CN117143997B - 一种用于pkd1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于pkd1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法，所述引物组包括6对引物，用于扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围，每对引物的扩增产物之间均有10kb以上的重叠区域。本发明通过设计一组引物，成功扩增整个PKD1基因，建库过程不需要再进行PCR扩增，利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变，携带者单体型构建过程无需其他家系样本；本发明检测结果能够媲美样本进行WGS测序，大大降低了检测成本和检测周期，更加适用于临床检测服务。

Description

一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
成人多囊肾病(polycystic kidney disease, PKD)是一种常见的遗传性肾脏疾病，大多数为常染色体显性遗传。患者多在成年后发病，发病率估计为1/400~1/1000。常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是最常见的遗传性肾脏病，遗传学研究表明该病的发生主要由于蛋白激酶D1(PKD1)或蛋白激酶D2(PKD2)突变引起的，其中PKD1为Ⅰ型多囊肾病，占据约80%~85%的病例；PKD2为Ⅱ型多囊肾病，占据约10%~15%的病例。ADPKD的特点是在任何年龄均可发病，多发于30~50岁，具有常染色体显性遗传特征，代代发病，基因缺陷引起的临床异常除了累积肾脏外，还伴有肝囊肿、胰腺囊肿、***、血管***及心脏瓣膜结构的畸形等症状。全球约1200万患者深受该疾病的影响，约有50%患者会发展到终未期肾功能衰竭，需要通过异源肾脏移植或者终身血液透析治疗维持生命。而在我国大约有150万人群饱受此疾病折磨。ADPKD不仅给患者造成严重的身体和精神上的折磨，同时给患者家庭带来沉重的经济负担。因此，对患者进行基因检测能够明确疾病发生的原因，预后判断直系亲属，提供产前诊断结果，为生育健康婴儿加强一份保障。
PKD1基因定位于人类染色体第16号染色体短臂1区3带3亚带 (16p13.3)，基因全长约47kb，共有46个外显子，编码4302个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白——多囊蛋白1(polycystin 1, PC1)。PKD1基因在16号染色体上存在着与其同源的6个假基因，假基因与其基因的1~33号外显子序列同源性高达97.7%，据报道，大约80%的致病突变发生在此区域，并且在此区域内有部分DNA序列GC含量高达85%，导致基因扩增存在一定的难度，对突变位点的验证也较为困难。除此之外，PKD1基因突变类型较多，且无突变热点，涉及到整个基因，因此针对PKD1基因的特异性检测极具挑战。
由于PKD1基因本身的结果特点以及突变类型，随着新技术的不断发展，PKD1基因的检测方法也在不断革新。目前检测PKD1的方法有LR-PCR、变性高效液相色谱、LR-PCR联合高通量测序、外显子捕获-高通量测序方法等。变性高效液相色谱技术用于PKD1基因突变筛查方法，虽然在一定程度上能够提高突变检测率，但是检测结果存在不稳定性以及结果的准确性也有待提高。目前较为经典的检测PKD1基因突变的方法为巢式PCR-Sanger测序，该方法需要先将目的基因通过LR-PCR进行扩增后，再针对突变位点再次进行靶向扩增测序后分析结果，该技术耗费人力较大，成本高昂且效率低下。张树忠等人联合采用LR-PCR和巢式PCR扩增的方法扩增PKD1全编码区来确定突变的具***点和类型，研究中用到的引物高达几十组，虽然结果较为准确，但是操作十分繁琐，需要结合变性高效液相色谱技术，检测成本较高且检测效率有待提升。此外TW201339309A公开了一种检测PKD1基因突变的引物组和试剂盒，其与张树忠等人的研究类似，也存在同样的问题。萧畔等人通过PCR特异性扩增PKD1基因的12、14、21外显子片段，检测区域有限，不具备检测PKD1整个基因区域的变异，具有一定的局限性。CN104531883A公开了一种检测PKD1基因突变的试剂盒和检测方法，通过5~8对长片段扩增子扩增PKD1基因2~46号外显子进行扩增，随后采用NGS的方法进行检测，虽然该方法能够快速高效地检测样本，但是由于该技术方法具有GC偏好性，对于PKD1基因高GC区域检测仍然具有缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法。本发明通过设计一组引物，成功扩增整个PKD1基因，建库过程不需要再进行PCR扩增，利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变，携带者单体型构建过程无需其他家系样本；本发明检测结果能够媲美样本进行WGS测序，大大降低了检测成本和检测周期，更加适用于临床检测服务。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种用于PKD1基因突变检测的引物组，所述引物组包括6对引物，用于扩增PKD1基因整个区域，每对引物的扩增产物之间均有10kb以上的重叠区域；
所述6对引物的序列如下（hg19参考基因组）：
用于扩增PKD1基因chr16：2130793-2144241的引物，其正向引物序列如SEQ IDNO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2134219-2154799的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2144661-2166375的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2151918-2173659的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2158065-2178648的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2171520-21918496的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:11所示，反向引物序列如SEQ ID NO:12所示。
所述6对引物的序列具体如表1所示：
表1 本发明采用LR-PCR扩增PKD1基因的引物序列
注：表中F为正向引物（上游引物），R为反向引物（下游引物）；表中的PCR引物从上到下依次为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
优选地，所述引物组用于扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围。
一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒用于PKD1基因突变检及PKD1基因单体型构建，包括如上所述的用于PKD1基因突变检测的引物组，所述引物组中的每个引物的浓度优选为10μM。
优选地，所述试剂盒包括用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂、和/或用于从样本中提取基因组DNA的试剂及处理后的PCR产物用于三代Nanopore测序的试剂。
优选地，所述用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂包括2×Phanta FlashMaster Mix，其包括DNA聚合酶、缓冲液和dNTP；所述DNA聚合酶优选为高保真性、高产量性、快速延伸性以及适用于高GC体系的DNA聚合酶混合物。
优选地，PCR反应总体系为50μL，包括2×Phanta Flash Master Mix 25μL、上下游引物各2μL（浓度10μmol/L）、DNA模板2μL（DNA量50~60ng）、PCR Enhancer 10μL、超纯水补足至50μL体系。
上述试剂可商购获得也可配制获得，商购途径以及配制方法为本领域技术人员公知。
优选地，所述试剂盒通过优化的反应时间和反应温度，扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围。
一种采用如上所述引物组或试剂盒用于非疾病诊断目的的体外检测PKD1基因突变以及构建PKD1基因单体型的方法，包括如下步骤：
（1）从受试者外周血样本中提取基因组DNA；
（2）以基因组DNA为模板，使用所述的用于PKD1基因突变检测的引物组，设定优化的反应时间和反应温度，每对引物单独扩增PKD1基因整个区域及其上下游共约15kb范围；
（3）对步骤（2）得到的6个PCR产物进行纯化回收；
（4）对纯化后的PCR产物进行浓度测定，按照一定比例混合纯化后的PCR产物，即可得到1个受试者PCR产物混合物；
（5）将受试者的PCR产物混合物直接构建Nanopore文库，在MinION芯片上进行ONT测序，获得长片段PCR产物的序列；
（6）通过Clair3软件对获得的PCR产物数据进行分析，将得到的序列片段比对到参考PKD1基因上，提取SNVs和Indels，确定样本PKD1基因SNVs以及单体型情况。
优选地，所述步骤（2）中，所述反应时间和反应温度为：
PCR循环参数设定：98℃-30s，循环数1 cycle；98℃变性10s，Tm-20s，72℃-6min，循环数为20~60 cycles，优选为35 cycles，72℃延伸5min；其中1、3和5号扩增子引物Tm为60~70℃，优选为64℃；2、4和6号扩增子引物Tm为60~70℃，优选为66℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）针对于PKD1基因本身的结果特点以及突变类型，本发明提供了一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法；本发明利用6对长片段扩增子引物，扩增PKD1基因整个区域，每对引物扩增产物之间都有10kb以上的重叠区域；通过利用长片段PCR技术靶向扩增整个PKD1基因及其上下游共约15kb范围，将纯化后的PCR产物按照一定比例混合后直接构建ONT文库，利用Nanopore测序仪mk-1C进行测序，通过生物信息学分析获得PKD1基因单体型信息或者直接检测PKD1基因突变信息；
（2）本发明通过设计一组引物，成功扩增整个PKD1基因，建库过程不需要再进行PCR扩增，利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变，携带者单体型构建过程无需其他家系样本；
（3）本发明检测结果能够媲美样本进行WGS测序，大大降低了检测成本和检测周期，更加适用于临床检测服务。
附图说明
图1为本发明实施例1中的LR-PCR扩增PKD1基因长片段扩增子扩增结果示意图；琼脂糖凝胶电泳图结果显示PKD1基因的6个扩增子产物条带单一，片段大小1号为13449bp，其他5个扩增子片段大小在20.3~21.7kb；其中23kb Marker为DNA marker（λDNA/HindIII，solarbio）；15kb Marker为DNA marker（Trans15K DNA Marker，全式金生物），泳道1~6分别为LR-PCR扩增PKD1基因1~6号长片段扩增子；
图2为本发明实施例1中的1例临床样本PKD1基因Oxford Nanopore测序的IGV可视化图；图中显示6个扩增子（引物设计位置：2130793~2196637，hg19）在PKD1基因所有内含子和外显子区域覆盖度达到100%；
图3为本发明实施例1中的PKD1阳性样本突变位点检出结果的IGV视图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
以下结合1例前期做过三代全基因组测序的样本以及1例PKD1阳性患者进行详细说明。在具体实施方式中，本发明通过利用长片段PCR技术靶向扩增整个PKD1基因及其上下游共约15kb范围，将纯化后的PCR产物按照一定比例混合后直接构建ONT文库，利用Nanopore测序仪进行测序，通过生物信息学分析获得PKD1基因单体型信息或者直接检测PKD1基因突变信息。本发明通过设计一组引物，成功扩增整个PKD1基因，建库过程不需要再进行PCR扩增，利用三代测序技术成功构建PKD1基因单体型以及检测PKD1基因内突变，携带者单体型构建过程无需其他家系样本。
实施例1
一、样本基因组DNA提取
取出受试者0.2ml外周血样本，按照血液基因组DNA提取试剂盒操作说明进行DNA提取。用Qubit试剂测定提取的DNA样本，该DNA样本为用于下一步PCR反应的模板。本实施例结合1例前期做过三代全基因组测序的样本以及1例PKD1阳性患者进行检测，PKD1阳性患者致病位点为已知突变类型Chr16:2160724 c.4444C>T。
二、LR-PCR扩增PKD1基因
根据PKD1基因序列，设计合成6对PKD1基因扩增引物。采用Phanta Flash MasterMix进行LR-PCR扩增，共扩增6个大片段序列，名称分别为1~6号扩增子，引物序列以及扩增产物大小如表1所示。PCR反应总体系为50μL，包括2×Phanta Flash Master Mix 25μL、上下游引物各2μL（浓度10μmol/L）、DNA模板2μL（DNA量50~60ng）、PCR Enhancer（北京诺唯赞生物科技有限公司）10μL、超纯水补足至50μL体系。PCR循环参数设定：98℃-30s，循环数1cycle；98℃变性10s，Tm-20s，72℃-6min，循环数为35 cycles，72℃延伸5min。其中1、3和5号扩增子引物Tm为64℃；2、4和6号扩增子引物Tm为66℃。
LR-PCR反应结束后，取出5μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳。结果显示6个扩增子的片段大小和设计的理论值一致，并且条带清晰（见图1）。
三、PCR产物纯化处理
将得到的PCR产物通过Agencourt XP磁珠（美国Beckman Coulter公司）进行纯化，磁珠量和PCR体系按1:1等量混合，震荡混匀后室温放置3min。瞬时离心后放置于磁力架上进行吸附，待溶液澄清后吸弃上清。用80%的乙醇清洗2遍磁珠后，吸弃多余的乙醇晾至磁珠表面干燥后，加入无核酸酶的水洗脱，用Qubit 2.0核酸蛋白定量仪对纯化后的产物进行浓度测定。
将纯化后的6个扩增子按照一定比例进行混合，混合后的DNA量不低于1000ng。
四、文库构建
文库构建采用Oxford Nanopore Technologies的Ligation Sequencing Kit(SQK-LSK110)进行操作，具体步骤如下：
1、NDA末端修复反应
1）将所用试剂置于冰上溶解；
2）在Eppendorf管中按下表加入试剂：
3）使用移液枪轻轻混匀，若要保留长片段的完整性，可手指轻弹混匀；
4）使用PCR仪进行20℃，5min和65℃，5min的扩增；
5）准备磁珠，震荡混匀，室温平衡30min；
6）将扩增完的样本分别转移到1.5mL离心管里；
7）将60μL重悬的磁珠加入到样本中，轻弹试管混合；
8）在四维旋转仪上室温孵育5min；
9）每个样本准备500μL，70%的无水乙醇溶液；
10）将样本放在磁力架上，静置后吸去上清液，样本保持在磁力架上，加入200μL70%的无水乙醇溶液，静置30s，弃掉酒精，重复一次（加入200μL 70%的无水乙醇溶液，静置30s，弃掉酒精）；
11）使用移液枪吸除乙醇，干燥30s，避免干燥至磁珠裂开；
12）从磁力架上取下试管，将磁珠重悬于27μL NF水中，室温孵育2min；
13）将试管置于磁力架上，直至洗脱液澄清；
14）将27μL洗脱液转移至新的1.5mL离心管中；
15）取出1μL进行定量，所得样本目标量＞700ng（Qubit浓度为20~60 ng/μL）。
2、barcode 连接反应
1）室温解冻Native barcode，每个样需要一个barcode；
2）将末修后500ng的样本溶解至22.5μL NF水里；
3）按顺序加入下表中的试剂，轻弹混匀；
4）使用移液枪轻轻混匀，若要保留长片段的完整性，可手指轻弹混匀；
5）在四维旋转仪上室温孵育10min；
6）将50μL重悬的磁珠加入到样本中，轻弹试管混合；
7）在四维旋转仪上室温孵育5min；
8）每个样本准备500μL，70%的无水乙醇溶液；
9）将样本放在磁力架上，静置后吸去上清液，样本保持在磁力架上，加入200μL70%的无水乙醇溶液，静置30S，弃掉酒精，重复一次（加入200μL 70%的无水乙醇溶液，静置30s，弃掉酒精）；
10）使用移液枪吸除乙醇，干燥30s，避免干燥至磁珠裂开；
11）从磁力架上取下试管，将磁珠重悬于28μL NF水中，室温孵育2min;
12）将试管置于磁力架上，直至洗脱液澄清；
13）将28μL洗脱液转移至新的1.5mL离心管中；
14）取出1μL进行定量（Qubit浓度为5~15ng/μL）；
15）对加了不同barcode的样本进行等摩尔量（技术支持推荐）混合至1.5mL离心管中，使合并的样本量达到700ng；
16）将700ng样本稀释到65μL NF水中；
17）如果700ng的混合样本体积超过65μL，用2.5倍磁珠对混样进行纯化，并用65μLNF水洗脱产物。
3、Adapter 连接反应
1）室温涡旋融化EB，NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer(5×)，涡旋T4Ligase和AMⅡ，置于冰上待用；
2）按照下表体系加入反应试剂：
3）轻弹试管并涡旋，在四维旋转仪上室温孵育10min；
4）准备磁珠，震荡混匀，室温平衡30min；
5）将50μL重悬的磁珠加入到样本中，轻弹试管混合；
6）在四维旋转仪上室温孵育5min；
7）将样本放在磁力架上，静置后吸去上清液，样本保持在磁力架上，使用250μLLFB清洗；
8）使用移液枪吸除上清，将样本取出磁力架，加入250μL LFB，轻弹使磁珠重悬后将样本置于磁力架，静置后吸去上清液；
9）重复步骤8）一次；
10）干燥30s，将样本取出磁力架，使用15μL的EB重悬，室温孵育10min，对于高分子量DNA，在37℃下金属浴培养10min可以提高长片段的回收率；
11）将样本置于磁力架上静置至洗脱液澄清，将15μL的洗脱液转移至1.5mL离心管中；
12）取出1μL进行定量，所得样本目标量约430ng（Qubit浓度为5~30ng/μL）。
五、Oxford Nanopore测序
在一个新的1.5mL离心管中加入以下试剂并涡旋混匀，即上机样本：
上机操作按照Oxford Nanopore测序仪说明书进行测序操作。测序仪采用OxfordNanopore MinION Mk1C单分子实时测序***，其MinION cell含有512个纳米孔通道，能够将每一条DNA样本进行单分子实时测序，将DNA序列转化为电信号。
六、结果分析
Nanopore超长读长原始下机数据为fast5格式，经过basecalling后将fast5格式转化成fastq格式，随后使用minimap2软件将fastq数据比对至GRCh37/hg19参考基因组，并使用Clair3软件对minimap2所生成的bam进行变异检测并且分型。最后，并使用IGV软件查看结果及绘制相关图谱。
1例测试过WGS数据的样本LR-PCR检出SNP和Indels结果以及单体型构建结果与WGS分析结果进行对比。PKD1临床样本通过数据分析得到了该患者PKD1基因上SNP、Indels位点以及单体型情况，随后通过巢式PCR验证了该患者检出SNP的准确性，并且检测该患者父母双方验证了单体型构建的准确性。
结果分析：
通过LR-PCR的方案扩增PKD1基因，图1显示了每个扩增子扩增片段大小和条带单一情况。从图1中可以看出，每个扩增子的条带单一，片段大小跟设定范围一致。本发明检测了1例阳性PKD1患者样本，如图2所示，通过IGV观察到设计的长片段扩增子能够完全覆盖整个PKD1基因区域，最低区域的测序深度也在30×以上。此外，通过LR-PCR的方法均可以成功检测到患者致病位点（如图3所示），并构建了该患者PKD1单体型，并且通过巢式PCR检测该患者父母双方验证了单体型构建的准确性。
表2为该患者单体型信息表以及通过巢式PCR验证父母双方对应位点检出SNP情况。另外如表3所示对比了1例做过WGS的非PKD1阳性样本数据的单体型构建结果和LR-PCR结果，结果发现，LR-PCR较WGS会有假阳性Indels检出，主要是由于基因结构中存在PolyA和PolyT结构会导致假Indels检出，其他SNP和Indels检出以及单体型构建的准确性与WGS结果相一致。
表2为本发明实施例1中的PKD1阳性样本单体型构建结果
表3 本发明实施例1中的WGS与LR-PCR单体型构建结果对比
注：加粗位点表示LR-PCR多检出位点。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于PKD1基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括6对引物，所述6对引物的序列如下：
用于扩增PKD1基因chr16：2130793-2144241的引物，其正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2134219-2154799的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2144661-2166375的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2151918-2173659的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2158065-2178648的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示；
用于扩增PKD1基因chr16：2171520-21918496的引物，其正向引物序列SEQ ID NO:11所示，反向引物序列如SEQ ID NO:12所示。
2.一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于PKD1基因突变检测的引物组。
3.如权利要求2所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述引物组中的每个引物的浓度为10μM。
4.如权利要求2所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂、和/或用于从样本中提取基因组DNA的试剂及处理后的PCR产物用于三代Nanopore测序的试剂。
5.如权利要求4所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增PKD1基因长片段序列的PCR反应试剂包括2×Phanta Flash Master Mix，其包括DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。
6.如权利要求5所述的一种用于PKD1基因突变检测的试剂盒，其特征在于，PCR反应总体系为50μL，包括2×Phanta Flash Master Mix 25μL、上下游引物各2μL、每个引物的浓度为10μmol/L、DNA模板2μL、DNA量为50~60ng、PCR Enhancer 10μL、超纯水补足至50μL体系。
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