CN117143264B - 乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用 - Google Patents
乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117143264B CN117143264B CN202311412647.0A CN202311412647A CN117143264B CN 117143264 B CN117143264 B CN 117143264B CN 202311412647 A CN202311412647 A CN 202311412647A CN 117143264 B CN117143264 B CN 117143264B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydrogel
- polysaccharide
- astragalus polysaccharide
- preparation
- acetoacetylated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 100
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 100
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 99
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 241001061264 Astragalus Species 0.000 title claims abstract description 53
- 235000006533 astragalus Nutrition 0.000 title claims abstract description 53
- 210000004233 talus Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 125000002339 acetoacetyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C(=O)C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- JKUYRAMKJLMYLO-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 3-oxobutanoate Chemical compound CC(=O)CC(=O)OC(C)(C)C JKUYRAMKJLMYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 229940054190 hydroxypropyl chitosan Drugs 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 17
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 abstract description 14
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 abstract description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 abstract description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 33
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 18
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 13
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 13
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 12
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 8
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 6
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 6
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 polysaccharides Acetoacetate Chemical class 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N Acetoacetic acid Natural products CC(=O)CC(O)=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 244000061520 Angelica archangelica Species 0.000 description 1
- 241001313857 Bletilla striata Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 240000008397 Ganoderma lucidum Species 0.000 description 1
- 235000001637 Ganoderma lucidum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001287 Guettarda speciosa Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- WOWBFOBYOAGEEA-UHFFFAOYSA-N diafenthiuron Chemical compound CC(C)C1=C(NC(=S)NC(C)(C)C)C(C(C)C)=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 WOWBFOBYOAGEEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004989 dicarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- SWRGUMCEJHQWEE-UHFFFAOYSA-N ethanedihydrazide Chemical compound NNC(=O)C(=O)NN SWRGUMCEJHQWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 230000019305 fibroblast migration Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N levoglucosan Chemical group O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2CO[C@@H]1O2 TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000011812 mixed powder Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000010388 wound contraction Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
- A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用,制备方法为将黄芪多糖与DMSO混合,在90℃下加热直至完全溶解,然后加热至110℃,并在氮气保护下滴加乙酰乙酸叔丁酯,搅拌6h;反应结束后,将产物滴加到乙醇中得到沉淀物,然后用无水乙醇洗涤沉淀,离心三次后,用水将沉淀物溶解,并透析24h,冷冻干燥48 h,得到乙酰乙酰化黄芪多糖。本发明通过引入一种新的官能基团乙酰乙酰基团,同时发挥交联位点和提高多糖药效的功能。该设计一方面避免醛基的引入,反应过程温和可控,另一方面无需添加强氧化剂,提高了植物多糖制剂的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及黄芪多糖水凝胶制备技术领域,更具体地说是涉及乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用。
背景技术
伤口愈合用辅料主要发挥遮盖和保护伤口目的,临床主要用于外伤、烧伤、糖尿病足和术后切口的伤口愈合。水凝胶是一种具有三维网状结构的高分子聚合物,可提供湿润的创面环境,是一种十分理想的创面敷料。其中,以多糖为骨架材料的水凝胶作为一种新兴快速发展的智能型高分子材料,在伤口愈合治疗中具有广阔的发展前景。
植物多糖是一种常见的生物大分子,是构建水凝胶体系的重要来源之一。植物多糖在伤口愈合治疗领域具有独特的优势,具体包括:(1)生物活性强:伤口愈合机制复杂,病理过程涉及氧化、炎症、生长因子、免疫调控和创面局部微循环环境等,植物多糖是中药中重要组成成分,基于中医临床传统用药经验,具有一定的促伤口愈合功能活性;(2)具备载药***的潜力:多糖可降解,生物安全性高,表面丰富的羟基等基团可以进行修饰,且植物多糖由药材提取制备,来源广泛,工艺简便,且可实现传统药材资源的充分利用。目前,基于植物多糖构建水凝胶制剂已成为制剂开发的重要研究方向,已有包括白芨多糖、当归多糖、灵芝多糖等多种植物多糖凝胶制剂的开发。
不同于常规合成来源多糖材料,基于植物多糖的水凝胶制剂往往在力学性能、机械强度、环境响应以及自愈合速率、抗菌活性、降解性能以及生物相容性等方面存在明显不足。因此,采取合适的功能化修饰策略,有助于植物多糖凝胶制剂产品的开发。目前,最常用的修饰策略为利用植物多糖分子链中最为普遍的邻二羟基作为可修饰的反应位点,通过亚胺键交联实现水凝胶的响应性和自修复性能,具体原理为邻二羟基通过高碘酸钠等氧化形成醛基与交联剂中氨基在室温下快速交联。高碘酸钠为目前植物多糖最常用的氧化剂,反应过程由于可控性较差,往往会造成植物多糖的大量降解,对多糖的活性产生明显影响,使得植物多糖的生物活性优势无法在凝胶制剂中得到体现。此外,残留的过氧化剂容易产生对皮肤的过敏性和刺激性作用,使得该类凝胶制剂的应用严重受限。
因此,针对植物多糖生物活性和材料属性无法兼容并存的现状,开发一种快捷、高效以及安全的修饰策略用于构建植物多糖基水凝胶是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此,本发明通过引入一种新的官能基团乙酰乙酰基团,同时发挥交联位点和提高多糖药效的功能。该设计一方面避免醛基的引入,反应过程温和可控,另一方面无需添加强氧化剂,提高了植物多糖制剂的安全性。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种乙酰乙酰化黄芪多糖,化学式如式I所示;其中,n为280~4200,重均分子量是1万到15万;
I。
本发明通过乙酰乙酰化手段对黄芪多糖进行修饰,首次发现经乙酰乙酰化修饰后的黄芪多糖不会破坏多糖活性,既提高了后期制备到的凝胶性能,又解决了多糖活性丧失的问题。
作为与上述技术方案相同的发明构思,本发明还请求保护一种乙酰乙酰化黄芪多糖的制备方法,过程包括:
1)将黄芪多糖与DMSO混合,并将混合物在90℃下加热直至多糖完全溶解,然后将混合物溶液加热至110℃,并在氮气保护下滴加乙酰乙酸叔丁酯,搅拌6h;其中,黄芪多糖、DMSO、乙酰乙酸叔丁酯的比例为m:v:m=1:14:4.11;
2)反应结束后,将产物滴加到乙醇中得到沉淀物,然后用无水乙醇洗涤沉淀,离心三次后,用水将沉淀物溶解,并透析24h,冷冻干燥48 h,得到乙酰乙酰化黄芪多糖。
作为与上述技术方案相同的发明构思,本发明还请求保护所述的乙酰乙酰化黄芪多糖在制备促进伤口愈合的水凝胶中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思,本发明还请求保护一种促进伤口愈合的水凝胶,包括:羟丙基壳聚糖、乙酰乙酰化黄芪多糖和交联剂,且三者质量比为5:5:0.1;其中,羟丙基壳聚糖和乙酰乙酰化黄芪多糖体积比为1:1(均为50mg/ml,5%),交联剂在体系中含量质量比为0.1%(1mg/ml)。
优选地,所述交联剂包括ADH、NPN或4PN。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明通过引入一种新的官能基团,乙酰乙酰基团(acetoacetyl group),同时发挥交联位点和提高多糖药效的功能。该设计一方面避免醛基的引入,反应过程温和可控,另一方面无需添加强氧化剂,提高了植物多糖制剂的安全性。
本发明制备到的新型黄芪多糖可以有效地对抗细胞中有害的ROS,保护细胞免受氧损伤,而常规修饰策略会破坏APS中的ROS清除活性,所以,经乙酰乙酰基团修饰后的黄芪多糖性能大大提升,将该乙酰乙酰化黄芪多糖与HPCS和交联剂复配制备得到水凝胶,该水凝胶具有良好的流变性能和注射性能,同时,具有自愈合能力,受到破坏后断键重新愈合,满足动态交联的要求,可以确保延长水凝胶的使用寿命和不同场景下的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为黄芪多糖乙酰乙酰化合成示意图;
图2附图为乙酰乙酰化黄芪多糖的表征实验:A,红外分析;B,DSC分析;C,核磁取代度分析;
图3附图为乙酰乙酰化黄芪多糖的体外抗氧化能力评价;
图4附图为乙酰乙酰化黄芪多糖促细胞迁移能力评价;
图5附图为乙酰乙酰化黄芪多糖在Hacat细胞中的ROS清除实验;
图6附图为基于乙酰乙酰化黄芪多糖水凝胶的流变性能分析;A为剪切速率变化曲线;B为通针性能检测;C为粘弹性检测;D为剪切应变考察;E为剪切应变循环考察;
图7附图为基于乙酰乙酰化黄芪多糖新型水凝胶的形态结构分析;
图8附图为基于乙酰乙酰化黄芪多糖水凝胶的溶胀率测定;
图9附图为基于乙酰乙酰化黄芪多糖水凝胶的降解速率分析;
图10附图为基于乙酰乙酰化黄芪多糖水凝胶的体外细胞毒性分析;
图11附图为基于乙酰乙酰化黄芪多糖水凝胶的体内促伤口愈合情况及愈合率;
图12附图为体内促伤口愈合活性评价(病理切片);
图13附图为体内促伤口愈合活性评价(Masson切片);
图14附图为体内促伤口愈合活性评价(免疫组化CD31切片)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1乙酰乙酰化黄芪多糖(AAA, Astragali polysaccharidesAcetoacetate)的合成
参见图1,将1g黄芪多糖分散在250mL三口烧瓶中,加入14mL二甲基亚砜(DMSO)分散,并将混合物在90℃下加热直至多糖完全溶解。然后将混合物溶液加热至110℃,并在氮气保护下滴加乙酰乙酸叔丁酯(t-BAA)(4.11g),搅拌6h。反应结束后,将产物滴加到乙醇中得到沉淀物,然后用无水乙醇洗涤沉淀,离心三次后,用水将沉淀物溶解,并透析24h,冷冻干燥48 h,得到乙酰乙酰化黄芪多糖(AAA)。
对照组1:黄芪多糖(APS,Astragali polysaccharides)
对照组2:氧化黄芪多糖(OAPS,Oxidized Astragali polysaccharides),制备过程包括:(高碘酸氧化法)
根据文献常规方法进行制备,称取5 g黄芪多糖于干燥的锥形瓶中,加入200 mL去离子水中,搅拌至多糖完全溶解后,向体系中加入4 g高碘酸钠(先溶于20 mL的去离子水中)。避光氧化6 h后,加入5 mL丙三醇,搅拌30 min后,终止反应;将反应后的多糖溶液透析3 d,收集冻干48 h,最终得到氧化黄芪多糖(OAPS)。
实施例2表征
1)红外表征
分别精密称取APS、OAPS、AAA样品各2 mg分别与0.1g KBr粉末置于研钵中充分磨匀,两种混合后的粉末分别放进压片机制片后,波数范围是400-4000 cm-1。光谱仪分辨率4cm-1,信躁比50000:1,扫描次数32次。
FT-IR光谱结果(图2A)显示,OAPS在1733 cm−1峰位出现了明显C=O吸收基团,归属于醛基基团,在APS未见该吸收峰出现,表明氧化醛基基团的成功引入。相比OAPS,AAA在1700–1760 cm−1处出现了乙酰乙酰基峰的新双羰基峰,复合乙酰乙酰基团双C=O的结构特征,证明AAA中成功引入了乙酰乙酰基团。
2)差式热量扫描考察
分别称取5.0 mg的APS、OAPS、AAA样品于铝板上,置于STA 449F3型Netzsch分析仪进行测定,加热速度10 ℃/min,测定范围0~300 ℃,氮气流速100 mL/min。
DSC结果(图2B)显示,纯APS的吸热峰位置是119℃左右,OAPS相比APS温度提高至125℃,AAA与纯APS和OAPS均有类似出峰位置,维持在130℃左右,表明氧化改性增强APS的热稳定性,推测与醛基增强了分子间相互作用有关,OAPS与APS均能体现出相同的C=O位点功能。
3)核磁共振氢谱分析
分别取约20 mg的APS、OAPS、AAA样品,加入核磁管,移取0.5 mL重水至核磁管中,震荡使样品完全溶解,进行测试,1H共振频率600MHZ,采样次数16次。
核磁共振结果(图2C)显示,OAPS相比APS在4.25 ppm和5.63 ppm出现新吸收峰信号,归属于醛基中的H信号。AAA由于双C=O的强吸收功能,其特征化学位移向高场移动,δ=3.56、2.10–2.45 ppm范围内的信号归因于乙酰乙酸的亚甲基和甲基基团。此外,δ=3.5–6.0ppm归因于脱水葡萄糖环的骨架,上述结果表明AAA中乙酰乙酰基团的存在。
根据以下公式计算AAA的取代度,得出AAA的取代度为0.86。
公式1
(其中I1为乙酰乙酰甲基的积分值,I2为APS无氢葡萄糖环主链的积分值。)
综合上述结果,鉴定AAA结构式如式I所示;
I。
实施例3乙酰乙酰化修饰多糖体外活性评价
1)DPPH清除率检测
用去离子水分别配制不同浓度的APS、OAPS、AAA三种多糖溶液,将19.72 mg的DPPH粉末溶在100 mL无水乙醇制备500 uM的DPPH备用(现用现配),在96孔板里每孔加入100 μLDPPH溶液,再加入同体积的样品溶液,避光孵育15 min,用酶标仪在517 nm测定吸光值。实验分为两组:空白组是在DPPH中加入空白溶剂作为100%,样品组。设置三个复孔,取平均值。通过以下公式计算DPPH的清除率:
DPPH清除率=(ODc-ODs)/ODc×100% 公式2
ODc为以去离子水加入DPPH溶液的吸光值,ODs为加入样品溶液组的吸光值。
DPPH自由基是用于反应氧化应激最具有代表性的自由基,实验设置了一系列浓度进行检测。结果见图3,显示,随着浓度的增高,三种多糖在高浓度均体现出较好的自由基清楚能力。然而不同的多糖浓度依赖特征并不相同。其中,在低浓度范围内(<1 mg/ mL),OAPS清除率明显小于其他两种多糖,表明OAPS起效浓度较高。与此同时,APS与AAA无明显差异,表明乙酰乙酰基团改性并未产生对APS抗氧化活性的影响。值得注意的是,2mg/ mL的浓度范围在现实状态下难以实现。因此,APS、AAA、OAPS分别达到89.6%、87.0%、81.1%的自由基清除率,只能提示达到饱和状态下的不同材料的抗氧化能力并无差别。
2)促L929细胞迁移分析
将对数生长期的小鼠成纤维细胞(L929)进行细胞铺板(密度5×105,3 mL)于六孔板里,培养24 h后,换液,使用无血清DEAE培养基预处理24 h后,使用200 μL枪头沿直尺划痕PBS冲洗2~3次,洗净漂浮细胞,每组加入配置好的培养基2 mL;配制分组主要是空白组:空白培养基;阳性对照组:配置了两种浓度的bFGF的培养基(10 ng/ mL和20 ng/ mL);实验组:分别配制了含APS、OAPS、AAA的培养基(125 μg/ mL)。设置三个复孔,划痕后0 h、12 h、24 h用显微镜拍照,并用ImageJ软件去定量面积,通过以下公式计算细胞迁移率:
细胞迁移率=(SC-SS)/SC×100% 公式3
(其中SC代表0h时划痕在显微镜视野中的面积,SS代表12 h、24 h划痕在视野中的面积。)
结果见图4,体外划痕实验评估了三种多糖(125 μg/ mL)促进促进成纤维细胞迁移的潜力。与对照组(25.3%)的细胞迁移率相比,APS(56.4%)和AAA(55.6%)表现出显著的促细胞迁移优化效果,表明AAA维持了APS的生物活性功能。与APS和AAA组相比,OAPS(30.2%)组的细胞迁移率明显更小,促细胞迁移能力不明显,表明常规的氧化修饰策略会降低APS的原有生物活性。
3)对脂多糖刺激的Hacat细胞的ROS清除试验
用脂多糖(LPS)进行Hacat细胞的氧化刺激造模。首先,用空白培养基配制好10 μg/ mL的脂多糖溶液,将对数生长期的Hacat细胞于六孔板里进行细胞铺板(密度1×105,3mL),培养24 h后,每孔加入2 mL预先配置好的LPS溶液,刺激12 h,弃去上清液,加入配制好的一定浓度的多糖培养基,孵育12 h,弃去上清液。
按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA探针,使其终浓度为10 μg/ mL。在上述六孔板里每个孔加入稀释好的探针1 mL,37℃细胞培养箱培养20分钟,用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA。弃去上清液,在六孔板中加入胰酶,用PBS进行洗涤,制成细胞悬液,收集细胞于流式管中,上流式细胞仪进行检测。实验分为三组:空白组:未经LPS刺激的正常细胞;造模组:经LPS刺激的造模细胞;对照组:造模后的细胞,进行APS、OAPS、AAA三种多糖的给药(125 μg/ mL)。
为了进一步探究AAA在抗氧化活性中的优势,我们采用流式细胞术对细胞进行ROS的清除能力检测。结果见图5,显示,造模组中ROS水平较空白对照组ROS水平升高,说明脂多糖能提高脓毒症肾小管上皮细胞的ROS水平,表明造模成功。APS和AAA的清除能力较好,显著下调,分别降低了12.9%、10.7%,无显著差异,而OAPS清除ROS效果较差,只下调了8.3%,说明氧化后多糖活性受到影响,乙酰乙酰化修饰策略不同于常规修饰策略。整体上表明AAA可以有效地对抗细胞中有害的ROS,保护细胞免受氧损伤,而常规修饰策略会破坏APS中的ROS清除活性。
实施例4基于乙酰乙酰化修饰黄芪多糖的凝胶制备与表征
(1)新型水凝胶的制备方法及成胶时间考察
用PBS(pH7.4)预先配制好100 mg/ mL的羟丙基壳聚糖(HPCS)、100 mg/ mL的AAA、100 mg/ mL 乙二酸二酰肼(ADH)、100 mg/ mL 氨基聚乙二醇(NPN)和100 mg/ mL 四臂氨基聚乙二醇(4PN)溶液,将HPCS、AAA和交联剂ADH、NPN、4PN溶液混合在EP管中(交联剂的结构式如下图所示),以不同的比例进行涡旋,按照表1的设计制备得到六种凝胶。采用倒置管试验测定凝胶化时间。反转EP管后无流动性的时间定义为凝胶时间。
表1 AAA与不同交联剂成胶时间考察(OAPS为对照组)
注:-代表不添加交联剂。
将不同浓度的HPCS、AAA和三种交联剂溶液混合,凝胶化时间如表1所示。处方中HPCS主要发挥构建复合网络,稳定骨架,增强水凝胶机械性能功能,是常用的水凝胶辅助材料,且HPCS含有一定含量氨基,可用于提供与AAA的共价交联反应。研究结果表明,H3处方凝胶化时间过久(>60 min),水凝胶太软,说明HPCS不足以提供更多的氨基链接位点,需要额外增加交联剂。当两者比例为1:1时,水凝胶用时在没加交联剂的处方中用时最短,我们选用处方2比例添加少量交联剂。结果表明,增加交联剂后,三个处方相较于处方2用时变短,说明交联剂提供了更多的连接位点,加4PN的水凝胶用时最短,因为其结构四端带氨基,比两端氨基的交联剂提供了多一倍的连接位点。
(2)水凝胶流变性能分析
A)可注射性能分析
研究水凝胶的可注射性能,确保凝胶在使用过程中通针性,利用流变仪对水凝胶进行了粘度性质的测试,测试温度37 ℃,测试频率1 Hz,测试应变为1%,剪切速率的范围设定为0.01-1 s−1,另外,我们选用25 G注射器型号,将注射器中的水凝胶挤出到玻璃小瓶里,进一步说明其通针性。
通过动态共价键交联的水凝胶具有一个重要特点是其具有可注射性能,也就是剪切稀化的性质。给予水凝胶一定的剪切力,这可以增加水凝胶的流动性,从而显示出可注射性能,也就是通针性。为了验证水凝胶的通针性,研究首先使用流变仪测试了水凝胶粘度随着剪切速率变化的曲线。实验结果(图6A)表明,随着剪切速率的增加,水凝胶的粘度迅速降低,说明水凝胶网络结构中的动态共价键通过剪切行为被破坏,流动性增加。为了更直观地说明水凝胶的剪切稀化行为,将水凝胶装入注射器(注射器针型号25 G),水凝胶能通顺的通过针头进入到玻璃小瓶中(结果见图6B),进一步表明水凝胶具有良好的注射性能,从而具有填充覆盖不规则伤口的潜力。
B)粘弹性分析
通过扫描频率为1 Hz的流变仪测量了不同处方的水凝胶的储能模量(G′)和损耗模量(G″)。在37℃的固定应变水平(1%)下,扫描频率(Frequency)范围在0.1~100 rad/s,进行模量的测定。
弹性模量(G′):表现的是材料的交联强度,描述基质的固体状特性,反映水凝胶抵抗外力破坏的能力;粘性模量(G″):表现的是基质的粘性指标,描述基质的液体状特性,表现的是敷料的柔顺性,反映敷料在外力作用下的变形特性。针对H1至H6的粘弹性分析结果表明(图6C),制备的六种凝胶制剂的储能模量G′在测试频率范围内基本保持不变,这说明基于AAA构建的复合凝胶网络具有良好的稳定性。加入交联剂之后的水凝胶的G′和G″值都有相应的提高,G′大于10000 Pa,G″大于1000 Pa,这可能是由于加入了交联剂后不仅增加了交联密度,还增加了部分粘度。
C)自愈合性能分析
选择处方H5进行剪切应变分析测试。首先在测试温度37℃,1 Hz测试频率下,开始进行应变范围扫描(Y=1%-1000%),探索出水凝胶-溶胶过渡点相对应的应变值。随后固定频率为1Hz,连续交替应变扫描评估水凝胶的G′和G″值,在20 min期间将应变从1%变化到500%,1%的应变剪切设置为200s,500%的应变剪切时间设置为100s。
水凝胶的自愈合能力在伤口治疗过程中可以达到延长使用寿命,不易受到外力破坏的能力。结果(图6D)显示,在一定的应变范围内(<90%),水凝胶的储能模量G′保持不变,表明形成的水凝胶可以承受较大的变形而保持完整的三维网络结构。施加的应变继续增加时,G′急剧下降;当施加的应变超过300%时,G′开始小于G″,此时水凝胶的三维结构发生严重偏移,大部分交联点断开,水凝胶从凝胶状态转变为溶胶状态。研究继续对水凝胶交替施加1%和500%的应变进行考察,结果见图6E,当进行1%应变剪切时,G′大于G″,当进行500%应变剪切时,G′开始小于G″;当应变剪切恢复到1%时,G′又大于G″,挥发到了原来的状态,重复多次循环操作,水凝胶依然有自我恢复的性质,说明了水凝胶具有自愈合能力,受到破坏后断键重新愈合,满足动态交联的要求,可以确保延长水凝胶的使用寿命和不同场景下的应用。
D)水凝胶形态结构分析
将上述材料按照处方比例制备好,拍摄该水凝胶形成凝胶前后的状态变化。对六种水凝胶进行冷冻干燥,然后用扫描电镜(SEM)进行横截面扫描,把凝胶样品粘到导电胶上然后喷金,上机测试,观察水凝胶的形态结构。
采用扫描电子显微镜(SEM)研究了AAA水凝胶平台的微观形态,如图7所示。在100μm尺寸下,可以清楚地观察到水凝胶的均匀多孔结构,保持大量水分,使其在结构上与细胞外基质(ECM)相似,能够很好的模拟细胞在体内生长的环境,促进细胞粘附、增殖和细胞因子的分泌。同时,交联密度越大,凝胶孔隙越小,加了交联剂的孔隙明显要小,说明交联剂可以提高交联密度。因此,H6处方明显孔隙最小,说明其交联密度最大。
(4)水凝胶溶胀率测定
使用已经形成稳定状态的水凝胶H1-H6后 ,用液氮快速冷冻,然后放置于冻干机中冻干,将冻干后的干凝胶称重,质量记为W0,然后,将干凝胶浸泡在盛有10 mLPBS溶液(pH=7.4)的50 mL离心管中,在设定的时间间隔,倒掉PBS溶液,用滤纸将凝胶表面的水分吸去,称取凝胶质量,记为Wt。水凝胶的溶胀率通过以下公式进行计算:
溶胀率(swelling ratio)=(Wt−W0)/W0,每组实验平行进行3次。
溶胀性能结果如图8显示,在最初的1h内,基于AAA构建的水凝胶表现出快速的溶胀行为,达到溶胀平衡,说明在水凝胶可以快速的吸收伤口渗出液,这可能归因于水凝胶的多孔结构和内部亲水性基团,有助于处理伤口的愈合。此外,添加交联剂的处方H4到H6溶胀率明显要低于没有加交联剂的处方,可能是交联剂导致处方交联密度增大溶胀率减小,H6处方的溶胀率在5左右,H4和H5处方不到10,交联密度过强反而失去优越的溶胀性能。
(5)水凝胶降解速率分析
首先,分别配制不同pH值(pH值为2.5、5.0和7.4)的PBS溶液,用作水凝胶降解测试的介质溶液。随后,在器皿中中制备稳定的水凝胶圆片(总体积约为0.5 mL),将其放在50mL离心管中,然后分别加入10 mL的上述降解溶液,并将其放置在37 ℃的恒温振荡培养箱中。在设定的时间间隔,取出上部降解液,对凝胶进行称重,并重新加入新的降解溶液。每组实验平行进行3次。
凝胶降解对于治疗过程施用后期十分重要,基于AAA构建的复合凝胶网络从设计上应具有酸敏感降解的特性。我们对H5处方进行降解情况研究,结果见图9所示,在pH=7.4的PBS溶液中,水凝胶首先吸水溶胀;大约12 h后,水凝胶质量逐渐减小,直至完全消失(10天之内),这表明在正常生理条件下,水凝胶会逐渐释放小分子交联剂,从而达到缓慢降解的目的,随着pH值的降低,凝胶降解速率明显增加,这是因为在低pH值条件下,动态亚胺键会解离的更快,说明水凝胶具有一定的酸响应性。因此,在施用后期,可以通过硼酸洗液(pH=3.8~4.2)等酸性洗液去除伤口残留的凝胶,进行换药操作。
(6)水凝胶生物安全性考察
制备六种处方的水凝胶,等水凝胶完全成型后,在37 ℃的空白DMEM培养基中(4mL)中浸泡24 h,制备新鲜的水凝胶提取物。将L929细胞以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中,向体系中加入0.1 mL一系列水凝胶提取液。然后放置在37 ℃二氧化碳恒温培养箱中培养24 h后,采用CCK-8法测定细胞存活率。多糖水凝胶样品体外细胞毒性实验重复三次。
结果见图10,各水凝胶实验组的存活率均高于90.0%,证实了水凝胶的生物安全性。
(7)水凝胶体内促伤口愈合活性评价
a)伤口愈合模型建立与给药方案
在大鼠全层皮肤创面模型中评价了水凝胶促进创面愈合的效果。将SD大鼠(雄性,180~200 g)随机分为5组(n=5),然后给予3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔注射麻醉。在去除背侧皮肤上的毛发后,形成一个直径为15毫米的全层皮肤损伤。bFGF@PLGA被选定为搭载的模型药物,采用喷雾干燥法制备含有bFGF的PLGA微球,用于控释bFGF以及防止药物破坏的目的。将0.4 mL高碘酸氧化黄芪多糖水凝胶(OAPS)、0.4mL含bFGF@PLGA的空白基质水凝胶(CAH)、0.4 mL的乙酰乙酰化黄芪多糖水凝胶组(AAA)、载bFGF@PLGA乙酰乙酰化黄芪多糖水凝胶组(bFGF@PLGA/AAA)(浓度1 mg/mL相当于22.1 μg/mL,每只鼠给药400 μL)和纱布组(Control)分别放入大鼠损伤部位,每天换药。然后分别在0、3、7、14 d拍摄创面区域,观察创面区域。伤口收缩的计算公式如下:伤口收缩(%)=(A0−At)/A0×100%,其中A0代表0d时的伤口面积和At代表拍摄时间时的伤口面积。
结果如图11所示,随着时间的推移,每组伤口都呈现出逐渐愈合的趋势,通过计算14天后的伤口愈合率,能够更明显对比各伤口敷料促进伤口愈合的能力。经ImageJ软件统计分析,Control组创面在14天后愈合率为65.4%,OAPS组愈合率为77.5%,两者没有十分明显的差异;AAA组(91.5%)、CAH组(92.3%)和bFGF@PLGA/AAA组(97.9%)的创面愈合能力有所改善,与Control组和OAPS组有非常显著的差异。上述结果表明说明AAA组和bFGF@PLGA/AAA处理的创面都有较好的愈合率,基本上被新形成的皮肤覆盖。对三组AAA组、CAH组和bFGF@PLGA/AAA组进行进一步的分析比较,可以发现AAA组在不添加药物的情况下治疗效果与CAH组基本一致,说明AAA组具有良好的促伤口愈合活性。在AAA负载药物的治疗过程中,bFGF@PLGA/AAA表现出更快的伤口愈合速度和愈合质量,具体结果可见day3与day7图片,表明AAA可以协同药物发挥更好的治疗作用,达到设计的最初目的。
b)组织学染色评价
通过组织学染色,能够从微观角度分析伤口愈合情况。因此连续给药后,在第3、14d后,处死动物,分离创面皮肤组织,伤口纵切放入4%多聚甲醛保存,并包埋于石蜡中,进行切片,用H&E染色、Masson染色和CD31染色观察,最后在显微镜下观察并拍照。
利用H&E染色、Masson染色和CD31染色进行了详细的组织形态学研究,术后第3天,第14天,伤口的组织学特征如图12、图13、图14所示。各组的伤口表面显示完全形成新的上皮,H&E染色结果显示,在第3天的时候,炎症细胞开始出现的,说明正处于炎症期,其中bFGF@PLGA/AAA处理伤口的水凝胶诱导的成纤维细胞密度最高。该伤口也显示出形成了密度最高的细胞外蛋白,说明bFGF释放可以增强早期伤口愈合过程。空白组和OAPS组在14天后出现很多炎症细胞的情况,说明伤口发生了过度的氧化应激导致伤口愈合缓慢,证明清除多余氧自由基对伤口愈合的重要性。相反,AAA组和bFGF@PLGA/AAA组在14天,炎症细胞消失,说明乙酰乙酰化黄芪多糖发挥了清除自由基和ROS的能力。因此,bFGF@PLGA/AAA组是通过AAA降低伤口局部炎症细胞和bFGF增加细胞外基质蛋白浓度的双重作用达到良好的治疗效果。
胶原蛋白是皮肤的主要结构蛋白,是有效重建伤口部位真皮组织的必要条件。治疗3天、14天后,对取出的组织进行masson组化染色,以确定胶原蛋白含量在伤口愈合过程中变化情况。在bFGF@PLGA/AAA组水凝胶覆盖的伤口组织中,观察到更多的胶原纤维的积累,表明胶原纤维被生物膜沉积。在CD31染色实验中,黄的圆圈代表血管内皮,各组的血管生长情况无明显差异,bFGF@PLGA/AAA组伤口处血管、毛囊、皮脂腺等结构更成熟、数量更多,愈合速度更快,表明加入bFGF在AAA的协同作用下可以通过修复受损微器官更有效加速伤口愈合。
上述结果表明,基于AAA构建的水凝胶制剂表现出良好的促伤口愈合活性,搭载市售模型药物bFGF,可以通过不同作用机理显著提高其促伤口愈合质量。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种乙酰乙酰化黄芪多糖,其特征在于,化学式如式I所示;其中,n为280~4200,重均分子量是1万到15万;其中R为氢原子或乙酰乙酰基团;
I。
2.权利要求1所述的一种乙酰乙酰化黄芪多糖的制备方法,其特征在于,过程包括:
1)将黄芪多糖与DMSO混合,并将混合物在90℃下加热直至多糖完全溶解,然后将混合物溶液加热至110℃,并在氮气保护下滴加乙酰乙酸叔丁酯,搅拌6h;其中,黄芪多糖、DMSO、乙酰乙酸叔丁酯的比例为m:v:m=1g:14mL:4.11g;
2)反应结束后,将产物滴加到乙醇中得到沉淀物,然后用无水乙醇洗涤沉淀,离心三次后,用水将沉淀物溶解,并透析24h,冷冻干燥48 h,得到乙酰乙酰化黄芪多糖。
3.权利要求1所述的乙酰乙酰化黄芪多糖在制备促进伤口愈合的水凝胶中的应用。
4.一种促进伤口愈合的水凝胶,其特征在于,包括:羟丙基壳聚糖、权利要求1所述的乙酰乙酰化黄芪多糖和交联剂,羟丙基壳聚糖和乙酰乙酰化黄芪多糖体积比为1:1,交联剂在体系中质量分数为0.1%,所述交联剂选自为ADH、NPN或4PN。
5.bFGF与权利要求4所述的水凝胶联用在制备促进伤口愈合的药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311412647.0A CN117143264B (zh) | 2023-10-30 | 2023-10-30 | 乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311412647.0A CN117143264B (zh) | 2023-10-30 | 2023-10-30 | 乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117143264A CN117143264A (zh) | 2023-12-01 |
CN117143264B true CN117143264B (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=88910380
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311412647.0A Active CN117143264B (zh) | 2023-10-30 | 2023-10-30 | 乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117143264B (zh) |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1639351A (zh) * | 2001-09-26 | 2005-07-13 | 赫尔克里士公司 | 乙酰乙酰基糖类及其制备方法 |
CN105622961A (zh) * | 2016-03-15 | 2016-06-01 | 东华大学 | 一种自愈性多糖水凝胶的制备方法 |
CN105859906A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-08-17 | 南京中医药大学 | 具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖乙酰化修饰产物及其制备方法 |
CN106110376A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 向晨 | 一种高力学强度和促进伤口愈合的新型多糖纤维素医用胶及其制备方法 |
CN113018202A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-25 | 浙江工业大学 | 一种铁皮石斛多糖/黄芪多糖复合水凝胶及其制备方法和应用 |
CN113372584A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-09-10 | 南京林业大学 | 一种基于羧甲基壳聚糖并具有自愈性能水凝胶的制备方法 |
CN113425893A (zh) * | 2021-07-26 | 2021-09-24 | 郑州大学 | 一种载药水凝胶的制备方法及其应用 |
CN114213679A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-22 | 华南理工大学 | 一种海藻多糖基水凝胶及其制备方法与应用 |
CN115010958A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-09-06 | 楼天女 | 一种用于促进伤口愈合的水凝胶及其制备方法和应用 |
CN115671277A (zh) * | 2022-10-13 | 2023-02-03 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一种基于黄芪多糖自组装形成的纳米肿瘤疫苗及其应用 |
CN115737887A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-03-07 | 河北大学 | 一种皮肤创面敷料及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8790632B2 (en) * | 2004-10-07 | 2014-07-29 | Actamax Surgical Materials, Llc | Polymer-based tissue-adhesive form medical use |
-
2023
- 2023-10-30 CN CN202311412647.0A patent/CN117143264B/zh active Active
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1639351A (zh) * | 2001-09-26 | 2005-07-13 | 赫尔克里士公司 | 乙酰乙酰基糖类及其制备方法 |
CN105622961A (zh) * | 2016-03-15 | 2016-06-01 | 东华大学 | 一种自愈性多糖水凝胶的制备方法 |
CN105859906A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-08-17 | 南京中医药大学 | 具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖乙酰化修饰产物及其制备方法 |
CN106110376A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 向晨 | 一种高力学强度和促进伤口愈合的新型多糖纤维素医用胶及其制备方法 |
CN113018202A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-25 | 浙江工业大学 | 一种铁皮石斛多糖/黄芪多糖复合水凝胶及其制备方法和应用 |
CN113372584A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-09-10 | 南京林业大学 | 一种基于羧甲基壳聚糖并具有自愈性能水凝胶的制备方法 |
CN113425893A (zh) * | 2021-07-26 | 2021-09-24 | 郑州大学 | 一种载药水凝胶的制备方法及其应用 |
CN114213679A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-22 | 华南理工大学 | 一种海藻多糖基水凝胶及其制备方法与应用 |
CN115010958A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-09-06 | 楼天女 | 一种用于促进伤口愈合的水凝胶及其制备方法和应用 |
CN115671277A (zh) * | 2022-10-13 | 2023-02-03 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一种基于黄芪多糖自组装形成的纳米肿瘤疫苗及其应用 |
CN115737887A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-03-07 | 河北大学 | 一种皮肤创面敷料及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"黄芪多糖衍生物的制备及乳化性能研究";宋照风等;《轻工科技》;第39卷(第5期);第8-15页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117143264A (zh) | 2023-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hu et al. | Dual-crosslinked mussel-inspired smart hydrogels with enhanced antibacterial and angiogenic properties for chronic infected diabetic wound treatment via pH-responsive quick cargo release | |
CN110603268B (zh) | 将利用棓酚基改性的透明质酸衍生物用作底物的水凝胶及其用途 | |
Martínez-Mejía et al. | Synthesis of new chitosan-glutaraldehyde scaffolds for tissue engineering using Schiff reactions | |
Chang et al. | Carboxymethyl chitosan and carboxymethyl cellulose based self-healing hydrogel for accelerating diabetic wound healing | |
CN105473622B (zh) | 用于制造成形的交联的透明质酸产物的方法 | |
Sun et al. | Preparation and characterization of epigallocatechin gallate, ascorbic acid, gelatin, chitosan nanoparticles and their beneficial effect on wound healing of diabetic mice | |
Shahbuddin et al. | Glucomannan-poly (N-vinyl pyrrolidinone) bicomponent hydrogels for wound healing | |
Ma et al. | Development of the mussel-inspired pH-responsive hydrogel based on Bletilla striata polysaccharide with enhanced adhesiveness and antioxidant properties | |
An et al. | Injectable thioketal-containing hydrogel dressing accelerates skin wound healing with the incorporation of reactive oxygen species scavenging and growth factor release | |
Liu et al. | Injectable hydrogels based on silk fibroin peptide grafted hydroxypropyl chitosan and oxidized microcrystalline cellulose for scarless wound healing | |
Iswariya et al. | Design and development of a piscine collagen blended pullulan hydrogel for skin tissue engineering | |
KR20200017625A (ko) | 생체분자 또는 약물의 생체 내 전달을 위한 수식된 히알루론산 유도체의 용도 | |
Yang et al. | Chitosan-based mussel-inspired hydrogel for rapid self-healing and high adhesion of tissue adhesion and wound dressings | |
KR20230059749A (ko) | 친수성 주사형 피부 충전 조성물 및 이의 제조 방법과 응용 | |
CN114524950A (zh) | 一种磁靶向疏水药物载体水凝胶及其制备方法和应用 | |
EP2704727B1 (en) | Skin and hair regeneration using polysaccharide-based hydrogels | |
Shi et al. | Supramolecular chitin-based hydrogels with self-adapting and fast-degradation properties for enhancing wound healing | |
Ding et al. | Photopolymerizable, immunomodulatory hydrogels of gelatin methacryloyl and carboxymethyl chitosan as all-in-one strategic dressing for wound healing | |
Mao et al. | Charge and receptor functional injectable hydrogels as cytokine-releasing reservoirs for wound healing | |
Chen et al. | Mussel-inspired self-healing hydrogel form pectin and cellulose for hemostasis and diabetic wound repairing | |
Hu et al. | Construction of a composite hydrogel of silk sericin via horseradish peroxidase‐catalyzed graft polymerization of poly‐PEGDMA | |
Qiu et al. | Biocompatible and biodegradable Bletilla striata polysaccharides hydrogels crosslinked by BDDE for wound healing through the regulating of macrophage polarization | |
Chen et al. | Inflammation-modulating antibacterial hydrogel sustained release asiaticoside for infection wound healing | |
Zhang et al. | Adaptive injectable carboxymethyl cellulose/poly (γ-glutamic acid) hydrogels promote wound healing | |
CN117143264B (zh) | 乙酰乙酰化黄芪多糖、制备方法及在制备促进伤口愈合水凝胶中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |