡处理，结束后进行清洗；S2、采用脂肪酶和表面活性剂对S1的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗；S3、采用碱性溶液对步骤S2的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗；S4、对S3的产物进行中和、清洗、冷冻干燥和灭菌，即得脱细胞骨材料；上述S1-S3中至少一个浸泡处理在负压环境中进行，且所述至少一个浸泡处理结束后的清洗包括：对相应产物进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水至少一次。
进一步的，还包括所述S4清洗后和冷冻干燥前对产物的表面修饰，所述表面修饰包括：S5、在负压环境中，采用酸性溶液对清洗后的产物进行处理，去除产物表面的羟基磷灰石，随后进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水至少一次；S6、对S5的产物先进行冷冻干燥处理，随后进行热交联和低温等离子处理。
进一步的，还包括对表面修饰后的产物的矿化处理，矿化处理结束后离心脱水，结束后重复矿化处理和离心脱水至少一次；对离心脱水后的产物用蒸馏水冲洗。
进一步的，所述负压环境的负压控制在0.1-10pa。
进一步的，所述离心脱水工艺为：转速500-5000r/min，离心时长1-10min。
进一步的，步骤S1中表面活性剂为曲拉通-100，吐温-80或吐温-100中的一种或多种，质量浓度为0.1％-0.4％，处理时间为1-4h，处理温度为10-30℃；步骤S1中采用表面活性剂对一定尺寸的离体骨骼浸泡处理，还加入了弱碱，浓度为0.1-1mol/L。
进一步的，步骤S2中的所述表面活性剂为曲拉通-100，吐温-80或吐温-100中的一种或多种，质量浓度为0.01％-0.4％；所述脂肪酶为碱性脂肪酶，酶活浓度为5 -20U/ml；溶剂为PBS缓冲液，pH为8-10，处理时间为0.5-24h，处理温度为10-30℃。
进一步的，步骤S3中的碱性溶液为：NaOH、Ca(OH)2或KOH中的一种或多种，浓度为0.1-1mol/L，处理温度为4-30℃，处理时间为10-20min。
进一步的，所述中和工艺为：缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液，浓度为0.01-0.5mol/L，pH为4.1-5.9，处理时长为10-60min，处理温度为4-30℃。
另一方面，本发明提供了一种骨材料，采用上述制备方法制成。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果包括：
在脱细胞工艺中采用负压和离心脱水的工序，优化了脱细胞工艺，使得酶解或碱液处理的强度变小，提升了细胞脱出效率的同时降低了脱细胞骨材料的破坏程度，提高了脱细胞骨材料成骨效应。具体的，现有技术中通常为了提高细胞的脱出效率，采用高浓度的酶、碱液和较高的温度对骨材料进行处理，但高浓度的酶、碱液和较高的温度对脱细胞骨材料的破坏程度增加，使得脱细胞骨材料成骨效应差，抗酶降解性能降低。骨组织的细胞成分一般分布在骨陷窝内，而骨陷窝之间主要通过骨小管相连，现有技术很难将核物质去除，因而会采用较高溶度的处理液或较高的温度，从而增加了对脱细胞骨材料的破坏程度。
其次，本发明采用的工艺为：表面活性剂对离体骨骼浸泡处理-脂肪酶和表面活性剂对产物进行处理-碱液对产物进行浸泡处理-中和、清洗、冷冻干燥和灭菌后得到骨材料，上述工艺并非简单的叠加，首先采用表面活性剂对离体骨骼进行处理，可以一定程度上破坏细胞膜，但破坏细胞膜后依然存在生物大分子结构，如蛋白质和脂肪等，其次采用脂肪酶，将脂肪分解为脂肪酸和甘油等物质，使得分子尺寸减少，最终在碱液的作用下，将分解产物排出。通过将酶解和碱液处理创造性结合，一定程度上降低酶解或碱液处理的处理强度，降低对骨材料的破坏。
再次，本发明中在S1-S3中至少一个浸泡处理在负压环境中进行，负压环境可以起到以下两方面作用：(1)骨组织的细胞成分一般分布在骨陷窝内，而骨小管具有狭小，不通透的特点，负压作用的引入，可以迫使溶液进入狭小的骨小管，使得溶液能够充分作用于细胞成分，提升细胞脱除效率；(2)细胞成分的破除是有机质分解的过程，有机质的分解会产生一定量的二氧化碳等气体物质，通过负压作用的引入，可快速抽出产品内部的气体将骨骼中的通道膨胀化，更能提高细胞脱出的效果，从而降低工艺强度，减少对脱细胞骨材料的损坏，提高成骨效应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的间歇式脱水工艺；
图2为本发明实施例和对比例所制备的脱细胞骨材料的切片的HE染色图，a-b：实施例1，c-d：实施例2，e-f：实施例3，g-h：实施例4，i-j：对比例1，k-l：对比例2，m-n：对比例3；
图3为本发明实施例和对比例所制备的脱细胞骨材料的抗酶解性能测试结果；
图4为本发明实施例1-2，6-7所制备的脱细胞骨材料24h和48h产品细胞毒性检测结果；
图5为本发明实施例1-2，6-7所制备的脱细胞骨材料表面电位测试结果；
图6为本发明实施例6-7表面微观结构图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
其总体思路如下：
第一方面，本发明提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法，包括：
S1、采用表面活性剂对一定尺寸的离体骨骼浸泡处理，结束后进行清洗。
选取动物骨骼为原材料，动物骨骼可以是牛，马，猪等哺乳动物的皮质骨或松质骨，也可以是鱼，鸟等飞禽、海洋生物的骨骼，使用刀具切割成规格大小，优选切割成长度为0.1-3cm的，去掉软骨以及多余的肌肉组织。
优选采用新鲜动物的骨骼，从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的猪骨，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存，将冷冻的材料解冻后对其进行充分清洗，然后将骨切成0.1-3cm长，切取松质骨或皮质骨，冲洗去除表面附着物。
步骤S1中表面活性剂为曲拉通-100，吐温-80或吐温-100中的一种或多种，质量浓度为0.1-0.4wt％，处理时间为1-4h，处理温度为10-30℃；步骤S1中采用表面活性剂对一定尺寸的离体骨骼浸泡处理，还加入了弱碱，浓度为0.1-1mol/L。所述的弱碱可以为Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3中的一种或多种溶解后所形成的水溶液，弱碱可膨化胶原，利于表面活性剂溶液交换，提升脂肪去除效率。
S2、采用脂肪酶和表面活性剂对S1的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗。
步骤S2中的所述表面活性剂为曲拉通-100，吐温-80或吐温-100中的一种或多种，质量浓度为0.01-0.4wt％；所述脂肪酶为碱性脂肪酶，酶活浓度为5-20U/ml；溶剂为PBS缓冲液，pH为8-10，处理时间为0.5-24h，处理温度为10-30℃。其中PBS缓冲液通过调整磷酸氢二钾-磷酸二氢钾的质量比得到PH为8-10的PBS缓冲液。通过调整磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的含量来获得不同PH值溶液为本领域公知常识。通过该步骤进一步去除样品中的脂肪和杂蛋白，其中脂肪酶起到酶解和软化的作用，表面活性剂有助于脱除样品中的细胞，而溶剂选用碱性缓冲液，目的是增加脂肪酶的活性。
脂肪酶购自上海丹尼悦生物科技有限公司的DENYPULP PAP-6P。
S3、采用碱性溶液对步骤S2的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗。
步骤S3中的碱性溶液为：NaOH、Ca(OH)2或KOH中的一种或多种，浓度为0.1-1mol/L，处理温度为4-30℃，处理时间为10-20min。本发明中通过碱性溶液破坏并溶出非胶原类蛋白并脱脂，需要指出的是，本发明通过在脱细胞工艺中加入了负压和离心脱水，配合脂肪酶酶解作用和碱液的处理，可以大大降低酶解过程和碱液处理的强度，本发明在0.1-1mol/L，处理时间为10-20min可以有效进行细胞的脱离，相较于现有技术，大大降低了脂肪酶和碱液对骨材料的破坏。
S4、对S3的产物进行中和、清洗、冷冻干燥和灭菌，即得脱细胞骨材料。
所述中和工艺为：缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液，浓度为0.01-0.5mol/L，pH为4.1-5.9，处理时长为10-60min，处理温度为4-30℃。用以快速中和产品的PH，降低碱液对产品的破坏作用。处理结束后用大量的水进行清洗。
所述冷冻干燥处理的工艺为：-20℃下保持8-20h，然后在较高真空下将冰转化成蒸气。灭菌采用钴-60辐射灭菌(辐照剂量为25KGy)。
上述S1-S3中至少一个浸泡处理在负压环境中进行，且所述至少一个浸泡处理结束后的清洗包括：对相应产物进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水至少一次。本发明中重复注水再离心脱水优选2-4次。
优选的，本发明在S1-S3步骤中均在负压环境中浸泡处理，可以最大程度将细胞脱出，且清洗过程中均采用离心脱水，将骨陷窝内的细胞脱出，为了尽量将骨骼中的异物排出，重复注水再离心脱水至少一次，优选1-2次，减少处理时间，提高细胞脱出效率。
可选的，还包括所述S4清洗后和冷冻干燥前对产物的表面修饰，所述表面修饰包括：
S5、在负压环境中，采用酸性溶液对清洗后的产物进行处理，去除产物表面的羟基磷灰石，随后进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水至少一次。
酸性溶液可以为强酸或弱酸，强酸为硝酸，硫酸，盐酸等中的一种或几种，弱酸为醋酸，磷酸等中的一种或几种，浓度为0.01-2mol/L，处理温度为4-30℃，处理时间为0.5-24h。该步骤为处理掉材料表面的羟基磷灰石，彻底暴露出胶原蛋白支架组织。
所述负压环境的负压控制在0.1-10pa，所述离心脱水工艺为：转速500-5000r/min，离心时长1-10min。
S6、对S5的产物先进行冷冻干燥处理，随后进行热交联和低温等离子处理。
步骤S6中冷冻干燥处理工艺为：-20℃下保持8-20h，然后在较高真空下将冰转化成蒸气。
热交联处理温度为60-120℃，处理时长为2-20h；本步骤处理工艺目的为提高脱细胞骨材料的降解性能，增强材料表面的亲水性。
低温等离子处理采用深圳诚峰智造的常压等离子处理机，气体流量为20ml/min，处理时间分别为0.5-10min，处理气氛为氮气，温度为40-70℃。该步骤的目的为改变表面胶原蛋白的电荷，使产品表面富集负电荷，植入体内后有利于成骨细胞的粘附与分化。
可选的，还包括对表面修饰后的产物的矿化处理，矿化处理结束后离心脱水，结束后重复矿化处理和离心脱水至少一次。
矿化处理工艺为：将表面修饰后脱细胞骨材料置于3-10mM CaCl2溶液中，搅拌使其分散均匀，静置0.5～2h后在其中加入K2HPO4，控制Ca/P为1.67，搅拌均匀，用NaOH调节pH为7～9，静置0.5-2h。
对离心脱水后的产物用蒸馏水冲洗。
本发明中，负压环境的负压控制在0.1-10pa，需要指出的是负压需要控制在一定范围内，若负压太低容易对骨骼中的通道造成损坏；若负压太高，则无法保证骨骼中通道的有效膨胀，使得溶液难以进入骨小管或二氧化碳气体难以排出。
所述离心脱水工艺为：转速500-5000r/min，离心时长1-10min，通过离心工艺将核物质从骨陷窝中脱除，离心脱水工艺的参数需要在上述范围内可以实现对核物质的有效脱离。若转速过高或离心时间过长，骨骼中的通道变形，使得通道的开口在离心力的作用下封闭，通道内部的液体无法排出，影响核物质的脱离；若转速过低或离心时间较短，则无法克服液体的表面张力将通道内的液体排出。
为了进一步提高离心脱水对核物质的去除，离心脱水工艺采用间歇式脱水工艺，具体的将离心脱水工艺划分为至少三个阶段，如图1所示，为三阶段脱水，横轴T0为离心时长，取值范围为1-10min，其中T1至T2构成了第一阶段脱水，T3至T4阶段构成了第二阶段脱水，T5至T0构成了第三段脱水，纵轴V为离心机转速，V1为设定转速，其取值范围为500-5000r/min，V0为预设转速阈值，当离心机下电后，离心机在惯性的作用下缓慢减速，当转速低至V0时，则对离心机通电升速至设定转速，其中V0的取值大于0.5V1但不超过500r/min。通过上述设置保证了在离心脱水过程中对核物质的冲刷作用，提高了核物质的去除效率。
为了进一步提高脱细胞效率，本发明中在步骤S1-S3中均采用了负压环境下，且完成浸泡处理后采用离心脱水。
本发明还提供了一种骨材料，采用上述制备方法制成。
本发明中，对脱细胞骨材料产品性能的测定，包括：
(1)脱细胞检测：将制备的样品放入脱钙剂中处理，脱钙后的样品用14％多聚甲醛磷酸缓冲液固定，常规石蜡包埋，切片后进行HE染色，光镜观察脱细胞效果。
(2)产品体外酶降解实验：取制备的样品1g，将其在1mg/ml胶原酶溶液中培养7d，结束后再次冷冻干燥所得样品并称重。
(3)产品细胞毒性的检测：将制备的样品在37℃的DMEM完全培养基(0.1g/ml)中浸泡72小时。用胰蛋白酶消化L929细胞。均匀分散后，将细胞接种在96孔板中，密度为5000个细胞。培养24小时后，用上述提取培养基替换旧培养基，再培养24小时或48小时后，用CCK-8试剂盒法测定细胞活力。
(4)固体表面电位测试：将制备的样品粘贴于测试载样台上，然后放置于固体表面膜电位仪中在pH＝7.2时进行数据测量。
(5)表面形貌观察：将制备的样品表面喷金处理后，进行SEM观察
为了更好的说明本发明的实施方式，下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，包括：
S1、将离体骨骼切割成1cm长，在10℃下，采用0.1mol/L Na2CO3、0.1wt％吐温-80溶液浸泡处理切割后的离体骨骼1h，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在0.1pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速3000r/min，离心时长2min。
离心脱水结束后，重复离心脱水两次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速3000r/min，离心时长2min，结束后再重复一次即可。
S2、将步骤S1的产物放入脂肪酶和曲拉通-100复配溶液中浸泡处理0.5h，溶液中脂肪酶活浓度为5U/ml，曲拉通-100的浓度为0.01wt％，溶液pH为8.0，处理温度为10℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在0.1pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速3000r/min，离心时长2min。
离心脱水结束后，重复离心脱水两次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速3000r/min，离心时长2min，结束后再重复一次即可。
S3、将步骤S2的产物放入碱液中处理，选用NaOH，溶液浓度为0.1mol/L，处理时长为10min，处理温度为4℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在0.1pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速3000r/min，离心时长2min。
离心脱水结束后，重复离心脱水两次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速3000r/min，离心时长2min，结束后再重复一次即可。
S4、随后使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液对步骤S3的产物进行中和处理，其中磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液的pH为5.0，浓度为0.4mol/L，温度为20℃，处理时长60min。处理结束后进行清洗，冷冻干燥处理和灭菌，得到脱细胞骨材料。
实施例2
本实施例提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，包括：
S1、将离体骨骼切割成1cm长，在20℃下，采用0.5mol/L Na2CO3、0.2wt％吐温-80溶液浸泡处理切割后的离体骨骼2h，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在1pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速5000r/min，离心时长1min。
离心脱水结束后，重复离心脱水四次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速5000r/min，离心时长1min，结束后再重复三次即可。
S2、将步骤S1的产物放入脂肪酶和曲拉通-100复配溶液中浸泡处理3h，溶液中脂肪酶活浓度为10U/ml，曲拉通-100的浓度为0.1wt％，溶液pH为9.0，处理温度为20℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在1pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速5000r/min，离心时长1min。
离心脱水结束后，重复离心脱水四次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速5000r/min，离心时长1min，结束后再重复三次即可。
S3、将步骤S2的产物放入碱液中处理，选用NaOH，溶液浓度为0.3mol/L，处理时长为12min，处理温度为15℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在1pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速5000r/min，离心时长1min。
离心脱水结束后，重复离心脱水四次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速5000r/min，离心时长1min，结束后再重复三次即可。
S4、随后使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液对步骤S3的产物进行中和处理，其中磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液的pH为4.1，浓度为0.5mol/L，温度为4℃，处理时长10min。处理结束后进行清洗，冷冻干燥处理和灭菌，得到脱细胞骨材料。
实施例3
本实施例提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，包括：
S1、将离体骨骼切割成0.5cm长，在30℃下，采用0.8mol/L Na2CO3、0.3wt％吐温-80溶液浸泡处理切割后的离体骨骼4h，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在5pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
离心脱水结束后，重复离心脱水两次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长10min，结束后再重复一次即可。
S2、将步骤S1的产物放入脂肪酶和曲拉通-100复配溶液中浸泡处理10h，溶液中脂肪酶活浓度为10U/ml，曲拉通-100的浓度为0.3wt％，溶液pH为9.0，处理温度为30℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在5pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
离心脱水结束后，重复离心脱水两次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长10min，结束后再重复一次即可。
S3、将步骤S2的产物放入碱液中处理，选用NaOH，溶液浓度为0.5mol/L，处理时长为18min，处理温度为30℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在5pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
离心脱水结束后，重复离心脱水四次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长10min，结束后再重复三次即可。
S4、随后使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液对步骤S3的产物进行中和处理，其中磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液的pH为5.9，浓度为0.01mol/L，温度为30℃，处理时长60min。处理结束后进行清洗，冷冻干燥处理和灭菌，得到脱细胞骨材料。
实施例4
本实施例提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，包括：
S1、将离体骨骼切割成3cm长，在30℃下，采用1mol/L Na2CO3、0.4wt％吐温-80溶液浸泡处理切割后的离体骨骼4h，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在10pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
离心脱水结束后，重复离心脱水四次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长10min，结束后再重复三次即可。
S2、将步骤S1的产物放入脂肪酶和曲拉通-100复配溶液中浸泡处理24h，溶液中脂肪酶活浓度为20U/ml，曲拉通-100的浓度为0.4wt％，溶液pH为10，处理温度为30℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在10pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
离心脱水结束后，重复离心脱水四次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长10min，结束后再重复三次即可。
S3、将步骤S2的产物放入碱液中处理，选用NaOH，溶液浓度为1mol/L，处理时长为20min，处理温度为30℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在10pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
离心脱水结束后，重复离心脱水四次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长10min，结束后再重复三次即可。
S4、随后使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液对步骤S3的产物进行中和处理，其中磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液的pH为5.0，浓度为0.4mol/L，温度为20℃，处理时长60min。处理结束后进行清洗，冷冻干燥处理和灭菌，得到脱细胞骨材料。
实施例5
本实施例提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，包括：
S1、将离体骨骼切割成0.1cm长，在30℃下，采用1mol/L Na2CO3、0.4wt％吐温-80溶液浸泡处理切割后的离体骨骼4h，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在10pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长1min，离心脱水工艺采用间歇式脱水工艺，本实施例采用三个阶段，其中V0取值为260r/min,T1至T2构成了第一阶段脱水，时长15s，T3至T4阶段构成了第二阶段脱水，时长15s，T5至T0构成了第三段脱水。
离心脱水结束后，重复离心脱水一次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长1min，采用三个阶段,其中V0取值为260r/min，T1至T2构成了第一阶段脱水，时长15s，T3至T4阶段构成了第二阶段脱水，时长15s，T5至T0构成了第三段脱水。
S2、将步骤S1的产物放入脂肪酶和曲拉通-100复配溶液中浸泡处理24h，溶液中脂肪酶活浓度为20U/ml，曲拉通-100的浓度为0.4wt％，溶液pH为10，处理温度为30℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在0.1pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长1min，离心脱水工艺采用间歇式脱水工艺，本实施例采用三个阶段，其中V0取值为260r/min，T1至T2构成了第一阶段脱水，时长15s，T3至T4阶段构成了第二阶段脱水，时长15s，T5至T0构成了第三段脱水。
离心脱水结束后，重复离心脱水一次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长1min，采用三个阶段，其中V0取值为260r/min，T1至T2构成了第一阶段脱水，时长15s，T3至T4阶段构成了第二阶段脱水，时长15s，T5至T0构成了第三段脱水。
S3、将步骤S2的产物放入碱液中处理，选用NaOH，溶液浓度为1mol/L，处理时长为20min，处理温度为20℃，浸泡处理置于负压环境中，负压控制在0.5pa。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长1min，离心脱水工艺采用间歇式脱水工艺，本实施例采用三个阶段，其中V0取值为260r/min，T1至T2构成了第一阶段脱水，时长15s，T3至T4阶段构成了第二阶段脱水，时长15s，T5至T0构成了第三段脱水。
离心脱水结束后，重复离心脱水一次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长1min，采用三个阶段，其中V0取值为260r/min，T1至T2构成了第一阶段脱水，时长15s，T3至T4阶段构成了第二阶段脱水，时长15s，T5至T0构成了第三段脱水。
S4、随后使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液对步骤S3的产物进行中和处理，其中磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液的pH为5.0，浓度为0.4mol/L，温度为20℃，处理时长60min。处理结束后进行清洗，冷冻干燥处理和灭菌，得到脱细胞骨材料。
实施例6
相较于实施例1，本实施例还包括所述S4清洗后和冷冻干燥前对产物的表面修饰，所述表面修饰包括：
S5、在0.5Pa的负压环境中，将清洗后的产物置于0.1mol/L HCl溶液中进行处理，去除产物表面的羟基磷灰石，处理温度为4℃，处理时间为2h，随后进行离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
离心脱水结束后，重复离心脱水两次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长10min，结束后再重复一次即可。
S6、对S5的产物先进行冷冻干燥处理，随后进行热交联和低温等离子处理。
步骤S6中冷冻干燥处理工艺为：-20℃下保持8h，然后在较高真空下将冰转化成蒸气。热交联处理温度为120℃，处理时长为20h。低温等离子处理气体。流量为20ml/min，处理时间分别为2min，处理气氛为氮气，温度为40℃。
实施例7
相较于实施例6，本实施例还包括对表面修饰后的产物的矿化处理和离心脱水，结束后重复矿化处理和离心脱水至少一次。本实施例包括了四次矿化处理和离心脱水。
第一次矿化处理工艺为：将步骤S6的产物置于5mM CaCl2溶液中，搅拌使其分散均匀，静置1h；后在其中加入K2HPO4，控制Ca/P为1.67，搅拌均匀，用NaOH调节pH为7.4，静置1h。结束后进行离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速500r/min，离心时长10min。
第二次矿化处理工艺为：将第一次矿化处理的产物置于10mM CaCl2溶液中，搅拌使其分散均匀，静置0.5h；后在其中加入K2HPO4，控制Ca/P为1.67，搅拌均匀，用NaOH调节pH为9，静置0.5h。将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速3000r/min，离心时长2min。
第三次矿化处理工艺为：将第二次矿化处理的产物置于3mM CaCl2溶液中，搅拌使其分散均匀，静置2h；后在其中加入K2HPO4，控制Ca/P为1.67，搅拌均匀，用NaOH调节pH为7，静置2h。将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速3000r/min，离心时长2min。
第四次矿化处理工艺为：将第三次矿化处理的产物置于5mM CaCl2溶液中，搅拌使其分散均匀，静置1h；后在其中加入K2HPO4，控制Ca/P为1.67，搅拌均匀，用NaOH调节pH为7.2，静置1h。将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速3000r/min，离心时长2min。
结束后对产物用大量蒸馏水进行清洗。即将产物放置于蒸馏水中，采用超声波对产物进行清洗。
对比例1
本对比例提供了一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，包括：
S1、将离体骨骼切割成1cm长，在10℃下，采用0.1mol/L Na2CO3、0.1wt％吐温-80溶液处理切割后的离体骨骼1h，结束后采用蒸馏水对产物进行清洗。
S2、将步骤S1的产物放入脂肪酶和曲拉通-100复配溶液中浸泡处理0.5h，溶液中脂肪酶活浓度为5U/ml，曲拉通-100的浓度为0.01wt％，溶液pH为8.0，处理温度为10℃，结束后采用蒸馏水对产物进行清洗。
S3、将步骤S2的产物放入碱液中处理，选用NaOH，溶液浓度为0.1mol/L，处理时长为10min，处理温度为4℃，结束后采用蒸馏水对产物进行清洗。
S4、随后使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液对步骤S3的产物进行中和处理，其中磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液的pH为5.0，浓度为0.4mol/L，温度为20℃，处理时长60min。处理结束后进行清洗，冷冻干燥处理和灭菌，得到脱细胞骨材料。
该对比例的清洗方式采用传统的清洗方式，如超声波清洗，蒸馏水冲洗等，该对比例采用超声波清洗的方式。
对比例2
与对比例1不同的是，对比例1中步骤S1、S2，S3浸泡处理完成后，本实施例对相应产物进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水两次。
浸泡处理结束后离心脱水，将产物置于离心机中，通过高速离心的方式去除产品内多余的水分，离心机转速3000r/min，离心时长2min。
离心脱水结束后，重复离心脱水两次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速3000r/min，离心时长2min，结束后再重复一次即可。
对比例3
与对比例1不同的是，对比例1中步骤S1、S2，S3浸泡处理在负压环境中进行。
其中步骤S1、S2和S3的浸泡处理在0.1pa负压下。
对比例4
与实施例5不同的是，对比例4中的离心脱水工艺为：离心机转速500r/min，离心时长1min，不采用间歇式脱水工艺。
离心脱水结束后，重复离心脱水一次：具体的，离心机停止后，关闭离心机出水阀门，向离心机中注入蒸馏水，待其充分吸满水分后，打开离心机，进行高速离心，离心机转速500r/min，离心时长1min。
对脱细胞骨材料产品性能的测定。
(1)脱细胞检测，表1为各实施例脱细胞结果。
表1各实施例脱细胞结果
如图2所示，对比例1，如图2i和2j所示，不使用离心与负压处理，产品分布有大量的核物质残留；而当引入了离心处理后，产品内部的核物质成分大量减少(对比例2，图2k、2l)，引起变化的原因分析是由于骨组织的细胞成分一般分布在骨陷窝内，而骨陷窝之间主要通过骨小管相连，在高速离心的作用下，可促使核物质快速从骨陷窝内脱除，提升细胞脱除效率。在骨组织的脱细胞处理过程中，提升细胞脱除效率与降低产品破坏程度是工艺追求的制衡点，通过离心工艺的引入，可大幅提升细胞脱除效率。
由图2m和2n所示，对比例3在对比例1的基础上引入了负压处理条件，也取得了脱细胞效率的大幅提升，分析原因主要有：①骨组织的细胞成分一般分布在骨陷窝内，而骨小管具有狭小，不通透的特点，负压作用的引入，可以迫使溶液进入狭小的骨小管，使得溶液能够充分作用于细胞成分，提升细胞脱除效率；②细胞成分的破除是有机质分解的过程，有机质的分解会产生一定量的二氧化碳等气体物质，通过负压作用的引入，可快速抽出产品内部的气体物质，提升溶液交换效率，加速有机质分解进程，提高细胞脱除效率。但依然存在少量核物质。
由图2a-2h所示，通过离心作用与负压作用的引入，产品的脱细胞效率达到大幅度提升，由此可证明通过离心与负压作用的结合，可快速促使细胞组织的分解，而高速离心作用能够保证分解后的核物质的快速排出，达成脱细胞效果。
由图2c-2h所示，可以发现各溶液浓度降低或者处理时长变短后，本工艺制备的材料脱细胞依然良好。
基于实施例5和对比例4的脱细胞结果，在相同的脱水时间和转速下，采用间歇式脱水工艺可以在短时间内获得脱细胞骨材料，而采用一次性脱水工艺无法将细胞有效去除。因此，采用间歇式脱水工艺可以大幅提高脱细胞效率。
(2)产品体外酶降解实验
通过测量对酶降解的抗性，进一步评估各组材料间的降解稳定性。根据图3可以看出，与实施例1相比，实施例2表现出相似的失重率，由此可证明即便是引入了离心以及负压处理装置取得脱细胞良好的效果后，材料仍然可以保持很高的耐降解性，保证了产品的力学优越性；而实施例1-5与对比例1-2相比，表现出良好的抗酶降解性，主要原因是在离心和负压处理的引入下，可在保证脱细胞效果的前提下，通过溶液浓度的降低以及处理时长的缩短获得产品耐降解性能的提升。实施例6-7与对比例1-2相比表现出良好的抗酶降解性，原因是一方面在离心和负压处理的引入，可在保证脱细胞效果的前提下，通过溶液浓度的降低以及处理时长的缩短获得产品耐降解性能的提升；另一方面产品的热交联带来了氢键与氨基的络合作用，进而增强了产品的耐降解性能。
(3)产品细胞毒性的检测
将实施例1-2、6-7样品进行产品细胞毒性检测。如图4所示，24小时或48小时后，四组样品的细胞存活率均较高，表明脱细胞骨材料的表面修饰以及体外矿化处理，并未影响产品的相容性，证明四组材料均具有良好的细胞相容性。
(4)固体表面电位测试
将实施例1-2、6-7所制备的脱细胞骨材料样品在同样工艺条件下灭菌后，取各组样品粘贴于测试载样台上，然后放置于固体表面膜电位仪中在pH＝7.2时进行数据测量。通过测试表面电位情况，进一步确认各组间电位情况对比。根据图5可以看出，与实施例1相比，实施例2表现出相似的表面电位，由此可证明引入了离心以及负压处理装置并未改变材料表面官能团情况；而实施例6-7相比于实施例1-2具有更低的负电荷特性，原因是等离子体处理可改变胶原蛋白表面情况。
(5)表面形貌观察
将实施例6-7样品进行表面喷金处理后，进行SEM观察。通过SEM观察，可对矿化后产品的表面形态变化进行观察。根据图6可以看出，与实施例6相比，实施例7表现表面更加粗糙，呈现大小不等的凹凸结构，由此可以得出，体外矿化可改善产品的表面粗糙度，利于细胞的沉积与分化，有效提高产品的生物相容性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种改善脱细胞骨材料成骨效应的制备方法，其特征在于，包括：
S1、采用表面活性剂对一定尺寸的离体骨骼浸泡处理，结束后进行清洗；
S2、采用脂肪酶和表面活性剂对S1的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗；
S3、采用碱性溶液对步骤S2的产物进行浸泡处理，结束后进行清洗；
S4、对S3的产物进行中和、清洗、冷冻干燥和灭菌，即得脱细胞骨材料；
上述S1-S3中至少一个浸泡处理在负压环境中进行，且所述至少一个浸泡处理结束后的清洗包括：对相应产物进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水至少一次。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括所述S4清洗后和冷冻干燥前对产物的表面修饰，所述表面修饰包括：
S5、在负压环境中，采用酸性溶液对清洗后的产物进行处理，去产物表面的羟基磷灰石，随后进行离心脱水，结束后重复注水再离心脱水至少一次；
S6、对S5的产物先进行冷冻干燥处理，随后进行热交联和低温等离子处理。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括对表面修饰后的产物的矿化处理，矿化处理结束后离心脱水，结束后重复矿化处理和离心脱水至少一次；
对离心脱水后的产物用蒸馏水冲洗。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述负压环境的负压控制在0.1-10pa。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述离心脱水工艺为：转速500-5000r/min，离心时长1-10min。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中表面活性剂为曲拉通-100，吐温-80或吐温-100中的一种或多种，质量浓度为0.1-0.4wt％，处理时间为1-4h，处理温度为10-30℃；
步骤S1中采用表面活性剂对一定尺寸的离体骨骼浸泡处理，还加入了弱碱，浓度为0.1-1mol/L。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中的所述表面活性剂为曲拉通-100，吐温-80或吐温-100中的一种或多种，质量浓度为0.01-0.4wt％；
所述脂肪酶为碱性脂肪酶，酶活浓度为5-20U/ml；
溶剂为PBS缓冲液，pH为8-10，处理时间为0.5-24h，处理温度为10-30℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中的碱性溶液为：NaOH、Ca(OH)2或KOH中的一种或多种，浓度为0.1-1mol/L，处理温度为4-30℃，处理时间为10-20min。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述中和工艺为：缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液，浓度为0.01-0.5mol/L，pH为4.1-5.9，处理时长为10-60min，处理温度为4-30℃。
10.一种骨材料，采用权利要求1-9任一所述的制备方法制成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311103498.XA CN117205368A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311103498.XA CN117205368A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117205368A true CN117205368A (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=89034486
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311103498.XA Pending CN117205368A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117205368A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030087428A1 (en) * | 1999-06-07 | 2003-05-08 | Lloyd Wolfinbarger | Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced |
| US20030135284A1 (en) * | 1998-06-30 | 2003-07-17 | Katrina Crouch | Plasticized bone grafts and methods of making and using same |
| US20100003301A1 (en) * | 2006-11-11 | 2010-01-07 | The University Of Tokyo | Bone Defect Filler, Release-Controlled Carrier, And Their Production Methods |
| RU2721604C1 (ru) * | 2019-06-07 | 2020-05-21 | Юрасова Юлия Борисовна | Способ получения остеопластических биоматериалов из костной ткани |
| US20220054271A1 (en) * | 2018-09-16 | 2022-02-24 | Cartiheal (2009) Ltd. | Optimized cage systems promoting bone repair and fusion |
| US20220280693A1 (en) * | 2019-05-08 | 2022-09-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue derived porous matrices and methods for making and using same |
-
2023
- 2023-08-30 CN CN202311103498.XA patent/CN117205368A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030135284A1 (en) * | 1998-06-30 | 2003-07-17 | Katrina Crouch | Plasticized bone grafts and methods of making and using same |
| US20030087428A1 (en) * | 1999-06-07 | 2003-05-08 | Lloyd Wolfinbarger | Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced |
| US20100003301A1 (en) * | 2006-11-11 | 2010-01-07 | The University Of Tokyo | Bone Defect Filler, Release-Controlled Carrier, And Their Production Methods |
| US20220054271A1 (en) * | 2018-09-16 | 2022-02-24 | Cartiheal (2009) Ltd. | Optimized cage systems promoting bone repair and fusion |
| US20220280693A1 (en) * | 2019-05-08 | 2022-09-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue derived porous matrices and methods for making and using same |
| RU2721604C1 (ru) * | 2019-06-07 | 2020-05-21 | Юрасова Юлия Борисовна | Способ получения остеопластических биоматериалов из костной ткани |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2031968B1 (en) | Structurally modified acellular tissue engineering scaffolds and methods of production | |
| US6696074B2 (en) | Processing fetal or neo-natal tissue to produce a scaffold for tissue engineering | |
| AU2013289661B2 (en) | Decellularization method for preparing extracellular matrix support material | |
| CN112618799B (zh) | 鱼皮脱细胞真皮基质及其制备方法和应用 | |
| CN105126170A (zh) | 脱细胞真皮基质及其制备方法 | |
| WO2010111263A1 (en) | Tissue engineering scaffolds and methods of use | |
| CN112755247B (zh) | 一种脱细胞真皮基质及其制备方法 | |
| CN1259980C (zh) | 一种生物医用材料及其制备方法和用途 | |
| CN109675112B (zh) | 一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法 | |
| US7754232B2 (en) | Ultrasonic modification of soft tissue matrices | |
| CN116966344A (zh) | 一种鹿角松质骨脱细胞组织工程支架材料及其制备方法和应用 | |
| CN107412867B (zh) | 一种异种脱细胞真皮基质的制备方法 | |
| CN117205368A (zh) | 一种改善脱细胞骨材料成骨效应制备方法及材料 | |
| CN108066823A (zh) | 一种细胞软骨基质及其制备方法 | |
| CN111420122A (zh) | 一种可诱导骨再生的生物膜及其制备方法 | |
| CN114796615B (zh) | 一种软骨脱细胞基质及其制备方法 | |
| CN113398317B (zh) | 一种止血材料及其制备方法 | |
| CN109498841B (zh) | 一种生物型骨膜修复材料及其制备方法 | |
| Kumaresan et al. | Development of Human Umbilical cord based scaffold for tissue engineering application | |
| CN111588910A (zh) | 一种高强度细胞外基质海绵及其制备方法 | |
| CN114848912A (zh) | 一种脱细胞真皮及其制备方法 | |
| CN112354015B (zh) | 一种异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法 | |
| CN115382021B (zh) | 一种复合人工软骨支架及其制备方法 | |
| CN107952116A (zh) | 一种脱细胞软骨支架及其制备方法 | |
| CA2448436C (en) | Eb matrix production from fetal tissues and its use for tissue repair |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |