CN117187357A - 一种多重荧光pcr检测微卫星不稳定状态试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，属于生物医药技术领域，本申请通过对2个单苷酸Bat‑25、Bat‑26和3个双核苷酸D2S123、D5S346、D17S250的重复位点进行PCR扩增，经毛细管电泳检测后在显示***中分析，并与正常组织作对照，可对林奇综合征进行筛查并鉴定结直肠癌等癌症患者中MSI的状态，可为患者提供预后信息、预测5‑氟尿嘧啶化疗疗效、以及预测实体瘤免疫治疗疗效的参考。本申请提供的试剂盒成本较低，特异性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本申请涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒。
背景技术
微卫星(Microsatellite，MS)序列，是一些短而重复的DNA序列，一般由1～6个核苷酸组成，串联重复排列，常见类型为双碱基CA/GA/GT或单碱基A/T等。MS序列位于基因的重要非编码区，也可以位于基因的编码区，多态性分布于整个基因组，约占基因组3％。微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)是由于在DNA复制时***或缺失突变引起的微卫星(MS)序列长度改变的现象，常由错配修复功能(Mismatch repair，MMR)缺陷引起。MSI现象于1993年在结直肠癌中首次发现，随后在子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤中均有发生MSI现象。MSI是Lynch综合征的特征性分子，约90％以上表现出MSI。如果MSI检测位点选择出现偏差，将直接影响微卫星高度不稳定(MSI-H)患者的检出率，选择错误会大大增加漏诊率，会影响到千万个肿瘤患者的生命。目前国际公认的是「2B3D」panel，如果检测位点尚未经过人群验证，可能会造成假阴性或假阳性的结果。
目前国际上MSI检测试剂盒是基于单核苷酸Panel位点的检测，如promega开发的5个单核苷酸的Panel(Bat-25、Bat-26、NR-21、NR-24、MONO-27)。我国2021年胃癌指南的MSI位点选择非常明确，5个位点的Panel(2B3D的NCI Panel和5个单核苷酸的Panel)，同年，《结直肠癌分子检测高通量测序专家共识》建议采用NCI推荐的2B3D位点。中国人群使用2B3DNCI Panel比单核苷酸Panel多检出近30％的MSI-H肿瘤，因此，2B3D NCI Panel在中国人群中的广泛使用可避免MSI-H肿瘤的漏检。无论是哪种Panel，检测方法均为多重荧光PCR+毛细管电泳。
目前国内只有一款基于2B3D的检测试剂盒，但只有一个PentaC的对照位点，其不足的地方在于一个对照位点不足以判断潜在的样品加错、样品污染。因为在多数情况下，对照位点的产物个数和大小一致(片段大小差异小于0.5nt)；少数情况下，由于样本存在微卫星不稳定，对照位点可能会表现不稳定，因此需要引入至少2个对照位点来核实检测样本是否为同一个体。
发明内容
为了解决以上技术问题，本申请提供了一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，本申请除了2B3D位点和Penta D对照位点外，还包含了性别位点，更加保障了检测的准确性。
本申请的技术方案如下：
一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，包括如下引物：
第一标志物，Bat-25，包含25个连续T的同聚物重复，其基因编号为X06182，s上下游引物为：
Bat-25-F：5’GGGAGTGATTCTCTAAAGAG 3’(SEQ ID No.1)；
Bat-25-R：5’TGACATTCTGCATTTTAACTATGG 3’(SEQ ID No.2)；
第二标志物，Bat-26，包含26个连续A的同聚物重复，其基因编号为U04045，上下游引物为：
Bat-26-F：5’GACTTCAGCCAGTATATGAAAT 3’(SEQ ID No.3)；
Bat-26-R：5’CTTCAGTATATGTCAATGAAAACATT 3’(SEQ ID No.4)；
第三标志物：D2S123，包含15个连续的CA同聚物重复，其基因编号为Z16551.1，上下游引物为：
D2S123-F：5’GCCTTTAACAGTGCTATTCAAC 3’(SEQ ID No.5)；
D2S123-R：5’ACCTATGGGACTGTGCATCTA 3’(SEQ ID No.6)；
第四标志物：D5S346，包含26个连续的CA同聚物重复，其基因编号为M73547.1，上下游引物为：
D5S346-F：5’TGGCATATGAATACCAGGATAG 3’(SEQ ID No.7)；
D5S346-R：5’CTAGTTTTTCAGGGAATTGAGAG 3’(SEQ ID No.8)；
第五标志物：D17S250，包含24个连续的CA同聚物重复，其基因编号为X54562.1，上下游引物为：
D17S250-F：5’GAAAAAAGTAAGCATAAAAAGGAAG3’(SEQ ID No.9)；
D17S250-F：5’GCTGGCCATATATATATTTAAACC3’(SEQ ID No.10)；
对照位点：Penta D，包含11个连续的AAAAG同聚物重复，其基因编号为AP001752.1，上下游引物为：
Penta D-F：5’CCAGGCATGGTGAGGCTG3’(SEQ ID No.11)；
Penta D-R：5’TGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG3’(SEQ ID No.12)；
性别位点：Amel，对照标志物，其基因编号为NG_012040.1，上下游引物为：
Amel-F：5’TGCGTTAACAATGCCCTGGG3’(SEQ ID No.13)；
Amel-R：5’GGAAGCTGGTGGTAGGAACT3’(SEQ ID No.14)。
进一步的，所述标志物、对照位点和性别位点所对应的上下游引物中至少有一条引物添加荧光基团。
进一步的，当各标志物和位点的上游引物在5’端添加荧光基团，其选自FAM蓝色荧光基团、HEX绿色荧光基团或ROX红色荧光基团中的一种。
进一步的，标志物Bat-25、D17S250在上游引物的5’端分别添加FAM荧光基团。
进一步的，标志物Bat-26、Penta D、Amel上游引物的5’端分别添加HEX荧光基团。
进一步的，标志物D5S346、D2S123上游引物的5’端添加ROX荧光基团。
进一步的，各标志物、对照位点和性别位点的上下游引物浓度相同，各引物终浓度为：
Bat-25 0.5μM
Bat-26 0.75μM
D2S123 0.15μM
D5S346 0.25μM
D17S250 0.5μM
PentaD 0.3μM
Amel 0.15μM。
进一步的，其包括如下的组分：
DNA聚合酶20μL/管
10X PCR反应液500μL/管
MSI引物混合液200μL/管
无核酸酶纯水1mL/管
MSI质控品1 20μL/管
MSI质控品2 20μL/管
LIZ500 25μL/管。
对比国内外MSI试剂盒，本申请提供的MSI试剂盒成本较低，特异性好，灵敏度高。本试剂盒可鉴定肿瘤微卫星不稳定MSI的状态，通过对2个单苷酸(Bat-25、Bat-26)和3个双核苷酸(D2S123、D5S346和D17S250)的重复位点进行PCR扩增，经毛细管电泳检测后在显示***中分析，并与正常组织作对照，可鉴定结直肠癌患者中MSI的状态。
附图说明
图1为本试剂盒对阴性标准品的检测结果为MSS；
图2为本试剂盒对阳性标准品的检测结果为MSI-H；
图3为本试剂盒对男性结直肠癌癌旁组织检测结果；
图4为本试剂盒对男性结直肠癌癌组织检测结果为MSS；
图5为本试剂盒对男性结直肠癌癌旁组织检测结果；
图6为本试剂盒对男性结直肠癌癌组织检测结果为MSI-H；
图7为本试剂盒对女性结直肠癌癌旁组织检测结果；
图8为本试剂盒对女性结直肠癌癌组织检测结果为MSS；
图9为本试剂盒对女性结直肠癌癌旁组织检测结果；
图10为本试剂盒对女性结直肠癌癌组织检测结果为MSI-H；
图11为本试剂盒对女性结直肠癌癌旁组织检测结果；
图12为本试剂盒对女性结直肠癌癌组织检测结果为MSL。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的说明。
实施例1
本申请提供的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，采用如下的方法制备而成：
1.引物的设计
本申请根据Gene Bank中查阅2B3D(Bat-25、Bat-26、D2S123、D5S346和D17S250)、对照位点PentaD和1个性别位点Amel所在的基因编号(见表1)。
表1位点基因编号
确定每个微卫星位点的主要重复序列及其上下游100bp左右的碱基序列，针对性的对每一个微卫星位点设计上游引物和下游引物，并在上游引物的5’端标记特定荧光基团，如表1所示。
各引物具体如下：
第一标志物Bat-25的上下游引物
Bat-25-F：5’-GGGAGTGATTCTCTAAAGAG-3’，碱基序列如SEQ ID No.1所示；
Bat-25-R：5’-TGACATTCTGCATTTTAACTATGG-3’，碱基序列如SEQ ID No.2所示；
第二标志物Bat-26的上下游引物
Bat-26-F：5’-GACTTCAGCCAGTATATGAAAT-3’，碱基序列如SEQ ID No.3所示；
Bat-26-R：5’-CTTCAGTATATGTCAATGAAAACATT-3’，碱基序列如SEQ ID No.4所示；
第三标志物D2S123的上下游引物
D2S123-F：5’GCCTTTAACAGTGCTATTCAAC 3’，碱基序列如SEQ ID No.5所示；
D2S123-R：5’ACCTATGGGACTGTGCATCTA 3’，碱基序列如SEQ ID No.6所示；
第四标志物D5S346的上下游引物
D5S346-F：5’TGGCATATGAATACCAGGATAG 3’，碱基序列如SEQ ID No.7所示；
D5S346-R：5’CTAGTTTTTCAGGGAATTGAGAG 3’，碱基序列如SEQ ID No.8所示；
第五标志物D17S250的上下游引物
D17S250-F：5’GAAAAAAGTAAGCATAAAAAGGAAG3’，碱基序列如SEQ ID No.9所示；
D17S250-F：5’GCTGGCCATATATATATTTAAACC3’，碱基序列如SEQ ID No.10所示；
对照位点Penta D的上下游引物
Penta D-F：5’CCAGGCATGGTGAGGCTG3’，碱基序列如SEQ ID No.11所示；
Penta D-R：5’TGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG3’，碱基序列如SEQ ID No.12所示；性别位点Amel的上下游引物
Amel-F：5’TGCGTTAACAATGCCCTGGG3’，碱基序列如SEQ ID No.13所示；
Amel-R：5’GGAAGCTGGTGGTAGGAACT3’碱基序列如SEQ ID No.14所示。
2.试剂盒的制备
1)配制引物混合液，其中上下游引物浓度相同，使各引物终浓度为：
Bat-25 0.5μM
Bat-26 0.75μM
D2S123 0.15μM
D5S346 0.25μM
D17S250 0.5μM
PentaD 0.3μM
Amel 0.15μM。
2)按表2所述组成制备试剂盒
表2试剂盒的组成
判定方法
根据引物的Tm值及理论所扩增出来的片段大小设计PCR程序(见表3)，扩增产物先进行琼脂糖凝胶电泳验证，确定条带大小位置后，再进行毛细管电泳分析，通过特定产物长度可以判定特定位点重复单元重复状态。
如果5个微卫星位点中有2个或2个以上微卫星位点发生变化，称为高频型(High-frequency MSI，MSI-H)，见附图2、5-6、9-10；
只有1个微卫星位点发生变化，称为低频型(low-frequency MSI，MSI-L)，见附图11-12；5个均没有发生改变称为微卫星稳定型(Microsatellite stable，MSS)，见附图1、3-4、7-8。
表3
一种鉴定肿瘤微卫星不稳定的方法，具休包括如下步骤：
(1)基因组DNA的提取：提取癌和癌旁组织的基因组DNA，要求肿瘤组织比例不小于20％，石蜡包埋组织室温保存时间不超过2年，石蜡切片厚度≥4μm，肿瘤组织和癌旁组织数量各≥6张，石蜡包埋的肿瘤组织来源的样本采用高效提取试剂盒提取DNA，并将所有样品浓度稀释至10ng/μl以备使用，如若当天不能使用，暂存于2-8℃48小时，长期保存在-20℃不超过6个月；
(2)多重PCR扩增反应：在20μl PCR管配置反应休系：引物混合液0.4μl，10X PCR反应液2μl，DNA聚合酶7.6μl，模板DNA 1μl，用灭菌去离子水补齐到20μl，用MSI质控品1(MSS)和MSI质控品2(MSI-H)样本作为对照，用无核酸酶纯水作为无模板对照，详细体系配制见表4；
表4.反应休系配制
所述引物混合液含有上述的14条特异性引物，其中，Bat-25的两条引物终浓度为0.5μM、Bat-26的两条引物终浓度为0.75μM、D2S123的两条引物终浓度为0.15μM、D5S346的两条引物终浓度为0.25μM、D17S250的两条引物终浓度为0.5μM、Penta D的两条引物终浓度为0.3μM、Amel的两条引物终浓度为0.15μM；
(3)按待检样本数量、2个MSI质控品和无核酸酶纯水空白对照的总数量配制PCR总的扩增休系，并进行分装，向分装好的PCR反应管依次加入1μl上述样品，将管盖盖好，涡旋使溶液充分混匀；记录编号顺序，微型离心机离心10秒；
(4)按表3运行多重荧光PCR反应程序；
(5)毛细管电泳检测多重PCR产物。
按按表5制备毛细管电泳检测样品，涡旋震荡后离心，放置到95℃金属浴5min，然后冰浴3min。将10ul混合液依次转移到96孔板中，打开3500Dx/3500xl Dx/3130/3130xl基因分析仪进行毛细管电泳检测，详见基因分析仪使用说明书。
表5.毛细管电泳样品制备
| 组分 | 加入量μL |
| 去离子甲酰胺HiDi | 8.7 |
| 分子量内标LIZ500 | 0.3 |
| PCR产物 | 1 |
| 共计 | 10 |
(6)检测数据使用分析软件(Applied Biosystems)进行数据分析，具休操作步骤参考/>分析软件用户使用手册。
(7)阳性判断值(参考范围)
1.本试剂盒根据不稳定的2个单核苷酸和3个双核苷酸重复位点个数判断样本微卫星不稳定状态，是实验结果有效的前提。
2.LIZ-500分子量内标的各片段大小标注正确，其分子量分别是：35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500bp。
3.判定有效峰和产物峰，每组中最高且纵坐标≥100RFU的峰为有效峰，有效峰中峰高高于其临近两侧峰的定为产物峰。
4.以无核酸酶纯水为模板进行扩增，无任何扩增产物。
5.以质控品为模板进行扩增，检测结果如附图1-2，各产物大小符合表6产物片段大小范围。
6.核实同一组肿瘤样本和癌旁样本的2个对照位点峰形是否一致，本试剂盒的2个单苷酸(Bat-25、Bat-26)的重复单元为1bp，3个双核苷酸(D2S123、D5S346和D17S250)的重复单元为2bp。若肿瘤组织有2个及以上产物峰，与对照组织相比有1个及以上产物峰变化超过2nt即判断为不稳定，反之为稳定。
7.根据同一组肿瘤样本和对照样本不稳定单核苷酸重复位点的个数，确定样本微卫星状态。微卫星不稳定判断阈值参数见表7。
表6检测位点产物片段大小
| 检测位点 | 荧光标记 | 产物片段大小(nt) |
| Bat-25 | FAM | 105-115 |
| Bat-26 | HEX | 142-162 |
| D2S123 | ROX | 192-212 |
| D5S346 | ROX | 157-177 |
| D17S250 | FAM | 172-192 |
| PentaD | HEX | 202-232 |
| Amel | HEX | 90-105 |
表7微卫星不稳定判断阈值参数
临床实验
图3-12为三名结直肠癌患者，提取癌和癌旁组织的基因组DNA，以本试剂盒的7个位点检测该患者微卫星不稳定的状态。首先性别基因Amel的位点在同一患者的癌和癌旁的峰形一致，其次对照位点PentaD位点峰形的一致性均证明样本没有被污染。附图3-4的男性结直肠癌患者的2B3D位点均未出现位移，判定为MSS。附图5-6的男性结直肠癌患者的癌组织对比癌旁组织Bat-26和D5S346均出现位移峰，判定为MSI-H；附图7-8女性结直肠癌患者的2B3D位点均未出现位移，判定为MSS。附图9-10的女性结直肠癌患者的癌组织对比癌旁组织Bat-25和D5S346均出现位移峰，判定为MSI-H。附图11-12的女性结直肠癌患者的癌组织对比癌旁组织有一个位点D5S346出现缺失，判定为MSI-L。
本试剂盒首次将微卫星位点(Bat-25、Bat-26、D2S123、D5S346和D17S250)、对照位点Penta D，以及性别鉴定位点Amel在同一PCR休系中进行检测，可同时检测待测的位点是否发生变化，以及识别潜在的样品混杂及污染。
本具休实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，包括如下引物：
第一标志物Bat-25的上下游引物
Bat-25-F：5’- GGGAGTGATTCTCTAAAGAG - 3’，碱基序列如SEQ ID No.1所示；
Bat-25-R：5’- TGACATTCTGCATTTTAACTATGG - 3’ ，碱基序列如SEQ ID No.2所示；
第二标志物Bat-26的上下游引物
Bat-26-F：5’- GACTTCAGCCAGTATATGAAAT -3’ ，碱基序列如SEQ ID No.3所示；
Bat-26-R：5’-CTTCAGTATATGTCAATGAAAACATT - 3’，碱基序列如 SEQ ID No.4所示；
第三标志物D2S123的上下游引物
D2S123-F：5’- GCCTTTAACAGTGCTATTCAAC -3’， 碱基序列如SEQ ID No.5所示；
D2S123-R ：5’- ACCTATGGGACTGTGCATCTA -3’ ，碱基序列如SEQ ID No.6所示；
第四标志物D5S346的上下游引物
D5S346-F：5’- TGGCATATGAATACCAGGATAG -3’，碱基序列如 SEQ ID No.7所示；
D5S346-R：5’- CTAGTTTTTCAGGGAATTGAGAG -3’，碱基序列如SEQ ID No.8所示；
第五标志物D17S250的上下游引物
D17S250-F：5’- GAAAAAAGTAAGCATAAAAAGGAAG-3’，碱基序列如SEQ ID No.9所示；
D17S250-F：5’- GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3’，碱基序列如SEQ ID No.10所示；
对照位点Penta D的上下游引物
Penta D-F：5’-CCAGGCATGGTGAGGCTG-3’ ，碱基序列如SEQ ID No.11所示；
Penta D-R：5’- TGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG-3’ ，碱基序列如SEQ ID No.12所示；
性别位点Amel的上下游引物
Amel-F：5’- TGCGTTAACAATGCCCTGGG-3’ ，碱基序列如SEQ ID No.13所示；
Amel-R：5’- GGAAGCTGGTGGTAGGAACT-3’ 碱基序列如SEQ ID No.14所示。
2.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，所述各标志物和位点所对应的上下游引物中至少有一条引物添加荧光基团。
3.根据权利要求2所述的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，当各标志物和位点的上游引物在5’端添加荧光基团，其选自FAM蓝色荧光基团、HEX绿色荧光基团或ROX红色荧光基团中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，标志物Bat-25、 D17S250在上游引物的5’端分别添加FAM荧光基团。
5.根据权利要求3所述的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，标志物Bat-26、Penta D、Amel上游引物的5’端分别添加HEX荧光基团。
6.根据权利要求3所述的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，标志物D5S346、D2S123上游引物的5’端添加ROX荧光基团。
7.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，各标志物及位点的上下游引物浓度相同，各引物终浓度为：
Bat-250.5 μM
Bat-260.75 μM
D2S1230.15μM
D5S3460.25 μM
D17S2500.5 μM
PentaD0.3 μM
Amel0.15 μM。
8.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，包括如下组成：
DNA聚合酶20μL/管
10X PCR反应液500μL/管
MSI引物混合液200μL/管
无核酸酶纯水1mL/管
MSI质控品120μL/管
MSI质控品220μL/管
LIZ50025μL/管。
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2023
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