CN117143997B - 一种用于pkd1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法,所述引物组包括6对引物,用于扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围,每对引物的扩增产物之间均有10kb以上的重叠区域。本发明通过设计一组引物,成功扩增整个PKD1基因,建库过程不需要再进行PCR扩增,利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变,携带者单体型构建过程无需其他家系样本;本发明检测结果能够媲美样本进行WGS测序,大大降低了检测成本和检测周期,更加适用于临床检测服务。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体涉及一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
成人多囊肾病(polycystic kidney disease, PKD)是一种常见的遗传性肾脏疾病,大多数为常染色体显性遗传。患者多在成年后发病,发病率估计为1/400~1/1000。常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是最常见的遗传性肾脏病,遗传学研究表明该病的发生主要由于蛋白激酶D1(PKD1)或蛋白激酶D2(PKD2)突变引起的,其中PKD1为Ⅰ型多囊肾病,占据约80%~85%的病例;PKD2为Ⅱ型多囊肾病,占据约10%~15%的病例。ADPKD的特点是在任何年龄均可发病,多发于30~50岁,具有常染色体显性遗传特征,代代发病,基因缺陷引起的临床异常除了累积肾脏外,还伴有肝囊肿、胰腺囊肿、***、血管***及心脏瓣膜结构的畸形等症状。全球约1200万患者深受该疾病的影响,约有50%患者会发展到终未期肾功能衰竭,需要通过异源肾脏移植或者终身血液透析治疗维持生命。而在我国大约有150万人群饱受此疾病折磨。ADPKD不仅给患者造成严重的身体和精神上的折磨,同时给患者家庭带来沉重的经济负担。因此,对患者进行基因检测能够明确疾病发生的原因,预后判断直系亲属,提供产前诊断结果,为生育健康婴儿加强一份保障。
PKD1基因定位于人类染色体第16号染色体短臂1区3带3亚带 (16p13.3),基因全长约47kb,共有46个外显子,编码4302个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白——多囊蛋白1(polycystin 1, PC1)。PKD1基因在16号染色体上存在着与其同源的6个假基因,假基因与其基因的1~33号外显子序列同源性高达97.7%,据报道,大约80%的致病突变发生在此区域,并且在此区域内有部分DNA序列GC含量高达85%,导致基因扩增存在一定的难度,对突变位点的验证也较为困难。除此之外,PKD1基因突变类型较多,且无突变热点,涉及到整个基因,因此针对PKD1基因的特异性检测极具挑战。
由于PKD1基因本身的结果特点以及突变类型,随着新技术的不断发展,PKD1基因的检测方法也在不断革新。目前检测PKD1的方法有LR-PCR、变性高效液相色谱、LR-PCR联合高通量测序、外显子捕获-高通量测序方法等。变性高效液相色谱技术用于PKD1基因突变筛查方法,虽然在一定程度上能够提高突变检测率,但是检测结果存在不稳定性以及结果的准确性也有待提高。目前较为经典的检测PKD1基因突变的方法为巢式PCR-Sanger测序,该方法需要先将目的基因通过LR-PCR进行扩增后,再针对突变位点再次进行靶向扩增测序后分析结果,该技术耗费人力较大,成本高昂且效率低下。张树忠等人联合采用LR-PCR和巢式PCR扩增的方法扩增PKD1全编码区来确定突变的具***点和类型,研究中用到的引物高达几十组,虽然结果较为准确,但是操作十分繁琐,需要结合变性高效液相色谱技术,检测成本较高且检测效率有待提升。此外TW201339309A公开了一种检测PKD1基因突变的引物组和试剂盒,其与张树忠等人的研究类似,也存在同样的问题。萧畔等人通过PCR特异性扩增PKD1基因的12、14、21外显子片段,检测区域有限,不具备检测PKD1整个基因区域的变异,具有一定的局限性。CN104531883A公开了一种检测PKD1基因突变的试剂盒和检测方法,通过5~8对长片段扩增子扩增PKD1基因2~46号外显子进行扩增,随后采用NGS的方法进行检测,虽然该方法能够快速高效地检测样本,但是由于该技术方法具有GC偏好性,对于PKD1基因高GC区域检测仍然具有缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷,提供一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法。本发明通过设计一组引物,成功扩增整个PKD1基因,建库过程不需要再进行PCR扩增,利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变,携带者单体型构建过程无需其他家系样本;本发明检测结果能够媲美样本进行WGS测序,大大降低了检测成本和检测周期,更加适用于临床检测服务。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
一种用于PKD1基因突变检测的引物组,所述引物组包括6对引物,用于扩增PKD1基因整个区域,每对引物的扩增产物之间均有10kb以上的重叠区域;
所述6对引物的序列如下(hg19参考基因组):
用于扩增PKD1基因chr16:2130793-2144241的引物,其正向引物序列如SEQ IDNO:1所示,反向引物序列如SEQ ID NO:2所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2134219-2154799的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:3所示,反向引物序列如SEQ ID NO:4所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2144661-2166375的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:5所示,反向引物序列如SEQ ID NO:6所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2151918-2173659的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:7所示,反向引物序列如SEQ ID NO:8所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2158065-2178648的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:9所示,反向引物序列如SEQ ID NO:10所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2171520-21918496的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:11所示,反向引物序列如SEQ ID NO:12所示。
所述6对引物的序列具体如表1所示:
表1 本发明采用LR-PCR扩增PKD1基因的引物序列
注:表中F为正向引物(上游引物),R为反向引物(下游引物);表中的PCR引物从上到下依次为:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
优选地,所述引物组用于扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围。
一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒,所述试剂盒用于PKD1基因突变检及PKD1基因单体型构建,包括如上所述的用于PKD1基因突变检测的引物组,所述引物组中的每个引物的浓度优选为10μM。
优选地,所述试剂盒包括用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂、和/或用于从样本中提取基因组DNA的试剂及处理后的PCR产物用于三代Nanopore测序的试剂。
优选地,所述用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂包括2×Phanta FlashMaster Mix,其包括DNA聚合酶、缓冲液和dNTP;所述DNA聚合酶优选为高保真性、高产量性、快速延伸性以及适用于高GC体系的DNA聚合酶混合物。
优选地,PCR反应总体系为50μL,包括2×Phanta Flash Master Mix 25μL、上下游引物各2μL(浓度10μmol/L)、DNA模板2μL(DNA量50~60ng)、PCR Enhancer 10μL、超纯水补足至50μL体系。
上述试剂可商购获得也可配制获得,商购途径以及配制方法为本领域技术人员公知。
优选地,所述试剂盒通过优化的反应时间和反应温度,扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围。
一种采用如上所述引物组或试剂盒用于非疾病诊断目的的体外检测PKD1基因突变以及构建PKD1基因单体型的方法,包括如下步骤:
(1)从受试者外周血样本中提取基因组DNA;
(2)以基因组DNA为模板,使用所述的用于PKD1基因突变检测的引物组,设定优化的反应时间和反应温度,每对引物单独扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围;
(3)对步骤(2)得到的6个PCR产物进行纯化回收;
(4)对纯化后的PCR产物进行浓度测定,按照一定比例混合纯化后的PCR产物,即可得到1个受试者PCR产物混合物;
(5)将受试者的PCR产物混合物直接构建Nanopore文库,在MinION芯片上进行ONT测序,获得长片段PCR产物的序列;
(6)通过Clair3软件对获得的PCR产物数据进行分析,将得到的序列片段比对到参考PKD1基因上,提取SNVs和Indels,确定样本PKD1基因SNVs以及单体型情况。
优选地,所述步骤(2)中,所述反应时间和反应温度为:
PCR循环参数设定:98℃-30s,循环数1 cycle;98℃变性10s,Tm-20s,72℃-6min,循环数为20~60 cycles,优选为35 cycles,72℃延伸5min;其中1、3和5号扩增子引物Tm为60~70℃,优选为64℃;2、4和6号扩增子引物Tm为60~70℃,优选为66℃。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)针对于PKD1基因本身的结果特点以及突变类型,本发明提供了一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法;本发明利用6对长片段扩增子引物,扩增PKD1基因整个区域,每对引物扩增产物之间都有10kb以上的重叠区域;通过利用长片段PCR技术靶向扩增整个PKD1基因及其上下游共约15kb范围,将纯化后的PCR产物按照一定比例混合后直接构建ONT文库,利用Nanopore测序仪mk-1C进行测序,通过生物信息学分析获得PKD1基因单体型信息或者直接检测PKD1基因突变信息;
(2)本发明通过设计一组引物,成功扩增整个PKD1基因,建库过程不需要再进行PCR扩增,利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变,携带者单体型构建过程无需其他家系样本;
(3)本发明检测结果能够媲美样本进行WGS测序,大大降低了检测成本和检测周期,更加适用于临床检测服务。
附图说明
图1为本发明实施例1中的LR-PCR扩增PKD1基因长片段扩增子扩增结果示意图;琼脂糖凝胶电泳图结果显示PKD1基因的6个扩增子产物条带单一,片段大小1号为13449bp,其他5个扩增子片段大小在20.3~21.7kb;其中23kb Marker为DNA marker(λDNA/HindIII,solarbio);15kb Marker为DNA marker(Trans15K DNA Marker,全式金生物),泳道1~6分别为LR-PCR扩增PKD1基因1~6号长片段扩增子;
图2为本发明实施例1中的1例临床样本PKD1基因Oxford Nanopore测序的IGV可视化图;图中显示6个扩增子(引物设计位置:2130793~2196637,hg19)在PKD1基因所有内含子和外显子区域覆盖度达到100%;
图3为本发明实施例1中的PKD1阳性样本突变位点检出结果的IGV视图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容,下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解,这些实施例仅用于对本发明进一步说明,而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明所述的内容后,该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整,仍属于本发明的保护范围。
以下结合1例前期做过三代全基因组测序的样本以及1例PKD1阳性患者进行详细说明。在具体实施方式中,本发明通过利用长片段PCR技术靶向扩增整个PKD1基因及其上下游共约15kb范围,将纯化后的PCR产物按照一定比例混合后直接构建ONT文库,利用Nanopore测序仪进行测序,通过生物信息学分析获得PKD1基因单体型信息或者直接检测PKD1基因突变信息。本发明通过设计一组引物,成功扩增整个PKD1基因,建库过程不需要再进行PCR扩增,利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变,携带者单体型构建过程无需其他家系样本。
实施例1
一、样本基因组DNA提取
取出受试者0.2ml外周血样本,按照血液基因组DNA提取试剂盒操作说明进行DNA提取。用Qubit试剂测定提取的DNA样本,该DNA样本为用于下一步PCR反应的模板。本实施例结合1例前期做过三代全基因组测序的样本以及1例PKD1阳性患者进行检测,PKD1阳性患者致病位点为已知突变类型Chr16:2160724 c.4444C>T。
二、LR-PCR扩增PKD1基因
根据PKD1基因序列,设计合成6对PKD1基因扩增引物。采用Phanta Flash MasterMix进行LR-PCR扩增,共扩增6个大片段序列,名称分别为1~6号扩增子,引物序列以及扩增产物大小如表1所示。PCR反应总体系为50μL,包括2×Phanta Flash Master Mix 25μL、上下游引物各2μL(浓度10μmol/L)、DNA模板2μL(DNA量50~60ng)、PCR Enhancer(北京诺唯赞生物科技有限公司)10μL、超纯水补足至50μL体系。PCR循环参数设定:98℃-30s,循环数1cycle;98℃变性10s,Tm-20s,72℃-6min,循环数为35 cycles,72℃延伸5min。其中1、3和5号扩增子引物Tm为64℃;2、4和6号扩增子引物Tm为66℃。
LR-PCR反应结束后,取出5μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳。结果显示6个扩增子的片段大小和设计的理论值一致,并且条带清晰(见图1)。
三、PCR产物纯化处理
将得到的PCR产物通过Agencourt XP磁珠(美国Beckman Coulter公司)进行纯化,磁珠量和PCR体系按1:1等量混合,震荡混匀后室温放置3min。瞬时离心后放置于磁力架上进行吸附,待溶液澄清后吸弃上清。用80%的乙醇清洗2遍磁珠后,吸弃多余的乙醇晾至磁珠表面干燥后,加入无核酸酶的水洗脱,用Qubit 2.0核酸蛋白定量仪对纯化后的产物进行浓度测定。
将纯化后的6个扩增子按照一定比例进行混合,混合后的DNA量不低于1000ng。
四、文库构建
文库构建采用Oxford Nanopore Technologies的Ligation Sequencing Kit(SQK-LSK110)进行操作,具体步骤如下:
1、NDA末端修复反应
1)将所用试剂置于冰上溶解;
2)在Eppendorf管中按下表加入试剂:
3)使用移液枪轻轻混匀,若要保留长片段的完整性,可手指轻弹混匀;
4)使用PCR仪进行20℃,5min和65℃,5min的扩增;
5)准备磁珠,震荡混匀,室温平衡30min;
6)将扩增完的样本分别转移到1.5mL离心管里;
7)将60μL重悬的磁珠加入到样本中,轻弹试管混合;
8)在四维旋转仪上室温孵育5min;
9)每个样本准备500μL,70%的无水乙醇溶液;
10)将样本放在磁力架上,静置后吸去上清液,样本保持在磁力架上,加入200μL70%的无水乙醇溶液,静置30s,弃掉酒精,重复一次(加入200μL 70%的无水乙醇溶液,静置30s,弃掉酒精);
11)使用移液枪吸除乙醇,干燥30s,避免干燥至磁珠裂开;
12)从磁力架上取下试管,将磁珠重悬于27μL NF水中,室温孵育2min;
13)将试管置于磁力架上,直至洗脱液澄清;
14)将27μL洗脱液转移至新的1.5mL离心管中;
15)取出1μL进行定量,所得样本目标量>700ng(Qubit浓度为20~60 ng/μL)。
2、barcode 连接反应
1)室温解冻Native barcode,每个样需要一个barcode;
2)将末修后500ng的样本溶解至22.5μL NF水里;
3)按顺序加入下表中的试剂,轻弹混匀;
4)使用移液枪轻轻混匀,若要保留长片段的完整性,可手指轻弹混匀;
5)在四维旋转仪上室温孵育10min;
6)将50μL重悬的磁珠加入到样本中,轻弹试管混合;
7)在四维旋转仪上室温孵育5min;
8)每个样本准备500μL,70%的无水乙醇溶液;
9)将样本放在磁力架上,静置后吸去上清液,样本保持在磁力架上,加入200μL70%的无水乙醇溶液,静置30S,弃掉酒精,重复一次(加入200μL 70%的无水乙醇溶液,静置30s,弃掉酒精);
10)使用移液枪吸除乙醇,干燥30s,避免干燥至磁珠裂开;
11)从磁力架上取下试管,将磁珠重悬于28μL NF水中,室温孵育2min;
12)将试管置于磁力架上,直至洗脱液澄清;
13)将28μL洗脱液转移至新的1.5mL离心管中;
14)取出1μL进行定量(Qubit浓度为5~15ng/μL);
15)对加了不同barcode的样本进行等摩尔量(技术支持推荐)混合至1.5mL离心管中,使合并的样本量达到700ng;
16)将700ng样本稀释到65μL NF水中;
17)如果700ng的混合样本体积超过65μL,用2.5倍磁珠对混样进行纯化,并用65μLNF水洗脱产物。
3、Adapter 连接反应
1)室温涡旋融化EB,NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer(5×),涡旋T4Ligase和AMⅡ,置于冰上待用;
2)按照下表体系加入反应试剂:
3)轻弹试管并涡旋,在四维旋转仪上室温孵育10min;
4)准备磁珠,震荡混匀,室温平衡30min;
5)将50μL重悬的磁珠加入到样本中,轻弹试管混合;
6)在四维旋转仪上室温孵育5min;
7)将样本放在磁力架上,静置后吸去上清液,样本保持在磁力架上,使用250μLLFB清洗;
8)使用移液枪吸除上清,将样本取出磁力架,加入250μL LFB,轻弹使磁珠重悬后将样本置于磁力架,静置后吸去上清液;
9)重复步骤8)一次;
10)干燥30s,将样本取出磁力架,使用15μL的EB重悬,室温孵育10min,对于高分子量DNA,在37℃下金属浴培养10min可以提高长片段的回收率;
11)将样本置于磁力架上静置至洗脱液澄清,将15μL的洗脱液转移至1.5mL离心管中;
12)取出1μL进行定量,所得样本目标量约430ng(Qubit浓度为5~30ng/μL)。
五、Oxford Nanopore测序
在一个新的1.5mL离心管中加入以下试剂并涡旋混匀,即上机样本:
上机操作按照Oxford Nanopore测序仪说明书进行测序操作。测序仪采用OxfordNanopore MinION Mk1C单分子实时测序***,其MinION cell含有512个纳米孔通道,能够将每一条DNA样本进行单分子实时测序,将DNA序列转化为电信号。
六、结果分析
Nanopore超长读长原始下机数据为fast5格式,经过basecalling后将fast5格式转化成fastq格式,随后使用minimap2软件将fastq数据比对至GRCh37/hg19参考基因组,并使用Clair3软件对minimap2所生成的bam进行变异检测并且分型。最后,并使用IGV软件查看结果及绘制相关图谱。
1例测试过WGS数据的样本LR-PCR检出SNP和Indels结果以及单体型构建结果与WGS分析结果进行对比。PKD1临床样本通过数据分析得到了该患者PKD1基因上SNP、Indels位点以及单体型情况,随后通过巢式PCR验证了该患者检出SNP的准确性,并且检测该患者父母双方验证了单体型构建的准确性。
结果分析:
通过LR-PCR的方案扩增PKD1基因,图1显示了每个扩增子扩增片段大小和条带单一情况。从图1中可以看出,每个扩增子的条带单一,片段大小跟设定范围一致。本发明检测了1例阳性PKD1患者样本,如图2所示,通过IGV观察到设计的长片段扩增子能够完全覆盖整个PKD1基因区域,最低区域的测序深度也在30×以上。此外,通过LR-PCR的方法均可以成功检测到患者致病位点(如图3所示),并构建了该患者PKD1单体型,并且通过巢式PCR检测该患者父母双方验证了单体型构建的准确性。
表2为该患者单体型信息表以及通过巢式PCR验证父母双方对应位点检出SNP情况。另外如表3所示对比了1例做过WGS的非PKD1阳性样本数据的单体型构建结果和LR-PCR结果,结果发现,LR-PCR较WGS会有假阳性Indels检出,主要是由于基因结构中存在PolyA和PolyT结构会导致假Indels检出,其他SNP和Indels检出以及单体型构建的准确性与WGS结果相一致。
表2为本发明实施例1中的PKD1阳性样本单体型构建结果
表3 本发明实施例1中的WGS与LR-PCR单体型构建结果对比
注:加粗位点表示LR-PCR多检出位点。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,做出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于PKD1基因突变检测的引物组,其特征在于,所述引物组包括6对引物,所述6对引物的序列如下:
用于扩增PKD1基因chr16:2130793-2144241的引物,其正向引物序列如SEQ ID NO:1所示,反向引物序列如SEQ ID NO:2所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2134219-2154799的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:3所示,反向引物序列如SEQ ID NO:4所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2144661-2166375的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:5所示,反向引物序列如SEQ ID NO:6所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2151918-2173659的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:7所示,反向引物序列如SEQ ID NO:8所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2158065-2178648的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:9所示,反向引物序列如SEQ ID NO:10所示;
用于扩增PKD1基因chr16:2171520-21918496的引物,其正向引物序列SEQ ID NO:11所示,反向引物序列如SEQ ID NO:12所示。
2.一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1所述的用于PKD1基因突变检测的引物组。
3.如权利要求2所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒,其特征在于,所述引物组中的每个引物的浓度为10μM。
4.如权利要求2所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂、和/或用于从样本中提取基因组DNA的试剂及处理后的PCR产物用于三代Nanopore测序的试剂。
5.如权利要求4所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒,其特征在于,所述用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂包括2×Phanta Flash Master Mix,其包括DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。
6.如权利要求5所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒,其特征在于,PCR反应总体系为50μL,包括2×Phanta Flash Master Mix 25μL、上下游引物各2μL、每个引物的浓度为10μmol/L、DNA模板2μL、DNA量为50~60ng、PCR Enhancer 10μL、超纯水补足至50μL体系。
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