CN117157071A - 包含自噬激活剂作为活性成分的组合物用于预防或治疗非综合征性常染色体显性耳聋 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗非综合征性听力损失的组合物和用于诊断非综合征性听力损失的组合物。本发明可用作一种治疗症状相对的根本治疗的方法，即通过有效控制OSBPL2蛋白突变体在细胞质中的积累来治疗，这是非综合征性听力损失的直接原因，特别是非综合征性常染色体显性遗传67耳聋(DFNA67)。本发明还首次在与DFNA67相关的OSBPL2基因中发现了新的移码突变，这些突变可作为高度可靠的生物标志物，可以在听力障碍出现之前预测发生DFNA67的风险。

Description

包含自噬激活剂作为活性成分的组合物用于预防或治疗非综 合征性常染色体显性耳聋
技术领域
本发明涉及通过激活自噬来治疗非综合征性常染色体显性遗传听力损失的方法，特别是涉及通过去除DFNA67患者的细胞质中累积的突变蛋白聚集体来治疗非综合征性常染色体显性遗传性听力损失的方法。
背景技术
听力损失是最常见的感觉障碍(1)，成人期发病的听力损失的发病率比儿童期听力损失要高很多，每10年增加一倍(2)。与成人期听力损失有关的约60个基因座和约30个基因被识别，它们通常以常染色体显性遗传的方式被遗传。据最近的报道，这些基因造成的成人期听力损失病例仅占5％至10％(2)。常染色体显性遗传性听力损失通常表现为后语言期和进行性听力损失，从高频率开始，到所有频率的耳聋。特别地，成人发病的听力损失对全世界成年人口构成沉重负担，还与较高的住院率、抑郁率和痴呆率相关(3-5)。此外，由于全球人口老龄化，听力损失正成为一种越来越普遍的残疾(6)，而目前还没有有效的治疗听力损失的策略。
OSBPL2(氧固醇结合蛋白样2；MIM606731)的突变与非综合征性听力损失(NSHL)、非综合征性常染色体显性67耳聋(DFNA67，MIM616340)(7-9)的病因有关。OSBPL2突变患者在5至40岁之间出现后语言期听力损失，以及双侧对称性中度至重度听力损失。在大多数情况下，听力损失在很小的时候从高频率开始，并在较晚的年龄发展到其他频率。
OSBPL2编码氧化固醇结合蛋白相关蛋白2(ORP2)，属于氧化固醇结合蛋白(OSBP)家族，是一组细胞内脂质受体(10)。该家族的大多数成员包含一个N端普列克底物蛋白(pleckstrin)同源结构域和一个高度保守的C端OSBP样固醇结合结构域，但OSBPL2仅包含固醇结合结构域(10)。体外研究表明，OSBPL2可以与22-和25-羟基胆固醇、磷脂酸和磷脂酰肌醇3-磷酸结合(11)。OSBPL2在胆固醇和甘油三酯的综合控制中起重要作用(11-13)；然而，OSBPL2缺乏导致NSHL的发病机制尚不完全清楚。OSBPL2异常的猪表现出进行性听力损失，伴有耳蜗毛细胞退化和静纤毛形态异常，以及高胆固醇血症(14)。此外，高脂肪饮食会加剧听力损失的发展，并导致更严重的高胆固醇血症。因此，这些研究将OSBPL2缺失导致的脂质代谢失调与听力障碍联系起来。然而，OSBPL2突变如何导致听力损失尚不清楚，因为患者有一个野生型和一个突变等位基因，而研究仅针对显示出功能缺陷的敲除后的猪、细胞和斑马鱼模型。
蛋白质构象病是指任何由错误折叠的蛋白质异常积累引起的疾病(16)。蛋白质错误折叠和细胞内积累是多种人类疾病的主要特征，例如神经退行性疾病，包括阿尔茨海默症，帕金森症，肌萎缩侧索硬化症，朊病毒病和聚谷氨酰胺疾病(16)。一些蛋白质构象病，例如由ΔF508突变引起的囊性纤维化，其特征为错误折叠的蛋白质在分泌途径的内质网(ER)或高尔基体中积累(17)。其他蛋白质构象病涉及错误折叠的蛋白质聚集体在细胞质或细胞核中的积累，如帕金森病(18)。蛋白质构象病也是听力损失的遗传原因之一。SLC26A4/pendrin的突变导致内耳的SLC26A4错误折叠，并导致由耳蜗退化造成的先天性耳聋(19,20)。此外，COCH中的突变导致耳蜗周围错误折叠的cochlin蛋白积累，并使听力功能缓慢恶化(21,22)。
本发明人在成人期进行性听力损失家族中鉴定出两个OSBPL2突变，并发现这些突变会导致变异的OSBPL2蛋白积累。本发明人还建立了新的小鼠听力损失模型。
在本说明书中，引用了许多出版物和专利文献。所引用的出版物和专利文献的公开全文通过引用并入本文，以更清楚地描述本发明的相关技术现状。
公开
技术问题
本发明人经过了广泛的研究努力，开发了有效的治疗组合物，用于遗传性听力障碍，特别是OSBPL2基因突变引起的非综合征性听力损失，通过明确其发病机制实现。结果，本发明人首次发现由OSBPL2基因突变引起的非综合征性听力损失是一种造成突变OSBPL2蛋白在细胞内聚集的蛋白质构象病，并且发现通过激活抑制突变蛋白积累的自噬途径可以从根本上消除非综合征性听力损失的发病机制，从而完成本发明。
因此，本发明的目的是提供一种用于预防或治疗非综合征性听力损失的组合物及其筛选方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断非综合征性听力损失的组合物。
本发明的其它目的和优点将在以下具体发明内容、所附权利要求和附图中更加清楚地详述。
技术方案
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗非综合征性听力损失的组合物，包括自噬激活剂作为活性成分。
本发明人经过了广泛的研究努力，开发了一种有效的治疗组合物，用于遗传性听力障碍，特别是OSBPL2基因突变引起的非综合征性听力损失，通过明确其发病机制实现。结果，本发明人首次发现由OSBPL2基因突变引起的非综合征性听力损失是一种造成突变OSBPL2蛋白在细胞内聚集的蛋白质构象病，并且发现通过激活抑制突变蛋白积累的自噬途径可以从根本上消除非综合征性听力损失的发病机制
如本文所用，术语“自噬”是指溶酶体相关的分解代谢过程，其降解对细胞的生存和生长非必要的或有害的细胞成分。自噬是细胞生存、分化、发育和维持稳态的重要过程，可防止异常蛋白质积累和聚集引起的疾病的发展，如阿尔茨海默症和角膜营养不良，还可以缓解斑块积聚引起的心血管疾病。
如本文所用，术语“自噬激活剂”包括一系列活性成分，包括试剂、化合物、天然产物、蛋白质和核酸分子，可促进或诱导细胞中的自噬。自噬激活剂可以通过本领域已知的各种方法进行筛选，这些方法可以确定与对照相比自噬活性的增加，例如，可以使用美国专利公开号2012/01788119中描述的方法筛选。本发明适用的各种自噬激活剂是在本领域已知的，包括但不限于mTOR通路抑制剂(例如雷帕霉素)、维生素D、维生素D类似物、mTOR通路依赖性自噬激活剂(例如海藻糖)、卡马西平、丙戊酸钠、维拉帕米、洛哌丁胺、胺碘酮、尼莫地平、尼群地平、尼古地平、匹莫齐特、卡帕他丁、卡肽汀、可乐定、匹美尼定、2',5'-二脱氧腺苷、米诺地尔、青霉素A，氟司必林和三氟拉嗪。此外，任何本领域已知的自噬激活剂都可被使用。
根据本发明的具体实施方案，用于本发明组合物的自噬激活剂可以是mTOR(雷帕霉素的机制性靶标)抑制剂。
如本文所用，术语“mTOR抑制剂”是指引起mTOR蛋白活性或表达降低的物质，不仅使得mTOR的活性或表达变得不可检测或mTOR以较低的水平存在，而且使得mTOR降低引起的自噬活性显著提升。
如本文所用，术语“表达降低”是指与对照相比，mTOR在蛋白质或基因水平上的表达水平降低至少20％、更具体至少30％、更优选至少40％。
如本文所用，术语“活性降低”是指与对照相比，mTOR在体内的固有功能显著降低到可测量的程度。具体地，该术语指mTOR的活性降低到细胞内自噬活性可显著改善或恢复的程度。活性的降低不仅包括功能的简单降低，还包括由于稳定性降低而导致的最终活性抑制。
更具体地，mTOR抑制剂是选自下组中的至少一种：雷帕霉素、Torin 1、依维莫司、子囊霉素、替西罗莫司、唑他莫司、利达福莫司、AP23841、AZD08055、OSI027及其药学上可接受的盐，最具体地是雷帕霉素。
如本文所用，术语“预防”或“防止”是指抑制从未被诊断为患有该病症或疾病，但可能患上这种病症或疾病的受试者中病症或疾病的发生。
如本文所用，术语“治疗”或“医治”是指(a)抑制病症、疾病或症状的进展；(b)减轻病症、疾病或症状；或(c)消除病症、疾病或症状。当将本发明的组合物施用于受试者时，其功能是通过增强自噬活性来去除突变的OSBPL2蛋白，从而抑制、消除或减轻由突变的OSBPL2蛋白的聚集和细胞内积累引起的听力损失症状的发作。因此，本发明的组合物本身可以作为这些疾病治疗的组合物，或可与其他药理成分联合施用，用作疾病的治疗辅助剂。因此，如本文所用，术语“治疗”或“治疗剂”包括“辅助治疗”或“治疗辅助剂”。
如本文所用，术语“施用”或“施与”是指将治疗有效量的本发明组合物直接施用于受试者，以在受试者体内产生相同量的本发明组合物。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指含有足以向要施用本发明的药物组合物的受试者提供有治疗或预防效果的药理成分的组合物的量。因此，术语“治疗有效量”包括“预防有效量”。
如本文所用，术语“受试者”包括但不限于人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴子、黑猩猩、狒狒或恒河猴。具体地，本发明中的受试者是人类。
当将本发明的组合物用于制备为药物组合物时，本发明的药物组合物含有药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物中包括的药学上可接受的载体包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，通常用在制剂中。除上述组分外，本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂在《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第19版，1995)中有详细描述。
本发明的药物组合物可以口服或注射给药，具体地，注射给药，更具体地，皮下、透皮、静脉或鼓室内注射给药。
本发明的药物组合物的合适剂量可以用各种方式规定，取决于如剂型，给药方式，患者的年龄、体重、性别、病理状况和饮食，给药时间，给药途径，***率和对药物的敏感性等因素。本发明的药物组合物对成人的优选剂量为0.001至100mg/kg的范围。
本发明的药物组合物可以按照本领域技术人员容易执行的方法，用药学上可接受的载体和/或赋形剂以单位剂量制备或制备成包含在多剂量容器中。在这种情况下，药物组合物的剂型可以是药物组合物在油或水介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液，或含有该药物组合物的提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊，并且还可以含有分散剂或稳定剂。
根据本发明的具体实施方案，可以用本发明组合物预防或治疗的非综合征性听力损失是由氧化固醇结合蛋白样2(OSBPL2)基因突变引起的听力损失。
更具体地，所述非综合征性听力损失是非综合征常染色体显性遗传67耳聋(DFNA67)。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于诊断非综合征性听力损失的组合物，其活性成分用于检测如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其编码的氨基酸序列。
本发明的组合物能诊断的非综合征性听力损失已经详细描述过，为了避免说明书过于复杂，此处将其省略。
根据本发明，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列是c.180_181ACdel(p.H60Qfs*93)的核苷酸序列，这是一种听力障碍患者OSBPL2基因中的新型移码突变。本发明人首先发现了c.180_181ACdel突变，该突变与常染色体显性遗传非综合征性听力损失患者的听力障碍表型相关未被报道过。因此，当c.180_181ACdel突变的存在被用作诊断或预测标志物时，甚至有可能在青少年后期出现OSBPL2基因突变引起的听力障碍症状之前预测未来发生听力障碍的风险，并在早期阶段建立治疗策略。
对本领域技术人员显而易见的是，本发明中要检测的用于诊断的核苷酸序列不仅限于所附序列表中列出的核苷酸序列。核苷酸序列的突变可能不会导致蛋白质序列的变化。所述核酸包括功能等效密码子的核酸分子，或编码相同氨基酸的密码子，例如由于密码子简并性，精氨酸和丝氨酸有六个密码子，或编码生物等效氨基酸的密码子。
考虑到上述突变具有生物等效活性，因此本发明的核酸分子应被理解为还包括与序列表中描述的序列实质等同的序列。所述实质等同是指使用本领域常用的算法分析比对序列时，本发明的上述序列对齐以尽可能地对应于任何其他序列，显示出至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％的同源性的序列。
如本文所用，术语“诊断”或“判断”指包括确定受试者对特定疾病的易感性，确定受试者目前是否患有特定疾病，确定患有特定疾病的受试者的预后，以及确定受试者未来是否有感染疾病的风险。更具体地，就本发明的目的而言，“诊断”是指确定受试者当前是否患有特定疾病或受试者未来是否有患该疾病的风险。
如本文所用，术语“用于诊断的组合物”是指包括用于检测OSBPL2基因中c.180_181ACdel突变以用于确定受试者是否有听力障碍或预测受试者未来是否可能产生成听力障碍的器件的集成混合物或装置。因此，该术语也可以表示为“诊断试剂盒”。
根据本发明的具体实施方式，用于检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的试剂是与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列特异性结合的引物或探针。
如本文所用，术语“核苷酸”指包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子及核苷酸，其中核苷酸是核酸分子中的基本结构单元，不仅包括天然核苷酸，还包括含有修饰的糖或碱基部分的类似物(Scheit，核苷酸类似物，John Wiley，纽约(1980)；Uhlman和Peyman，化学评论，90:543-584(1990))。
如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸，其在能诱导与核酸链互补的引物延伸产物(模板)合成的条件下作为合成起点，即存在核苷酸和聚合酶(如DNA聚合酶)以及合适的温度和pH的条件下。具体地，所述引物是脱氧核糖核苷酸单链。本发明中的引物可以包括天然存在的dNMP(即dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、修饰后的核苷酸或非天然核苷酸。此外，引物还可以包括核糖核苷酸。
本发明所用的引物可以是延伸引物，其通过模板依赖性核酸聚合酶退火到靶核酸并形成与靶核酸互补的序列。所述延伸引物延伸到固定探针退火的位置，并占据探针退火的区域。
本发明所用的延伸引物包括与目标核酸的特定核苷酸序列互补的杂交核苷酸序列，例如上述OSBPL2突变基因。术语“互补”是指引物或探针具有足够的互补性，以至于在一定的退火或杂交条件下选择性地杂交到目标核酸序列。术语“实质上互补”指包括“完全互补”和“全部互补”。具体地，指完全互补。如本文所用，术语“实质互补序列”不仅包括完全配对的序列，而且包括与要比较的序列在一定范围内部分不匹配的序列，在该范围内它可以退火到特定序列并用作引物。
所述引物应足够长，以能在聚合酶的存在下引发延伸产物的合成。所述引物的合适长度取决于许多因素，例如温度、pH和引物的来源，但通常为15至30个核苷酸。短引物分子与模板形成足够稳定的杂交复合物通常需要更低的温度。所述引物的设计可以由本领域技术人员参考目标核苷酸序列容易地进行，例如使用引物设计程序(例如PRIMER 3)。
如本文所用，术语“探针”是指具有键的天然或改造的单体或线性低聚物，包括可以与特定的核苷酸序列杂交的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。具体地，所述探针是单链的，以实现最大的杂交效率。更具体地，所述探针是脱氧核糖核苷酸。用于本发明的探针，可以使用与OSBPL2突变基因的特定核苷酸序列完全互补的序列，但是只要保证特异性杂交不中断，也可以使用与其基本互补的序列。通常，杂交形成的双链体的稳定性往往由末端序列的不匹配决定，因此，优选地使用与目标序列的3'端或5'端互补的探针。
适合杂交的条件可以参考Joseph Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约(2001)和Haymes,B.D.等人，核酸杂交，实用方法，IRL出版社，华盛顿特区(1985)中公开的内容来确定。
如本文所用，术语“互补”是指用于抑制表达的核酸分子具有足够的互补性，以在预定的退火或杂交条件下选择性地杂交到目标核酸序列。术语“互补”指包括“实质上互补”和“完全互补”。优选地，为完全互补。如本文所用，术语“实质互补序列”不仅包括完全匹配的序列，也包括一定范围内部分匹配的序列，在该范围内可以退火到特定序列，并能发生序列特异性杂交。
根据本发明的具体实施方式，用于检测由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的试剂是能特异性结合SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段，或是能与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列特异性结合的适配体。
本发明中的SEQ ID NO:2是由c.180_181ACdel编码的氨基酸序列，是本发明识别出的一种新型移码突变。
根据本发明，本发明中的突变蛋白可以通过使用抗原-抗体反应的免疫测定方法进行检测，并用于分析是否存在听力障碍。该免疫测定可以根据常规开发的各种免疫测定或免疫染色方案进行。例如，当本发明根据放射免疫的方法测定时，可以使用以放射性同位素(例如，C14,I125,P32,and S35)标记的抗体。在本发明中，特异性识别OSBPL2蛋白突变体的抗体是多克隆或单克隆抗体，优选地为单克隆抗体。
本发明的抗体可以通过本领域常用的方法生产，例如融合法(Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志，6:511-519(1976))，重组DNA法(美国专利号4,816,567)，或噬菌体抗体库法(Clackson等人，Nature，352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222:58,1-597(1991))。抗体生产的一般程序在Harlow，E.和Lane，D.，使用抗体：实验室手册，冷泉港出版社，纽约，1999年等中有详细描述。
通过上述免疫测定过程分析最终信号的强度，可以预测上皮屏障功能。换言之，如果受试者样本中突变的OSBPL2蛋白的信号比正常样本中的信号强，则可确定受试者的听力功能已经丧失或将来有丧失的风险。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白的结构中抗原可以结合的一部分多肽。抗原结合片段的例子包括但不限于F(ab')2、Fab'、Fab、Fv.和scFv。
如本文所用，术语“特异性结合”与“特异性识别”具有相同的含义，指抗原和抗体(或其片段)通过免疫反应特异性地相互作用。
在本发明中，可以使用特异性结合到突变的OSBPL2蛋白的适配体代替抗体。如本文所用，术语“适配体”是指以高亲和力和特异性与特定目标物质结合的单链核酸(RNA或DNA)分子或肽分子。关于适配体的总体内容在Hoppe-Seyler F和Butz K的“肽适配体：分子医学强大的新工具”.分子医学杂志.78(8):426-30(2000)和Cohen BA，Colas P，Brent R.“从组合库中分离的人工细胞周期抑制剂”.美国国家科学院院刊.95(24):14272-7(1998).中详细公开。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种筛选预防或治疗非综合征性听力损失的组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使测试物质与含有mTOR的生物样品或表达mTOR的细胞接触：和
(b)测量mTOR的活性或表达水平，其中如果mTOR的活性或表达水平降低，则确定测试物质为能用于预防或治疗非综合征性听力损失的组合物。
通过本发明的方法筛选的物质用于预防或治疗的非综合征性听力损失已经在上面进行了描述，为了避免说明书过于复杂，此处将其省略。
如本文所用，术语“生物样品”是指任何含有表达mTOR蛋白的细胞的样品，其从哺乳动物(包括人类)获得。生物样品的例子包括但不限于组织、器官、细胞或细胞培养物。
在说明本发明的筛选方法时使用的术语“候选物”指一种用于筛选的未知物质，以检查其是否能通过添加到含有表达mTOR的细胞的样品中来影响mTOR的活性或表达水平。测试物质的例子包括但不限于化合物、核苷酸、肽和天然提取物。测量用测试物质处理的生物样品中mTOR的表达水平或活性的步骤可以通过本领域已知的各种表达水平和活性测量方法进行。测量的结果中，如果mTOR的表达水平或活性降低，则可以确定测试物质是用于预防或治疗非综合征性听力损失的组合物，特别是被本发明人新确定为蛋白质构象病的DFNA67。
如本文所用，术语“活性或表达水平的降低”是指mTOR在体内的内在功能或表达水平降低到mTOR诱导的自噬抑制显著降低的程度，且突变的OSBPL2蛋白的聚集和积累降低到可测量的水平。活性的降低不仅包括简单的功能降低，还包括由稳定性降低引起的活性的最终抑制。具体地，活性的降低意味着与对照组相比，活性或表达水平至少降低20％，更具体地至少40％，更具体地至少60％的状态。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种预防或治疗非综合征性听力损失的方法，包括施用自噬激活剂的步骤。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种诊断非综合征性听力损失的方法，包括测量SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其编码的氨基酸序列的表达水平的步骤。
有益效果
本发明的特征和优点总结如下。
(a)本发明提供了用于预防或治疗非综合征性听力损失的组合物和用于诊断非综合征性听力损失的组合物。
(b)本发明可用作一种与治疗症状相对的根本治疗方法，通过有效控制OSBPL2突变蛋白在细胞质的积累来治疗，OSBPL2突变蛋白是造成非综合征性听力损失的直接原因，特别是非综合征性常染色体显性遗传67耳聋(DFNA67)。
(c)本发明还首次在与DFNA67相关的OSBPL2基因中发现了新的移码突变，这些突变可用作高度可靠的生物标志物，用于在听力障碍出现之前预测发生DFNA67的风险。
附图简述
图1显示了OSBPL2突变的鉴定结果。图1a和1b分别显示了YUHL3和YUHL457家族的谱系，听力损失展现出常染色体显性遗传模式，无综合征的特征。其中显示了个体的OSBPL2基因型。M1,c.158_159AAdel(p.Gln53Argfs*100)；M2,c.180_181ACdel(p.His60Glnfs*93).图1c显示了两个家族中每个先证者的纯音听力图，表明双侧感音神经性听力损失发生在YUHL3 III-13(女性/37)和YUHL457III-4(女性/51)。YUHL3 III-13和YUHL457 III-4的听力损失分别在20岁末和30岁初发病。重度-极重度(>70dB HL)听力损失主要影响高频，以向低频的听力损失发展为特征。受影响的患者在250和500Hz时有残余的听力功能。红色，右耳；蓝色，左耳。图1d显示了人类OSBPL2 cDNA的外显子结构和OSBPL2的结构域结构。指出了在DFNA67患者中鉴定的移码变异，本发明鉴定的变异以蓝色标出。图1e显示了末端被截断的OSBPL2突变体的序列比对结果。与DFNA67相关的OSBPL2突变导致几乎相同的融合蛋白，由大约50个氨基酸的OSBPL2的N-末端和100个氨基酸的新肽组成。添加的氨基酸与任何已知的蛋白质没有同源性。
图2显示了突变体OSBPL2形成细胞内聚集体。图2a显示了使用抗Myc抗体对HeLa或HEI-OC1细胞中的OSBPL2野生型(WT)和突变体进行免疫荧光染色的结果。WT OSBPL2在细胞质中均匀存在，而截短的OSBPL2突变蛋白在大多数细胞中显示出聚集模式(箭头)。比例尺：20μm.图2b显示了突变体OSBPL2形成高分子量多聚体，并且在用5nM巴非霉素A1处理24小时后浓度增加。数据表示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，ns：不显著；学生t检验。图2c显示了HeLa细胞中OSBPL2WT和突变型蛋白的免疫荧光染色结果。标记了内质网(ER，YFP-ER)，高尔基体(YFP-高尔基体)，膜(GFP848膜)，核内体(GFP-RAB5)和溶酶体(GFP-LAMP1)。通过计算曼德斯共定位系数来量化共定位。比例尺：20μm。数据表示为平均值±SD。*p<0.05，***p<0.005，学生t检验。
图3显示了Osbpl2敲除小鼠不会发生听力损失。图3a显示了OSBPL2在小鼠耳蜗中的表达。OSBPL2(红色)与Tuj1或Myo7a(绿色)共免疫染色。比例尺：20μm。图3b显示了产生Osbpl2敲除(KO)小鼠的过程。选择了靶向Osbpl2外显子3的单向导RNA。图3c和3d是显示Osbpl2+/+(黑色)，Osbpl2+/-(蓝色)和Osbpl2-/-(红色)小鼠在出生后(P)第120天的ABR和DPOAE阈值的图。不同基因型在听力功能方面无显著差异。数据显示为平均值±SD。图3e和3f显示了Osbpl2+/+(黑色)和Osbpl2-/-(红色)小鼠在出生后(P)第120天喂食高脂肪饮食(HFD)的ABR和DPOAE阈值。即使在Osbpl2敲除的小鼠中，HFD也不会诱导听力障碍。数据显示为平均值±SD。图3g显示了HFD喂食两个月的Osbpl2+/+，Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠的血清胆固醇(CHOL)，甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)水平。
图4显示了表达突变OSBPL2的转基因小鼠听力损失的概述。图4a示意性地显示了表达p.Q53Rfs*100OSBPL2的转基因小鼠(hQ53R-TG)的产生。转基因盒由CAG启动子、3XFLAG标记的p.Q53Rfs*100OSBPL2和SV40 poly(A)尾部序列组成；箭头表示用于基因型的PCR引物。图4b显示了使用抗FLAG抗体对hQ53R-TG小鼠的内耳，脑，肝脏和肾脏中的p.Q53Rfs*100OSBPL2进行免疫印迹的结果。图4c和4d显示了出生后第60天(P60)对照(黑色)和hQ53R-TG(红色)小鼠的ABR和DPOAE阈值的图表。与对照小鼠相比，hQ53R-TG小鼠在所有频率下都表现出严重的听力损失。数据显示为平均值±SD。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005，ns：不显著；学生t检验。对整个挂载的内耳进行鬼笔环肽(绿色)和FLAG(红色)免疫染色，显示了在出生后第60天(P60)的hQ53R-TG小鼠的科蒂氏器严重退化和嘌呤霉素突变蛋白聚集(图4e)。比例尺：100μm.图4f显示了出生后第60天(P60)的hQ53R-TG小鼠的免疫组织化学和组织学分析结果。抗Tuj1，抗Myo7a和H&E染色显示了hQ53R-TG小鼠的嘌呤霉素神经元和毛细胞退化。
图5显示了突变OSBPL2导致内溶酶体稳态的缺陷。图5a显示了使用蛋白质组学鉴定的野生型(WT)和p.Q53Rfs*100OSBPL2的代表性相互作用因子。紫色标记的蛋白质通常在WT和突变型OSBPL2中都检测到。蓝色标记的蛋白质被鉴定为WT OSBPL2的相互作用因子，而红色标记的蛋白质与突变的OSBPL2结合。SNRPF和VAPB(以紫色底和黑色边框标记)是WTOSBPL2的已知相互作用因子。图5b显示了突变OSBPL2的基因本体(GO)分析的结果。图5c显示了自噬的通量测定结果，表明过表达p.Q53Rfs*100OSBPL2的细胞中LC3-I到LC3-II的转化降低。转染后48小时，将细胞在Earle平衡盐溶液(EBSS)中血清饥饿处理和/或用10μM氯喹处理4小时，分别诱导或抑制自噬。*p<0.05，学生t检验。图5d的左图显示，与过表达WTOSBPL2的细胞相比，过表达p.Q53Rfs*100OSBPL2的细胞中LysoTracker的信号强度增加。将转染了指定质粒的HeLa细胞与200nM LysoTracker在37℃下孵育1小时。比例尺：20μm。***p<0.005；学生t检验。图5d的右图显示，与过表达WT OSBPL2的细胞相比，过表达p.Q53Rfs*100OSBPL2的细胞中积累了更多若丹明标记的葡聚糖。比例尺：20μm。***p<0.005；学生t检验。
图6显示了雷帕霉素恢复由突变OSBPL2引起的细胞缺陷。图6a显示，p.Q53Rfs*100OSBPL2的过表达增加了高分子量的多泛素化蛋白，而3μM雷帕霉素处理或营养饥饿处理减少了突变的OSBPL2多聚体以及多泛素化蛋白。转染HEK 293细胞，收集产物。蛋白质样品用抗FLAG抗体免疫沉淀，并使用抗泛素、抗MYC和抗FLAG抗体进行免疫印迹。FL表示全长。图6b显示了p.Q53Rfs*100OSBPL2的过表达诱导mTOR磷酸化，而WT OSBPL2的过表达降低了mTOR磷酸化。由突变OSBPL2过表达引起的mTOR磷酸化在用3μM雷帕霉素处理后降低。密度测定分析结果代表至少三个独立实验，条带强度归一化为β-肌动蛋白。**p<0.01；学生t检验。图6c至6e显示了雷帕霉素处理增加了自噬标志物LC3和p62与p.Q53Rfs*100OSBPL2的共定位。将含有mCherry-LC3或GFP-p62和OSBPL2的质粒转染到HeLa细胞中，并用300nM雷帕霉素处理24小时。通过计算曼德斯共定位系数来量化共定位。比例尺：20μm。*p<0.05，**p<0.01；学生t检验。
图7显示了雷帕霉素部分恢复hQ53R-TG小鼠的听力损失表型。图7a是雷帕霉素(Rapa，2mg/kg)治疗策略的示意图。每天腹腔注射雷帕霉素，策略#1从出生后(P)第1天到第10天，策略#2从P7天至P15天，策略#3从P30天至P60天。在P30天和P60天时检查听力能力。Rapa指雷帕霉素。图7b和7c显示了对照(黑色)，hQ53R-TG(红色)和使用策略#2处理的hQ53R-TG小鼠(蓝色)在P60天的ABR和DPOAE阈值。雷帕霉素处理显著降低hQ53R-TG小鼠的ABR短声阈值至40dB。在用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠中，在6和12kHz下的DPOAE振幅也恢复了。数据展示为平均值±SD。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,ns表示不显著；学生t检验。图7d显示了用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠响应短声刺激的代表性ABR记录，表明雷帕霉素恢复了听力表型。图7e显示了未处理或用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠在P30天时的免疫组织化学和组织学分析结果。Myo7a、TUJ1和H&E染色显示，与未处理的hQ53R-TG相比，雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠中的毛细胞和嘌呤霉素神经元恢复得更多。雷帕霉素还降低了使用抗FLAG抗体检测到的p.Q53Rfs*100OSBPL2的强度。图7f显示了与对照小鼠相比，用或未用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠内耳的扫描电子显微镜(SEM)图像。SEM图像显示，与未处理的hQ53R-TG小鼠相比，雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠的毛细胞部分恢复。比例尺：10μm。图7g显示了对照、未处理的hQ53R-TG和雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠的透射电子显微镜图像。hQ53R-TG小鼠在嘌呤霉素神经元的细胞质中具有电子致密结构(红色箭头)，但在用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠中这些结构显著降低。黑色矩形部分在右侧图中被放大。
图8显示了雷帕霉素对YUHL3和YUHL457家族DFNA67患者的影响。在给予雷帕霉素(雷帕穆尼，辉瑞)之前和给药3个月(每日2mg)后(图8a和8b)，获得来自YUHL3和YUHL457家族的DFNA67患者(n＝5)的纯音听力图。显示了双耳的数据。入选患者最初表现出轻度至重度-极重度的听力损失(图8a)。三个月后，计算出听觉阈值的变化，在3,000Hz时听觉阈值显著改善(图8b)。数据表示为平均值±SD。**p<0.01双尾t检验。由于计算了仅具有初始反应的患者(YUHL457：IV-2)的DPOA(畸变产物耳声发射)阈值，双耳(图8c中的右图，红色；图8d中的左图，蓝色)在除4kHz之外的所有频率下DPOAE均显示出阳性响应。虚线表示背景噪音级别。雷帕霉素处理3个月后，双耳信噪比(SNR)的变化呈阳性(图8e)。图8f显示了在三名有耳鸣症状的患者中，雷帕霉素治疗3个月后耳鸣障碍量表(THI)评分的计算结果。
图9显示了YUHL3和YUHL457中OSBPL2变体的分离。显示了来自YUHL3(图9a)和YUHL457(图9b)家族的患者的OSBPL2变体的Sanger测序轨迹。
图10显示了OSBPL2突变患者的听力表型。展示了YUHL3和YUHL457家族中个体的纯音听力图。OSBPL2突变的患者标有星号。F表示女性；M表示男性；红色表示右耳；蓝色表示左耳。
图11显示了移码突变对OSBPL2表达的影响。图11a显示了实时PCR结果，表明具有OSBPL2突变的个体中的OSBPL2 mRNA量与没有OSBPL2突变的个体的量没有差异。M1表示c.158_159AAdel(p.Gln53Argfs*100)；M2表示c.177_178ACdel(p.His60Glnfs*93)。根据GAPDH表达归一化基因表达并计算为2-ΔΔCt，数据表示为平均值±SD。图11b至11e显示了野生型(WT)和突变型OSBPL2稳定性的测试结果。用环己酰亚胺(100μg/ml)处理后在指定时间获得样品。p.Q53Rfs*100突变体，尤其是多聚体，在过表达时比OSBPL2 WT更稳定。数据为至少三个独立实验的代表，条带强度归一化为β-肌动蛋白。代表性的免疫印迹结果如图11d和11e所示。*p<0.05，**p<0.01，n.s.表示不显著；学生t检验。
图12显示了p.L195M对OSBPL2表达的影响。p.L195M突变蛋白表现出与野生型(WT)OSBPL2相似的表达模式，而截短的OSBPL2蛋白在过表达时形成细胞质聚集体(图12a)。比例尺：20μm。WT和p.L195M OSBPL2在变性条件下没有显示出多聚体条带，而OSBPL2新蛋白即使在变性条件下也形成多聚体(图12b)。
图13显示了突变体OSBPL2与野生型OSBPL2的相互作用。HEK 293细胞与MYC标记的野生型(WT)OSBPL2以及FLAG标记的WT或p.Q53Rfs*100OSBPL2共转染。转染后36小时，使用抗MYC(左)或抗FLAG(右)抗体对全细胞裂解物进行免疫沉淀，并进行免疫印迹。
图14示出了Osbpl2敲除小鼠的听觉表型。图14a显示了进行T7E1测定以鉴定由CRISPR-Cas9***产生的***/缺失等位基因的结果。F0小鼠(#13)用于进一步繁殖。图14b显示了从#13F0小鼠繁殖的F1小鼠的PCR基因分型结果。#13F0小鼠具有97-bp***(#13-低)和533-bp***(#13-高)的混合基因型。两种基因型都用于进一步的实验。图14c显示了利用Osbpl2+/+、Osbpl2+/-和osbpl2-/-小鼠的脑和内耳裂解物作OSBPL2免疫印迹的结果。图14d显示了Osbpl2+/+(黑色)，Osbpl2+/-(蓝色)和Osbpl2-/-(红色)小鼠在出生后至180天的短声ABR阈值。图14e显示了使用抗Myo7a(绿色)和抗OSBPL2(红色)进行免疫组织化学的结果，扫描电子显微镜确认P120天时Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠的毛细胞和静纤毛正常。图14f显示了P30天和P120天时Osbpl2小鼠科蒂氏器的免疫组织化学和组织学分析结果。抗Tuj1(绿色)、抗NF-H(红色)和H&E染色表明，Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠的螺旋神经节神经元与Osbpl2+/+小鼠相当。此外，毛细胞在Osbpl2+/-和osbpl2-/-小鼠中恢复良好。
图15显示了高脂肪饮食不会诱导Osbpl2-/-小鼠的听力损失。图15a显示了在P120天使用鬼笔环肽(绿色)对喂食高脂肪饮食(HFD)的Osbpl2+/+和Osbpl2-/-小鼠耳蜗进行免疫染色的结果。Osbpl2+/+和Osbpl2-/-小鼠的内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHCs)在形态学上没有显著差异。比例尺，20μm。图15b显示了HFD喂食的Osbpl2+/+和Osbpl2-/-小鼠耳蜗切片的H&E染色结果。在两种基因型中，都观察到螺旋神经节神经元和科蒂氏器的完整形态。比例尺，100μm。
图16显示了Osbpl2全身消耗对小鼠能量稳态的影响。图16a至16e显示了在正常食物饮食两个月后进行间接热量计量分析的结果。显示了Osbpl2+/+(黑色)，Osbpl2+/-(蓝色)和Osbpl2-/-(红色)小鼠的体重(图16a)，每日食物摄入量(图16b)，日常活动(图16c)，能量消耗(图16d)和脂肪组成(图16e)(每组n＝3至4)。
图17显示了OSBPL2突变患者的血脂谱。高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(图17a)、脂肪酸、载脂蛋白A1和载脂蛋白B(图17b)的水平在对照个体和具有OSBPL2突变的患者之间没有差异。所有患者均来自YUHL3家族。M1为c.158_159AAdel(p.Gln53Argfs*100)。
图18显示了p.Q53Rfs*46鼠的OSBPL2蛋白不形成细胞质内聚集体或多聚体。图18a显示了人(p.Q53Rfs*100)和小鼠(p.Q53Rfs*46)OSBPL2突变蛋白的序列比对结果，这些突变蛋白分别是由于Osbpl2和OSBPL2 cDNA的158和159位的两个碱基的缺失而产生。图18b显示了小鼠OSBPL2(mOSBPL2)野生型(WT)和p.Q53Rfs*46突变体的免疫荧光分析结果。用抗Myc和抗BiP抗体对细胞进行免疫染色。WT和p.Q53Rfs*46OSBPL2均均匀存在于细胞质中。比例尺：20μm。图18c显示了WT和p.Q53Rfs*46mOSPBL2的免疫印迹结果。在过表达人p.Q53Rfs*100OSPBL2的细胞中观察到的多聚体条带，在过表达p.Q53Rfs*46MmOSPBL2的细胞中未观察到。
图19显示了具有毛细胞和螺旋神经节变性的2周龄hQ53R-TG小鼠的分析结果。图19a显示了hQ53R-TG小鼠的PCR基因分型结果。正向引物用于CAG启动子区域，反向引物用于OSBPL2 cDNA的编码区域。扩增子大小为643bp。图19b显示了对照和hQ53R-TG小鼠在出生后(P)第14天的免疫组织化学和组织学分析结果。HsQ53R-TG小鼠和对照小鼠在毛细胞、螺旋神经节或神经纤维细丝方面未观察到明显差异。图19c显示了对照和hQ53R-TG小鼠在P28天的免疫组织化学和组织学分析结果。与对照组小鼠相比，hQ53R-TG小鼠耳蜗所有区域的毛细胞和螺旋神经节神经元显著缺失。
图20显示了表达野生型OSBPL2的转基因小鼠不表现出听力障碍。图20a是用于产生表达人野生型OSBPL2的转基因小鼠(hWT-TG)的转基因盒的示意图。转基因盒由CAG启动子，3XFLAG标记的WT OSBPL2和SV40 poly(A)尾部序列组成；箭头表示用于基因分型的PCR引物。图20b显示了hWT-TG小鼠的PCR基因分型结果。正向引物用于CAG启动子区域，反向引物用于OSBPL2 cDNA的编码区域。扩增子大小为643bp。图20c显示了使用抗FLAG抗体在hWT-TG小鼠的内耳、脑、肝脏和肾脏中进行WT OSBPL2免疫印迹的结果。图20d和20e显示了P60天对照(黑色)和h-TG(蓝色)小鼠的ABR和DPOAE阈值。与对照小鼠相比，hQ53R-TG小鼠在所有频率下都表现出严重的听力损失。数据表示为平均值±SD。图20f显示了截至出生后第90天的对照和hWT-TG小鼠的短声ABR阈值。
图21显示了对野生型和p.Q53Rfs*100OSBPL2相互作用蛋白进行LC/MS-MS分析的结果。图21a示意性地说明了使用LC/MS-MS鉴定野生型(WT)和p.Q53Rfs*100OSBPL2的过程。HEK 293细胞用3XFLAG标记的细菌碱性磷酸酶(BAP)，OSBPL2-WT或OSBPL2-p.Q53Rfs*100转染。细胞裂解物用FLAG M2抗体偶联琼脂糖珠免疫沉淀，并通过与3xFLAG肽竞争洗脱。图21b显示了从洗脱液中检测WT和p.Q53Rfs*100OSBPL2的结果。每个纯化步骤都通过免疫印迹确认。图21c显示了洗脱液SDS-PAGE分析的结果。
图22显示了OSBPL2和p62/SQSTM1之间的蛋白-蛋白相互作用。图22a显示了与野生型(WT)OSBPL2与全长(FL)p62共免疫沉淀的结果。几乎没有观察到p.Q53Rfs*100OSBPL2和p62之间的相互作用，即使它们的相互作用在蛋白质组学分析中被鉴定出来。蛋白酶体抑制剂MG132不影响OSBPL2和p62之间的相互作用。图22b显示了p62的结构域结构。PB1或UBA结构域的缺失并不抑制OSBPL2和p62之间的相互作用。MG132用于增加p62-ΔPB1的表达。在图22a和22b中，转染后使用FLAG M2抗体偶联琼脂糖珠对细胞裂解物进行共免疫沉淀。FL表示全长；PB1为Phox和Bem1p结构域；ZZ为锌结合结构域，存在于肌营养不良蛋白、CREB结合蛋白中；LIR为LC3相互作用区域模体；UBA为泛素相关结构域。
图23显示了OSBPL2相互作用蛋白的基因本体(GO)富集分析的结果。图23a显示了在野生型(WT)OSBPL2免疫沉淀中鉴定的152种蛋白质的GO条目。图23(b)显示了在p.Q53Rfs*100OSBPL2免疫沉淀中鉴定的407种蛋白质的GO条目。分别对代表生物过程的GO类别进行富集分析。根据-log(p值)绘制显著富集的GO条目。
图24显示了OSBPL2对未折叠蛋白反应的影响。p.Q53Rfs*100OSBPL2的过表达没有诱导未折叠蛋白质反应。WT和p.Q53Rfs*100OSBPL2中的IRE1α、BiP和XBP1的表达水平均未改变。XBP1s为XBP1拼接；XBP1u为XBP1-未拼接。密度测定分析为至少三个独立实验的代表，根据β-肌动蛋白的条带强度归一化条带强度。ns为不显著；学生t检验。
图25显示了初始的雷帕霉素治疗导致生长迟缓。图25a显示了在出生后(P)第10天拍摄的小鼠照片。从P1天至P10天每天以2mg/kg的剂量腹腔注射雷帕霉素(图7a中的策略#1)。图25b表示未用或用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠体重变化的图。
图26显示了雷帕霉素对hQ53R-TG小鼠的影响。图26a显示了用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠(黑色，n＝5)和hQ53R-TG小鼠(红色，n＝6)在P60天的听觉脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)的阈值。当从P30天开始的一个月内每天施用雷帕霉素(图4a中的策略#3)，即使在P60天，hQ53R-TG小鼠的听力也没有改善。数据表示为平均值±SD。图26b显示，当应用策略#2时，雷帕霉素处理恢复了毛细胞和听觉神经纤维变性。整个耳蜗与鬼笔环肽(绿色)和抗NF-H抗体(红色)共染色。与未处理的hQ53R-TG小鼠相比，用雷帕霉素处理的hQ53R-TG小鼠中毛细胞和听觉神经纤维恢复得更多。比例尺：50μm。Rapa为雷帕霉素。
图27显示了TORIN1处理HEK 293细胞后OSBPL2野生型(WT)和突变蛋白的免疫荧光测量结果的图像。比例尺：50μm。
具体实施方式
在下文中，将参照实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅用于更详细地说明本发明，对于本领域技术人员来说显而易见的是，根据本发明的主题，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例
实验方法
患者和感音神经性听力损失诊断
本研究获得延世大学卫生***世福兰斯医院的机构审查委员会的批准(IRB#4-2015-0659)。本发明人获得了听力损失患者的书面知情同意书，以参与本研究并发表其临床数据，并将其纳入YUHL队列。对所有患者及其受影响和未受影响的家庭成员进行纯音和语音听力图检查。在双壁音频室中使用临床听力计测量纯音的空气传导(250-8,000Hz)和骨传导(250-4,000Hz)阈值。
听力损失的程度是通过500、1000、2000和4000Hz的空气传导平均阈值来确定的。年幼的婴儿也测定了稳态听觉反应。进行颞骨计算机断层扫描和磁共振成像以评估内耳异常。本发明人进行了概念验证临床试验，其中来自YUHL3家族的OSBPL2突变患者正在接受雷帕霉素(辉瑞)治疗。该试验得到了世福兰斯医院(#2020-0250)和食品药品***(#33042)的机构审查委员会(IRB)的批准。三名试验的低频听力功能残余的成年患者每天服用2mg雷帕霉素，持续3个月。
摄入雷帕霉素3个月和6个月后为评估的主要终点，以确定该治疗在改善纯音听力图中低频听力阈值和减少耳鸣症状方面是否安全有效。
WES
用红细胞裂解液、细胞裂解液和蛋白质沉淀溶液(iNtRon生物科技公司)从患者及其父母的外周血中提取得到基因组DNA。使用安捷伦SureSelect V5富集捕获试剂盒(安捷伦科技)和依诺米那HiSeq 2500平台(101个碱基，双末端)按前面所述(23)进行WES和突变体过滤。使用CLC Genomic Workbench(9.5.3版本)软件(Qiagen)将序列读取定位到人类参考基因组中(NCBI build 3/hg19)。所有最小覆盖率为2的变体都被使用。变体是用CLCWorkbench中的基本变体调用器调用的。
逆转录实时荧光定量PCR
使用TRIzol试剂从每个患者和健康受试者中分离全血RNA。根据制造商的说明书，在20μl的最终体积中加入1μg总RNA，使用iScriptTM Select cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，加利福尼亚州，美国)进行逆转录。根据制造商的说明书，使用StepOnePlusTM实时荧光定量PCR***和TaqMan Master Mix(美国加利福尼亚州赛默飞世尔科技)在96孔板中进行实时荧光定量PCR。使用的探针是GAPDH(Hs02758991_g1)和OSBPL2(Hs01023271_m1，赛默飞世尔科技)。每个PCR反应重复进行三次。使用GAPDH作为对照，通过阈值循环(Ct)方法计算相对基因表达水平：ΔCt＝Ct(GAPDH)-Ct(OSBPL2)。根据GAPDH归一化OSBPL2的倍数变化，计算为2-ΔΔCt。
质粒构建和定点诱变
人OSBPL2的cDNA购自傲锐基因科技(美国马里兰州)，并亚克隆到pENTR-D-TOPO载体(英杰公司，加利福尼亚州，美国)。根据制造商的说明使用LR克隆酶(英杰)构建表达载体，在N末端带上Myc或FLAG标签。OSBPL2突变克隆是使用Quick Change II XL定点诱变试剂盒(安捷伦科技)通过基于PCR的定点诱变产生的。此外，OSBPL2 cDNA被克隆到p3XFLAG-CMVTM-10(E7658，Sigma)和pCAGGS(RDB08938，Riken)中。p62/SQSTM1质粒由龙泰权博士(首尔国立大学医学院)提供。使用的载体如下：p3XFLAG507 CMVTM-7(E7408,Sigma)、pEYFP-Golgi(#6909-1)、pEYFP-ER(#6906-1,Clontech)、pCAG-mGFP-Membrane(#14757)、GFP-Rab5(#31733)和GFP-Lamp1(#16290,Addgene)。
细胞培养和转染
HEK 293和HeLa细胞使用标准方法在Dulbecco改良的基本培养基(DMEM；GibcoBRL，马里兰州，美国)补充10％胎牛血清(Gibco BRL)和青霉素(50IU/ml)/链霉素(50μg/ml)(Gibco BRL)(37℃，5％ CO2)中培养。HEI-OC1细胞在允许条件下(33℃，10％CO2)，在含有10％FBS、不含抗生素的高葡萄糖DMEM(Gibco BRL)中培养。根据制造商的说明书，使用脂质体PLUS(英杰)或TransporterTM5转染(Polysciences)试剂，用质粒转染细胞。
免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光
根据先前报道过的方法进行免疫印迹和免疫荧光(31,32)。抗OSBPL2(Proteintech,14,751-1-AP和Novus,NBP1-92,236),抗Tuj1(801201,BioLegend),抗Myo7a(25-6790,Proteus),抗神经丝-H(AB5539,Sigma),抗β-肌动蛋白(sc-1615,圣克鲁斯生物技术公司),抗BiP(ab21685),抗XBP1(ab37151,Abcam),抗Myc(2276S和5605S),抗DYKDDDDK(FLAG)(8146S和2368S),抗LC3A/B(4108S),抗p62(5114S),抗泛素(3933S),抗IREα(14C10),抗mTOR(7C10),抗磷酸化-mTOR(Ser2448)(D9C2),抗磷酸化-p70 S6 kinase(Thr389)(108D2),抗phospho-4E-BP1(Thr37/46)(236B4,Cell Signalling Technology)抗体,LysoTrackerTMRed DND-99(英杰),以及Alexa-结合的鬼笔环肽(英杰)均是从商业渠道购买的。
使用1：1,000稀释度的一抗进行免疫印迹，然后使用1：2,000稀释度的相应的抗同型二抗(Santa Cruz Biotechnology)。用SuperSignal West-Pico套件(ThermoScientific)可视化信号。使用ImageJ量化条带强度。使用EZview红色抗FLAG M2和抗c-Myc亲和凝胶(Sigma)进行共免疫沉淀。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用含有10％驴血清和1％牛血清白蛋白的封闭缓冲液中培养的细胞中检测免疫荧光。
从小鼠身上解剖的内耳在4℃的含有4％多聚甲醛(PFA)的PBS中固定1小时。将固定后的耳蜗用0.3％Triton X-100和皂苷透化30分钟，并在室温下用含有5％山羊血清的PBS封闭1小时。一抗和荧光团标记的二抗分别稀释1:50至1:1,000和1:2,000。使用卡尔蔡司LSM700或LSM780显微镜获得共聚焦图像，同时使用ZEN软件处理图像。共定位使用曼德斯共定位系数(MCC)衡量。为了定义高于70荧光阈值水平的重叠信号，使用了绿色和红色通道。然后，根据重叠信号计算平均MCC。
动物实验
动物实验方案已获得延世大学医学院机构动物保护和使用委员会的批准(#2019-553 0250)。将小鼠在无病原体的条件下饲养，从7:00AM到7:00PM进行周期性光照，且可以随意获取水和辐照鼠粮(Cat#0006972，LabDiet，密苏里州，美国)或HFD(研究饮食，D12451，新泽西州，美国)。将雷帕霉素(Sigma)溶解在DMSO(100mg/ml)中并储存在-20℃。使用前，将雷帕霉素稀释在含有5％ PEG-400和5％ Tween-80的溶液中作为储备溶液(1.2mg/ml)。每组小鼠腹腔注射的终剂量为每天2.0mg/kg。对照小鼠注射相同量的载体溶液。
Osbpl2基因敲除小鼠的产生
标记有核定位信号的Cas9和靶向Osbpl2外显子3的gRNA是从Macrogen公司(韩国首尔)购买的。gRNA活性(gRNA1：AATTAGTGGGATGATTGACTTGG，gRNA2：ACCAGCAAAAGTACTAGGAGTGG)通过使用体外切割反应敲除Osbpl2来验证。简要地，将扩增的Osbpl2在37℃下与Cas9(20nM)和sgRNA(40nM)在1×NEB 3.1缓冲液中孵育90分钟。用含有30％甘油，1.2％SDS和100mM EDTA的6×停止溶液停止反应。用电泳确认切割活性。
Osbpl2敲除小鼠由Macrogen公司生产。简要地，将母马的血清***(7.5IU)和人绒毛膜***(5IU)施用于C57BL/6N雌性小鼠。48小时后，将这些雌性小鼠与C57BL/6N雄性小鼠交配。第二天，处死雌性小鼠，获得受精胚胎。将sgRNA和Cas9混合物显微注射到单细胞胚胎中。显微注射的胚胎在37℃下孵育1至2小时。将大约14至16个注射的单细胞胚胎移植到假怀孕受体小鼠(ICR)的输卵管中。F0代出生后，通过PCR(正向：GGGTTTGCACACTTGTTTCC，反向：TCATGGACTAGCATGGGTCA)和T7E1分析对尾切样品进行基因分型。对T7E1阳性样品进行TA克隆并通过Sanger测序进行分析。以下引物用于F1代基因分型：正向，TCTATAGGGGAATTTTCAGAGGC；反向，GCGTACCTGTGCTTTTGAATTC。
转基因小鼠的产生
转基因小鼠由Macrogen公司生产。编码3XFLAG标记的野生型或p.Q53Rfs*100OSBPL2的cDNA被亚克隆到pCAGGS载体中，该载体含有鸡β-肌动蛋白启动子，位于AvrII和PvuI限制性内切酶位点之间。通过凝胶提取去除主链片段(约1.6kb)，并将约4.7kb片段显微注射到单细胞胚胎中。使用显微操纵器将4ng/μl DNA直接注射到受精卵的雄性原核中。在F0代出生后，通过尾切样品的PCR对转基因的存在进行基因分型(正向：CTGTGCGGAGCCGAAATCTG，反向：ATGGTCCACACACGCTGAAGTCGC)。目标片段大小为643bp。
ABR
ABR阈值通过Tucker-Davis Technologies(TDT)的RZ6数字信号处理硬件和BioSigRZ软件(美国佛罗里达州阿拉丘亚)在隔音室中测量得到。皮下针(电极)放置在麻醉小鼠左右耳的腹外侧顶点。使用SigGenRZ软件和RZ6数字信号处理器以4、6、8、10、12、18、24、30和42kHz的频率产生校准的短声刺激(10μs)或音突发刺激(5ms)，并使用多域1(MF1)磁扬声器(TDT)传递到耳道。
刺激强度从10dB增加到95dB SPL，每次5dB。ABR信号被输入到低美杜莎生物放大器***(RA4LI，TDT)，该***将信号传送到RZ6数字信号处理硬件。使用0.5-1kHz带通滤波器对记录的信号进行滤波，并对响应512个音突发的ABR波形进行平均。使用BioSigRZ软件确定每个频率的ABR阈值。用短声诱发ABR的波形信号作为输入/输出(I/O)函数，随着刺激水平的增加(20-90dB SPL)，计算峰值幅度(mV)。
DPOAE
DPOAE是使用TDT麦克风-扬声器***的组合来测量的。使用带有SigGenRZ软件的RZ6数字信号处理器产生主要刺激音，并通过ER 10B+麦克风(Etymotic，IL，USA)和位于耳道中的MF1扬声器传递。主音设置为频率比(f2/f1)为1.2，目标频率为6、12、16、18、22、24和30kHz。f2强度与f1强度相同(L1＝L2)。主音产生的声音通过ER 10B+麦克风接收，并使用RZ6数字信号处理器录制。DPOAE输入/输出(I/O)功能设定为在特定频率(6和30kHz)下，f2/f1为1.2，L1＝L2。主音的强度从20dB SPL增加到80dB，增量为5dB SPL。使用DP-gram对每个主音进行快速傅里叶变换，以确定两个2f1-f2畸变产物的平均频谱和本底噪声。
SEM
将内耳解剖并在室温下在0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)中用含有2.5％戊二醛的2％多聚甲醛固定2小时。固定后，将耳蜗上皮和盖膜分离，并在4℃下用2.5％戊二醛在含有2mM氯化钙和3.5％蔗糖的0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)中固定过夜。将固定后的样品在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中与2mM氯化钙在4℃下每次20分钟洗涤三次，然后使用四氧化锇(OsO4)-硫代碳酰肼(OTO)进行后固定。样品使用乙醇脱水，使用临界点干燥器(Leica 30EMCPD300，德国韦茨拉尔)干燥，固定在短管上，并使用喷涂刻蚀仪(ACE600；徕卡显微***)镀铂(20到30nm)。将铂涂层标本安装在短截支架上，并使用肖特基发射扫描电子显微镜(JSM-IT500，JEOL，东京，日本)成像。
TEM
将耳蜗在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中用2％多聚甲醛和2％戊二醛固定12小时，用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤，用1％OsO4在0.1M磷酸盐缓冲液中后固定2小时，用乙醇脱水，然后用环氧丙烷浸润2小时。将标本嵌入Poly/Bed 812试剂盒(Polysciences)，并在65℃的电子显微镜烘箱(TD-700，DOSAKA，日本)中聚合12小时。使用配备金刚石刀的超薄切片机将组织块切成200nm切片，并用甲苯胺蓝染色以进行光学显微镜观察。然后使用超薄切片机将感兴趣的区域切成80nm切片，放置在铜网格上，用3％乙酸铀酰染色30分钟和3％柠檬酸铅染色7分钟，并使用配备Megaview IIICCD相机(软成像***-德国)的透射电子显微镜(JEM-1011，JEOL，日本东京)在80kV的加速电压下成像。
WT与突变体OSBPL2之间的相互作用
从表达p3XFLAG-OSBPL2 WT，p.Q53Rfs*100或细菌碱性磷酸酶的HEK 293细胞中提取蛋白质(75mg)，将提取的蛋白质与80μl FLAG M2琼脂糖珠(Sigma)在4℃的轨道振荡器中孵育48小时。琼脂糖珠用裂解缓冲液洗涤四次，以限制非特异性结合。然后，加入含有150ng/μl 3xFLAG肽的200μl洗脱缓冲液，将样品孵育过夜。使用免疫印迹、考马斯亮蓝染色和银染分析洗脱液，并进行纳米LC-MS/MS分析。肽在C18预置柱(75μm×2cm，nanoViper，Acclaim PepMap100；赛默飞世尔科技)和C18分析柱(75μm×50cm，PepMap RSLC；赛默飞世尔科技)中分离。使用LC-MS/MS***分析肽，该***由Easy nLC 1000(赛默飞世尔科技)和配备纳米电喷雾源的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(赛默飞世尔科技)组成。使用以下软件分析协议对Uniprot人类数据库进行MS/MS谱分析。将所有蛋白质的反向序列附加到数据库中以进行FDR计算。
ProLucid用于鉴定肽，前体质量误差为5ppm，片段离子质量误差为200ppm(33)。使用DTASelect(美国加利福尼亚州斯克里普斯研究所)对输出数据文件进行过滤和排序以组成蛋白质列表，两个或以上的肽用于蛋白质鉴定，假阳性率小于0.01(34)。质谱蛋白质组学数据使用PRIDE合作伙伴存储库(数据集标识符PXD021514)存放到ProteomeXchange联盟。
GO分析
使用注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)分析了WT和p.Q53Rfs*100OSBPL2的相互作用因子。使用默认参数运行DAVID(版本6.8)在线版本中的功能注释工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。分别分析代表分子功能、细胞成分和生物过程的GO类别。p值<0.05被认为有显著差异。
通过其他mTOR抑制剂观察聚集的变化
对培养的HEK 293细胞进行免疫荧光分析。将转染的HEK293细胞在含有4％多聚甲醛的PBS中固定10分钟。将固定后的细胞用0.1％Triton X-100透化10分钟，然后用10％驴血清和1％牛血清白蛋白在室温下封闭1小时。一抗和荧光基团标记的二抗分别稀释1：50至1：1,000和1：2,000。使用卡尔蔡司LSM700或LSM780显微镜获得共聚焦图像。
统计学分析
所有定量数据均来自至少三个独立实验。对两组之间的统计学显著差异，使用GraphPad Prism 7.0软件对Bonferroni校正的学生t检验或双向方差分析进行多重比较。小于0.05的P值被认为具有统计显著性差异。
实验结果
通过全外显子组测序(WES)鉴定OSBPL2突变
延世大学听力损失(YUHL)研究募集了678个家庭。为了确定听力损失的遗传原因，本发明人在对听力损伤最常见的突变基因GJB2和SLC26A4进行预先筛选后，对202个听力损失家庭进行了WES鉴定(23)。在202个家族中，本发明人在两个家族中检测到潜在致病的OSBPL2突变，表明1.0％(2/202)的听力损失病例是由OSBPL2引起的。在这两个家庭中，患者YUHL3 III-13，IV-11和YUHL457 III-4接受了WES(图1a和1b)。根据谱系，怀疑这些家族存在常染色体显性遗传(图1a和1b)。本发明人首先检查了已知与听力损失相关的121个基因中非同义或剪接变异的WES数据，并在OSBPL2中发现了以下杂合移码变异：YUHL3中的c.158_159AAdel(p.Gln53Argfs*100，p.Q53Rfs*100)和YUHL457 c.180_181CAdel(p.His60Glnfs*93，p.H60Qfs*93)(表1和图1和9)。本发明人还发现c.180_181CAdel变体尚未在任何公共数据库中报告，包括dbSNP，EPS或gnomAD(表1)。此外，从韩国国家生物库和疾病控制与预防中心获得的627名韩国患者的全基因组测序数据集中也没有检测到这种变异(表1)。本发明人进行了Sanger测序，以检查这些OSBPL2变体是否与两个家族的受影响状态无关，并发现这些变体共同存在于YUHL457除IV-6和V-1之外的具有听力损失表型的成员中(表1和图1，9a和9b)。鉴定出的OSBPL2基因中的c.180_181CAdel(p.H60Qfs*93)变异已提交至ClinVar(接收#SCV001424910)。
OSBPL2突变的患者表现出对称性、进行性和向下发展的感音神经性听力损失，发病时间为十几岁后期至二十几岁(图1c，1d和10)。虽然听力损失的发病时间是可变的，但听力恶化到第二十几岁初才开始。听力损失的严重程度达到严重-极严重，患者最终需要植入人工耳蜗。YUHL3家族的II-5、III-4、III-13和IV-11和YUHL457家族的III-4和III-6都有植入人工耳蜗。
测试结果非常好，因此可以进行开放式听觉听力，句子理解得分在80％至100％之间。这些发现表明，人工耳蜗的植入在听觉神经病变中没有导致显著的听觉康复，这表明OSBPL2突变引起的听力损失不是听觉神经病变。
[表1]
acDNA突变根据人类cDNA参考序列编号为NM_144498.2。
bdbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)。
cNHLBI外显子组测序计划(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)。
dgnomAD浏览器(http://exac.broadinstitute.org/)。
e韩国参考基因组数据库。
fPolyPhen-2 HumVar预测分数(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)。
鉴定的变异株对OSBPL2表达的影响
本发明人发现了两个移码突变，其中一个以前已被鉴定出来。因此，4个移码突变与NSHL相关，并且都是OSBPL2外显子3中的两个碱基对缺失，导致截短蛋白添加氨基酸且长度几乎相同(图1e和1f)。本发明人检测了OSBPL2中的移码突变是否导致OSBPL2 mRNA表达降低，观察到具有和没有OSBPL2突变的个体之间OSBPL2mRNA的表达水平没有差异(图11a)。
接下来，本发明人比较了WT和突变型OSBPL2在异源***中的稳定性。过表达OSBPL2的HEK 293细胞用环己酰亚胺(100μg/ml)处理12小时以阻断蛋白质合成。蛋白质印迹分析显示，表达突变型OSBPL2的细胞具有多聚体大小的条带，而在表达WT OSBPL2的细胞中几乎没有观察到。此外，突变型OSBPL2，尤其是多聚体，比WT蛋白更稳定(图11b至11e)。
为了进一步检测鉴定的突变对OSBPL2表达的影响，本发明人进行了免疫荧光检测，以可视化HEK 293、HEI-OC1和HeLa细胞中野生型(WT)和突变型的OSBPL2。WT OSBPL2弥漫分布在所有细胞系的整个细胞质中(图2a和12a)。OSBPL2突变截短蛋白p.R50Afs*103、p.Q53Rfs*100和p.H60Qfs*93在所有细胞系中过表达时形成聚集体；然而，错义变体p.L195M没有形成细胞质聚集体，并且具有与WT蛋白相似的定位模式(图2a和12a)。蛋白质印迹分析还显示过表达截短OSBPL2的细胞中存在多聚体条带，但在过表达WT或p.L195MOSBPL2的细胞中没有多聚体条带(图2b和12b)，表明p.L195M错义变异在病理上可能与其他截短突变体不同。对应于多聚体的条带强度在溶酶体抑制剂巴非霉素A1处理后进一步增加(图2b)。由于已知OSBPL2形成四聚体(12)，本发明人检测截短的突变蛋白是否仍然可以与WT OSBPL2蛋白相互作用，即使它缺乏氧化固醇结合结构域(图1e)。免疫共沉淀表明p.Q53Rfs*100可与WT蛋白形成二聚体(图13a和13b)，表明突变蛋白可能是显性抑制。
此外，结果表明WT OSBPL2与ER标记共定位，而p.Q53Rfs*100OSBPL2与核内体和溶酶体标记共定位(图2c)。
Osbpl2基因敲除小鼠未表现出听力损失
本发明人证实了OSBPL2在小鼠内耳中普遍表达，包括内毛细胞和外毛细胞、支持细胞、神经节神经元细胞和血管纹上皮细胞(图3a)。由于杂合子OSBPL2突变可能通过单倍体不足或显性抑制效应导致常染色体显性听力损失，因此本发明人首先使用CRISPR-Cas9***产生Osbpl2敲除(KO，Osbpl2-/-)小鼠。将引导RNA设计为靶向Osbpl2的外显子3(图3b)，以便在OSBPL2的外显子3中发生人类中鉴定的移码突变(表1)，并使用T7E1测定筛选所得的编辑后的等位基因(图14a)。通过基因分型和蛋白质印迹分析确认Osbpl2靶向(图14b和14c)。Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠与它们的WT后代没有太大区别。本发明以30天为间隔，至出生后第(P)180天，通过测量听觉脑干反应(ABR)对短声刺激或纯音刺激的阈值，来确定Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠的听力敏感性。Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠在所有频率下的短声和纯音刺激的ABR阈值均与Osbpl2+/+小鼠相当(图3c和14d)。反映耳蜗外毛细胞扩增功能的畸变产物耳声发射(DPOAE)阈值在任何基因型之间均无显著差异(图.3d)。全视野免疫荧光和扫描电子显微镜(SEM)显示，P120天时Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠的OHC静纤毛束与Osbpl2+/+小鼠相当(图14e)。组织学和免疫荧光染色显示，不同基因型的整体耳蜗形态和嘌呤霉素神经元(SGN)没有差异(图14f)。在猪模型中，高脂肪饮食(HFD)加剧了听力损失的发展；因此，本发明人研究了HFD是否诱导Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠的听力损失。然而，Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠在断奶到16周后摄入HFD，没有表现出听力损失或任何形态变化(图3e，3f，15a和15b)。此外，在喂食HFD两个月的Osbpl2-/-小鼠中未观察到高胆固醇血症(图8g)，Osbpl2+/-和Osbpl2-/-小鼠的甘油三酯、高密度脂蛋白、食物摄取、活性、体重、脂肪组成和能量消耗总体上与Osbpl2+/+小鼠相似(图8g和16a至16e)。本发明人还检查了有或没有杂合子OSBPL2突变的患者的血脂谱。OSBPL2杂合c.158159AAdel患者的脂质和脂蛋白水平与没有等位基因的对照患者相似(图17a至17f)，表明这些患者的听力损失不是由于脂质代谢异常引起的。这些发现不仅表明OSBPL2的功能对正常听力不是必要的，而且还表明单倍体不足或显性抑制效应不是Osbpl2+/-或Osbpl2-/-小鼠听力损失的原因。
表达p.Q53Rfs*100的转基因小鼠再现了听力损失。
由于Osbpl2-/-小鼠没有表现出听力损失和高胆固醇血症，本发明人假设截短的OSBPL2可能有在WT OSBPL2中没有观察到的额外功能。为了证明这一点，本发明人构建了一种基因敲入小鼠模型，其中引入了在人类患者中鉴定出的移码突变，或者构建了一种表达人类突变型OSBPL2的转基因小鼠模型。删除Osbpl2 cDNA第158位和第159位的两个AA碱基，以模拟人类c.158_159AAdel(p.Q53Rfs*100)突变，所得蛋白(p.Q53Rfs*46)缩短为46个氨基酸(图18a)。此外，小鼠p.Q53Rfs*46OSBPL2不形成细胞质聚集体或多聚体(图10b和10c)。因此，本发明构建了一种转基因小鼠模型，其表达N末端标记FLAG的p.Q53Rfs*100OSBPL2突变体(图4a，hQ53R-TG)。通过基因分型确认成功转基因(图19a)，并在内耳和大脑中高表达(图4b)。hQ53R-TG小鼠存活，可育，并以预期的孟德尔比率出生，没有表现出任何严重异常。此外，在P14天，在hQ53R-TG小鼠科蒂氏器中耳蜗的组织和形态中没有观察到明显的缺陷(图19b)。然而，与Osbpl2-/-小鼠不同，在P60天，hQ53R-TG小鼠在所有频率上都表现出明显高于的对照的ABR和DPOAE阈值(图4c和4d)。在耳蜗的免疫荧光染色中，在听觉毛细胞和SGN中观察到转基因表达，鬼笔环肽染色显示了hQ53R-TG中毛细胞的变性(图4e)。免疫荧光和组织学分析还显示，在hQ53R-TG小鼠中，科蒂氏器的毛细胞严重退化，SGNs显著减少(图4f和19c)。此外，本发明构建了一种转基因小鼠模型，其表达N末端标记FLAG的野生型OSBPL2(图20a至20c，hWT-TG)。然而，与hQ53R-TG小鼠不同，在P90天hWT-TG小鼠没有发展到听力损失(图20d至20f)。这些结果表明，p.Q53Rfs*100OSBPL2突变蛋白的表达通过耳蜗变性破坏听力功能。
截短的OSBPL2突变体导致内溶酶体稳态缺陷和自噬受损。
四个致病性OSBPL2突变导致几乎相同的截短蛋白，形成细胞质聚集体(图11e，11f和12)，本发明人对其进行了蛋白质组学分析，以通过鉴定其相互作用组来了解突变体OSBPL2的功能(图21)。本发明人用N末端FLAG标记的WT和p.Q53Rfs*100OSBPL2瞬时转染HEK293细胞。
使用抗FLAG磁珠亲和纯化后，使用液相色谱与高分辨率质谱仪(LC-MS/MS)分析蛋白质洗脱液。总共有152和407种蛋白质分别被鉴定为WT或突变体OSBPL2的相互作用因子。其中，人类参考相互作用组(http://www.interactome-atlas.org/)中报道过的WT OSBPL2的相互作用因子VAPB和SNRPF被分离出来(图5a)。有趣的是，自噬体载货蛋白p62/SQSTM1(24)也被鉴定为WT和突变体OSBPL2的相互作用因子(图5a)。本发明人使用免疫共沉淀证实了这种相互作用，发现与WT OSBPL2和p62之间的相互作用相比，p.Q53Rfs*100OSBPL2和p62之间的相互作用非常弱(图22a)。p62通过其包含的ZZ结构域、LIR模体或两者组合的区域与WT OSBPL2相互作用(图22b)。基因本体(GO)分析表明，仅与p.Q53Rfs*100相互作用的蛋白质参与蛋白质稳定，巨自噬，核内体组织，TORC1信号传导的调节和泛素化(图5b和23)。
由于p.Q53Rfs*100与核内体和自噬相关的蛋白质相互作用，本发明人首先通过测量总LC3水平和LC3-II：LC3I比值来检测WT和突变型OSBPL2对自噬通量的影响。p.Q53Rfs*100OSBPL2的过表达降低了活性膜上LC3II与胞质LC3I的比值(图5c)。p.Q53Rfs*100OSBPL2的过表达也增加了一种酸性染料LysoTracker的信号(图5d)，并降低了引入葡聚糖的降解(图5e)。
OSBPL2蛋白的免疫沉淀显示，与过表达WT OSBPL2的细胞相比，过表达p.Q53Rfs*100OSBPL2的细胞中高分子量多泛素化蛋白的水平增加(图6a)。有趣的是，雷帕霉素处理降低了多泛素化蛋白水平和p.Q53Rfs*100的多聚体大小条带(图6a)。p.Q53Rfs*100OSBPL2的过表达导致mTOR磷酸化增加(图6b)，但没有改变与未折叠蛋白反应相关的蛋白质的表达，例如IRE1α、BiP和XBP1(图24)。在雷帕霉素处理后也降低了由p.Q53Rfs*100OSBPL2引起的mTOR磷酸化增强(图14b)。p.Q53Rfs*100OSBPL2与LC3和p62的部分共定位，在雷帕霉素处理后增强(图6c至6f)。
雷帕霉素部分恢复hQ53R-TG小鼠和DFNA67患者的听力损失表型
由于雷帕霉素在体外降低了p.Q53Rfs*100的多聚体条带，本发明人研究了雷帕霉素是否可以恢复hQ53R-TG小鼠的听力损失。因为早在P21天时就检测到hQ53R-TG小鼠的听力障碍，本发明人每天从P1天开始给予雷帕霉素(图7a，策略#1)，但由于生长迟缓在P10天停止注射(图25)。从P30天开始，每天给药雷帕霉素，给药一个月，但在P60天测量听力时没有显示出疗效(图7a，策略#3和图26a)。因此，本发明人从P7天至P15天每天注射雷帕霉素，然后在P30天测量听力灵敏度(图7a，策略#2)。有趣的是，雷帕霉素治疗显著降低了ABR和DPOAE阈值，特别是在hQ53R-TG小鼠的低频下(图7b至7d)。组织学和免疫荧光分析显示，与未处理的小鼠相比，雷帕霉素处理后的hQ53R-TG小鼠中维持了毛细胞和SGN(图7和26b)。此外，雷帕霉素处理后p.Q53Rfs*100OSBPL2表达显著降低(图7e)。在P60天对耳蜗的SEM观察表明，与对照小鼠相比，hQ53R-TG小鼠的静纤毛异常，但在对hQ53R-TG小鼠施用雷帕霉素治疗后部分恢复(图7f)。透射电子显微镜(TEM)显示hQ53R-TG小鼠中1型SGNs的细胞质中具有大的电子致密结构，类似于不溶性蛋白质沉积物，但雷帕霉素处理显著减少了这些结构(图7g)。
基于这些发现，本发明人进行了一项概念验证临床试验，其中雷帕霉素(Rapamune，辉瑞)被施用于来自YUHL3和YUHL457家族的OSBPL2突变患者。向五名轻度至重度听力损失的成年患者施用2mg雷帕霉素，每天一次，持续3个月(图8a)。
总之，如3,000Hz的纯音听力图所示，听力障碍得以挽救(图8b)。在一名最初对DPOAE表现出反应(YUHL457：IV-2)的患者中，双侧信噪比增加(图8c至8e)。在五名患者中有三名发现了耳鸣症状；根据耳鸣障碍量表(THI)问卷，两名轻度至中度听力损失患者的症状得到缓解，一名重度听力损失患者的症状没有变化(图8f)(25)。治疗3个月后，3例患者未观察到严重的副作用或其他安全问题。
综上所述，这些发现表明自噬缺陷参与了hQ53R-TG小鼠听力损失的发病机制，并表明雷帕霉素可作为治疗由OSBPL2突变引起的听力损失的有效治疗组合物。
聚集突变体OSBPL2 p.Q53Rfs*100被Torin1有效还原。
为了对HEK293细胞中的野生型(WT)和突变型OSBPL2进行免疫荧光分析，用抗Myc(OSBPL2)抗体对细胞进行免疫染色。WT OSBPL2均匀存在于细胞质中，而截短的OSBPL2突变蛋白在大多数细胞中表现出聚集形式。然而，用1μM Torin1处理显著降低了突变型OSBPL2聚集体，但不影响WT OSBPL2(图27)。
尽管参照具体特征详细描述了本发明，但对于本领域技术人员显而易见的是，该描述仅仅是其优选实施例，并不限制本发明的保护范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求及其等同物来定义。
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<110> 延世大学校产学协力团
<120> 包含自噬激活剂作为活性成分的组合物用于预防或治疗非综合征性常染色体显性耳聋
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130 135 140
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145 150

Claims (13)

1.一种用于预防或治疗非综合征性听力损失的组合物，其含有作为活性成分的自噬激活剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述自噬激活剂为mTOR(雷帕霉素的机制性靶标)抑制剂。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述mTOR抑制剂选自下组中的至少一种：雷帕霉素、Torin 1、依维莫司、子囊霉素、替西罗莫司、佐他莫司、利罗莫司、AP23841、AZD08055、OSI027及其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述非综合征性听力损失是由氧化固醇结合蛋白样2基因(OSBPL2)突变引起的听力损失。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述非综合征性听力损失为非综合征常染色体显性遗传67耳聋(DFNA67)。
6.一种用于诊断非综合征性听力损失的组合物，其含有作为活性成分的试剂，用于检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由其编码的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述用于检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的试剂是与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列特异性结合的引物或探针。
8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述用于检测由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的试剂是与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列特异性结合的适配体。
9.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述非综合征性听力损失是由氧化固醇结合蛋白样2基因(OSBPL2)突变引起的听力损失。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述非综合征性听力损失为非综合征常染色体显性遗传67耳聋(DFNA67)。
11.一种用于筛选预防或治疗非综合征性听力损失的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使测试物质与含有mTOR的生物样品或表达mTOR的细胞接触；
(b)测量mTOR的活性或表达水平，其中，如果mTOR的活性或表达水平降低，则确定测试物质为预防或治疗非综合征性听力损失的组合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述非综合征性听力损失是由氧化固醇结合蛋白样2基因(OSBPL2)突变引起的听力损失。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述非综合征性听力损失为非综合征性常染色体显性遗传67耳聋(DFNA67)。
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