CN117165512A - 一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及诱导细胞分化技术领域，具体涉及一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法。本发明先从新生牛犊胰腺组织提取外泌体，加入β‑神经生长因子与维生素B3混合制成胰岛β样细胞诱导剂，然后将间充质干细胞置于胰岛β样细胞诱导剂中进行培养，进而诱导获得胰岛β样细胞。本发明能够价格低廉、环保、高效的获得胰岛β样细胞，且诱导获得的胰岛β样细胞在体内、外对糖浓度高度敏感，可以显著降低糖尿病血糖并显著延长其生存期，且对糖尿病动物模型及正常人体无明显毒副作用，具有重要的潜在临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及诱导细胞分化技术领域，具体涉及一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，世卫组织估计全球有2.3亿多人患有糖尿病，这一数字到2030年可能会增加一倍以上。高血糖是由于胰岛素分泌的绝对不足或相对不足所导致的。长期高血糖会导致各种组织的病变，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。目前，糖尿病的治疗方式主要有控制饮食、口服降糖药和注射胰岛素等，虽然它们都有一定的治疗效果，但都无法治愈。由于糖尿病是胰岛分泌胰岛素相对或绝对不足诱发高血糖而导致的，所以胰岛移植可能是治愈糖尿病的唯一方法，特别是胰岛素绝对不足的I型糖尿病；使用胰岛细胞移植有望替代受损的胰岛细胞，进而根据血糖变化分泌适量的胰岛素，但是人体胰岛细胞移植的供体来源极其困难。
胰岛移植的其中一个来源是从尸体胰腺中分离胰岛，然后将其移植到糖尿病患者的肝内或介入到胰腺中，其优点是可能对血糖反应较敏感，对I型糖尿病具有较好的疗效。但其缺点是来源极其困难，而且因HLA(人类白细胞抗原)不相容、抗原性较强，移植不宜长期存活或需要长期用抗排斥药物。另一来源是应用干细胞技术诱导获得胰岛素分泌细胞，但是有些技术需要导入调控基因同时引入了病毒，技术复杂。目前实验中用得最多的是以细胞因子(如，活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子等)作为诱导剂将间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞，该方法虽然对糖尿病动物模型有一定的降糖作用，但成人一次移植至少需要3-5×107个胰岛β细胞，要制备如此大量的胰岛β样细胞，所需的诱导剂价格极其昂贵。
众所周知，成人骨髓、脂肪内含有丰富的间充质干细胞，且取材方便。因此，如果能够诱导间充质干细胞高效地向胰岛β样细胞分化且可以获得足够成人移植的胰岛细胞量，必将具有重要的临床价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，成功地将成人骨髓、脂肪间充质干细胞体外诱导为胰岛β样细胞，一方面间充质干细胞来源于自体，移植后不宜排斥，可以长期存活，是理想的细胞来源之一；另一方面能够价格低廉、环保、高效的获得足够成人移植的胰岛β样细胞。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，包括以下步骤：
S1、将新生牛犊胰腺切成组织块，于无血清培养基中贴壁培养2-4天，去除组织块后贴壁细胞继续培养3-5天，收集培养基上清，低温离心收集上清，再冷冻超速离心收集沉淀物，经生理盐水悬浮后制得新生牛犊胰腺外泌体；
S2、往新生牛犊胰腺外泌体中加入β-神经生长因子和维生素B3，混合均匀后得到胰岛β样细胞诱导剂；
S3、将间充质干细胞培养到第三代后，加入胰岛β样细胞诱导剂，培养诱导至少3周，即可将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞。
本发明方法能够使100％间充质干细胞分化为胰岛β样细胞，且能够价格低廉、环保、高效的获得足够成人移植的胰岛β样细胞(自体骨髓间充质干细胞具有取材方便，增殖能力强等特点，诱导过程中细胞增殖明显，可以获得任何量细胞)；同时，诱导获得的胰岛β样细胞对糖浓度高度敏感，还可以显著降低糖尿病血糖并显著延长其生存期，且对糖尿病动物模型及正常人体无明显毒副作用，可以完全替代胰岛β细胞。
优选地，所述间充质干细胞的来源包括但不限于脐带、脂肪、骨髓。
优选地，S1中用生理盐水将新生牛犊胰腺外泌体悬浮至浓度为1-10×1012/mL。
优选地，S2中新生牛犊胰腺外泌体在诱导剂中的浓度为1x1010-10x1010，β-神经生长因在诱导剂中的浓度为90-110μg/L，维生素B3在诱导剂中的浓度为9-12μg/mL。
优选地，S3中加入胰岛β样细胞诱导剂后，控制新生牛犊胰腺外泌体的终浓度为1x1010-10x1010/mL，β-神经生长因子的终浓度为90-110μg/L，维生素B3的终浓度为9-12μg/mL。
优选地，S3中间充质干细胞培养到第三代后调整浓度至1-10x104/mL，再加入诱导剂。
优选地，S3中培养诱导的条件为37℃，5％CO2。
优选地，S1中组织块的大小为0.8-1.2mm。
本发明第二方面提供了一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的诱导剂，所述诱导剂包括新生牛犊胰腺外泌体、β-神经生长因子和维生素B3。
优选地，所述新生牛犊胰腺外泌体的制备方法为：将新生牛犊胰腺切成组织块，于无血清培养基中贴壁培养2-4天，去除组织块后贴壁细胞继续培养3-5天，收集培养基上清，低温离心收集上清，再冷冻超速离心收集沉淀物，经生理盐水悬浮后制得。
优选地，所述新生牛犊胰腺外泌体在诱导剂中的浓度为1x1010-10x1010，β-神经生长因在诱导剂中的浓度为90-110μg/L，维生素B3在诱导剂中的浓度为9-12μg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，先从新生牛犊胰腺组织提取外泌体，加入β-神经生长因子与维生素B3混合制成胰岛β样细胞诱导剂，然后将间充质干细胞置于胰岛β样细胞诱导剂中进行培养，进而成功诱导获得胰岛β样细胞。本发明具有以下优点：
(1)本发明从新生牛犊废弃的胰腺提取外泌体，进而添加β-神经生长因子与维生素B3制成诱导剂，价格低廉、环保；
(2)本发明可以将人类间充质干细胞(包括脐带、脂肪、骨髓)100％诱导为功能齐全的胰岛β样细胞，同时还保留了干细胞特征；且间充质干细胞来源于自体，移植后不宜排斥，可以长期存活，是理想的细胞来源之一；
(3)本发明诱导获得的胰岛β样细胞完全可以替代胰岛β细胞；
(4)本发明方法考虑到奶牛饲养场中的胎牛或新生公牛犊绝大多数在出生后立即被处死，胰腺作为废物被扔掉，而胎牛和新生牛犊胰腺中富含完整的诱导胰腺干细胞向胰岛分化的细胞因子网络和外泌体。因此本发明能够充分利用被废弃的胎牛、新生牛胰腺组织，不仅实现了废物利用，还有利于环保；
(5)本发明诱导获得的胰岛β样细胞对糖浓度高度敏感，可以显著降低糖尿病血糖并显著延长其生存期，且对糖尿病动物模型及正常人体无明显毒副作用。
附图说明
图1为分离纯化的新生牛犊胰腺外泌体的电镜图；
图2为培养到第三代的间充质干细胞(普通光学显微镜，梭形细胞)，其中A-D为不同背景拍摄，细胞呈梭形；
图3为间充质干细胞的流式细胞鉴定结构，其中CD34-/HLA-DR-/,CD29+/CD73+/CD90+CD105+为间充质干细胞表面标志物；
图4为间充质干细胞诱导为胰岛细胞团(A表示诱导10天无染色；B表示双硫腙染色的结果)；注：胰岛细胞图经双硫腙染色呈粉红色，说明细胞内含有大量胰岛素；
图5为诱导获得的胰岛β样细胞的流式细胞鉴定结果(胰岛β细胞标志物DNER和DISP2强阳性同时仍然表达间充质干细胞标志CD90、CD105)；
图6为不同细胞在低糖、高糖培养基中培养不同时间后的胰岛素分泌量(mU/L)；其中，LG:低糖培养基；HG：高糖培养基；Control:空白对照(DMEM/F12培养液)；MSC:未诱导的间充质干细胞；Routine:常规方法诱导的β样细胞；Novel：实施例1制备的β样细胞；从左到右分别表示，LG medium(10min)、HG medium(10min)、LG medium(60min)、HG medium(60min)；
图7为糖尿病大鼠模型移植不同细胞后的生存期(周)；其中，Control:未注射任何细胞空白对照组；MSC:移植间充质干细胞；routineβcell:移植常规方法诱导的β细胞；novelβcell:移植实施例1制备的胰岛β细胞；
图8为不同细胞移植到糖尿病大鼠模型后不同时间(周)内的血糖(mM)变化曲线；其中，A线为未注射细胞的对照组；B线为未经诱导的间充质干细胞；粉红色线，常规方法诱导胰岛β样细胞；C线为实施例1制备的胰岛β样细胞；
图9为实施例1制备的胰岛β样细胞注射到正常人体后对血糖(mM)和胰岛素(pM)分泌的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法
1、胰岛β样细胞诱导剂的制备，具体包括以下步骤：
(1)在奶牛养殖场(内蒙古医科大学动物实验室GRP实验室)，无菌收集新生牛犊胰腺，实验室内4℃环境下将胰腺切成1mm的组织块，于无血清培养基(美国Gibco公司的DMEM/F12培养基，培养基量以刚好没过组织块为宜)中贴壁培养3-4天，去掉组织块，贴壁的细胞继续培养4天，收集培养瓶中上清液，低温(4℃)下3000rpm离心15分钟，收集上清，再冷冻(4℃)超高速离心(100000g，60分钟)，弃上清，最后用生理盐水重悬沉淀物，即得牛犊胰腺外泌体。用电镜对从新生牛犊胰腺分离的外泌体进行观察得知，其直径约为30-150nm(图1)。同时，通过纳米流式细胞仪调节所得外泌体颗粒的浓度为1012/mL，-80℃保存备用；
(2)用无血清培养基悬浮新生牛犊胰腺外泌体，按照1×1010-10×1010/mL的浓度进行悬浮，然后添加浓度为100μg/L的β-神经生长因子(购自美国PEPROTECH公司)和浓度为10ug/mL的维生素B3，混合均匀后得到胰岛β细胞诱导剂。
2、将自体骨髓间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞，具体为：
首先，在无菌条件下从股骨干骨髓腔穿刺抽取骨髓组织10mL，注入含枸橼酸钠抗凝剂的离心管中，再加入等量含10％FBS的DMEM/F12培养液，采用全骨髓贴壁法进行培养。37℃、5％CO2培养箱中培养7天后换液得到原代BM-MSC，此后每3天换液1次。待细胞融合至80％-90％后进行传代，用常规间充质干细胞完全培养基(DMEM/F12培养基)将骨髓间充质干细胞培养到第三代，再通过流式细胞鉴定方法对细胞表面标志物进行鉴定(阳性标志物CD90、CD105、CD73，阴性标志物CD44、CD34、HLA-DR)(图2、3)，并用无血清培养基调节细胞浓度为104细胞/mL。
然后往骨髓间充质干细胞中加入步骤1制备的胰岛β样细胞诱导剂，控制胰岛β样细胞诱导剂中新生牛犊胰腺外泌体的终浓度为1×1010-10×1010/mL，β-神经生长因子的终浓度为100μg/L，维生素B3的终浓度为10μg/mL，然后转入T175培养瓶中，于37℃，5％ CO2下培养诱导3周。如图2所示，间充质干细胞为梭形，图3的流式细胞鉴定结果也证实了梭形细胞为间充质干细胞。经诱导培养后，细胞变成圆形并聚集成球型的胰岛细胞团结构(图4A)，进一步经免疫组化染色证实细胞团可以分泌胰岛素，与从胰腺中分离的胰岛细胞团结构完全相同，经双硫腙染色后呈红色(图4B)，且100％间充质干细胞分化为胰岛细胞团。图5的流式细胞鉴定结果也证实了胰岛β样细胞的存在，100％诱导为功能齐全的胰岛β样细胞，同时还保留了干细胞特征。
实施例2胰岛β样细胞诱导方法的应用效果验证
1、各种细胞在低糖(LG medium)和高糖培养基中不同时间胰岛素分泌量
将各种细胞(未诱导的间充质干细胞、常规方法诱导的β样细胞、实施例1制备的β样细胞)等量(1×106个细胞)置于24孔培养板中，每种细胞重复6孔，37℃下利用低糖培养基(LG medium)和高糖培养基(HG medium)培养不同时间(10min、60min)后收集培养基上清液，ELISA定量检测培养基中的胰岛素含量。其中，高糖培养基为Gibco的DMEM培养基，货号为C11995500BT，含4500mg/L Glucose；低糖培养基为天津灏洋的DMEM低糖培养基(产品批号为Lot20190212-0265，型号为TBD11054)，含1000mg/L D-Glucose。常规方法诱导β样细胞采用常规因子诱导法：取传至第3代的人骨髓间充质干细胞，融合至80％-90％时向培养基中加入100μg/Lβ-神经生长因子，10mg/L维生素B3，20μg/L表皮生长因子，诱导14d。然后向培养基中加入10mg/L维生素B3，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，1％胰岛素-转铁蛋白-硒，继续诱导14d，共诱导28d(具体方法参照“山霞,崔晓兰,时瀚等.人脐带间充质干细胞诱导分化不同阶段的胰岛样细胞移植治疗糖尿病[J].中国组织工程研究,2017,21(29):4703-4708.”)。
根据表1中不同细胞在不同糖浓度的培养基中的胰岛素分泌量可知，实施例1制备的胰岛β样细胞对糖浓度的敏感性是常规方法制备的胰岛β样细胞的3倍以上。同时，由图6可以看出，实施例1诱导获得的胰岛β样细胞对糖浓度高度敏感，在低糖培养基中10min后胰岛素的分泌量为38.3+22.1mU/L，在低糖培养基中60min后的分泌量为69.6+32.8mU/L，在高糖培养基中10min后的分泌量为269.4+131.1mU/L，在高糖培养基中60min后的分泌量为933.4+205.3mU/L。与空白对照相比，未经诱导的间充质干细胞对糖浓度无明显反应，利用实施例1方法制备的胰岛β细胞，对高糖的反应灵敏度显著高于常规方法制备的胰岛β样细胞。
表1不同细胞在低糖、高糖培养基中培养不同时间后的胰岛素分泌量(mU/mL)
2、糖尿病大鼠模型注射不同细胞后的生存期研究：
制备糖尿病大鼠模型(Wista大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。造模方法：高糖高脂饲料喂养4周后行链脲佐菌素50mg/kg腹腔注射，连续3次，血糖浓度高于16.7mol/L表示造模成功)40只，大鼠模型的空腹血糖都超过20mM，将其随机分为4组：Control组、MSC组、routineβcell组和novel组。其中，Control组没有注射任何细胞；MSC组尾静脉注射106个/Kg的间充质干细胞；routineβcell组尾静脉注射106个/Kg常规方法制备的胰岛β样细胞；novel组尾静脉注射106个/Kg实施例1制备的胰岛β样细胞。
由图7可知，采用实施例1制备的胰岛β细胞移植治疗糖尿病大鼠模型后，其生存时间超过60周，而其它细胞移植组的糖尿病大鼠在35周内全部死亡，所以本次试验在60周结束。
由图8可知，实施例1制备的胰岛β样细胞的降糖作用维持大约20周左右，以后虽然血糖较高，但生存期长达60周左右，存活的糖尿病大鼠一直保持健康状态，而常规方法制备的胰岛β样细胞只能维持在10周之内，且生存期不到35周。说明本发明制备的胰岛β样细胞除了可以降低血糖外还可以修复高血糖对机体的损伤，显著延长其生存期。
3、胰岛β样细胞对正常人体的安全性
将利用实施例1方法诱导获得的胰岛β细胞按照1×106个/公斤体重的量注射到本发明者李鑫(无糖尿病)的脐周，每天测空腹血糖和胰岛素，连续2周。
如图9所示，曲线A为空腹血糖的测试曲线，曲线B为空腹胰岛素的测试曲线，胰岛β样细胞注射后对正常成人空腹胰岛素分泌和血糖无显著影响。脐周注射后除了局部的轻微疼痛之外，并无其它诸如过敏、发烧等其它严重不良反应，对正常成人无明显的降糖作用，也无显著提高胰岛素分泌水平的作用，说明本发明方法制备的胰岛β样细胞对正常成人无明显的不良反应。
综上可见，本发明利用由新生牛犊胰腺外泌体、β-神经生长因子和维生素B3组成的诱导剂成功地将成人间充质干细胞体外诱导为胰岛β样细胞，且能够价格低廉、环保、高效的获得足够成人移植的胰岛β样细胞；同时，诱导获得的胰岛β样细胞对糖浓度高度敏感，可以完全替代胰岛β细胞，还可以显著降低糖尿病血糖并显著延长其生存期，且对糖尿病动物模型及正常人体无明显毒副作用，具有重要的潜在临床应用价值。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将新生牛犊胰腺切成组织块，于无血清培养基中贴壁培养2-4天，去除组织块后贴壁细胞继续培养3-5天，收集培养基上清，低温离心收集上清，再冷冻超速离心收集沉淀物，经生理盐水悬浮后制得新生牛犊胰腺外泌体；
S2、往新生牛犊胰腺外泌体中加入β-神经生长因子和维生素B3，混合均匀后得到胰岛β样细胞诱导剂；
S3、将间充质干细胞培养到第三代后，加入胰岛β样细胞诱导剂，培养诱导至少3周，即可将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞。
2.根据权利要求1所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的来源包括脐带、脂肪、骨髓。
3.根据权利要求1所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，S1中用生理盐水将新生牛犊胰腺外泌体悬浮至浓度为1-10×1012/mL。
4.根据权利要求1所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，S2中新生牛犊胰腺外泌体在诱导剂中的浓度为1x1010-10x1010，β-神经生长因子在诱导剂中的浓度为90-110μg/L，维生素B3在诱导剂中的浓度为9-12μg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，S3中加入胰岛β样细胞诱导剂后，控制新生牛犊胰腺外泌体的终浓度为1x1010-10x1010/mL，β-神经生长因子的终浓度为90-110μg/L，维生素B3的终浓度为9-12μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，S3中间充质干细胞培养到第三代后调整浓度至1-10x104/mL，再加入诱导剂。
7.根据权利要求1所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，S3中培养诱导的条件为37℃，5％CO2。
8.根据权利要求1所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的方法，其特征在于，S1中组织块的大小为0.8-1.2mm。
9.一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂包括新生牛犊胰腺外泌体、β-神经生长因子和维生素B3。
10.根据权利要求9所述的一种将自体间充质干细胞诱导为胰岛β样细胞的诱导剂，其特征在于，所述新生牛犊胰腺外泌体的制备方法为：将新生牛犊胰腺切成组织块，于无血清培养基中贴壁培养2-4天，去除组织块后贴壁细胞继续培养3-5天，收集培养基上清，低温离心收集上清，再冷冻超速离心收集沉淀物，经生理盐水悬浮后制得。
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