CN117158408A - 载***/胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及***/胚胎玻璃化冷冻技术领域，尤其是涉及载***/胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法。本发明首先通过微流控芯片制备海藻酸钠水凝胶包封***的载细胞微球，再将收集的载细胞微球置于冷冻载体中，然后将载有微球的冷冻载体放入玻璃化溶液进行CPA加载，最后将载有微球的冷冻载体整体投入液氮中进行冷冻保存。本发明应用的微流控芯片可稳定生成具有高分散性和均匀性的载***海藻酸钠微球，微球空包率和***丢失率较低，且***的存活率和后期发育情况均良好；***玻璃化冷冻保存技术，可有效降低保护剂浓度与加载时长，减少对细胞的毒性作用和渗透损伤，提高***的存活率和发育率。

Description

载***/胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法

技术领域

本发明涉及***/胚胎玻璃化冷冻技术领域，尤其是涉及载***/胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法。

背景技术

***/胚胎冷冻保存不仅可用于人类的生育力保存，还可为保护物种资源和拯救濒危物种提供技术保障，在基础研究、遗传保存模型的应用和临床应用中都具有重要作用。***/胚胎冷冻保存技术通常分为慢速冷冻和玻璃化冷冻。慢速冷冻是将经过预处理的***/胚胎进行程序降温，降温过程中冰晶的形成会对细胞造成损伤，导致冻存效果不理想，目前已被玻璃化冷冻技术取代。玻璃化是指冷冻前对细胞进行高浓度的低温保护剂(Cryoprotective agents，CPA)加载，然后以极高的冷却速率将液态快速过渡到玻璃状阶段，此阶段无冰晶产生，减少了胞内冰损伤。

目前临床操作中常用的玻璃化冷冻技术仍是Kuwayama等提出的Cryotop法。尽管***/胚胎冷冻复温后的存活率高达90-97％，但使用的高浓度保护剂会对细胞产生毒性作用，造成***/胚胎的DNA损伤使其发育能力减退。在平衡阶段以及升温过程中细胞内外过快的渗透压变化极易造成细胞的渗透损伤，也可能会导致***萎缩变形，从而影响细胞的冻后存活率与发育率。除此之外，CPA与***/胚胎的接触会引起细胞内钙离子增加，从而诱发皮质颗粒提前发生胞吐作用，导致***透明带***，影响***的穿透和受精。因此，需要新型的***/胚胎玻璃化保存方法，以提高细胞冻后发育能力。

水凝胶一种是由亲水性聚合物通过共价键或分子间作用力相互作用组成的三维网状结构物质，可以吸收大量的水或生物液体，且具有良好的生物相容性。水凝胶中的水可以分为三类：自由水、中间水和结合水，其中结合水在-100℃以下时仍能保持液态和流动性。因水凝胶特殊的结构和化学组成，其具有一定的抑冰能力。基于此种特殊性质，水凝胶作为细胞载体的冷冻保存研究引起了相关领域研究人员的极大兴趣。Sarbani等使用蚕丝、卡拉胶和明胶制备的混合水凝胶封装成骨细胞冷冻保存，复温后的细胞仍保持较高的分化和增殖能力。Paweena等研究了生物可降解的纤维蛋白原水凝胶包裹猫卵巢组织对其抗冷冻能力的影响，冻后卵巢皮质中的卵泡的形态和数量均高于未包封组。这些水凝胶封装细胞或组织进行冷冻保存研究已在低温保存领域逐渐兴起，然而，目前还没有任何报道水凝胶应用于包封***。

海藻酸钠是由褐藻或细菌产生的一种多糖的统称，能在毫摩尔浓度的钙或其他二价阳离子作用下形成稳定的水凝胶。这种胶化特性可在生理条件下包裹住细胞，并使细胞在整个基质中均匀分布。海藻酸钠水凝胶独特的三维网络结构具有限制冰晶生长的作用，使用海藻酸钠水凝胶包封细胞或组织进行低温保存，可以提高细胞或组织复温后的存活率和发育能力。

海藻酸钠水凝胶包封细胞用于低温保存时，要求载细胞微球具有良好的生物相容性、均匀性、耐冻性。在低温保存过程中，较差的均匀度或较为脆弱的水凝胶外壳可能会对CPA渗透载细胞水凝胶微球的过程产生影响，从而导致CPA加载的效率降低；在投入液氮后，不均匀的水凝胶外壳在热应力的作用下，可能会在的薄弱部位形成裂纹，从而对细胞造成破坏，影响细胞的冻存效果。因此，在使用海藻酸钠水凝胶微球包封细胞时，包封材料、包封方法以及外壳形状尺寸等问题还待解决。

目前，海藻酸钠水凝胶微球的制备方法包括手动制备以及电气设备辅助下的自动化制备。其中，手动制备通常是将含有海藻酸钠和细胞的混合溶液液滴置于网状物上倒置在氯化钙溶液上方，然后快速摇动或轻敲，使液滴落入交联浴；或者将含有海藻酸钠和细胞的混合溶液从移液管末端直接滴入交联浴中从而生成微球。虽然这种方法不需要使用任何仪器，但通过网格抖落液滴，或者移液枪吸取含细胞的海藻酸钠溶液的操作对液滴的液体量有一定要求，通常最小液体量需2.5μL，人工操作无法精确控制生成的水凝胶微球形态和大小，导致微球大小过大或者过小，尺寸分布不均匀，这些因素可能会影响细胞封装冻存的效果和冻后存活发育情况。海藻酸钠水凝胶微球的电气自动化制备包括同轴气流法及静电喷雾法等。同轴气流法是使用同轴气流将出口处针尖上的液滴滴入交联浴中，可以产生最小400μm左右的微球，其粒度分布通常会较大。静电喷雾法的液滴生成过程与同轴气流法类似，静电喷雾法可以生产小于200μm，尺寸分布较小的微球。虽然这些自动化方法可以生成粒径较均匀的水凝胶微球，但这些电气设备在使用过程中可能会对细胞造成一定的损害，因此需要研究开发既操作温和，又可以稳定且均匀生成载细胞水凝胶微球的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供载***/胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法。本发明应用的微流控芯片可稳定生成具有高分散性和均匀性的载***海藻酸钠微球，微球空包率和***丢失率较低，且***的存活率和后期发育情况均良好；***玻璃化冷冻保存技术，可有效降低保护剂浓度与加载时长，减少对细胞的毒性作用和渗透损伤，提高***的存活率和发育率。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种载***/胚胎水凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

(S1)将***分散于海藻酸钠溶液中，得到含***的海藻酸钠溶液；

(S2)将步骤(S1)得到的含***的海藻酸钠溶液、矿物油、油乳化剂泵送至微流控芯片中，含***的海藻酸钠溶液与矿物油在微流控芯片的第一个交汇区形成第一液滴，第一液滴与油乳化剂在微流控芯片的第二个交汇区混合，进一步在微流控芯片的S型交联通道中交联形成载***/胚胎水凝胶微球。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S1)中，海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5％～1.5％；优选地，海藻酸钠溶液的质量浓度为1％。

***与海藻酸钠溶液的用量比为30～35颗：800μL。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S2)中，所述微流控芯片由上至下分别为依次连接的设置有出口和入口的顶层、分布层、通道层和底层；

所述通道层为三通道结构，所述三通道结构包括含***的海藻酸钠溶液与矿物油交汇的第一通道、第一液滴与油乳化剂交汇的第二通道，以及，S型交联通道；

所述第一通道分别与含***的海藻酸钠溶液的入口、矿物油的入口以及第二通道的入口相连接；含***的海藻酸钠溶液与矿物油交汇处靠近第二通道的入口处的一侧设置有喉部；

所述第二通道分别与第一通道的出口、油乳化剂的入口和S型交联通道的入口相连接；

所述S型交联通道的出口与顶层的出口相连接。

在本发明的一个实施方式中，所述微流控芯片为PMMA材质制作的流动聚焦型微流控芯片。

微流控***，该***主要由液体泵送区、微球生成区和收集区组成，可通过调整各相溶液的流速，从而控制微球生成的速度和粒径。所述微流控***通过使用微流控芯片技术微囊化细胞来实现载细胞微球的均匀、高通量制备。

在本发明的一个实施方式中，通道层长150mm，宽60mm，S型交联通道总长为10mm×40mm，其中喉部长300μm，宽120μm。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S2)中，油乳化剂为无水氯化钙、矿物油和司盘80的混合物；

含***的海藻酸钠溶液、矿物油、油乳化剂的泵送速度依次为2μL/min、20μL/min～40μL/min、20μL/min～40μL/min。

在本发明的一个实施方式中，矿物油与油乳化剂的泵送速度相同。

本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的载***/胚胎水凝胶微球，所述微球粒径为100～320μm；

优选地，所述微球的粒径为262μm。

本发明的第三个目的是提供一种载***/胚胎水凝胶微球的玻璃化保存方法，包括以下步骤：

(A1)将载***/胚胎水凝胶微球置于冷冻载体中，得到载有微球的冷冻载体；

(A2)步骤(A1)制备得到的载有微球的冷冻载体置于玻璃化溶液中进行CPA加载；

(A3)步骤(A2)结束后，将载有微球的冷冻载体置于液氮中进行冷冻保存；

使用前，对载***/胚胎水凝胶微球进行复温处理。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A1)中，所述冷冻载体为304不锈钢材质的80目金属筛网。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，所述玻璃化溶液为DMSO、EG和海藻糖的混合物。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，玻璃化溶液中，DMSO的质量分数为10％，EG的质量分数为10％，海藻糖的浓度为0.5M。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，CPA加载过程中，时间为4～12min；

优选地，CPA加载过程中，时间为8min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A3)中，复温过程中，将载有微球的冷冻载体置于预热的复温溶液中进行复温，然后转移至稀释释放溶液进行稀释释放；

其中，所述稀释释放溶液为海藻糖与柠檬酸钠的混合溶液，稀释释放过程同步进行。

在本发明的一个实施方式中，复温过程具体如下：

使用前(需要复温***时)，用镊子将金属筛网从液氮中取出，迅速放入预热好的37℃的复温溶液中，1min后再转至稀释释放溶液中稀释释放3min，期间晃动筛网让海藻酸钠微球落入溶液中，外部的海藻酸钠水凝胶被稀释释放溶液中的柠檬酸钠解交联，随后***从海藻酸钠水凝胶内部释放至溶液中；3min后，使用口吸器将释放出的***依次在BS溶液中清洗3次，最后吹入M2溶液恢复中。

本发明首先通过一个微流控***制备海藻酸钠水凝胶包封***的载细胞微球，再将收集的载细胞微球置于冷冻载体中，然后将载有微球的冷冻载体放入玻璃化溶液进行CPA加载，最后将载有微球的冷冻载体整体投入液氮中进行冷冻保存。复温释放程序可以为一步法、两步法以及三步法，优选为先复温再同时进行稀释和释放程序的两步法。

本发明应用的微流控芯片可稳定生成具有高分散性和均匀性的载***海藻酸钠微球，微球空包率和***丢失率较低，且***的存活率和后期发育情况均良好。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的一种海藻酸钠水凝胶包封***的玻璃化保存方法，与传统***玻璃化冷冻技术相比，该方法可有效降低保护剂浓度与加载时长，减少对***的毒性作用和渗透损伤；其次，该方法中使用的海藻酸钠水凝胶不仅生物相容性良好，还具有独特三维网络结构，包封***用于玻璃化冻存时，能够限制冰晶生长，耐冻性好，减少了***的冷冻损伤。在复温时，封装的***也可以很容易地释放。使用本发明提供的方法可提高***的存活率和发育率，是一种新型的较为温和的***玻璃化冷冻技术。

(2)本发明提供的一种海藻酸钠水凝胶包封***的载细胞微球制备方法，采用了具有高度可控性的微流控芯片，基于该芯片搭建的微流控***能够根据需求生成不同尺寸大小的载细胞微球。该微流控***解决了细胞封装中载细胞微球生成效率低、尺寸不均匀等问题，通过调整溶液浓度和流速能够满足对微球的不同尺寸需求。

附图说明

图1为实施例3中微流控芯片各层结构示意图。图中标号：1.顶层；2.分布层；3.通道层；4.底层。

图2为实施例4中芯片喉部结构示意图。其中：(a)无喉部；(b)喉部宽150μm；(c)喉部长300μm，宽120μm。

图3为实施例4中液滴在喉部的生成情况。

图4为实施例5中微流控芯片的三种交联结构。其中：(a)外部交联芯片；(b)双通道内部交联芯片；(c)三通道内部交联芯片；图中标号：5.海藻酸钠入口；6.矿物油入口；7.油乳化剂入口；8.第一交汇口；9.第二交汇口；10.S型交联通道；11.出口；12.海藻酸钠流道；13.矿物油流道；14.油乳化剂流道；15.第一液滴流道；16.混合流道。

图5为实施例5中微球粒径分布图。其中：(a)外部交联芯片微球粒径分布；(b)双通道内部交联芯片微球粒径分布；(c)三通道内部交联芯片微球粒径分布。

图6为实施例7中液滴微流控***制备载***海藻酸钠水凝胶微球示意图。

图7为实施例7中海藻酸钠水凝胶包封释放***的存活与发育情况。

图8为实施例8中不同玻璃化方案***的存活及体外发育情况。其中：字母(a～d)表示Tukey新复极差法中的显著性差异(P<0.05)。

图9为实施例9中不同载***水凝胶微球粒径下***存活及体外发育情况。其中：字母(a～d)表示Tukey新复极差法中的显著性差异(P<0.05)。

图10为实施例10中不同保护剂浓度***存活及体外发育能力情况。其中：字母(a～d)表示Tukey新复极差法中的显著性差异(P<0.05)。

图11为实施例11中不同保护剂加载时长下***存活及体外发育情况。其中：字母(a～d)表示Tukey新复极差法中的显著性差异(P<0.05)。

图12为实施例12中不同复温与释放程序***存活及体外发育情况。其中：字母(a～d)表示Tukey新复极差法中的显著性差异(P<0.05)。

具体实施方式

本发明提供一种载***/胚胎水凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

(S1)将***分散于海藻酸钠溶液中，得到含***的海藻酸钠溶液；

(S2)将步骤(S1)得到的含***的海藻酸钠溶液、矿物油、油乳化剂泵送至微流控芯片中，含***的海藻酸钠溶液与矿物油在微流控芯片的第一个交汇区形成第一液滴，第一液滴与油乳化剂在微流控芯片的第二个交汇区混合，进一步在微流控芯片的S型交联通道中交联形成载***/胚胎水凝胶微球。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S1)中，海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5％～1.5％；优选地，海藻酸钠溶液的质量浓度为1％。

***与海藻酸钠溶液的用量比为30～35颗：800μL。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S2)中，所述微流控芯片由上至下分别为依次连接的设置有出口和入口的顶层、分布层、通道层和底层；

所述通道层为三通道结构，所述三通道结构包括含***的海藻酸钠溶液与矿物油交汇的第一通道、第一液滴与油乳化剂交汇的第二通道，以及，S型交联通道；

所述第一通道分别与含***的海藻酸钠溶液的入口、矿物油的入口以及第二通道的入口相连接；含***的海藻酸钠溶液与矿物油交汇处靠近第二通道的入口处的一侧设置有喉部；

所述第二通道分别与第一通道的出口、油乳化剂的入口和S型交联通道的入口相连接；

所述S型交联通道的出口与顶层的出口相连接。

在本发明的一个实施方式中，所述微流控芯片为PMMA材质制作的流动聚焦型微流控芯片。

微流控***，该***主要由液体泵送区、微球生成区和收集区组成，可通过调整各相溶液的流速，从而控制微球生成的速度和粒径。所述微流控***通过使用微流控芯片技术微囊化细胞来实现载细胞微球的均匀、高通量制备。

在本发明的一个实施方式中，通道层长150mm，宽60mm，S型交联通道总长为10mm×40mm，其中喉部长300μm，宽120μm。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S2)中，油乳化剂为无水氯化钙、矿物油和司盘80的混合物；

含***的海藻酸钠溶液、矿物油、油乳化剂的泵送速度依次为2μL/min、20μL/min～40μL/min、20μL/min～40μL/min。

在本发明的一个实施方式中，矿物油与油乳化剂的泵送速度相同。

本发明提供一种通过上述方法制备得到的载***/胚胎水凝胶微球，所述微球粒径为100～320μm；

优选地，所述微球的粒径为262μm。

本发明提供一种载***/胚胎水凝胶微球的玻璃化保存方法，包括以下步骤：

(A1)将载***/胚胎水凝胶微球置于冷冻载体中，得到载有微球的冷冻载体；

(A2)步骤(A1)制备得到的载有微球的冷冻载体置于玻璃化溶液中进行CPA加载；

(A3)步骤(A2)结束后，将载有微球的冷冻载体置于液氮中进行冷冻保存；

使用前，对载***/胚胎水凝胶微球进行复温处理。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A1)中，所述冷冻载体为304不锈钢材质的80目金属筛网。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，所述玻璃化溶液为DMSO、EG和海藻糖的混合物。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，玻璃化溶液中，DMSO的质量分数为10％，EG的质量分数为10％，海藻糖的浓度为0.5M。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，CPA加载过程中，时间为4～12min；

优选地，CPA加载过程中，时间为8min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A3)中，复温过程中，将载有微球的冷冻载体置于预热的复温溶液中进行复温，然后转移至稀释释放溶液进行稀释释放；

其中，所述稀释释放溶液为海藻糖与柠檬酸钠的混合溶液，稀释释放过程同步进行。

在本发明的一个实施方式中，复温过程具体如下：

使用前(需要复温***时)，用镊子将金属筛网从液氮中取出，迅速放入预热好的37℃的复温溶液中，1min后再转至稀释释放溶液中稀释释放3min，期间晃动筛网让海藻酸钠微球落入溶液中，外部的海藻酸钠水凝胶被稀释释放溶液中的柠檬酸钠解交联，随后***从海藻酸钠水凝胶内部释放至溶液中；3min后，使用口吸器将释放出的***依次在BS溶液中清洗3次，最后吹入M2溶液恢复中。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂，所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法；若无特殊芯片，微流控芯片的细节结构与现有技术微流控芯片相同。

实施例1

本实施例提供主要试剂及其配制方法。

(1)基础液(BS)：吸取40mL TCM 199于50mL离心管中，再加入10mL胎牛血清，混合均匀配置为含20％胎牛血清的基础液；

(2)海藻酸钠溶液：用天平称取50mg、100mg、150mg、200mg，分别置于15mL离心管中，在每支离心管中加入100mg D-甘露醇，再加入BS溶液定容至10mL，冷藏静置一夜使海藻酸钠充分溶解。最终配制成0.5％、1％、1.5％、2％四种浓度的海藻酸钠溶液；

(3)捡卵操作液：取适量M2培养液，加入1％青链霉素，配置为含100IU/mL双抗的捡卵操作液；

(4)***体外培养液：取适量KSOM培养液，加入1％青链霉素，配置为含100IU/mL双抗的***体外培养液；

(5)氯化钙溶液：称取166.47mg无水氯化钙粉末于离心管中，加入10mL BS使其充分溶解，最终浓度为0.15M；该溶液用于海藻酸钠的交联；

(6)柠檬酸钠溶液：称取220.56mg柠檬酸三钠晶体于离心管中，加入10mL BS配置为0.075M柠檬酸钠溶液。该溶液用于海藻酸钠水凝胶的解交联；

(7)油乳化剂：称取无水氯化钙2.1g于15mL离心管中，加入PBS 3mL震荡摇匀，定容为0.7g/mL的氯化钙溶液。吸取9mL矿物油和0.6mL司盘80放入氯化钙溶液中，来回上下颠倒直至油水混合呈乳液状。再将离心管放入超声波清洗机中，超声波模式下5min。最终配置成含0.175g/mL氯化钙的油乳化剂；

(8)油相液：量取10mL矿物油，0.2mL司盘80，常温下混合均匀；

(9)细胞松弛素B溶液：取1mg细胞松弛素B，加入1mL M2培养液，充分溶解后取20μL于离心管中，再加入5mL M2培养液中，混合均匀配置成5μg/mL细胞松弛素B溶液；

(10)氯化锶溶液：称取266.6mg氯化锶，加入1mL M2，充分溶解后制成1μmol/μL氯化锶原液；

(11)激活溶液：取10μL氯化锶原液，1mL M2和5μL CB原液，混匀备用。最终激活溶液中细胞松弛素B浓度为5μg/mL，氯化锶浓度为10μg/mL；

(12)低温保护剂：称取海藻糖1.7115g倒入离心管中，加入EG 1.5mL，DMSO1.5 mL，再加入BS定容至10mL。最终保护剂浓度为15％DMSO+15％EG+0.5M海藻糖；

(13)平衡溶液(ES)：DMSO+EG+BS；ES中，DMSO质量浓度为7.5％，EG质量浓度为7.5％；

(14)玻璃化溶液1(VS1)：DMSO+EG+海藻糖+BS；VS1中，DMSO质量浓度为7.5％，EG质量浓度为7.5％，海藻糖的浓度为1M；

(15)玻璃化溶液2(VS2)：DMSO+EG+海藻糖+BS；VS2中，DMSO质量浓度为8.75％，EG质量浓度为8.75％，海藻糖的浓度为0.5M；

(16)玻璃化溶液3(VS3)：DMSO+EG+海藻糖+BS；VS3中，DMSO质量浓度为10％，EG质量浓度为10％，海藻糖的浓度为0.5M；

(17)玻璃化溶液4(VS4)：DMSO+EG+海藻糖+BS；VS4中，DMSO质量浓度为12.5％，EG质量浓度为12.5％，海藻糖的浓度为0.5M；

(18)玻璃化溶液5(VS5)：DMSO+EG+海藻糖+BS；VS5中，DMSO质量浓度为15％，EG质量浓度为15％，海藻糖的浓度为0.5M；

(19)复温溶液(TS)：海藻糖+BS；TS中，海藻糖的浓度为1M；

(20)稀释溶液(DS)：海藻糖+BS；DS中，海藻糖的浓度为0.5M；

(21)稀释释放溶液：海藻糖+柠檬酸钠+BS；稀释释放溶液中，海藻糖的浓度为0.5M，柠檬酸钠的浓度为0.075M；

(22)复温释放溶液：海藻糖+柠檬酸钠+BS；复温释放溶液，海藻糖的浓度为0.75M，柠檬酸钠的浓度为0.075M。

实施例2

本实施例提供***的获取和处理方法。

(1)选取7周龄ICR系SPF级小鼠，待其熟悉适应环境一周后，腹腔注射孕马血清***(PMSG)0.2mL，48小时后再腹腔注射人绒毛膜***(HCG)0.2mL以刺激小鼠卵巢，诱导卵泡大量成熟并***；

(2)在注射HCG后的15.5小时内用颈椎脱臼法快速处死小鼠，用75％的乙醇消毒腹部皮肤，再用剪刀剪开皮肤露出腹膜，用另一把无菌眼科剪剪开腹膜，内脏上翻，暴露出子宫、输卵管和卵巢。用镊子夹住子宫上部将其提起，剔去多余的脂肪垫，剪断输卵管与子宫之间的联结，取出输卵管与卵巢结合体；

(3)将输卵管放入PBS中涮洗3次，再移入提前预热好的M2捡卵液。在体视镜视野下，找到输卵管与卵巢连接处的膨大处，并用1mL注射器划破输卵管壶腹部，可见***与卵丘细胞复合物(COC)流出；

(4)使用口吸器将COC转移到50μL的透明质酸酶液滴中，并用10μL移液枪反复吹打4min。待颗粒细胞松散后立即转移至M2培养液中，避免在消化酶中时间过长对***造成伤害。再将裸卵依次在M2培养液液滴中清洗4次，彻底去除透明质酸酶；

(5)在35mm培养皿中制作两个50mL的M2液滴，挑选形态完整、胞质均匀、极体表面光滑的***放入M2培养液微滴中，每滴微滴中的***数量控制在10～20枚。最后用2mL胚胎用矿物油封住，放入培养箱中备用。

实施例3

本实施例提供微流控芯片的设计与制作。

制备海藻酸钠水凝胶微球的微流控芯片主体由顶层1、分布层2、通道层3和底层4四部分组成。各层结构与顺序如图1所示。顶层1设置有各相溶液入口和出口，溶液从入口处泵入，进入分布层2均匀分散，再在通道层3内交汇形成液滴，最后再由顶层1的出口处流出。其中，顶层1与底层4PMMA板厚度为0.5mm，分布层2与通道层3厚度为0.3mm。PMMA微流控芯片的制作流程如下：

(1)微流控芯片各层结构绘制

根据所需功能设计微流控芯片的整体结构，在Auto CAD 2018中分别绘制各层芯片的几何图形。

(2)激光雕刻机加工

将双面胶贴在通道层3与连续相分布层2的板材上，放入激光雕刻机操作仓。上传CAD图纸到激光雕刻机的配套软件中，设置打印参数，将CAD图形雕刻至PMMA板材上，依次完成芯片各层的制作。

(3)各层芯片清洗

将雕刻好后的各层芯片放入盛有去离子水的超声波清洗机中，在超声波模式下清洗20min，用以去除芯片上残留的灰尘与粉末。清洗好后，擦干各层芯片，自然温度下让其晾干。

(4)芯片贴合与键合

清洗干燥好后的各层芯片层层贴合，确保芯片各个结构位置对应。将贴合好的芯片放入真空贴合机中设置真空键合时间为4min，键合好的芯片再放入除泡仓中设置除泡时长为10min。

(5)部件连接

在微流控芯片的溶液进出口处贴上防撞贴，根据实验需求，选取适合尺寸的钢针***各出入口，滴加UV胶，光照固化2h。实验时，芯片通过硅胶管与其他仪器和设备连接，构成完整的微流控芯片***。

实施例4

微流控芯片不同喉部结构对液滴生成的影响

为评估两相流交叉处结构即芯片喉部对液滴生成的影响，本发明设计了三种不同类型和尺寸的喉部，喉部结构示意图如图2所示，部分参数设计如下：(a)无喉部；(b)较宽喉部结构，宽150μm；(c)喉部长300μm，宽120μm。设置分散相1％海藻酸钠溶液流速为2μL/min，连续相矿物油的流速为20μL/min。通过显微镜观察微流控芯片喉部的液滴生成情况。

结果参看图3，无喉部结构的微流控芯片通道内液滴难以形成；150μm的较宽喉部结构微流控芯片中，液滴仍然无法稳定地在喉部产生，分散相溶液持续拖尾，形成的液滴粒径大小不一，尺寸分布不均；长300μm，宽120μm的喉部结构微流控芯片中，液滴可在喉部区域稳定且均匀的产生。

实施例5

微流控芯片不同交联结构对海藻酸钠水凝胶微球生成效果的影响

本发明设计了如图4所示的3种结构的微流控芯片，其中(a)如图4a所示，为外部交联芯片，芯片长80mm，宽40mm；含***的海藻酸钠溶液从海藻酸钠入口5处进入芯片，通过海藻酸钠流道12进入交汇处；矿物油从矿物油入口6进入芯片，通过矿物油流道13进入第一交汇口8，两者交汇于喉部处，剪切生成液滴后从出口11流出顺着硅胶管流入氯化钙溶液中交联生成载***/胚胎水凝胶微球；(b)如图4b所示，为双通道内部交联芯片，芯片长125mm，宽50mm，右侧S型通道为液滴交联区域，总长度为12×30mm。含***的海藻酸钠溶液和油乳化剂分别从海藻酸钠入口5和油乳化剂入口7泵入，分别通过海藻酸钠流道12和油乳化剂流道14进入芯片通道内，并在第一交汇口8的喉部交汇，剪切生成球状液滴的同时进入S型交联通道10，海藻酸钠接触油乳化剂中的氯化钙直接交联成水凝胶微球，最终交联完成的载***/胚胎水凝胶微球从出口11流入盛有PBS的收集皿中；(c)如图4c所示，为三通道内部交联芯片(也即通道层为三通道结构，三通道结构包括含***的海藻酸钠溶液与矿物油交汇的第一通道(海藻酸钠流道12、矿物油流道13、第一次交汇口8)、第一液滴与油乳化剂交汇的第二通道(第一液滴流道15、油乳化剂流道14和第二交汇口9)，以及，S型交联通道10；第一通道分别与海藻酸钠溶液入口5、矿物油入口6以及第二通道的入口相连接；第一通道的出口靠近海藻酸钠溶液入口5处的一侧设置有喉部；第二通道分别与第一通道的出口、油乳化剂入口7和S型交联通道10的入口相连接；S型交联通道10的出口与底层相连接)，芯片长150mm，宽60mm，S型交联通道10总长为10×40mm。含***的海藻酸钠溶液通过海藻酸钠入口5进入，矿物油通过矿物油入口6进入，两者分别通过海藻酸钠流道12和矿物油流道13交汇于第一次交汇口8，剪切生成第一液滴；油乳化剂通过油乳化剂入口7进入，沿油乳化剂流道14进入，并与沿第一液滴流道15流动的第一液滴交汇于第二交汇口9，然后在右方S型交联通道10内，第一液滴与油乳化剂接触后进一步通过混合流道16进入S型交联通道10交联成载***/胚胎水凝胶微球，微球通过出口11处流出到盛有PBS的收集皿中进行收集。

实验设置分散相为1％海藻酸钠溶液，流速为2μL/min。矿物油相与油乳化剂相流速均为20μL/min。分别收集3种微流控芯片生成的海藻酸钠水凝胶微球，倒置显微镜下观察微球形态并拍照记录，最后使用Image J中的测量工具对各组微球进行粒径测量。

结果参看图5，不同的交联方式以及芯片结构会对微球的粒径大小以及均匀性情况造成较大影响。外部交联微流控芯片生成的微球平均粒径为208.29μm，变异系数高达29.73％，表明外部交联芯片生成的海藻酸钠水凝胶微球粒径分布范围广，均匀性差；双通道与三通道内部交联微流控芯片生成的微球粒径更为均匀，两中芯片生成的微球平均粒径分别为263.74μm和262.76μm，这表明内部交联芯片更有利于维持微球粒径的均匀性。

综合考虑微流控芯片几何结构与通道参数对液滴与微球生成效果的影响，以下实施例中优选三通道微流控芯片。

实施例6

微流控芯片溶液浓度和流速对微球生成的影响

使用三通道微流控芯片，设置连续相为海藻酸钠溶液，浓度分别为0.5％，1％，1.5％，溶液流速固定为2μL/min。油相为添加0.1％司盘80的矿物油，流速分别设置为20μL/min、30μL/min、40μL/min。油乳化剂相流速与油相相同。3组不同浓度海藻酸钠均进行3种不同流速比实验，共9组，分析微球生成效果和粒径尺寸，确定最适生成参数。

表1不同流速与浓度下微球的平均粒径及变异系数对比

如表1所示在流速比为1：10时，0.5％海藻酸钠溶液生成的微球粒径最大，1％海藻酸钠组的变异系数最低。随着海藻酸钠溶液浓度的增大，微球平均粒径逐渐减小。总体而言，1％组在3种流速比下均可稳定产生均匀性较高的微球，并且可以通过控制连续相的流速有效控制微球的尺寸。

因此，选定海藻酸钠溶液浓度为1％，分散相流速为2μL/min为最适参数,以下实施例均以此为优选参数。

实施例7

微流控芯片制备载***海藻酸钠水凝胶微球的效果评估

(1)微流控***的搭建

微流控芯片制备载***海藻酸钠水凝胶微球的装置示意图如图6所示，该***主要由液体泵送区、微球生成区和收集区组成，可通过调整各相溶液的流速，从而控制微球生成的速度和粒径。

(2)微流控芯片制备载***海藻酸钠水凝胶微球

使用口吸器将30～35颗***吹至1％海藻酸钠溶液中，待***充分分散后，用1mL注射器吸取含***的海藻酸钠溶液，将注射器固定于注射泵上，通过硅胶管与微流控芯片的分散相入口连接，设置流速为2μL/min。用5mL注射器分别吸取矿物油与油乳化剂，固定连接好后分别设置流速为20μL/min、30μL/min、40μL/min。开启注射泵开关，待各相溶液流速稳定后，可在芯片喉部观察到均匀形成的液滴。液滴通过矿物油与油乳化剂的交汇处继续流向S型交联区，在此处交联成海藻酸钠微球。泵送完成后，可在与芯片出口连接的盛有PBS溶液的收集皿中收集海藻酸钠微球。

(3)海藻酸钠水凝胶包封释放***的存活与发育情况测定

从收集皿中收集微球，再添加柠檬酸钠溶液对海藻酸钠水凝胶进行解交联，释放***，并将***在M2溶液中清洗3次。观察包封释放后的***的存活情况，并对存活的***及新鲜组***进行孤雌激活，具体步骤如下：

1)先在培养皿中制作两个50μL的KSOM液滴，沿培养皿边缘加入2mL胚胎用矿物油封层，放入培养箱中平衡过夜。再取新培养皿，制作50μL激活液液滴，胚胎用矿物油覆盖后放入培养箱中平衡3.5h。

2)待平衡好后将***移入激活液液滴中，再放进培养箱中激活培养4h。4h后，将***取出，并在M2溶液中洗涤3次。清洗后的***置于KSOM液滴中放入培养箱继续培养。

3)6h后观察***激活情况，以极体排出为激活成果标志。此后每24h观察一次***情况；在48h后观察***卵裂情况，挑选卵裂细胞换液继续培养；96h后观察细胞发育情况，并计算囊胚率。

存活率、卵裂率、囊胚率的计算方法如下：

存活率(％)＝存活数/***总数×100％

卵裂率(％)＝卵裂数/存活数×100％

囊胚率(％)＝囊胚数/卵裂数×100％

表2不同流速比下海藻酸钠水凝胶微球的空包率与***丢失率情况对比

如表2和图7所示，结果表明，高流速比情况下，微球空包率更高，包封效果不佳，同时会出现较高的***丢失率，随着流速比的降低，微球的空包率和***丢失率随之降低；使用微流控芯片包封***，再将***释放，对***的存活率和后续发育能力与新鲜组相比无显著性差异。

实施例8

海藻酸钠水凝胶包封***玻璃化冻存效果评估

分别采用Cryotop法、低浓度CPA-水凝胶包封法以及低浓度CPA-Cryotop法进行对比验证。具体步骤如下：

(1)Cryotop组：冷冻过程，每组取10颗***，使用口吸器将***从培养液转移至400μL的ES液滴中平衡15min，再移至400μL VS5中浸润1min。CPA加载完成后，迅速将***吹至Cryotop载杆上，每根载杆上放置2～3颗***。随后将载有***的Cryotop载杆直接放入液氮中，待液氮稳定后套上塑料外壳，整体投入液氮中冷冻1h。复温过程，冷冻1h后，将Cryotop载体从液氮中取出，摘下塑料外壳，并将载杆前端迅速浸入提前预热好的37℃的800μL TS中，轻轻抖动使***从载杆上脱离到溶液中，1min后，再把***转移到800μL的DS中稀释5min。最后将***在BS中清洗3次后移至M2溶液中。

(2)低浓度CPA-海藻酸钠水凝胶包封组：包封过程，每组取30～35颗***与800μL 1％海藻酸钠溶液混合并使其均匀分布于溶液中。使用1mL注射器吸取海藻酸钠与***的混合溶液，将该注射器、含油乳化剂的注射器和含矿物油的注射器分别固定在注射泵上，设置流速分别为2μL/min、30μL/min、30μL/min。通过内径为0.5mm的硅胶管连接注射器与微流控芯片，开启泵送，整体时长约为5～8min。从回收皿中收集制备好的载***海藻酸钠水凝胶微球，移至金属筛网载体中，并用PBS清洗三次。冷冻过程，将盛有微球的金属筛网直接浸入含1mL的VS3中进行CPA加载，加载时间为10min，加载好CPA后用吸水纸在金属筛网下方吸除多余液体，再将金属筛网投入液氮中进行冷冻。复温过程，冷冻1h后，用镊子将金属筛网从液氮中取出，迅速放入预热好的37℃的复温溶液中，1min后再转至稀释释放溶液中稀释释放3min，期间晃动筛网让海藻酸钠微球落入溶液中，外部的海藻酸钠水凝胶被稀释释放溶液中的柠檬酸钠解交联，随后***从海藻酸钠水凝胶内部释放至溶液中。3min后，使用口吸器将释放出的***依次在BS溶液中清洗3次，最后吹入M2溶液恢复中。

(3)低浓度CPA-Cryotop组：所有实验过程均与Cryotop组相同，仅将玻璃化溶液换为与海藻酸钠水凝胶包封组相同的VS3。

各实验组最终收集的***均在培养箱中恢复1h，统计存活细胞数，计

算存活率，随后进行体外孤雌激活操作，计算得出***的卵裂率与囊胚率。所有实验均重复3次。

如图8所示，海藻酸钠水凝胶包封***在低浓度保护剂VS3中玻璃化保存的存活率和发育率，与Cryotop法在高浓度保护剂VS5中玻璃化保存的结果没有显著性差异，说明海藻酸钠水凝胶的封装可以降低***玻璃化所需的保护剂浓度。

实施例9

不同粒径载***水凝胶微球玻璃化冻存效果评估

通过控制微流控芯片中矿物油与油乳化剂的流速改变载***海藻酸钠微球的粒径，并分别进行冻存复温实验。固定含***的1％海藻酸钠溶液的流速为2μL/min；矿物油与油乳化剂流速相同，设置为20μL/min、30μL/min、40μL/min。流速比为10、15、20时生成的海藻酸钠微球的平均粒径分别为262μm、193μm、156μm。对不同流速比下生成的载***微球分别进行冷冻复温，实验流程同实施例8中的步骤(2)，统计***的存活及后续发育情况。

如图9所示，微球粒径为262μm时，***存活率(93.16％)、卵裂率(71.78％)、囊胚率(21.06％)与193μm组的存活率(92.48％)、卵裂率(70.80％)、囊胚率(20.42％)均无显著性差异；156μm组的***存活率和卵裂率仅为68.26％和59.44％，远低于对照组和其他两组。因此，控制水凝胶微球的平均粒径可以调控保护剂的渗透速率，从而降低***的渗透损伤。

实施例10

不同保护剂浓度对载***水凝胶微球玻璃化冻存的影响

选取四种不同浓度的低温保护剂，即VS1、VS2、VS3、VS4用以确定海藻酸钠水凝胶包封***后，低温保护剂的最适浓度。各组均通过微流控芯片制备收集优选的粒径约为262μm的载***微球，将载***微球置于金属筛网中后，分别浸入到1mL的四种不同浓度的低温保护剂中，加载时长均为10min。后续冻存、复温及释放程序均与实施例8中的步骤(2)相同。

如图10所示，随着保护剂浓度的升高，***的存活率及发育率也随之上升，但并不呈单调上升趋势。当保护剂浓度提至12.5％ EG+12.5％DMSO+0.5M海藻糖(VS4)时，VS4组***的存活率、卵裂率和囊胚率虽然与VS3组的结果无显著性差异，但有小幅下降，说明海藻酸钠水凝胶与保护剂浓度之间存在最适平衡点。

实施例11

不同保护剂加载时长对载***水凝胶微球玻璃化冻存的影响

将微流控芯片制备的载***海藻酸钠水凝胶微球在VS3的低温保护剂中分别加载4min、8min、12min。加载完成后，吸水纸吸除多余保护剂，继续进行冻存复温操作，其他操作步骤同实施例8中的步骤(2)。

如图11所示，4min组的***存活率远低于其他组别，仅为23.99％；8min组的细胞存活率(91.98％)与12min组的存活率(92.28％)并无显著性差异，但8min组的细胞卵裂率(75.84％)和囊胚率(23.86％)显著高于12min组的61.88％和15.70％。

实施例12

不同复温释放程序对载***水凝胶微球冻存复温的影响

设计了3组复温和***释放步骤，各组载***微球的保护剂加载及冻存步骤均为262μm的1％海藻酸钠微球，一步加载VS3保护剂，时长8min，投入液氮中冷冻1h。具体步骤如下：

(1)一步法：复温与释放过程同时进行。金属筛网从液氮中取出后，直接放入复温释放溶液中，并用镊子轻触筛网使微球从内壁脱落至溶液中。复温释放3min后，使用口吸器吸出***至BS中。

(2)两步法：稀释与释放同时进行。先将微球浸入1M的海藻糖溶液中复温1min，再将微球移至0.5M海藻糖与0.075M柠檬酸钠的混合溶液中稀释释放3min，再将***移至BS中。

(3)三步法：复温、稀释、释放分别进行。将冷冻1h后的装有载细胞微球的金属筛网从液氮中取出，先浸入37℃1M的海藻糖溶液中复温1min，再转移至0.5M的海藻糖溶液中稀释3min，最后将完成复温的海藻酸钠微球抖落到0.075M的柠檬酸钠溶液中解交联3min，释放出***。在体视镜视野下，配合使用口吸器将***移入BS中。

各组***转移至BS中后，均依次洗涤3次，再移入M2液滴中，放入培养箱培养2h后统计***存活数量，计算存活率。再将存活***孤雌激活，统计卵裂细胞和发育至囊胚期的细胞数量。

如图12所示，对比三种不同的复温、释放方式对***玻璃化复温后的存活率与发育率影响，先复温再同时进行稀释和释放程序的两步法的存活率、卵裂率和囊胚率显著高于复温与释放过程同时进行的一步法和复温、稀释、释放分别进行的三步法。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的解释，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种载***/胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(S1)将***分散于海藻酸钠溶液中，得到含***的海藻酸钠溶液；

(S2)将步骤(S1)得到的含***的海藻酸钠溶液、矿物油、油乳化剂泵送至微流控芯片中，含***的海藻酸钠溶液首先与矿物油形成第一液滴，第一液滴与油乳化剂混合后，进一步交联形成载***/胚胎水凝胶微球。

2.根据权利要求1所述的一种载***/胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中，海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5％～1.5％；

***与海藻酸钠溶液的用量比为30～35颗：800μL。

3.根据权利要求1所述的一种载***/胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(S2)中，所述微流控芯片由上至下分别为依次连接的设置有出口和入口的顶层、分布层、通道层和底层；所述通道层为三通道结构，所述三通道结构包括含***的海藻酸钠溶液与矿物油交汇的第一通道、第一液滴与油乳化剂交汇的第二通道，以及，第一液滴与油乳化剂进行交联的S型交联通道。

4.根据权利要求3所述的一种载***/胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述第一通道分别与含***的海藻酸钠溶液的入口、矿物油的入口以及第二通道的入口相连接；含***的海藻酸钠溶液与矿物油交汇处靠近第二通道的入口处的一侧设置有喉部；

所述第二通道分别与第一通道的出口、油乳化剂的入口和S型交联通道的入口相连接；

所述S型交联通道的出口与顶层的出口相连接。

5.根据权利要求1所述的一种载***/胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(S2)中，油乳化剂为无水氯化钙、矿物油和司盘80的混合物；

含***的海藻酸钠溶液、矿物油、油乳化剂的泵送速度依次为2μL/min、20μL/min～40μL/min、20μL/min～40μL/min。

6.一种通过权利要求1～5任一所述方法制备得到的载***/胚胎水凝胶微球，其特征在于，所述微球粒径为100μm～320μm。

7.一种如权利要求6所述的载***/胚胎水凝胶微球的玻璃化保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A1)将载***/胚胎水凝胶微球置于冷冻载体中，得到载有微球的冷冻载体；

(A2)步骤(A1)制备得到的载有微球的冷冻载体置于玻璃化溶液中进行CPA加载；

(A3)步骤(A2)结束后，将载有微球的冷冻载体置于液氮中进行冷冻保存；

使用前，对载***/胚胎水凝胶微球进行复温处理。

8.根据权利要求7所述的一种载***/胚胎水凝胶微球的玻璃化保存方法，其特征在于，步骤(A1)中，所述冷冻载体为304不锈钢材质的80目金属筛网。

9.根据权利要求7所述的一种载***/胚胎水凝胶微球的玻璃化保存方法，其特征在于，步骤(A2)中，所述玻璃化溶液为DMSO、EG和海藻糖的混合物；

CPA加载过程中，时间为4min～12min。

10.根据权利要求7所述的一种载***/胚胎水凝胶微球的玻璃化保存方法，其特征在于，步骤(A3)中，复温过程中，将载有微球的冷冻载体置于预热的复温溶液中进行复温，然后转移至稀释释放溶液进行稀释释放；

其中，所述稀释释放溶液为海藻糖与柠檬酸钠的混合溶液，稀释释放过程同步进行。