CN117120456A - 聚-吗啉代寡核苷酸缺口体 - Google Patents

聚-吗啉代寡核苷酸缺口体 Download PDF

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Abstract

提供了缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐和制造这些缺口体的方法。这些缺口体包括缺口区域，该缺口区域含有通过硫代磷酸酯键彼此连接的脱氧核糖核苷；位于该缺口区域的5’末端的5’翼区域，该5’翼区域含有通过磷二酰胺键彼此连接的吗啉代单体；以及位于该缺口区域的3’末端的3’翼区域，该3’翼区域含有通过磷二酰胺键彼此连接的吗啉代单体。还提供了反义寡核苷酸。这些反义寡核苷酸可用于制备用于抑制Tau mRNA转录的缺口体。

Description

聚-吗啉代寡核苷酸缺口体
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2020年12月11日提交的美国临时专利申请号63/124,471的权益。该申请通过援引并入，如同在本文完整重写一样。
技术领域
本披露涉及立体无规和立体定义的聚-吗啉代寡核苷酸缺口体实施例及其合成方法。
背景技术
神经***变性障碍是以中枢神经***和周围神经***结构和功能衰退为特征的一组障碍。虽然神经***变性障碍表现出异质性的症状，但它们可以具有相似的特征。一种神经***变性疾病(阿尔茨海默病)，是神经***变性障碍，其特征在于淀粉样蛋白β斑块和神经原纤维缠结的积聚。其也是痴呆的主要原因。尽管罕见的家族性阿尔茨海默病的一些病例涉及淀粉样蛋白β前体蛋白的常染色体显性突变，但大多数病例是迟发型阿尔茨海默病(LOAD)，不遵循孟德尔遗传模式。虽然LOAD的机制尚不完全清楚，但全基因组关联研究已经鉴定出LOAD的遗传风险因素。科学家们已经证明了这些基因影响淀粉样蛋白β斑块的产生、聚集、或清除的能力。
阿尔茨海默病的一个报道的病理指标是存在由超磷酸化Tau组成的细胞内神经原纤维缠结。参见Chong，等人，“Tau Proteins and Tauopathies in Alzheimer’s Disease[阿尔茨海默病中的Tau蛋白和tau蛋白病变]，”Cell Mol.Neurobiol.[细胞和分子神经生物学]2018年7月；38(5)：965-980。研究已报道，调节Tau mRNA和Tau蛋白表达可能有助于改善Tau相关神经***变性疾病(包括阿尔茨海默病和原发性tau蛋白病变)的影响。
反义寡核苷酸(ASO)以序列特异性方式用于调节基因表达。它们已被开发用于靶标验证和治疗目的。反义技术具有治愈由有害基因的表达引起的疾病(包括由病毒感染、癌症生长和炎性疾病引起的疾病)的潜力。优化的反义寡核苷酸(ASO)(如缺口体(gapmer))可用于靶向初级基因转录物、一种或多种mRNA产物、剪接和未剪接的编码和非编码RNA。
ASO通过两种广泛的机制调节RNA功能。空间阻断机制，其可能导致剪接调节、无义介导的衰变(NMD)、翻译阻断，RNA酶H介导的降解，其通过制造RNA-ASO异源双链体而导致靶RNA的切割。
缺口体是嵌合反义寡核苷酸，该嵌合反义寡核苷酸含有侧接经修饰的寡核苷酸的翼区域的脱氧核苷酸缺口区域。脱氧核苷酸单体的缺口区域足够长以诱导RNA酶H介导的切割。翼区域是2’-修饰的核糖核苷酸的嵌段或其他人工修饰的核糖核苷酸单体，它们保护内部嵌段免受核酸酶降解，并增加与靶RNA的结合亲和力。经修饰的DNA类似物(如2’-MOE、2’-OMe、LNA和cEt)，由于它们在生物流体中的稳定性和对RNA的结合亲和力的增加，已被考查为翼区域。
磷二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)是短的单链DNA类似物，这些类似物含有由磷二酰胺键连接的吗啉环的骨架。PMO通常是不带电荷的核酸类似物，这些核酸类似物通过沃森一克里克(Watson-Crick)碱基配对与靶RNA的互补序列结合以阻断蛋白质翻译。PMO对生物流体中存在的各种酶具有抗性，这一特性使其可用于体内应用。
发明内容
本披露的一个方面涉及缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐的实施例。缺口体或缺口体的药学上可接受的盐含有缺口区域和翼区域。在优选的实施例中，缺口区域两侧是翼区域。
在一些实施例中，缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐具有缺口区域，该缺口区域可含有通过硫代磷酸酯键彼此连接的6至12个(即，6、7、8、9、10、11或12个中的每一种)脱氧核糖核苷。
在其他实施例中，缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐具有位于缺口区域5’末端处的5’翼区域，其中该5’末端翼区域含有通过磷二酰胺键彼此连接的3至7个(即，3、4、5、6或7个中的每一种)吗啉代单体。
在一些实施例中，缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐具有位于缺口区域3’末端处的3’翼区域，其中该3’末端翼区域含有通过磷二酰胺键彼此连接的3至7个(即，3、4、5、6或7个中的每一种)吗啉代单体。
缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐的缺口区域的脱氧核糖核苷可由以下结构构成：
其中P*表示立构中心，该立构中心可以处于R(Rp)或S(Sp)构型。
缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐的翼区域的吗啉代单体可由以下结构构成：
其中P*表示立构中心，该立构中心可以处于R(Rp)或S(Sp)构型。
在每个脱氧核糖核苷和吗啉代寡聚物结构中列举的每个碱基部分(B)可以独立地选自包括在式I中的基团：
式I
其中R选自H、C(O)R1或C(O)OR1；R1选自C1-C6烷基或芳基；并且该芳基为未经取代的或被选自下组的取代基取代，该组包括卤素、硝基和甲氧基。
在一些实施例中，缺口体的硫代磷酸酯键和磷二酰胺键中的每个磷可以独立地处于R或S构型。每个R或S构型为至少90％纯、至少95％纯、或至少99％纯。当将构型称为“纯”时，我们打算说明至少给定百分比的缺口体将包括给定的每个位置处的方向。
在其他实施例中，5’和3’翼区域各自包括通过磷二酰胺键彼此连接的五个吗啉代单体。在一些实施例中，5’和3’翼区域各自包括通过磷二酰胺键彼此连接的4个吗啉代单体。
在一些实施例中，缺口区域包括通过硫代磷酸酯键彼此连接的十个脱氧核糖核苷。在其他实施例中，缺口区域包括通过硫代磷酸酯键彼此连接的八个脱氧核糖核苷。
在其他实施例中，5’和3’翼区域中的每个磷磷具有S构型。每个S构型为至少90％纯、至少95％纯、或至少99％纯。
在一些实施例中，缺口区域中的每个磷具有S构型。每个S构型为至少90％纯、至少95％纯、或至少99％纯。
在其他实施例中，缺口区域中的磷具有R与S构型的混合。每个磷具有R或S构型，该R或S构型为至少90％纯、至少95％纯、或至少99％纯。
在一些实施例中，缺口区域中的磷、翼区域中的磷、或两个区域中的磷都是立体无规的。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐可与脂质缀合。在一些实施例中，脂质是棕榈酰脂质或胆固醇。脂质可以在缺口体的3’末端和/或5’末端缀合。脂质可以通过在缺口体的3’和/或5’末端处使用接头与这些缺口体缀合。在优选的实施例中，接头可以是PEG或己氨基接头。
本披露的另一个方面涉及包括缺口体或缺口体的药学上可接受的盐的药物组合物。缺口体或缺口体的药学上可接受的盐可以是本申请中讨论的任何实施例。
在其他实施例中，提供了缺口体，这些缺口体在该缺口体的DNA缺口区域可以包括一个或两个磷酸二酯键。
缺口体可用于治疗多种疾病和障碍。例如，它们可用作反义寡核苷酸用于体外靶向人微管相关蛋白tau(MAPT)基因转录物以治疗Tau相关神经***变性疾病，包括阿尔茨海默病和原发性tau蛋白病变。
在一些实施例中，反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐是长度在12至24个(即，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个中的每一种)核碱基之间的缺口体，该缺口体包含选自下组的核苷酸序列，该组由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17组成。在其他实施例中，缺口体长度可以是12至26个(即，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个中的每一种)核碱基，该缺口体包含选自下组的核苷酸序列，该组由SEQ ID NO：1至SEQID NO：17组成。反义寡核苷酸可以是嵌合寡核苷酸。嵌合寡核苷酸可以设计为本文披露的缺口体。
在其他实施例中，本文披露的缺口体可以由选自下组的核苷酸序列组成或包含该核苷酸序列，该组由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17组成。在另外的实施例中，缺口体具有至少一个经修饰的核苷间键、糖部分、或核碱基。在又另外的实施例中，经修饰的核苷间键是磷二酰胺吗啉代核苷键和/或硫代磷酸酯键。
本披露的另一个方面涉及在需要Tau抑制的患者中抑制Tau表达的方法，其中该方法包括使该患者的细胞或组织与如本文披露的反义寡核苷酸、缺口体或反义寡核苷酸和/或缺口体的药学上可接受的盐接触。
所讨论的实施例的其他方面和优点从以下说明书、附图以及所附权利要求书中应当是清楚的。
附图说明
图1A和图1B展示了寡核苷酸的固相合成和该固相合成中偶联反应的合成循环的示意图。
图2A和图2B描绘了根据溶液相合成方法的PMO-缺口体的代表性合成。
图3展现了一般SEQ ID NO：7作为5-8-5 PMO-缺口体(SEQ ID NO：7)的实例(粗体核苷酸是存在于翼区域的核苷酸)。“R”和“S”表示每个键的磷立体化学。
图4展现了一般SEQ ID NO：12作为立体定义的4-10-4 PMO-缺口体(SEQ ID NO：12)的实例(粗体核苷酸是存在于翼区域的核苷酸)。“R”和“S”表示每个键的磷立体化学。
图5显示了5-8-5和4-10-4 PMO-缺口体的结构。
图6显示了表13a和13b中化合物123和132a至132n的序列和磷立体化学(SEQ IDNO.12)。前四个和最后四个核苷酸是翼区域核苷酸。“R”和“S”表示每个键的磷立体化学。“M”意指R构型和S构型的混合，mC意指5-甲基胞嘧啶，并且C意指胞嘧啶。
具体实施方式
本披露的一个方面涉及缺口体或缺口体的药学上可接受的盐的实施例，该缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐由缺口区域和翼区域构成。优选地，缺口区域两侧是翼区域。
因此，所披露的缺口体的典型效用是，它们可以针对选择性基因转录物进行功能化，并充当翻译抑制剂。目的基因转录物是那些已被鉴定为有助于有害疾病的发生和发展的基因。
虽然认为本文使用的术语很好地为本领域的普通技术人员所理解，本文阐述定义以便于解释本文所披露的主题。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本文披露的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些方法、装置和材料相似或等效的任何方法、装置和材料可以用于目前披露的主题的实践或测试，但是本文描述代表性的方法、装置和材料。
除非另外规定或提及组合的上下文相反地清楚暗示，如本文中所使用，方法或过程步骤的所有组合均能以任何顺序进行。
本披露的方法和装置(包括其组件)可以包含本文所述的实施例的必要元件和限制以及本文所述的或另外有用的任何另外或任选组分或限制，由其组成和基本上由其组成。例如，被列为“包含”某些序列的缺口体，在其他实施例中，可能由这些序列组成，或基本上由这些序列组成。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表达成分的物理大小、量、特性(如反应条件)的所有数值应被理解为在所有情况中被术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，否则说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，这些近似值可以根据本披露主题试图获得的所需特性而变化。
如本文所用的“缺口体”是指嵌合反义寡核苷酸，该嵌合反义寡核苷酸含有足够长以诱导RNA酶H切割的脱氧核苷酸单体中心嵌段。“立体无规的缺口体”是在其每个立构中心具有(R)或(S)构型的混合的缺口体。在一些实施例中，立体无规的缺口体是来自与吗啉代或脱氧核糖核苷单体的延伸反应的产物。“立体定义的缺口体”是在其每个立构中心具有(R)或(S)立体化学构型的缺口体，其中这些构型是可控的。立体定义的缺口体可以是来自与立体纯吗啉代或脱氧核糖核苷单体的立体特异性延长反应的产物，其中将该缺口体的磷立体化学控制为一系列确定的立体化学(R)或(S)构型。
“PMO-缺口体”是包括翼区域的缺口体，这些翼区域包含通过磷二酰胺键彼此连接的吗啉代单体。
当提及反应时，“立体无规的”意指已经进行了反应而无对得到的立体化学的偏好。
作为描述异构体的术语的“R”和“S”是在不对称取代的原子上的立体化学构型的描述符，这些原子包括但不限于：碳、硫、磷和季氮。将不对称取代的原子指定为“R”或“S”是通过应用Cahn-Ingold-Prelog优先规则完成的，如本领域技术人员所熟知的，并描述于有机化学命名法E部分，立体化学的国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)规则中。
如本文所用的“药学上可接受的盐”是指本披露中化合物的酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的盐是保留母体化合物的活性并且不会对其施用的受试者和在其施用的情况下产生任何过度有害或不希望的影响的任何盐。药学上可接受的盐包括但不限于金属络合物以及无机酸和羧酸的盐。药学上可接受的盐还包括金属盐，如铝盐、钙盐、铁盐、镁盐、锰盐、钠盐和络合盐。此外，药学上可接受的盐包括但不限于，酸性盐如乙酸盐、天冬氨酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、醋氧乙(axetil)盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、双硫酸(bisulfuric)盐、双酒石酸盐(bitartaric)、丁酸盐、依地酸钙盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸(edisylic)盐、十二烷基磺酸(estolic)盐、esyl、乙磺酸(esylic)盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸(gluceptic)盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、羟乙酰基对氨苯砷酸(glycolylarsanilic)盐、环乙磺酸(hexamic)盐、己基雷锁辛酸(hexylresorcinoic)盐、海巴酸(hydrabamic)盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟基萘甲酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、粘康酸(muconic)盐、萘磺酸(napsylic)盐、硝酸盐、草酸盐、对硝基甲磺酸盐、扑酸(pamoic)盐、泛酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、邻苯二甲酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、磺酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸(teoclic)盐、甲苯磺酸盐等。
术语“药物组合物”包括适用于对哺乳动物(例如人)施用的制剂。当本发明化合物作为药物施用于哺乳动物(例如人)时，它们可以以其自身给予或以含有例如0.1％至99.9％(更优选0.5％至90％)活性成分的药物组合物和药学上可接受的载体组合给予。
可以根据常规药物复合技术将本文所述的化合物与药学上可接受的载体组合。如本文所用，“药学上可接受的载体”可以包括适合于所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂、或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿的医药科学]，第十六版，E.W.Martin(宾夕法尼亚州伊斯顿市的马克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)，1980)披露了用于配制药物组合物的各种载体以及用于其制备的已知技术。除非任何常规载体介质与化合物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学效应或在其他方面以有害方式与药物组合物的一种或多种任何其他组分相互作用，否则其使用被考虑在本发明的范围内。
可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油；红花籽油、芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇类；如丙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；基于水的溶液，如PBS或盐水；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液；以及其他无毒相容性润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁；以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂；防腐剂和抗氧化剂也可以根据配制者的判断存在于组合物中。
此外，载体可以根据施用所需的制剂形式来采取各种各样的形式，该施用例如是经口、经鼻、直肠、***、鞘内、肠胃外(包括静脉内注射或输注)。在制备用于口服剂型的组合物中，可以采用任何常见的药物介质。常见的药物介质包括，例如，在口服液体制剂(例如像，悬浮液、溶液、乳剂和酏剂)的情况下为水、二醇类、油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等；气溶胶；或者在口服固体制剂(例如像，粉末、胶囊和片剂)的情况下的载体，如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
在组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、生育酚等；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可以将包含化合物的药物组合物配制成具有任何所需浓度。在一些实施例中，配制组合物以使其至少包含治疗有效量。在一些实施例中，配制组合物以使其包含不会引起一种或多种不必要的副作用的量。
药物组合物包括适合经口、舌下、经鼻、直肠、***、局部、口腔、鞘内和/或肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)施用的那些，尽管最合适的途径将取决于所治疗病症的性质和严重程度。组合物可以方便地以单位剂型存在，且可通过制药领域领中众所周知的任何方法制备。在某些实施例中，药物组合物配制用于以丸剂、胶囊剂、锭剂或片剂形式口服施用。在其他实施例中，药物组合物呈悬浮液的形式。
术语“烷基”包括支链、直链和环状的经取代或未经取代的饱和脂族烃基。C1-C6烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、环己基甲基、环丙基甲基和新己基基团。
术语“芳基”包括6元至14元(即，6、7、8、9、10、11、12、13或14元中的每一种)单环、双环或三环芳香族烃环***。芳基基团的实例包括苯基和萘基。
卤素可以是F、Cl、Br或I。
本申请详细描述了对常规的缺口体的改进。常规的缺口体可以通过下图表示：
一项改进涉及在翼区域使用磷二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)。这些PMO具有比DNA更高的RNA结合亲和力，并且对核酸酶具有抗性。
第二个改进涉及通过缺口区域中的硫代磷酸酯键将脱氧核糖核苷连接在一起。这些硫代磷酸酯键使核苷酸间键对核酸酶降解具有抗性。
在一些实施例中，5’和3’翼区域中的每一个通过硫代磷酸酯或磷二酰胺间键中的一种连接到缺口区域。
改进的缺口体的一般结构可以通过下图表示：
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有硫代磷酸酯键和磷二酰胺键，其中这些键各自具有独立地处于R或S构型的磷，并且其中每个R或S构型为至少90％纯。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有硫代磷酸酯键和磷二酰胺键，其中这些键各自具有独立地处于R或S构型的磷，并且其中每个R或S构型为至少95％纯。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有硫代磷酸酯键和磷二酰胺键，其中这些键各自具有独立地处于R或S构型的磷，并且其中每个R或S构型为至少99％纯。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有缺口区域，该缺口区域含有通过硫代磷酸酯键彼此连接的6-12个(即，6、7、8、9、10、11或12个中的每一种)脱氧核糖核苷。
在优选的实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐进一步具有缺口区域，该缺口区域含有通过硫代磷酸酯键彼此连接的8-10个(即，8、9或10个中的每一种)脱氧核糖核苷。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有5’和3’翼区域，其中这些5’和3’翼区域可以各自由通过磷二酰胺键彼此连接的3-7个(即，3、4、5、6或7个中的每一种)吗啉代单体组成。在优选的实施例中，5’和3’翼区域各自由通过磷二酰胺键彼此连接的4或5个吗啉代单体组成。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有磷二酰胺键，其中5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少90％纯。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有磷二酰胺键，其中5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少95％纯。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有磷二酰胺键，其中5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少99％纯。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有硫代磷酸酯键，其中缺口区域中的该硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少90％纯。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有硫代磷酸酯键，其中缺口区域中的该硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少95％纯。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有硫代磷酸酯键，其中缺口区域中的该硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少99％纯。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐在缺口区域具有硫代磷酸酯键，其中这些硫代磷酸酯键的至少一个磷具有R构型。在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐在缺口区域具有硫代磷酸酯键，其中这些硫代磷酸酯键的一个磷具有R构型。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐在缺口区域具有硫代磷酸酯键，其中这些硫代磷酸酯键的至少两个磷原子具有R构型。在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐在缺口区域具有硫代磷酸酯键，其中这些硫代磷酸酯键的两个磷原子具有R构型。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐在缺口区域具有硫代磷酸酯键，其中所有这些硫代磷酸酯键都具有S硫代磷酸酯构型。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐在缺口区域具有硫代磷酸酯键，其中所有这些硫代磷酸酯键都具有R硫代磷酸酯构型。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐具有硫代磷酸酯键和磷二酰胺键，其中这些键中的所有磷原子是立体无规的。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐与脂质、细胞穿透肽、或多个N-乙酰基半乳胺糖(GalNAc)缀合。脂质可以是例如，生育酚、胆固醇、棕榈酰脂质、或二十二碳六烯酸(DHA)脂质。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐与脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc缀合，其中该脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc通过接头与这些缺口体缀合。
在优选的实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐用PEG接头或己氨基接头与脂质缀合。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐与脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc缀合，其中该脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc在这些缺口体的3’末端缀合。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐与脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc缀合，其中该脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc在这些缺口体的5’末端缀合。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐与脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc缀合，其中硫代磷酸酯键和磷二酰胺键都具有立体无规的磷原子。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐与脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc缀合，其中5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少90％纯。
在一些实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐与脂质、细胞穿透肽或多个GalNAc缀合，其中缺口区域中的硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少90％纯。
在其他实施例中，缺口体或这些缺口体的药学上可接受的盐包含代表寡核苷酸的核苷酸序列，这些寡核苷酸可用于或作为反义寡核苷酸用于调节Tau mRNA和用于Tau蛋白表达。这些序列示于表1中：
表1
序列 SEO ID NO：
GGGGACTCGCTGACATGG (SEQ ID NO：1)
TGGGTGTAGCGAGAATCC (SEQ ID NO：2)
GGGTGCACTAGTTTATAG (SEQ ID NO：3)
GGGGTCTTCTAATATCCT (SEQ ID NO：4)
AGGTTCTCGCTATATCGC (SEQ ID NO：5)
GAGTTAGAAGCTTTGACT (SEQ ID NO：6)
GCAGATGACCCTTAGACA (SEQ ID NO：7)
CAAACCTGTCACACCCGA (SEQ ID NO：8)
TTAAACCCCATAGACATA (SEQ ID NO：9)
GAGGCCCAAATGATCACA (SEQ ID NO：10)
TGGATTTAGCAGTAGGGT (SEQ ID NO：11)
AGCAGATGACCCTTAGAC (SEQ ID NO：12)
AGCCGGCATACAGTATAT (SEQ ID NO：13)
TGTGCTCTTTATGGATGG (SEQ ID NO：14)
GGATTTAGCAGTAGGGTG (SEQ ID NO：15)
CCCCATGACTACAGTGTG (SEQ ID NO：16)
GCTTTTGTGACCAGGGAC (SEQ ID NO：17)
表1中显示的序列处于5’到3’方向。
在一些实施例中，表1中显示的核苷酸序列可以作为本文披露的5-8-5缺口体存在，这意味着它们具有8个寡核苷酸反义缺口区域，该8个寡核苷酸反义缺口区域两侧有两个5个寡核苷酸翼区域。例如，如果SEQ ID NO：7是5-8-5缺口体，那么它将具有以下序列：GCAGATGACCCTTAGACA(SEQ ID NO：7)，其中下划线部分代表存在于缺口体的缺口区域内的脱氧核糖核苷，这些脱氧核糖核苷通过硫代磷酸酯键彼此连接。非下划线部分代表存在于翼区域内的吗啉代单体，这些吗啉代单体通过磷二酰胺键彼此连接。在优选的实施例中，5-8-5缺口体是PMO-缺口体。
表1中显示的核苷酸序列也可以作为立体无规或立体定义的5-8-5缺口体存在。
表1中的缺口体可以是立体定义的5-8-5缺口体。图3描绘了一般SEQ ID NO.7的立体定义的5-8-5缺口体。
在其他实施例中，表1中显示的核苷酸序列可以作为本文披露的4-10-4缺口体存在，这意味着它们具有10个寡核苷酸反义缺口区域，该10个寡核苷酸反义缺口区域两侧有两个4个寡核苷酸翼区域。例如，如果一般SEQ ID NO：12是4-10-4缺口体，那么它将具有以下序列：AGCAGATGACCCTTAGAC(SEQ ID NO：12)，其中下划线部分代表存在于缺口体的缺口区域内的脱氧核糖核苷，这些脱氧核糖核苷通过硫代磷酸酯键彼此连接。非下划线部分代表存在于翼区域内的吗啉代单体，这些吗啉代单体通过磷二酰胺键彼此连接。在优选的实施例中，4-10-4缺口体是PMO-缺口体。
表1中显示的核苷酸序列也可以作为立体无规或立体定义的4-10-4缺口体存在。
表1中的缺口体可以是立体定义的4-10-4缺口体。图4描绘了一般SEQ ID NO.12的立体定义的4-10-4缺口体。
图5显示了5-8-5和4-10-4 PMO-缺口体的一般结构。
在特定的实施例中，翼区域的吗啉代单体通过磷二酰胺键连接，并且缺口区域的脱氧核糖核苷通过硫代磷酸酯键连接。在其他实施例中，缺口区域通过硫代磷酸酯键和/或磷二酰胺键与翼区域连接。
表1中显示的核苷酸序列可以作为本文披露的缺口体存在，其中这些缺口体的硫代磷酸酯和磷二酰胺键中的每个磷可以独立地处于R或S构型。每个R或S构型为至少90％纯、至少95％纯、或至少99％纯。
本领域技术人员将理解可以在缺口体中进行单核苷酸取代，并且在某些情况下这不会影响活性。
因此，所披露的缺口体的效用是，它们可以针对选择性基因转录物进行功能化，并充当翻译抑制剂，特别是Tau mRNA的翻译抑制剂。目的基因转录物是那些已被鉴定为有助于有害疾病的发生和发展的基因。在特定实施例中，那些有害疾病与Tau表达有关。
本披露还包括用于固相合成所披露的PMO-缺口体的方法。
在一些实施例中，通过固相合成方法合成PMO-缺口体，其中这些固相合成方法进一步包括将吗啉代单体附接至固体支持体。在优选的实施例中，固体支持体是氨基甲基聚苯乙烯树脂。
在其他实施例中，固相合成方法进一步包括通过将吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与吗啉代单体在固体支持体上偶联，延长5’-翼区域。
在一些实施例中，固相合成方法进一步包括通过将反向DNA-或吗啉代-亚磷酰胺与PMO在固体支持体上偶联，延长DNA缺口区域。
在其他方法中，固相合成方法进一步包括通过将吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与PMO-DNA嵌合体在固体支持体上偶联，延长3’-翼区域。
在一些实施例中，通过固相合成方法延长5’PMO-缺口体翼区域可以进一步包括脱三苯甲基化步骤。脱三苯甲基化步骤可以包括在3wt/v％TCA在CH2Cl2中的混合物中处理延长的5’-翼区域。
在其他实施例中，通过固相合成方法延长5’-翼区域进一步包括中和该延长的5’-翼区域。中和可以包括用iPr2NEt、DMI和CH2Cl2(比率为10∶45∶45)的混合物洗涤延长的5’-翼区域。
在一些实施例中，固相合成方法进一步包括通过将吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与吗啉代单体在DMI中的1，2，2，6，6-五甲基哌啶(PMP)的存在下，延长5’-翼区域。
在一些实施例中，通过固相合成方法延长5’-翼区域进一步包括对该延长的5’-翼区域进行封端。封端可进一步包括将延长的5’-翼区域与四氢呋喃(THF)、2，6-二甲基吡啶和Ac2O的混合物混合。对延长的5’-翼区域进行封端还可进一步包括将该延长的5’-翼区域与16％1-甲基咪唑和THF的混合物混合。在一些实施例中，对延长的5’-翼区域进行封端可以包括将该延长的5’-翼区域与以上所述的两种混合物混合。
在其他实施例中，通过固相合成方法延长5’-翼区域进一步包括从该延长的5’-翼区域去除Ac2O。Ac2O的去除可进一步包括将延长的5’-翼区域与吗啉在DMI中的0.4M溶液混合。
可重复脱三苯甲基化步骤、中和步骤、偶联步骤、封端步骤和Ac2O去除步骤，直到连接了具有所需量的吗啉代单体的5’-翼区域。
在其他实施例中，通过固相合成方法延长DNA缺口区域可以进一步包括脱三苯甲基化步骤。脱三苯甲基化步骤可以包括在3wt/v％TCA在CH2Cl2中的混合物中处理延长的PMO-缺口体。
在其他实施例中，固相合成方法进一步包括通过将反向DNA-或吗啉代-亚磷酰胺与5’-PMO翼区域在亚酰胺和5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)在乙腈中的混合物中偶联，延长DNA缺口区域。
在一些实施例中，通过固相合成方法延长DNA缺口区域可以进一步包括硫化步骤。硫化步骤可以包括在((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1，2，4-二噻唑啉-3-硫酮(DDTT)在吡啶和乙腈中的混合物中处理延长的PMO-缺口体，其中吡啶与乙腈的比率可以是2/3。
在其他实施例中，通过固相合成方法延长DNA缺口区域进一步包括封端步骤。封端可进一步包括将DNA缺口区域与10vol％乙酸酐在THF中的混合物混合并延长。对延长的DNA缺口区域进行封端还可进一步包括将该延长的DNA缺口区域与比率为10∶80∶10(w/w/w)的1-甲基咪唑-THF-吡啶的混合物混合。在一些实施例中，对延长的DNA缺口区域进行封端可以包括将该延长的DNA缺口区域与以上所述的两种混合物混合。
可重复脱三苯甲基化步骤、偶联步骤、硫化步骤和封端步骤，直到连接了具有所需量的脱氧核糖核苷的DNA缺口区域。
在一些实施例中，通过固相合成方法延长3’-PMO翼区域可以进一步包括脱三苯甲基化步骤。脱三苯甲基化步骤可以包括在3wt/v％TCA在CH2Cl2中的混合物中洗涤延长的3’PMO-缺口体翼区域。
在其他实施例中，通过固相合成方法延长3’PMO-缺口体翼区域进一步包括中和该延长的3’PMO-缺口体翼区域。中和可以包括用DMI和CH2Cl2中的iPr2NEt(比率为10∶45∶45)洗涤延长的3’PMO-缺口体翼区域。
在一些实施例中，固相合成方法进一步包括通过将吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与吗啉代单体在DMI中的PMP的存在下，延长3’PMO-缺口体翼区域。
在一些实施例中，通过固相合成方法延长3’PMO-缺口体翼区域进一步包括对该延长的3’PMO-缺口体翼区域进行封端。封端可进一步包括将延长的3’PMO-缺口体翼区域与THF、2，6-二甲基吡啶和Ac2O的混合物混合。对延长的3’PMO-缺口体翼区域进行封端还可进一步包括将该延长的3’PMO-缺口体翼区域与16％1-甲基咪唑和THF的混合物混合。在一些实施例中，对延长的3’PMO-缺口体翼区域进行封端可以包括将该PMO-缺口体与以上所述的两种混合物混合。
在其他实施例中，通过固相合成方法延长3’PMO-缺口体翼区域进一步包括从该延长的3’PMO-缺口体翼区域去除Ac2O。Ac2O的去除可进一步包括将延长的3’PMO-缺口体翼区域与吗啉在DMI中的0.4M溶液混合。
在一些实施例中，通过固相合成方法延长3’PMO-缺口体翼区域进一步包括用CH2Cl2洗涤该延长的3’PMO-缺口体翼区域。在Ac2O去除步骤、脱三苯甲基化步骤、中和步骤、偶联步骤、和/或封端步骤后，可以将延长的3’PMO-缺口体翼区域用CH2Cl2洗涤。
可重复脱三苯甲基化步骤、中和步骤、偶联步骤、封端步骤和Ac2O去除步骤，直到连接了具有所需量的吗啉代单体的3’PMO-缺口体翼区域。
在一些实施例中，形成所披露的PMO-缺口体的固相合成方法可进一步包括从固体支持体上切割完全延长的PMO-缺口体。切割步骤可以包括将附接至固体支持体的完全延长的PMO-缺口体与20vol％二乙胺在CH3CN中的混合物混合。切割步骤可进一步包括将附接至固体支持体的完全延长的PMO-缺口体与比率为3∶1的28％NH4OH和EtOH的混合物混合。
在其他实施例中，形成所披露的PMO-缺口体的固相合成方法进一步包括通过反相液相色谱法纯化这些PMO-缺口体。在优选的实施例中，将PMO-缺口体通过反相高效液相色谱法纯化。
在一些实施例中，形成所披露的PMO-缺口体的固相合成方法进一步包括通过脱盐步骤、阴离子交换步骤、浓缩步骤或三个步骤中的任何组合纯化这些PMO-缺口体。
本披露的另一个方面涉及溶液相合成方法以产生立体定义的PMO-缺口体。
在一些实施例中，通过以溶液相合成方法偶联立体定义的5’-片段与立体定义的3’-片段产生立体定义的PMO-缺口体。
在其他实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤包括12-mer立体定义的3’-片段与6-mer立体定义的5’-片段之间的偶联。
在一些实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤包括13-mer立体定义的3’-片段与5-mer立体定义的5’-片段之间的偶联。
在一些实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤包括14-mer立体定义的3’-片段与6-mer立体定义的5’-片段之间的偶联。
12-mer、13-mer或14-mer立体定义的3’-片段可以进一步包括磷二酰胺连接的吗啉代单体和/或硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷。
5-mer和6-mer立体定义的5’-片段可以含有磷二酰胺连接的吗啉代单体和/或硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷。
在一些实施例中，立体定义的PMO-缺口体的合成需要脱保护步骤。脱保护步骤可以包括将立体定义的PMO-缺口体中间体在甲醇、28％氢氧化铵和/或DL-二硫苏糖醇的溶液中混合。可以向该溶液中进一步添加乙腈和EtOAc的混合物。
在其他实施例中，立体定义的PMO-缺口体的合成需要纯化步骤。纯化步骤可以包括过滤沉淀物，洗涤沉淀物，干燥沉淀物，将溶液用硅胶色谱法纯化，过滤浆料，将浆料或溶液离心，将溶液用RP-HPLC纯化，将溶液用IEX-HPLC纯化，将溶液脱盐，将溶液冷冻干燥，和/或其组合。
在一些实施例中，5’-片段的合成包括偶联步骤、Tr脱保护步骤、活化步骤或其组合。溶液相合成方法可进一步包括一系列这些步骤，可以重复这些步骤直到合成所需长度的立体定义的5’-片段。
溶液相合成方法的偶联步骤可进一步包括将吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与PMO偶联。其他实施例可以包括将吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与1-mer吗啉代偶联。
在其他实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤可进一步包括在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮中并且在1，2，2，6，6-五甲基哌啶(PMP)的存在下混合吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯。
在一些实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤可进一步包括在偶联完成后向偶联反应混合物中添加EtOAc、甲基叔丁基醚和/或正庚烷，直到沉淀出目标产物。
在其他实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤可进一步包括在偶联完成后添加吗啉。
在一些实施例中，5’-片段合成的Tr脱保护步骤可以包括将立体定义的PMO在DCM、乙醇和三氟乙酸(TFA)的溶液中混合。另外的实施例可以包括4-氰基吡啶/TFA在DCM/TFA/乙醇中的溶液的用途。脱保护步骤可进一步包括向混合物中添加EtOAc、甲基叔丁基醚、和/或正庚烷，直到沉淀出目标产物。可以收集沉淀物，并且将其用EtOAc、DCM、甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇和/或其组合进一步洗涤。
该过程中的沉淀物将是所需的产物的TFA盐。产物的游离碱可以通过将TFA盐溶解于DCM中，任选地用MeOH，并用PMP处理而形成。随后，添加EtOAc、MTBE、和/或正庚烷以沉淀出产物。
在一些实施例中，5’-片段合成的活化步骤可以包括将5-mer或6-mer立体定义的PMO-缺口体中间体(包含PMO和脱氧核糖核苷)与(2S，3aS，6R，7aS)-3a-甲基-2-((全氟苯基)硫代)-6-(丙-1-烯-2-基)六氢苯并[d][1，3，2]氧杂硫杂磷杂茂2-硫化物((-)-PSI试剂)或(2R，3aR，6S，7aR)-3a-甲基-2-((全氟苯基)硫代)-6-(丙-1-烯-2-基)六氢苯并[d][1，3，2]氧杂硫杂磷杂茂2-硫化物((+)-PSI试剂)混合。反应混合物可进一步包括分子筛、DBU、DMI、DCM和/或THF。可以将溶液进一步用氮气冲洗，然后添加DBU。也可以向溶液中添加EtOAc、甲基叔丁基醚和/或正庚烷，直到沉淀出目标产物。将沉淀物用EtOAc和/或甲基叔丁基醚洗涤。
在一些实施例中，用2-氯-“螺环”-4，4-五亚甲基-1，3，2-氧硫杂磷杂环戊烷进行5’-片段的活化。活化过程可进一步包含反应混合物中的二异丙基乙胺、THF和DCM，以及添加的元素硫。
在一些实施例中，3’-片段的合成包括立体定义的PMO的合成、碱基保护基团的脱保护、N-保护步骤、5’-O-保护基团的脱保护、偶联步骤、DMT脱保护步骤或其组合。溶液相合成方法可进一步包括一系列这些步骤，可以重复这些步骤直到合成所需长度的立体定义的3’-片段。
在其他实施例中，用于3’-片段合成的碱基保护基团的脱保护步骤可以包括将立体定义的PMO在甲醇和/或28％氢氧化铵的溶液中混合。脱保护步骤可进一步包括向溶液中添加EtOAc、MeCN、和/或甲基叔丁基醚，直到沉淀出目标产物。可以将沉淀物用EtOAc、DCM、甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇和/或其组合洗涤。
在其他实施例中，溶液相合成方法的N-保护步骤可以包括将脱保护立体定义的PMO在THF、水和甲醇的溶液中混合。可以向溶液中进一步添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶和3，5-双(三氟甲基)苯甲酰氯。N-保护步骤可进一步包括添加EtOAc、DCM、甲醇和/或其组合，直到沉淀出目标产物。可以将沉淀物用EtOAc、DCM和/或其组合洗涤。
在一些实施例中，溶液相合成方法的5’-OTBDPS脱保护步骤可以包括将立体定义的PMO在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、甲氧基三甲基硅烷、吡啶、TEA、甲醇和/或TEA-3HF的溶液中混合。脱保护步骤可进一步包括向溶液中添加EtOAc，直到沉淀出目标产物。可以收集沉淀物，并且将其用EtOAc、DCM、甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇和/或其组合进一步洗涤。
在其他实施例中，3’-片段的合成包括将手性P(V)活化的核苷与包含立体定义的硫代磷酸酯键的脱氧核糖核苷酸或立体定义的PMO中的一种偶联。
手性P(V)活化的核苷
在其他实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤可进一步包括将(+)-或(-)-PSI-缀合的核苷与包含立体定义的硫代磷酸酯键的立体定义的PMO-缺口体中间体或立体定义的PMO偶联。(+)-或(-)-PSI-缀合的核苷与立体定义的PMO或立体定义的PMO-缺口体中间体的一个的偶联可以发生在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮的溶液中。反应混合物可进一步包含分子筛和/或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。还可以将溶液与甲苯共沸一次至三次，然后添加/>分子筛和/或DBU。还可以将溶液用氮气或氩气冲洗一次或三次，并且放置在惰性气氛下，然后添加DBU。/>
在一些实施例中，溶液相合成方法的偶联步骤在室温下进行。
该说明书包括必需的序列表，并且各种化合物表明了该化合物中使用的核苷酸序列。本领域技术人员将理解，当序列被称为“5-8-5PMO-缺口体”或“5-8-5”序列时，在确定的化合物中，在5’到3’的方向上，序列表中所示的核苷酸被连接，使得核苷酸1至6通过磷二酰胺键连接，核苷酸6至14通过硫代磷酸酯键连接，并且核苷酸14至18通过磷二酰胺键连接。同样地，在4-10-4 PMO-缺口体中，在确定的化合物中，在5’到3’的方向上，序列表中所示的核苷酸被连接，使得核苷酸1至5通过磷二酰胺键连接，核苷酸5至15通过硫代磷酸酯键连接，并且核苷酸15至18通过磷二酰胺键连接。此外，此类化合物的立体化学如本申请的主体所报道。
在其他实施例中，溶液相合成方法的DMT脱保护步骤可进一步包括在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇、2，2，2-三氟乙醇、DCM和/或三乙基硅烷的混合物中混合立体定义的PMO-缺口体中间体。脱保护步骤可进一步包括向溶液中添加EtOAc、甲基叔丁基醚和/或正庚烷，直到沉淀出目标产物。可以收集沉淀物，并且将其用EtOAc、DCM、甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇和/或其组合进一步洗涤。
实例
缩写
在整个实例中可以使用以下缩写。
Bz：苯甲酰基
iBu：异丁酰基
CE：氰基乙基
DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCM：二氯甲烷
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺
DMAP：4-(二甲基氨基)吡啶
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DMI：1，3-二甲基-2-咪唑啉酮
DMSO：二甲基亚砜
DMT：4，4′-二甲氧基三苯甲基
EtOAc：乙酸乙酯
HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-***并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
MeCN：乙腈
MMT：4-甲氧基三苯基甲基
MTBE：甲基叔丁基醚
PMP：1，2，2，6，6-五甲基哌啶
tert-：叔
TEA：三乙胺
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TBDPS：叔丁基二苯基甲硅烷基
Tr：三苯基甲基
以下实例中的化合物的化学名称是使用“E-手册(E-Notebook)2014”第13版或E-手册第18.1.1.0073版(铂金埃尔默有限公司(PerkinElmer Co.，Ltd.))，基于化学结构创建的。
在实例中，使用SNAP柱或Hi-FlashTM柱硅胶或氨基(YAMAZENE公司)进行快速色谱法分离。
质子核磁共振(NMR)谱在JEOL JNM-ECZ 400S/L1或JEOL JNM-ECZ 500R/S1或Varian Inova 500MHz或Varian Inova 400MHz、或Bruker 400MHz光谱仪上记录。化学位移以(ppm)为单位报告，并且偶合常数以赫兹(Hz)为单位报告。裂分形式的缩写如下：s：单峰；d：双峰；t：三重峰；m：多重峰；以及brs：宽单峰。31P核磁共振(NMR)谱在Varian Inova400MHz或Bruker 400MHz光谱仪上记录。化学位移以(ppm)为单位报告。裂分形式的缩写如下：s：单峰。
使用Acquity UPLC和SQD2(沃特世(Waters))、或Acquity UPLC和Synapt G2(沃特世)、或Nexera X3 UHPLC(岛津公司(Shimadzu))和Q Exactive Plus(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))进行质谱法。
在实例中，将可商购的产品适当地用作可商购化合物。
实例1：单体的合成和吗啉代单体在固体支持体上的负载
((2R，3S，5R)-3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(5-甲基-2，4-二氧代-3， 4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯的合成
方法-1
向3′-O-[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]胸苷(CAS 76054-81-4)(3.00g，5.51mmol)在DCM(20mL)中的溶液中添加1-甲基咪唑(0.524mL，6.61mmol)、2，6-二甲基吡啶(1.60mL，13.8mmol)，随后伴随冰冷却一次性添加(二甲基氨基)膦酰二氯(1.63mL，13.8mmol)。将所得溶液在室温下搅拌6h。伴随冰冷却，向5％柠檬酸水溶液(60mL)中添加反应混合物。将混合物分离，并且将水层用DCM萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用50％至80％EtOAc/庚烷进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(2.71g)。
方法-2
在0℃下，向3′-O-[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]胸苷(3.00g，5.51mmol)在CH3CN(55mL)和DCM(55mL)中的溶液中添加溴化锂(1.58g，18.2mmol)和DBU(2.74mL，18.2mmol)，随后一次性添加(二甲基氨基)膦酰二氯(0.853mL，7.16mmol)，并且在相同温度下搅拌15min。将所得溶液在室温下搅拌1h。在0℃下，向反应混合物中添加在水(95mL)中的柠檬酸一水合物(5.0g，23.8mmol)。向混合物中添加DCM(50mL)，并将混合物通过ISOLUTETM相分离器(拜泰齐公司(Biotage))分离，并且将有机层在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用50％至100％EtOAc/庚烷进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(1.18g)。
1HNMR(396MHz，氯仿-d)δ7.28-7.36(m，7H)，7.94(br s，1H)，7.42-7.46(m，2H)，6.80-6.88(m，4H)，6.34-6.45(m，1H)，4.26-4.35(m，1H)，3.86-4.03(m，2H)，3.79(s，6H)，3.45-3.57(m，1H)，2.59-2.67(m，7H)，2.04-2.20(m，1H)，1.84-1.91(m，3H)，1.61-1.73(m，1H)。
((2R，3S，5R)-5-(4-苯甲酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3-(双(4-甲氧基苯基) (苯基)甲氧基)四氢呋喃-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯的合成
在-10℃下，向N-苯甲酰基-3′-O-[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基1-2′-脱氧胞苷(CAS 140712-80-7)(2.00g，3.16mmol)在CH3CN(20mL)和DCM(28mL)中的溶液中添加溴化锂(0.850g，9.78mmol)和DBU(1.46mL，9.78mmol)，随后一次性添加(二甲基氨基)膦酰二氯(0.560mL，4.73mmol)。将所得溶液在-10℃下搅拌4h。向反应混合物中添加5％柠檬酸水溶液(220mL)。将混合物在-10℃下搅拌5min。向混合物中添加DCM，然后将其分离。将水层用DCM萃取，并且将合并的有机层用水洗涤，然后用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用60％至80％EtOAc/庚烷进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(1.49g)。
1H NMR(氯仿-d，396MHz)δ8.02-8.05(m，1H)，7.87(br d，2H，J＝7.7Hz)，7.60(t，1H，J＝7.7Hz)，7.44-7.52(m，5H)，7.28-7.36(m，6H)，7.21-7.26(m，1H)，6.83-6.85(m，4H)，6.38-6.42(m，1H)，4.29-4.32(m，1H)，3.99-4.04(m，0.5H)，3.92-3.93(m，0.5H)，3.83-3.87(m，1H)，3.79(s，6H)，3.44-3.52(m，1H)，2.63(s，1.5H)，2.63(s，1.5H)，2.60(s，1.5H)，2.59(s，1.5H)，1.63-1.73(m，2H)。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C39H41ClN4O8P的计算值：759.235；发现值：759.372。
((2R，3S，5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲 氧基)四氢呋喃-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯的合成
在0℃下，向N-苯甲酰基-3′-O-[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2′-脱氧腺苷(CAS 140712-79-4)(3.00g，4.56mmol)、1-甲基咪唑(0.434mL，5.47mmol)、和2，6-二甲基吡啶(1.32mL，11.4mmol)在DCM(22.6mL，351.2mmol)中的溶液中添加(二甲基氨基)膦酰二氯(1.35mL，11.4mmol)。将混合物逐渐加温至室温并在室温下搅拌5h。将反应混合物倒入冰冷的5％柠檬酸水溶液中，然后用EtOAc萃取(2次)。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物使用20％至40％至80％EtOAc/庚烷进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(2.10g)。1H NMR(396MHz，氯仿-d)δppm8.84-8.95(m，1H)，8.78(s，1H)，8.13(m，1H)，8.00(m，2H)，7.58-7.64(m，1H)，7.47-7.53(m，4H)，7.28-7.42(m，6H)，6.79-6.92(m，4H)，6.54(m，1H)，4.48-4.57(m，1H)，4.06-4.17(m，2H)，3.94-4.05(m，1H)，3.80(m，1H)，3.79(s，6H)，2.59-2.60(m，3H)，2.55-2.56(m，3H)，2.33-2.46(m，1H)，2.11-2.30(m，1H)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C40H41ClN6O7P的计算值：783.246；发现值：783.368。
((2R，3S，5R)-3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(2-异丁酰胺基-6-氧代- 1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯的合成
(1)N-(9-((2R，4S，5R)-4-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(((叔丁基二甲 基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺
向N-(9-((2R，4S，5R)-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(CAS 68892-42-2)(5.00g，14.8mmol)在吡啶(33.5mL，0.414mol)中的溶液中伴随冰冷却添加叔丁基氯二甲基硅烷(3.35g，22.2mmol)。将所得溶液在室温下搅拌190min。向溶液中添加4，4′-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(8.54g，25.2mmol)。将所得溶液在50℃下搅拌2h。向反应混合物中添加饱和NaHCO3水溶液(150mL)，然后将其分离。将水层用DCM萃取两次，并且将合并的有机层用水和盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用33％至66％EtOAc/庚烷进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(8.78g)。
1H NMR(氯仿-d，396MHz)δ11.87(s，1H)，7.98(s，1H)，7.80(s，1H)，7.45-7.47(m，2H)，7.28-7.36(m，6H)，7.21-7.24(m，1H)，6.82-6.84(m，4H)，6.20-6.24(m，1H)，4.36-4.38(m，1H)，4.05-4.07(m，1H)，3.78(s，6H)，3.58-3.62(m，1H)，3.31-3.35(m，1H)，2.54-2.61(m，1H)，1.94-2.01(m，1H)，1.83-1.88(m，1H)，1.27-1.29(m，6H)，0.77(s，9H)，-0.07(s，3H)，-0.09(s，3H)。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C41H52N5O7Si的计算值：754.363；实测值：754.387。
(2)N-(9-((2R，4S，5R)-4-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(羟基甲基)四氢 呋喃-2-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺
向N-(9-((2R，4S，5R)-4-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(4.50g，5.97mmol)在THF(41mL)中的溶液中添加四正丁基氟化铵(1M THF溶液，6.57mL，6.57mmol)。将所得溶液在室温下搅拌18h。将反应混合物用EtOAc(400mL)稀释，并且用饱和NH4Cl水溶液(200mL)、饱和NaHCO3水溶液(200mL)和盐水(200mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用0％至20％MeOH/DCM进行硅胶柱色谱法以得到含有目标材料的混合物。将混合物使用1％至5％MeOH/DCM进行进一步硅胶柱色谱法以得到目标材料(3.03g)。
1H NMR(氯仿-d，396MHz)δ12.00(br s，1H)，8.24(br s，1H)，7.65(s，1H)，7.43-7.46(m，2H)，7.28-7.35(m，6H)，7.21-7.23(m，1H)，6.81-6.85(m，4H)，6.15(dd，1H，J＝5.3，9.7Hz)，5.14(br d，1H，J＝11.0Hz)，4.50(d，1H，J＝5.7Hz)，4.05(s，1H)，3.78(s，3H)，3.78(s，3H)，3.68-3.71(m，1H)，3.27(t，1H，J＝11.0Hz)，2.55-2.62(m，1H)，2.41(ddd，1H，J＝5.7，9.7，13.6Hz)，1.70(dd，1H，J＝5.3，13.6Hz)，1.22-1.23(m，6H)。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C35H38N5O7的计算值：640.277；实测值：640.615。
(3)((2R，3S，5R)-3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(2-异丁酰胺基-6-氧 代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯
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向N-(9-((2R，4S，5R)-4-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(2.38g，3.73mmol)在CH3CN(32mL)和DCM(32mL)中的溶液中添加溴化锂(1.29g，14.9mmol)和DBU(2.25mL，14.9mmol)，随后伴随冰冷却一次性添加(二甲基氨基)膦酰二氯(0.887mL，7.45mmol)。将所得溶液伴随冰冷却搅拌45min。向反应混合物中添加5％柠檬酸水溶液(300mL)。将混合物伴随冰冷却搅拌5min。向混合物中添加DCM(270mL)，然后将其分离。将水层用DCM萃取两次，并且将合并的有机层用水洗涤。将水层用DCM萃取两次，并将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用0％至16％THF/DCM进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(2.08g)。
1H NMR(氯仿-d，396MHz)δ12.15(s，0.5H)，12.11(s，0.5H)，10.01(s，0.5H)，9.93(s，0.5H)，7.64(s，0.5H)，7.61(s，0.5H)，7.44-7.47(m，2H)，7.30-7.36(m，6H)，7.21-7.24(m，1H)，6.83-6.86(m，4H)，6.27-6.31(m，0.5H)，6.16-6.20(m，0.5H)，4.70-4.76(m，0.5H)，4.48-4.49(m，0.5H)，4.32-4.38(m，1H)，4.20-4.25(m，1H)，3.99-4.03(m，0.5H)，3.85-3.88(m，0.5H)，3.78(s，3H)，3.78(s，3H)，2.65-2.76(m，2H)，2.62(s，1.5H)，2.61(s，1.5H)，2.59(s，1.5H)，2.58(s，1.5H)，1.94-1.99(m，0.5H)，1.67-1.72(m，0.5H)，1.16-1.21(m，6H)。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C37H43ClN6O8P的计算值：765.256；发现值：765.383。
((2S，6R)-6-(2-异丁酰胺基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗 啉-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯的合成
向N-(9-((2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(4.00g，6.91mmol)在CH3CN(59mL)和DCM(59mL)中的溶液中添加溴化锂(2.40g，27.6mmol)和DBU(4.17mL，27.6mmol)，随后伴随冰冷却一次性添加(二甲基氨基)膦酰二氯(1.65mL，13.8mmol)。将所得溶液伴随冰浴搅拌35min。向反应混合物中添加5％柠檬酸水溶液(220mL)。将混合物伴随冰浴搅拌5min。向混合物中添加DCM(180mL)，然后将其分离。将水层用DCM萃取两次，并将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用0％至16％THF/DCM进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(2.70g)。
1H NMR(氯仿-d，396MHz)δ11.98(br s，0.5H)，11.97(br s，0.5H)，8.62(s，0.5H)，8.46(s，0.5H)，7.58(s，0.5H)，7.57(s，0.5H)，7.44(br s，6H)，7.28-7.31(m，6H)，7.17-7.21(m，3H)，5.96-6.01(m，1H)，4.42-4.47(m，1H)，4.02-4.18(m，2H)，3.41-3.44(m，1H)，3.19-3.23(m，1H)，2.66-2.71(m，1H)，2.64(s，1.5H)，2.63(s，1.5H)，2.61(s，1.5H)，2.59(s，1.5H)，1.69-1.75(m，1H)，1.50-1.57(m，1H)，1.26-1.31(m，6H)。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C35H40ClN7O5P的计算值：704.251；实测值：704.380。
((2S，6R)-6-(6-(2-氰基乙氧基)-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗 啉-2-基)甲基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺的合成
在0℃下，向N-(6-(2-氰基乙氧基)-9-((2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)-9H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(3.00g，4.75mmol)在DCM(30mL)中的溶液中添加DIPEA(1.82mL，10.5mmol)，随后添加2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(1.17mL，5.22mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1h。在0℃下，向混合物中添加饱和NaHCO3水溶液。将有机层通过ISOLUTETM相分离器(拜泰齐公司)分离，并且将有机层在真空中浓缩以给出粗品。将残余物使用50％至100％EtOAc/庚烷进行硅胶柱色谱法以得到目标材料(1.50g)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.76-7.82(m，2H)，7.43-7.53(m，5H)，7.26-7.32(m，6H)，7.15-7.22(m，3H)，6.18-6.25(m，1H)，4.69-4.83(m，2H)，4.32-4.41(m，1H)，3.43-3.76(m，8H)，3.21-3.33(m，1H)，2.93-3.09(m，3H)，2.45-2.57(m，2H)，1.68-1.81(m，1H)，1.32-1.36(m，6H)，1.10-1.14(m，6H)，0.99-1.06(m，6H)。
负载到氨基甲基聚苯乙烯树脂上的4-(((2S，6R)-6-(5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二 氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸的合成
将4-(((2S，6R)-6-(5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(CAS 1362664-41-2)(360mg，0.617mmol)溶解于DMF(15.4mL)中。添加HATU(793mg，2.09mmol)和DIPEA(0.539mL，3.08mmol)，然后将氨基甲基聚苯乙烯树脂(Primer SupportTM 5G Amino，29-0999-92，由GE医疗集团(GE Healthcare)制造)(2.00g，胺含量：400μmol/g)添加至反应混合物中，并且在室温下在生物振荡器(110rpm)上轻轻振荡12h。将树脂过滤，依次用DCM、在CHCl3中的50％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在真空下干燥1h。将树脂上未反应的胺通过与封端剂B溶液-1(THF/1-Me-咪唑/吡啶(8∶1∶1))(97mL)和封端剂A溶液-1(10vol％Ac2O/THF)(65mL)在生物振荡器(110rpm)上在室温下反应1h进行封端。将树脂过滤，依次用DCM、在DCM中的20％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在高真空下干燥以得到目标材料(1.80g，载量：229μmol/g)。
负载到氨基甲基聚苯乙烯树脂上的4-(((2S，6R)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代嘧啶- 1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸的合成
将4-(((2S，6R)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(CAS 1362664-31-0)(540mg，0.803mmol)溶解于DMF(22mL)中。添加HATU(1.03g，2.71mmol)和DIPEA(0.701mL，4.01mmol)，然后将氨基甲基聚苯乙烯树脂(Primer SupportTM 5G Amino，29-0999-92，由GE医疗集团制造)(2.32g，胺含量：450μmol/g)添加至反应混合物中，并且在室温下在生物振荡器(110rpm)上轻轻振荡12h。将树脂过滤，依次用DCM、在CHCl3中的50％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在真空下干燥1h。将树脂上未反应的胺通过与封端剂B溶液-1(THF/1-Me-咪唑/吡啶(8∶1∶1))(127mL)和封端剂A溶液-1(10vol％Ac2O/THF)(84mL)在生物振荡器(110rpm)上在室温下反应2h进行封端。将树脂过滤，依次用DCM、在DCM中的20％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在高真空下干燥以得到目标材料(2g，载量：194μmol/g)。
负载到氨基甲基聚苯乙烯树脂上的4-(((2S，6R)-6-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9- 基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸的合成
将4-(((2S，6R)-6-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(CAS 446206-67-2)(174mg，0-250mmol)溶解于DMF(6.3mL)中。添加HATU(321mg，0.845mmol)和DIPEA(0.218mL，1.25mmol)，然后将氨基甲基聚苯乙烯树脂(PrimerSupportTM 5G Amino，29-0999-92，由GE医疗集团制造)(813mg，胺含量：400μmol/g)添加至反应混合物中，并且在室温下在生物振荡器(110rpm)上轻轻振荡12h。将树脂过滤，依次用DCM、在CHCl3中的50％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在真空下干燥1h。将树脂上未反应的胺通过与封端剂B溶液-1(THF/1-Me-咪唑/吡啶(8∶1∶1))(39.4mL)和封端剂A溶液-1(10vol％Ac2O/THF)(26.2mL)在生物振荡器(110rpm)上在室温下反应1h进行封端。将树脂过滤，依次用DCM、在DCM中的20％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在高真空下干燥以得到目标材料(827mg，载量：196μmol/g)。
负载到氨基甲基聚苯乙烯树脂上的4-(((2S，6R)-6-(6-(2-氰基乙氧基)-2-异丁 酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸的合成
(1)4-(((2S，6R)-6-(6-(2-氰基乙氧基)-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯 甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸
在室温下，向N-(6-(2-氰基乙氧基)-9-((2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)-9H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(1.50g，2.37mmol)和DMAP(0.87g，7.12mmol)在1，2-二氯乙烷(15mL)中的溶液中添加琥珀酸酐(0.475g，4.75mmol)，并且在45℃下搅拌1.5h。将混合物冷却至室温。添加MeOH(5mL)，并且将混合物蒸发。将EtOAc和0.5M KH2PO4水溶液(pH约7)添加至残余物中，并且将有机层分离。将水层用EtOAc萃取。将合并的有机层用0.5MKH2PO4水溶液(酸性)、水、然后盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩以给出4-(((2S，6R)-6-(6-(2-氰基乙氧基)-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(1.51g)。
1H NMR(396MHz，氯仿-d)δ9.22-9.36(m，1H)，7.73-7.79(m，1H)，7.43-7.54(m，5H)，7.28-7.35(m，6H)，7.15-7.23(m，4H)，5.95-6.05(m，1H)，4.71-4.88(m，2H)，4.45-4.56(m，1H)，4.30-4.39(m，1H)，3.77-3.89(m，1H)，3.38-3.46(m，1H)，3.13-3.21(m，1H)，2.97-3.09(m，2H)，2.80-2.92(m，2H)，2.47-2.67(m，4H)，2.05-2.11(m，1H)，1.23-1.30(m，6H)。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C40H42N7O7的计算值：732.314；实测值：732.493。
(2)负载到氨基甲基聚苯乙烯树脂上的4-(((2S，6R)-6-(6-(2-氰基乙氧基)-2-异 丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸
将4-(((2S，6R)-6-(6-(2-氰基乙氧基)-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(183mg，0.25mmol)溶解于DMF(7.5mL)中。添加HATU(321mg，0.845mmol)和DIPEA(0.218mL，1.25mmol)，然后将氨基甲基聚苯乙烯树脂(PrimerSupportTM 5G Amino，29-0999-92，由GE医疗集团制造)(813mg，胺含量：400μmol/g)添加至反应混合物中，并且在室温下在生物振荡器(110rpm)上轻轻振荡18h。将树脂过滤，依次用DCM、在CHCl3中的50％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在真空下干燥1h。将树脂上未反应的胺通过与封端剂B溶液-1(THF/1-Me-咪唑/吡啶(8∶1∶1))(39.4mL)和封端剂A溶液-1(10vol％Ac2O/THF)(26.2mL)在生物振荡器(110rpm)上在室温下反应1h进行封端。将树脂过滤，依次用DCM、在DCM中的20％MeOH、DCM和醚洗涤。将树脂在高真空下干燥以得到目标材料(750mg，载量：208mol/g)。
1H-NMR：质子核磁共振光谱法
质子核磁共振光谱法的化学位移以来自四甲基硅烷的δ单位(ppm)记录。图谱中的缩写如下所示：
s：单峰，d：双峰，t：三重峰，q：四重峰，quin：五重峰，m：多重峰，br：宽峰。
硅胶柱色谱法
使用山善集团(YAMAZEN Corporation)生产的Parallel Prep{Hi-快速柱填充普通硅胶)，大小：S(16 x 60mm)，M(20 x 75mm)，L(26 x 100mm)，2L(26 x 150mm)，由山善集团生产}。
实例2：立体无规的PMO-缺口体固相合成的总体合成方案
在NTS DNA/RNA合成仪(NIHON技术服务公司(NIHON TECHNO SERVICE))和nS-8II合成仪(基因设计公司(GeneDesign))上合成寡核苷酸。所有合成均使用1.0μmol规模的空合成柱(Empty Synthesis Columns-TWIST，Glen研究公司(Glen Research))进行，该柱填充有负载有PrimerSupport(Primer SupportTM 5G Amino，GE医疗集团，琥珀酸盐接头)的N-Tr-吗啉代单体。
通过NTS DNA/RNA合成仪进行N-Tr-吗啉代(PMO)-二甲基氯氨基磷酸酯或3’-DMT-DNA-5’-二甲基氯氨基磷酸酯的偶联。将二甲基氯氨基磷酸酯试剂制备成在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)中的0.20M溶液，并且将1，2，2，6，6-五甲基哌啶(PMP)在DMI中的0.3M溶液用作偶联活化剂。使用在DCM(CH2Cl2)中的3％三氯乙酸(TCA)进行脱三苯甲基化，并且用封端混合物A(THF/2，6-二甲基吡啶/Ac2O，Glen研究公司)和封端混合物B(16％1-Me-咪唑/THF，Glen研究公司)完成封端。使用在DMI和DCM中的DIPEA进行中和。将固体支持体中剩余的Ac2O通过DMI中的0.4M吗啉溶液除去。表2中描述了合成循环的逐步描述。
表2：PMO-或DNA-二甲基氯氨基磷酸酯偶联的合成循环。
通过NTS DNA/RNA合成仪(Nihon技术服务公司(Nihon-techno service))进行
通过nS-8II合成仪进行3’-DMT-DNA-5’-氰基乙基亚磷酰胺和N-Tr-吗啉代氰基乙基亚磷酰胺的偶联。如表2所示，将亚磷酰胺制备成CH3CN中的0.20M或0.30M溶液。将5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)在CH3CN中的0.40M溶液用作偶联活化剂。使用在DCM中的3％三氯乙酸进行脱三苯甲基化，并且用封端剂A溶液-1(10vol％Ac2O/THF，和光纯药工业株式会社(WAKO))和封端剂B溶液-1(THF/1-Me-咪唑/吡啶，(8∶1∶1，和光纯药工业株式会社))完成封端。用((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1，2，4-二噻唑啉-3-硫酮(DDTT)在吡啶和CH3CN(3∶2)中的0.05M溶液进行硫化。表3中描述了合成循环的逐步描述。
表3：DNA-或PMO-亚磷酰胺偶联的合成循环。
通过nS-8II合成仪(基因设计公司)进行
寡核苷酸的切割和脱保护：自动合成完成后，将固体支持体用在CH3CN中的20vol％二乙胺处理，然后静置1h。将支持体用无水CH3CN洗涤，并且用氩气干燥。将支持体转移到空螺口管中，并在60℃下用28％NH4OH和EtOH(3∶1，1mL)的溶液处理过夜。将支持体用Disc针头过滤器(亲水PTEE，0.45μm，岛津公司)过滤。将滤液在N2流下干燥。将所得残余物溶解于水中。(当溶液中出现悬浮物时，进行进一步过滤。)通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和液相色谱法质谱法(LCMS)分析粗材料。
图1A和图1B是寡核苷酸的固相合成和该实例中详述的偶联反应的合成循环的示意图。5′-活化的DNA单体用于克服由于合成方向相反(即PMO为5’至3’，DNA为3’至5’)而带来的合成挑战。
N-Tr的纯化：将粗材料通过RP-HPLC用纯化条件-1(小规模)或条件-2(中等规模)进行纯化。收集获得的级分，并将其用N2流干燥。
纯化条件-1：
柱：XBridge BEH C18 OBD prep(10 x 150mm，粒径5μm，沃特世)
检测：260nm
柱温：55℃
洗脱液A：100mM HFIP，8.6mM TEA/水
洗脱液B：100％MeOH
梯度B：25min内25％至56％
流速：3.5mL/min
纯化条件-2：
柱：XBridge BEH Prep C18 OBD(19 x 150mm，粒径5μm，沃特世)
检测：260nm
柱温：55℃
洗脱液A：100mM HFIP，8.6mM TEA/水
洗脱液B：100％MeOH
梯度B：20min内10％至70％
流速：20mL/min
脱三苯甲基化和纯化(用于体外/体内)：通过混合TFA(0.17mL)、Et3N(0.16mL)、EtOH(0.25mL)、2，2，2-三氟乙醇(2.5mL)和DCM(22.25mL)，制备用于脱三苯甲基化的溶液。在0℃下向纯化的N-Tr的残余物中添加上述溶液(过量)。几个小时后，在0℃下，将在DCM中的5％DIPEA添加至混合物中用于中和。然后将混合物通过N2流干燥。将残余物用水溶解，并用纯化条件-1，使用梯度B：25min内25％至35％，通过RP-HPLC纯化。收集获得的级分，并将其用N2流干燥。
寡核苷酸的脱盐(用于体外)：脱三苯甲基化后，将纯化的寡核苷酸用水稀释至总体积为2.5mL，然后使用水作为平衡缓冲液，根据制造商的方案，通过IllustraTM NAPTM-25柱(GE医疗集团)脱盐。将获得的溶液用N2流干燥。
寡核苷酸的离子交换(用于体内-1)：脱三苯甲基化后，将纯化的寡核苷酸用起始缓冲液(0.02M磷酸Na缓冲液(pH 8.0)，20％CH3CN)稀释，直到总体积变为1mL。按照制造商的方案，使用起始缓冲液和洗脱缓冲液(含有1.5M NaCl的起始缓冲液)，通过HiTrapQ HP(1mL，GE医疗集团)进行阴离子交换。收集获得的级分，并将其用N2流干燥。将残余物用水稀释至总体积为2.5mL，然后使用水作为平衡缓冲液，根据制造商的方案，通过IllustraTMNAPTM-25柱(GE医疗集团)脱盐。将获得的溶液用N2流干燥。
寡核苷酸的离子交换(用于体内-2)：通过使用离心旋转过滤器(Vivaspin 20，3,000分子量截留，GE医疗集团)进行阴离子交换。脱三苯甲基化后，将纯化的寡核苷酸用NaOAc(0.1M)溶解至总体积高达14mL，然后将溶液应用于旋转过滤器。将样品用离心机浓缩至小于5mL。将浓缩的溶液用水稀释至总体积高达14mL，并且浓缩至小于5mL。将该稀释和浓缩过程重复两次。将残余物转移到空管中，并用真空浓缩器浓缩。
分析：将获得的残余物用水溶解，并且通过260nm处的吸光度(用Nanodrop测量)和因子值(ng·cm/μL)确定浓度。
实例3：PMO中磷立体化学的确定
通过TA PMO二核苷酸的X射线结构(美国专利10,457,698)和31P NMR化学位移确定活化的吗啉代单体的绝对立体化学。A2单体给出具有Sp构型的TA2二聚体，这是由X射线结晶学确定的。根据立体特异性偶联反应过程中立体化学的反转，将A2的立体化学确定为Rp。
A2、T1、C1和G2单体在31P NMR中显示相同的趋势(化学位移比其他相应异构体低)，表明A2、T1、C1和G2具有相同的P构型，该P构型根据A2的立体化学被指定为Rp，并给出具有Sp构型的偶联产物。
来自A2、T1、C1和G2的二聚体在31P NMR中显示出相同的趋势：分别高于来自A1、T2、G1和C2的二聚体的化学位移。
表4描绘了各种吗啉代单体和二聚体的31P NMR化学位移和指定的P立体化学。
表4-各种吗啉代单体和二聚体的31P NMR化学位移和指定的P立体化学。
*A1和A2意指活化的A单体在手性HPLC条件下的早期洗脱A异构体(A1)和后期洗脱A异构体(A2)。同样地，“1”和“2”命名表示其他活化的单体的早期和后期洗脱手性HPLC条件。
实例4：立体定义的5-8-5 PMO-缺口体的溶液相合成
作为实例4中方案的替代方案，立体定义的PMO-缺口体的溶液相合成的总体合成方案如下所示：
PMO-缺口体的脱氧核糖核苷之间的硫代磷酸酯键中磷原子的立体化学通过使用如由以下披露的类似方法来控制：Knouse和deGruyter等人(参见Knouse，K.和deGrutyer，J.等人，“Unlocking P(V)：Reagents for chiral phosphorothioate synthesis[解锁P(V)：手性硫代磷酸酯合成试剂]”，Science[科学]，2018，361(6408)：1234-1238)以及Stec等人(参见Stec等人，“Deoxyribonucleoside-O-(2-Thio-and2-Oxo-“spiro”-4，4-pentamethylene-1，3，2-oxathiaphospholane)s：Monomers for StereocontrolledSynthesis of Oligo(deoxyribonucleoside phosphorothioate)s and Chimeric PS/POOligonucleotides[脱氧核糖核苷/>-O-(2-硫代和2-氧代-“螺环”-4，4-五亚甲基-1，3，2-氧硫杂磷杂环戊烷)：用于立体控制合成寡聚(脱氧核糖核苷硫代磷酸酯)和嵌合体PS/PO寡核苷酸的单体]”，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]1998，120，7156-7167；Karwowski和Stec等人，“Stereocontrolled synthesis of LNA Dinucleoside phosphorothioate by theoxathiaphospholane approach[通过氧硫杂磷杂环戊烷法立体控制合成LNA二核苷硫代磷酸酯]”，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机与药物化学快报]，11(2001)1001-1003；以及Karwowski和Stec等人，“Nucleoside 3′-O-(2-Oxo-“Spiro”-4.4-Pentamethylene-1.3.2-Oxathiaphospholane)S：Monomers For Stereocontrolled Synthesis Of Oligo(Nucleoside Phosphorothioate/Phosphate)S[核苷3′-O-(2-氧代-“螺环”-4，4-五亚甲基-1，3，2-氧硫杂磷杂环戊烷)：用于立体控制合成寡聚(核苷硫代磷酸酯/磷酸盐)的单体]”，Nucleosides&Nucleotides[核苷与核苷酸]，17(9-11)，1747-1759(1998))，它们全部通过援引并入本文。
本实例中呈现的立体定义的PMO-缺口体的溶液相合成与以前的反义寡核苷酸的溶液相合成的不同在于本合成采用了12+6的偶联步骤。之前的溶液相合成典型地一次偶联一个核苷酸，直到形成最终产物；然而，这些偶联方法导致最终产物被不同长度的其他种类的寡核苷酸污染的机会增加。这种增加的污染机会是由于并非所有的寡核苷酸都有足够的时间与添加到溶液中的下一个核苷酸相互作用。因此，不仅最终产物含有不同长度的核苷酸的机会增加，而且含有不同核苷酸序列的核苷酸的机会也增加。
进行6+12偶联的优点是，它减少了在形成最终产物之前一次加入一个核苷酸的步骤数，因此有可能使最终产物的纯度和产量提高。
图2A和图2B描绘了根据该实例中详述的溶液相合成方法的PMO-缺口体的代表性合成。
实例4.1：5’-PMO翼的制备
5’-PMO翼的2-mer：偶联
在室温下，向起始材料1(0.500g，1.15mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(8.76mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.63mL)，随后添加C1(0.803g，1.15mmol)。搅拌溶液直至反应完成。缓慢添加甲基叔丁基醚(MTBE)(45mL)，随后添加正庚烷(40mL)。将上清液溶液除去。将固体溶解于DCM中，并且使用在DCM中的0-25％的甲醇梯度作为洗脱液通过硅胶柱色谱法纯化，以得到目标化合物2(0.98g)。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C60H59N9O10P的计算值1096.41；实测值1096.13。
5’-PMO翼的2-mer：脱保护
/>
在室温下，向起始材料2(1.2g，1.1mmol)在DCM(12.00mL)和乙醇(0.64mL，11mmol)中的溶液中逐滴添加TFA(0.548mL，7.12mmol)。将反应搅拌过夜。将MTBE(45mL)缓慢添加至反应中，形成白色沉淀物(TFA盐)。将浆料混合物搅拌10-15min，然后过滤。将饼状物用MTBE(2 x 10mL)洗涤。将TFA盐溶解于DCM(12mL)中，并且用1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.991mL，5.47mmol)处理以形成游离碱。将溶液搅拌10-15min后，将MTBE(50mL)缓慢添加至反应中，导致白色沉淀物。将混合物搅拌10-15min并过滤。将饼状物用MTBE(2 x 10mL)洗涤。获得0.74g的目标产物3。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C41H45N9O10P的计算值854.29；实测值854.20。
5’-PM0翼的3-mer：偶联
将起始材料3(0.74g，0.87mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(8mL)中。在室温下，添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.475mL，2.60mmol)，随后添加G’2(0.732g，1.04mmol)。将混合物在室温下搅拌3-4h，并且用EtOAc(约10mL)然后MTBE(50mL)处理。将沉淀物通过过滤收集，并且用MTBE(2 x 10mL)洗涤。获得1.3g的目标产物4。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C76H84N16O15P2的计算值1522.56；实测值1522.25。
5’-PMO翼的3-mer：脱保护
将起始材料4(1.3g，0.85mmol)溶解于DCM(16.8mL)和乙醇(0.499mL，8.54mmol)中。在室温下添加TFA(0.329mL，4.27mmol)。2h后，缓慢添加MTBE(55mL)，导致沉淀。搅拌5-10min后，将固体过滤并用MTBE(2x10mL)洗涤。在室温下，将所得固体再溶解于10mL DCM中，并且用1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.780mL，4.27mmol)处理。将溶液搅拌10分钟后，缓慢添加MTBE(50mL)，导致沉淀。搅拌10-15min后，将混合物过滤，用MTBE(2 x 10mL)洗涤，并干燥。获得1.05g的目标产物5。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C57H69N16O15P2的计算值1279.46；实测值1279.14。
5’-PMO翼的4-mer：偶联
/>
将起始材料5(1.05g，0.821mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(10.7mL)中。在室温下，添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.450mL，2.46mmol)，随后添加T1(0.600g，0.985mmol)。将混合物在室温下搅拌2-4h。缓慢添加10mL的EtOAc。添加MTBE(50mL)直到白色悬浮液持续存在。将所得浆料搅拌10-15min，然后过滤。将饼状物用MTBE(2 x 10mL)洗涤，并且干燥。获得1.52g的目标产物6。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C88H102N20O20P3的计算值1851.68；实测值1852.17。
5’-PMO翼的4-mer：脱保护
将起始材料6(1.5g，81mmol)溶解于DCM(15.9mL)和乙醇(0.946mL，16.2mmol)中。逐滴添加TFA(0.478mL，6.20mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌2-4h。添加EtOAc(10mL)，随后添加MTBE(30-40mL)。形成白色沉淀物。将浆料搅拌10-15min并过滤。将饼状物用MTBE(2 x 10mL)洗涤。将沉淀物再溶解于10mL DCM中，并且用1，2，2，6，6-五甲基哌啶(1.18mL，6.48mmol)处理。搅拌10min后，添加EtOAc(30mL)，随后添加MTBE(30mL)。将所得混合物搅拌10-15min，并且将沉淀物通过过滤收集，用MTBE(2 x 10mL)洗涤，并干燥。获得0.96g的目标产物7。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C69H88N20O20P3的计算值1609.57；实测值1610.21。
5’-PMO翼的5-mer：偶联
将起始材料7(0.96g，0.60mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(9.73mL)中。在室温下，添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.327mL，1.789mmol)，随后添加T1(0.436g，0.716mmol)。将混合物搅拌12-16h。添加EtOAc(20mL)，随后添加MTBE(40mL)。将所得混合物搅拌10-15min并过滤。将饼状物用EtOAc(2 x 10mL)洗涤，并且干燥。获得1.3g的目标产物8。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C100H121N24O25P4的计算值1090.89；实测值1091.55。
5’-PMO翼的5-mer：脱保护
/>
将起始材料8(1.3g，0.60mmol)溶解于DCM(11.7mL)中。在室温下，逐滴添加乙醇(0.696mL，11.9mmol)，随后添加TFA(0.275mL，3.57mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2-3小时。添加EtOAc(40mL)直到形成沉淀物。将浆料搅拌5-10min并过滤。将饼状物用EtOAc(2x 5mL)洗涤。将沉淀物再溶解于DCM 8mL中，并且添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.871mL，4.77mmol)。将所得溶液在室温下搅拌10-15分钟，并且用EtOAc(10mL)随后MTBE(40mL)处理。将所得混合物搅拌5-10min并过滤。将饼状物用MTBE(2 x 5mL)洗涤，并且干燥。1.1g的目标产物9。MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C81H107N24O25P4的计算值1939.68；实测值1939.98。
5’-PMO翼的6-mer：偶联
将起始材料9(1.1g，0.567mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(12mL)中。在室温下添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.411mL，2.27mmol)，随后添加((2R，3S，5R)-3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯10(0.532g，0.794mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。添加10mL EtOAc和20-30mL MTBE。将所得浆料搅拌10-15分钟并过滤。将饼状物用EA(2 x 10mL)洗涤，并且干燥。获得1.45g的目标产物11。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C114H144N27O33P5的计算值1286.96；实测值1287.22。
5’-PMO翼的6-mer：脱保护
将起始材料11(1.45g，0.563mmol)溶解于DCM(27.2mL)和乙醇(1.65mL，28.2mmol)中。在室温下添加二氯乙酸(1.86mL，22.5mmol)。3h后，反应完成。添加EtOAc(10mL)，随后添加MTBE(40-50mL)，直到沉淀物持续存在。将混合物搅拌5min并过滤。将饼状物用MTBE(2 x10mL)洗涤，并且干燥。获得1.28g的目标产物12。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C93H126N27O31P5的计算值1135.89；实测值1135.95。
用(-)-PSI激活5’6-mer
将起始材料12(1.28g，0.564mmol)和(-)-PSI试剂(奥德里奇公司(Aldrich)，CAS：2245335-70-8，0.352g，0.789mmol)添加至反应烧瓶中。添加3.8g分子筛，将反应混合物用氮气冲洗10-20min。添加DCM(30mL)和THF(20mL)。将所得混合物在室温下搅拌，并且用N2冲洗30min。逐滴添加DBU(0.119mL，0.789mmol)。将反应混合物搅拌1-2h。完成后，将反应混合物过滤至含有MTBE(120mL)的烧瓶中。形成白色沉淀物。将沉淀物搅拌10-15min。将沉淀物过滤，用MTBE(2 x 10mL)洗涤，并且干燥。将沉淀物回收并干燥，以给出1.3g的目标产物13a。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C103H141N27O32P6S2的计算值1258.91；实测值1259.17。
替代路径：用2-氯-“螺环”-4，4-五亚甲基-1，3，2-氧硫杂磷杂环戊烷激活6-mer
在室温下，向12(2.3g，1.0mmol)和0.19mL的二异丙基乙胺(1.1mmol)在THF和DCM中的磁力搅拌的溶液中逐滴添加2-氯-“螺环”-4，4-五亚甲基-1，3，2-氧硫杂磷杂环戊烷(1.1mmol)。反应完成后，添加元素硫(1.5mmol)。搅拌持续12h。完成后，将反应混合物过滤至含有MTBE的烧瓶中。将所得沉淀物过滤，用MTBE洗涤，并且在真空中干燥。将沉淀物回收并进一步干燥，以给出目标产物13b。
实例4.2：3’-PMO翼的制备
3’-PMO的2-mer：偶联
将起始材料14(100mg，0.169mmol)用MeCN追洗一次，然后溶解于DCM(2mL)中，随后添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(92μL，0.506mmol)。在室温下，向混合物中添加反应物C1(144mg，0.206mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后使其直接经受硅胶柱色谱法。用在DCM中的8％MeOH洗脱，以得到216mg的目标产物15。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C70H73N11O8PSi的计算值1254.51；实测值1254.43。
3’-PMO的2-mer：脱保护
向装有起始材料15(212mg，0.169mmol)的烧瓶中添加TFA(85μL，1.1mmol)在DCM(2.8mL)中的溶液，随后添加乙醇(99μL，1.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将该混合物用饱和NaHCO3水溶液处理，并且用DCM萃取两次。将DCM层合并，并且用半饱和的盐水洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩。将所得残余物用硅胶柱色谱法纯化，以给出137mg的目标产物16。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C51H59N11O8PSi的计算值1012.41；实测值1012.30。
3’-PMO的3-mer：偶联
在室温下，向起始材料16(137mg，0.135mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(2mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(73.5μL，0.406mmol)，随后添加反应物C1(123mg，0.176mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。向反应混合物中添加MTBE(20mL)，随后添加正庚烷(10mL)。将沉淀物通过过滤收集，并且用MTBE/正庚烷(9mL，2∶1 v/v)冲洗。在室温下，将沉淀物再溶解于DCM(15mL)中，并且用吗啉(12μL，0.14mmol)处理。将混合物在室温下搅拌过周末，然后浓缩并用MeCN追洗。材料(17)不经进一步纯化即可直接用于下一步。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C88H95N16O13P2Si的计算值1673.65；实测值1673.45。
3’-PMO的3-mer：脱保护
向装有起始材料17(227mg，0.136mmol)的烧瓶中添加TFA(67.9μL，0.881mmol)在DCM(2.3mL)中的溶液，随后添加乙醇(79μL，1.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌40min，然后在室温下添加另外的在DCM(1.2mL)中的TFA(130μL，1.68mmol)。将其在室温下搅拌6h。向混合物中添加MTBE(21mL)和正庚烷(7mL)。将沉淀物通过过滤收集，并且用MTBE冲洗。获得238mg沉淀物。在室温下，将沉淀物再溶解于DCM(2mL)中，向其中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(198μL，1.08mmol)。将混合物在室温下搅拌1h，然后添加MTBE(20mL)，并且将所得悬浮液在室温下搅拌过夜。将沉淀物通过过滤收集，并且用MTBE冲洗。获得205mg的目标产物18。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C69H81N16O13P2Si的计算值1431.54；实测值1431.26。
3’-PMO的4-mer：偶联
在室温下，向起始材料18(205mg，0.143mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(3.0mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(78μL，0.43mmol)，随后添加反应物C1(125mg，0.179mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1.5h，然后添加吗啉(12.5μL，0.143mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后向其中添加MTBE直到通过LCMS检测到上清液中无产物。将沉淀物通过过滤收集，并且用MTBE冲洗。然后将该沉淀物用在DCM中的12％至15％MeOH通过硅胶柱色谱法纯化，以给出194mg的目标产物19。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C106H118N21O18P3Si的计算值1046.90；实测值1047.16。
3’-PMO的4-mer：脱保护
向装有起始材料19(194mg，0.093mmol)的烧瓶中添加TFA(60μL，0.78mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液，随后添加乙醇(54.1μL，0.93mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5h，然后添加MTBE(20mL)。将沉淀物通过过滤收集，并且用MTBE冲洗。将沉淀物再溶解于DCM(2.0mL)中，向其中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(102μL，0.556mmol)。将混合物在室温下搅拌20min，然后添加MTBE(20mL)。将沉淀物通过过滤收集，并且用MTBE冲洗。获得167mg的目标产物20。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C87H103N21O18P3Si的计算值1850.68；实测值1850.56。
3’-PMO的5-mer：偶联
在室温下，向起始材料20(167mg，0.09mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(2.0mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(49.4μL，0.271mmol)，随后添加反应物T1(71mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过周末，然后添加MTBE(20mL)。将上清液通过倾析除去。将残余物用硅胶柱色谱法纯化。用在DCM中的10％至30％MeOH洗脱，以得到202mg的目标产物21。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C118H137N25O23P4Si的计算值1211.95；实测值1212.46。
3’-PMO的5-mer：脱保护
向起始材料21(1.65g，0.647mmol)在DCM(15.7mL)中的溶液中添加乙醇(0.38mL，6.5mmol)，然后添加TFA(0.470mL，6.10mmol)。1.5h后，在室温下添加MTBE(60mL)。将所得浆料通过烧结玻璃过滤器过滤。将饼状物用MTBE/DCM(10mL/3mL)的混合物冲洗，并且在真空中干燥2h，导致1.44g的目标产物22。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C99H123N25O23P4Si的计算值1090.90；实测值1091.03。
3’-PMO的5-mer：Bz基团的脱保护
/>
在室温下，将起始材料22(0.44g，0.19mmol)溶解于甲醇(6mL)和28％氢氧化铵(6mL)的混合物中。将所得混合物在50℃-52℃下加热12h，并且冷却至室温。将大多数的溶剂通过氮气吹扫除去。将残余物溶解于DCM/MeOH(6/2mL)中，并且用40mL EtOAc处理。添加EtOAc后，出现沉淀。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM/MeOH(20mL/3mL/1mL)的混合物冲洗。在真空中干燥过夜，以得到330mg的目标产物23。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C71H106N25O19P4Si的计算值1764.68；实测值1764.99。
3’-PMO的5-mer：吗啉保护
向起始材料23(526mg，0.298mmol)在THF/水/MeOH(9mL/1.6mL/1mL)的混合物中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(162μL，0.894mmol)和3，5-双(三氟甲基)苯甲酰氯(64.8μL，0.358mmol)。将所得混合物在室温下搅拌，同时通过LCMS监测反应进程。1h后，分两批添加另外的30μL的双(三氟甲基)苯甲酰氯。反应完成后，将反应混合物在真空中浓缩。将所得残余物溶解于DCM/MeOH(12mL/3mL)的混合物中，然后用EtOAc(80mL)处理。添加EtOAc后，出现沉淀。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(4mL/1mL)和EtOAc(10mL)冲洗。在真空中干燥2h，以得到547mg的目标产物24。在所得滤液中产生了另外的沉淀。获得24mg的第2批产物。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C80H109F6N25O20P4Si的计算值1002.84；实测值1002.91。
3’-PMO的5-mer：TBDPS的脱保护
在室温下，向起始材料24(571mg，0.285mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5.7mL)中的溶液中添加吡啶(8.6mL)和TEA(8.6mL)。将所得溶液用TEA-3HF(371μL，2.278mmol)处理，然后搅拌过夜。通过LCMS监测完成后，将反应混合物用甲氧基三甲基硅烷(3.4mL，25mmol)处理并在室温下搅拌1h。然后添加MeOH(3mL)和1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(6mL)以制备澄清溶液。将所得溶液添加至EtOAc(60mL)中，用约10mL EtOAc冲洗。添加后，出现白色沉淀。将浆料通过烧结玻璃过滤器过滤并用EtOAc(10mL)冲洗。在室温下，将所得沉淀物溶解于DCM(20mL)/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(20mL)的混合物中，并且用EtOAc(50mL)处理。添加EtOAc后，出现沉淀。将所得沉淀物通过过滤收集并用EtOAc(15mL)冲洗。在氮气吹扫下在真空中干燥，以提供523mg的目标产物25。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C64H90F6N25O20P4的计算值1766.56；实测值1766.61。
实例4.3：DNA的延长
6-mer：偶联
将起始材料25(125mg，0.071mmol)和反应物H1(158mg，0.177mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(3mL)中，并且将所得混合物在30℃-32℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(350mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.064mL，0.42mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜(16h)，同时通过LCMS监测反应进程。完成后，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将滤液添加至EtOAc(15mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(2mL)冲洗。向所得浆料中添加另外的7.5mL的EtOAc。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL/1mL)和EtOAc(10mL)的混合物冲洗。在真空中干燥40min，以提供228mg的目标产物26。
HRMS(ESI)m/z：[M+H]+针对C102H126F6N28O28P5S的计算值2492.7643；实测值2492.7361。
6-mer：脱保护
将起始材料26(228mg，0.0710mmol)溶解于1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(1.5mL)、2，2，2-三氟乙醇(0.75mL)、DCM(3.7mL)和三乙基硅烷(2.2mL)的混合物中，并且将所得溶液在室温下搅拌。4h后，添加另外的2mL的1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇。反应完成(通过LCMS监测)后，添加25mL EtOAc和33mL MTBE。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(8mL/2mL)的混合物冲洗。在真空中干燥过夜，以提供150mg的目标产物27。
HRMS(ESI)m/z：[M+H]+针对C74H104F6N28O25P5S的计算值2086.6074；实测值2086.5801。
7-mer：偶联
向起始材料27(150mg，0.064mmol)和反应物H1(172mg，0.192mmol)的混合物中添加1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(3.6mL)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(350mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.058mL，0.38mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜(13h)，同时通过LCMS监测反应进程。完成后，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将滤液添加至EtOAc(15mL)中，用2mL 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮冲洗。向所得浆料中添加另外的5mL的EtOAc。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL/1mL)和EtOAc(10mL)的混合物冲洗。在真空中干燥30min，以提供218mg的目标产物28。
HRMS(ESI)m/z：[M-DMT+2H]+针对C91H122F6N31O31P6S2的计算值2509.6728；实测值2509.6360。
7-mer：脱保护
向起始材料28(218mg，0.064mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(2mL)、2，2，2-三氟乙醇(0.5mL)、三乙基硅烷(1.5mL)和DCM(2.5mL)的混合物。将所得溶液在室温下搅拌，同时通过LCMS监测进程。反应完成后(3h)，添加40mL EtOAc。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(8mL/2mL)的混合物冲洗。在真空中干燥过夜，以提供150mg的目标产物29。
HRMS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C84H119F6N31O30P6S2的计算值1203.3272；实测值1203.3145。
8-mer：偶联
将起始材料29(150mg，0.055mmol)和反应物30a(150mg，0.166mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5.5mL)中。将所得溶液在30℃-33℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(350mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.067mL，0.44mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌，同时通过LCMS监测反应进程。完成后(2.5d)，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将滤液添加至EtOAc(24mL)中，用2.5mL 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮冲洗。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(8mL/2mL)和EtOAc(10mL)的混合物冲洗。在室温下在真空中干燥过夜，以提供214mg的目标产物31。
HRMS(ESI)m/z：[M-DMT+2H]+针对C101H134F6N36O35P7S3的计算值2838.7075；实测值2838.6948。
8-mer：脱保护
向起始材料31(214mg，0.055mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(2mL)、2，2，2-三氟乙醇(0.5mL)、三乙基硅烷(1.5mL)和DCM(2.5mL)的混合物。将所得溶液在室温下搅拌，同时通过LCMS监测进程。反应完成后(3h)，添加35mL EtOAc。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(8mL/2mL)的混合物冲洗。在真空中干燥过夜，以提供146mg的目标产物32。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C101H131F6N36O35P7S3的计算值1418.34；实测值1418.52。
9-mer：偶联
向起始材料32(146mg，0.044mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5.0mL)中的溶液中添加反应物H2(105mg，0.133mmol)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(400mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.060mL，0.40mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌，同时通过LCMS监测反应进程。完成后(2d)，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将所得滤液添加至EtOAc(25mL)中，用3mL 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮冲洗。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(6mL/2mL)和EtOAc(10mL)的混合物冲洗。在室温下在真空中干燥2h，以提供238mg的目标产物33。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C132H162F6N38O43P8S4的计算值1729.42；实测值1729.95。
9-mer：脱保护
向起始材料33(238mg，0.058mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(2mL)、2，2，2-三氟乙醇(0.5mL)、三乙基硅烷(1.5mL)和DCM(2.5mL)的混合物。将所得溶液在室温下搅拌，同时通过LCMS监测进程。反应完成后(18h)，添加40mL EtOAc。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(6mL/2mL)的混合物冲洗。在真空中干燥3h，以提供目标产物34(理论上为170mg)。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C111H144F6N38O41P8S4的计算值1578.36；实测值1578.94。
10-mer：偶联
向起始材料34(理论上为170mg，0.045mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)中的溶液中添加反应物H2(107mg，0.135mmol)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(400mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.068mL，0.45mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌，同时通过LCMS监测反应进程。完成后(3d)，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将所得滤液添加至EtOAc(24mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(4mL)冲洗。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(6mL/2mL)和EtOAc(10mL)的混合物冲洗。在室温下在真空中干燥，以提供目标产物35(理论上为205mg)。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C142H175F6N40O49P9S5的计算值1890.43；实测值1890.37。
10-mer：脱保护
向起始材料35(理论上为205mg，0.045mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(3mL)、2，2，2-三氟乙醇(0.75mL)、三乙基硅烷(2.25mL)和DCM(3.75mL)的混合物，并且将所得溶液在室温下搅拌，同时通过LCMS监测进程。反应完成后(5.5h)，添加45mL EtOAc。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(6mL/2mL)的混合物冲洗。在真空中干燥3h，以提供165mg的目标产物36。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C121H157F6N40O47P9S5的计算值1737.86；实测值1738.55。
11-mer：偶联
向起始材料36(165mg，0.039mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)中的溶液中添加反应物37(104mg，0.117mmol)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(400mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.070mL，0.47mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌，同时通过LCMS监测反应进程。完成后(2d)，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将所得滤液添加至EtOAc(30mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)冲洗。将所得浆料混合物离心(2000rpm，15min)。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(6mL/2mL)和EtOAc(10mL)的混合物冲洗。在室温下在真空中干燥，以提供目标产物38(理论上为199mg)。/>
MS(ESI)m/z：[M-DMT-2H]3-针对C138H174F6N43O53P10S6的计算值1299.26；实测值1299.95。
11-mer：脱保护
/>
向起始材料38(理论上为199mg，0.039mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(3mL)、2，2，2-三氟乙醇(0.75mL)、三乙基硅烷(2.25mL)和DCM(3.75mL)的混合物。将所得溶液在室温下搅拌过夜，然后用40mL EtOAc处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(6mL/2mL)的混合物冲洗。在真空中干燥2h，以提供170mg的目标产物39。
MS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C138H174F6N43O53P10S6的计算值1299.26；实测值1300.75。
12-mer：偶联
向起始材料39(171mg，0.036mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)中的溶液中添加反应物H2(84mg，0.107mmol)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(500mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.070mL，0.47mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌，同时通过LCMS监测反应进程。完成后(3d)，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将所得滤液添加至EtOAc(30mL)中，用5mL 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮冲洗。将所得浆料混合物离心(2000rpm，15min)。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(6mL/2mL)和EtOAc(10mL)的混合物冲洗。在室温下在真空中干燥，以提供目标产物40(理论上为199mg；在LCMS条件下未观察到MS，但该产物产生了其他测试产物)。
12-mer：脱保护
/>
将起始材料40(199mg，0.036mmol)溶解于1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(4mL)、2，2，2-三氟乙醇(1mL)、三乙基硅烷(3mL)和DCM(5mL)的混合物中。将所得溶液在室温下搅拌，同时通过LCMS监测进程。反应完成后(15h)，将反应混合物用40mL EtOAc和15mL MTBE处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(6mL/2mL)的混合物冲洗。在真空中干燥过夜，以提供174mg的目标产物41。
MS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C141H183F6N45O58P11S7的计算值1371.26；实测值1371.87。
实例4.4：12+6偶联
/>
向起始材料41(163mg，0.0310mmol)和反应物13a(170mg，0.068mmol)的混合物中添加1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(6mL)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸四次(每次2.5mL)。向所得溶液中添加分子筛(450mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加DBU(0.071mL，0.47mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌，同时通过LCMS监测反应进程。完成后(24h)，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将滤液添加至EtOAc(12mL)中，用3mL 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮冲洗。将所得浆料混合物离心(3000rpm，30min)。将所得沉淀物通过倾析收集，并且溶解于DCM/EtOH(14mL/7mL)的混合物中。向所得溶液中添加EtOAc(20mL)。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM/EtOH(3mL/2mL/1mL)的混合物冲洗。在室温下在真空中干燥1h，以提供0.20g的目标产物42a。该材料无需进一步纯化即用于下一步。
MS(ESI)m/z：[M+5H]5+针对C234H314F6N72O90P17S8的计算值1294.11；实测值1294.25。
与13b的替代性12+6偶联
/>
将起始材料41(0.53g，0.10mmol)和反应物13b(0.74g，0.30mmol)的混合物溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮中，并且与甲苯共沸三次。向所得溶液中添加4A MS和1，4-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，1.5mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜，过滤，并且添加至EtOAc中。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM/EtOH(3/2/1)的混合物冲洗。在真空中干燥，以提供目标产物42b。
实例4.5：最终的脱保护
/>
向起始材料42a(0.20g)在甲醇(5mL)和28％氢氧化铵(5mL)的混合物中的溶液中添加DL-二硫苏糖醇(0.026g，0.17mmol)。将所得混合物在53℃-55℃下搅拌20h，并且冷却至室温。添加另外的MeOH(2mL)和28％氢氧化铵(2mL)。将所得混合物在50℃-55℃下再搅拌10h，并且在室温下持续2天。添加MeCN/EtOAc(60mL/20mL)的混合物，并且将所得浆料进行离心(4000rpm，30min)。将所得沉淀物分离并溶解于水(约20mL)中。将水溶液进行四次超滤(Amicon Ultra-15，ultracel 3K，3500rpm，45min)。将所得溶液用5mL水稀释，并且在表5中描述的以下条件下通过IEX-HPLC纯化。
表5：IEX-HPLC条件
用Amicon Ultra-15、Ultracel-3K(3500rpm，45min)对纯化产物进行脱盐。将所得溶液(10mL)冷冻干燥3天，以提供20mg的目标产物43。
MS(ESI)m/z：[M+5H]5+针对C193H290N72O84P17S8的计算值1148.9；实测值1149.2。
实例5：立体定义的4-10-4PMO-缺口体的溶液相合成
实例5.1至5.5报告了具有SEQ ID NO：12的立体特异性4-10-4缺口体的制备。
合成的缺口体具有本文如下表示的手性：
SSSSSSSRSSSSSSSSS(化合物132m)、SSSRSSSRSSSSSSSSS(化合物132n)或SSSMSSSRSSSSSSSSS(化合物132f)
“M”意指R构型与S构型的混合。
受益于本说明书，包括本文所述的其他实例，本领域技术人员将认识到，可以参考偶联步骤中添加试剂的手性来制备具有相同序列但不同手性的缺口体。
实例5.1 5’-PMO翼的制备
5’-PMO的2-mer：偶联
在环境温度下，向起始材料44(1.00g，1.42mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(10mL)中的溶液中添加反应物G’2(0.854g，1.491mmol)和1，2，2，6，6-五甲基哌啶(1.03mL，5.68mmol)。将反应溶液搅拌过夜，并且用THF(10mL)、随后用MTBE(100mL)和正庚烷(100mL)处理。将上清液倾析/过滤，并且将粘性物质用THF/MTBE/正庚烷(20mL/100mL/100mL)的混合物冲洗。将剩余材料溶解于CH2Cl2中，并且通过硅胶柱色谱法(梯度为在EtOAc中的0％至20％MeOH)纯化，以得到目标化合物46(1.33g)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C59H61N13O9P的计算值1126.44；实测值1126.29。
5’-PMO的2-mer：脱保护
在环境温度下，向装有起始材料46(1.33g，1.18mmol)的烧瓶中添加乙醇(0.690mL，11.8mmol)，随后添加TFA(0.364mL，4.72mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。将反应溶液搅拌25min，并且用EtOAc(7.5mL)、随后正庚烷(40mL)处理。将浆料过滤，并且将饼状物用CH2Cl2(15mL)、EtOAc(7.5mL)和正庚烷(40mL)的混合物冲洗。然后在环境温度下，将TFA盐再溶解于CH2Cl2(20mL)中，并且添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(2.14mL，11.8mmol)。将反应混合物搅拌5-10min，然后添加正庚烷(100mL)。将浆料进行超声处理以分解任何聚集的块，然后过滤。将饼状物用CH2Cl2(20mL)和正庚烷(100mL)的混合物冲洗，以得到目标化合物47(0.93g)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C40H47N13O9P的计算值884.34；实测值884.26。
5’-PMO的3-mer：偶联
在环境温度下，向起始材料47(0.930g，1.05mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(9.24mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.571mL，3.16mmol)，随后添加反应物C1(0.918g，1.32mmol)。将反应溶液搅拌过夜，并且用EtOAc(10mL)、随后MTBE(150mL)和正庚烷(50mL)处理。将浆料过滤，并且将饼状物用EtOAc(10mL)、MTBE(75mL)和正庚烷(25mL)的混合物冲洗，以得到目标化合物48(1.70g)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C77H83N18O14P2的计算值1545.58；实测值1545.58。
5’-PMO的3-mer：脱保护
在环境温度下，向装有起始材料48(1.70g，1.10mmol)的溶液的烧瓶中添加乙醇(0.642mL，11.0mmol)，随后添加TFA(0.339mL，4.40mmol)在CH2Cl2(25.5mL)中的溶液。将反应溶液搅拌1h，并且用EtOAc(12.5mL)、随后正庚烷(45mL)处理。将浆料过滤，并且将饼状物用CH2Cl2(25mL)、EtOAc(12.5mL)和正庚烷(40mL)的混合物冲洗。然后在环境温度下，将TFA盐溶解于CH2Cl2(25.5mL)中，并且添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(1.99mL，11.0mmol)。将反应溶液搅拌约10min，并且用EtOAc(12.5mL)、随后MTBE(70mL)处理。然后将浆料过滤，并且将饼状物用CH2Cl2(25.5mL)、EtOAc(12.5mL)、和MTBE(70mL)的混合物冲洗，以得到目标化合物49(1.19g)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C58H69N18O14P2的计算值1303.47；实测值1303.45。
5’-PMO的4-mer：偶联
在环境温度下，向起始材料49(1.19g，0.913mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(8.0mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.496mL，2.74mmol)，随后添加反应物A2(0.824g，1.14mmol)。将反应溶液搅拌过夜，并且用EtOAc(8mL)、随后MTBE(100mL)处理。将浆料过滤，并且用EtOAc(16mL)和MTBE(100mL)的混合物冲洗，以得到目标化合物50(2.04g)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C96H105N25O18P3的计算值1988.73；实测值1988.67。
5’-PMO的4-mer：脱保护
在环境温度下，向装有起始材料50(2.04g，1.03mmol)的烧瓶中添加乙醇(0.599mL，10.3mmol)，随后添加TFA(0.474mL，6.15mmol)在CH2Cl2(24mL)中的溶液。将反应溶液搅拌1.5h，并且用EtOAc(12mL)、随后正庚烷(40mL)处理。将浆料过滤，并且将饼状物用CH2Cl2(24mL)、EtOAc(12mL)和正庚烷(40mL)的混合物冲洗。然后将TFA盐溶解于CH2Cl2(23.8mL)中，并且用1，2，2，6，6-五甲基哌啶(1.856mL，10.26mmol)处理约10min，然后添加EtOAc(48mL)，随后添加MTBE(48mL)。将浆料过滤，并且用CH2Cl2(24mL)、EtOAc(48mL)、和MTBE(48mL)的混合物冲洗，以得到目标化合物51(1.50g)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C77H91N25O18P3的计算值1746.62；实测值1746.51。
5’PMO的5-mer：偶联
在环境温度下，向起始材料51(500mg，0.286mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(7.5mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.16mL，0.86mmol)，随后添加反应物52a(206mg，0.358mmol)(根据以下报道的过程合成)。将反应溶液搅拌过夜，并且用EtOAc(7.5mL)、随后MTBE(100mL)处理。将浆料过滤，并且用EtOAc(15mL)和MTBE(100mL)的混合物冲洗，以给出目标化合物53(710mg)。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δppm 17.42(s，1P)，17.07(s，1P)，17.02(s，1P)，16.82(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C99H129N31O24P4Si的计算值1143.93；实测值1144.03。
5’PMO的5-mer：脱保护
在环境温度下，向装有起始材料53(710mg，0.31mmol)的烧瓶中添加吡啶(5.90mL，73.0mmol)、三乙胺(5.93mL，42.5mmol)和CH2Cl2(5.9mL)。然后将溶液用三乙胺三氢氟酸盐(759μL，4.66mmol)处理。将反应溶液搅拌过夜，在冰浴中冷却，然后用甲氧基三甲基硅烷(2.95ml，21.4mmol)处理。将混合物在冰浴中搅拌1h，并且用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5.9mL)、随后EtOAc(100mL)和MTBE(50mL)处理。将浆料过滤，并且用CH2Cl2(5.9mL)、EtOAc(118mL)、和MTBE(50mL)的混合物冲洗，以得到目标化合物54(627mg)。
31P NMR(162MHz，氯仿-d)δppm 17.37(s，1P)，17.08(s，1P)，17.03(s，1P)，16.82(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C93H115N31O24P4的计算值1087.39；实测值1087.17。
5’PMO的5-mer：用(-)-PSI激活
在环境温度下，向起始材料54(510mg，0.235mmol)在CH2Cl2(21.9mL)、THF(7.1mL)和1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(1.7mL)的混合物中的溶液中添加(-)-PSI(奥德里奇公司，CAS：2245335-70-8，194mg，0.434mmol)，随后添加激活的分子筛(2.5g)。将混合物搅拌50min，并且用DBU(49.5μL，0.329mmol)在CH2Cl2(0.872mL)中的溶液逐滴处理。然后将反应混合物搅拌30min。将沉淀物过滤，并且将饼状物用CH2Cl2(43.6mL)、THF(14.2mL)和1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(3.5mL)的混合物冲洗。将滤液用MTBE(218mL)处理，将所得沉淀物过滤，并且将饼状物用CH2Cl2(31.8mL)、THF(10.6mL)和MTBE(100mL)的混合物冲洗，以得到目标产物55(548mg)。
31P NMR(162MHz，CD2Cl2)δppm 101.46(s，1P)，16.74(s，1P)，16.46(s，1P)，16.32(s，1P)，16.13(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C103H130N31O25P5S2的计算值1210.40；实测值1210.09。
化合物52a和52b的合成
在0℃下，向N-(9-((2R，4S，5R)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺56(2.76g，6.11mmol)在乙腈(40mL)和CH2Cl2(40mL)中的溶液中添加DBU(3.04mL，20.2mmol)和LiBr(1.75g，20.2mmol)，随后添加二甲基磷氨基二氯化物(1.16mL，9.78mmol)。将反应溶液在0℃下搅拌1h，然后用10％柠檬酸水溶液(77mL)淬灭。将混合物用CH2Cl2萃取两次(每次200mL)。将合并的有机层随后用水和15we％NaCl水溶液洗涤两次，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。用梯度为正庚烷中的90％至100％EtOAc进行Biotage纯化，以得到作为两种非对映异构体52a和52b的混合物的目标产物52(1.91g)。将两种非对映异构体的混合物进行制备型HPLC分离，以得到52b(444mg)和52a(304mg)。
HPLC分离条件
柱：Chiralpak IA，21 x 250mm，5μ
流速：20mL/min
流动相：100％EtOAc
梯度：等度
运行时间：20分钟
注射体积：500uL 150mg/ml浓度
检测：254nm
峰1(Rt 9.3min)
((2R，3S，5R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(2-异丁酰胺基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基(S)-二甲基氯氨基磷酸酯(52b)：
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝12.19(br s，1H)，9.93(br s，1H)，7.76(br s，1H)，6.25(br t，J＝7.3Hz，1H)，4.98-4.90(m，1H)，4.67(br d，J＝4.3Hz，1H)，4.39-4.26(m，2H)，3.08-2.99(m，1H)，2.82-2.73(m，1H)，2.73(s，3H)，2.69(s，3H)，2.28(br dd，J＝5.9，13.5Hz，1H)，1.26(d，J＝6.9Hz，3H)，1.22(d，J＝6.8Hz，3H)，0.93(s，9H)，0.14(s，3H)，0.14(s，3H)。
31P NMR(162MHz，氯仿-d)δppm 20.39(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C22H39ClN6O6PSi的计算值577.21；实测值577.07。
峰2(Rt 15.3min)
((2R，3S，5R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(2-异丁酰胺基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基(R)-二甲基氯氨基磷酸酯(52a)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝12.24(br s，1H)，10.34(br s，1H)，7.88(br s，1H)，6.27(br t，J＝6.8Hz，1H)，5.27-5.13(m，1H)，4.91-4.85(m，1H)，4.37-4.26(m，1H)，4.15-4.07(m，1H)，3.24-3.16(m，1H)，2.80(s，3H)，2.76(s，3H)，2.75-2.71(m，1H)，2.37(br dd，J＝6.9，12.1Hz，1H)，1.25(d，J＝6.8Hz，3H)，1.24(d，J＝6.8Hz，3H)，0.92(s，9H)，0.12(s，3H)，0.12(s，3H)
31P NMR(162MHz，氯仿-d)δppm 19.67(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C22H39ClN6O6PSi的计算值577.21；实测值577.07。
实例5.2：3’-PMO翼的制备
3’-PMO的2-mer：偶联
向起始材料57(1.33g，2.32mmol)在THF(16mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(1.15mL，6.34mmol)。将所得溶液冷却至0℃，并且用反应物G2(1.60g，2.11mmol)处理。将反应混合物加温至环境温度并搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液(25mL)和水(10mL)，并且将所得混合物用CH2Cl2萃取三次(每次40mL)。将合并的有机层用30wt％NaCl水溶液(20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化。用在EtOAc中的3％-15％MeOH洗脱，以得到2.316g的目标产物58。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C62H64N14O9P的计算值1179.47；实测值1179.41。
3’-PMO的2-mer：脱保护
在环境温度下，向起始材料58(2.316g，1.964mmol)在CH2Cl2(35mL)中的溶液中添加乙醇(1.2mL，20mmol)，随后添加TFA(0.91mL，12mmol)。在环境温度下，将反应混合物搅拌1h，然后用1，2，2，6，6-五甲基哌啶(2.7mL，15mmol)处理。将所得混合物在真空中浓缩。将残余物用EtOAc(25mL)、随后MTBE(50mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MTBE和EtOAc(15mL/5mL)的混合物冲洗。将滤饼在真空中干燥2h以提供1.75g的目标产物59。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C43H50N14O9P的计算值937.36；实测值937.10。
3’-PMO的3-mer：偶联
在0℃下，向起始材料59(1.75g，1.87mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(20mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.68mL，3.7mmol)，随后添加反应物A2(1.42g，1.96mmol)。将反应混合物加温至环境温度并搅拌过夜。向反应混合物中添加EtOAc(20mL)，随后添加MTBE(60mL)和正庚烷(80mL)。将沉淀物通过倾析收集。将分离的产物(60)不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C81H86N21O13P2的计算值1622.62；实测值1622.59。
3’-PMO的3-mer：脱保护
在环境温度下，向起始材料60(理论上为3.03g，1.87mmol)在CH2Cl2(24mL)中的溶液中添加乙醇(1.1mL，19mmol)和TFA(0.86mL，11.2mmol)。将反应混合物搅拌30min，然后添加另外的TFA(0.43mL，5.6mmol)。搅拌2h后，将反应混合物用EtOAc(75mL)、随后MTBE(50mL)处理。将沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MTBE(10mL/10mL)冲洗。在环境温度下，将所得固体溶解于CH2Cl2(25mL)中，并且用1，2，2，6，6-五甲基哌啶(1.02mL，5.60mmol)处理。将混合物搅拌10min，然后添加EtOAc(75mL)和MTBE(50mL)。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MTBE(15mL/15mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥，以提供2.25g的目标产物61。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C62H72N21O13P2的计算值1380.51；实测值1380.31。
3’-PMO的4-mer：偶联
在环境温度下，向起始材料61(2.20g，1.59mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(20mL)中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.73mL，4.0mmol)，随后添加反应物C1(1.22g，1.75mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后添加另外的C1(0.20g，0.29mmol)。再搅拌4h后，将反应混合物用吗啉(42μL，0.48mmol)处理。20min后，添加EtOAc(20mL)和MTBE(150mL)。将所得沉淀物通过过滤收集，用EtOAc/MTBE(10mL/20mL)的混合物冲洗，并且在真空中干燥过夜。将所得固体(3.74g)溶解于CH2Cl2(25mL)中。向溶液中添加EtOAc(25mL)，随后添加MTBE(100mL)。将所得沉淀物通过过滤收集，用EtOAc/MTBE(10mL/30mL)的混合物冲洗，并且在真空中干燥过夜。获得3.20g的目标产物62。
MS(ESI)m/z：[M-Tr+2H]+针对C80H94N26O18P3的计算值1800.65；实测值1800.05。
3’-PMO的4-mer：脱保护
在环境温度下，向起始材料62(194mg，1.57mmol)在CH2Cl2(42mL)中的溶液中添加EtOH(0.92mL)和TFA(0.96mL，12mmol)。将反应混合物搅拌2h，并且用EtOAc(4mL)、随后MTBE(80mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MTBE(10mL/20mL)的混合物冲洗。将所得固体溶解于CH2Cl2(42mL)中，并且用1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.85mL，4.7mmol)处理。将所得溶液在环境温度下搅拌10min，然后添加EtOAc(40ml)和MTBE(100mL)。将沉淀物通过过滤收集，用EtOAc/MTBE(20mL/40mL)的混合物冲洗，并且在真空中干燥2h。将固体溶解于CH2Cl2(40mL)中。向溶液中添加EtOAc(40mL)，随后添加MTBE(60mL)。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MTBE(20mL/20mL)的混合物冲洗。将固体溶解于CH2Cl2(40mL)中，并且用EtOAc(80mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集并用EtOAc(约30mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥，以提供2.05g的目标产物63。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C80H94N26O18P3的计算值1800.65；实测值1800.68。
3’-PMO的4-mer：整体脱保护
在环境温度下，将起始材料63(1.25g，0.695mmol)溶解于甲醇(20mL)和28％氢氧化铵(20mL)的混合物中。向溶液中添加吗啉(0.73mL，8.3mmol)。将所得混合物在50℃-52℃下加热15h，并且冷却至环境温度。在真空中浓缩后，将残余物溶解于CH2Cl2/MeOH(12.5mL/5mL)中，并且用EtOAc(60mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/CH2Cl2/MeOH(20mL/2.5mL/1mL)的混合物冲洗。将滤饼在真空中干燥过夜，以得到928mg的目标产物64。
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C45H69N25O13P3的计算值1260.47；实测值1260.98。
3’-PMO的4-mer：吗啉保护
向起始材料64(理论上为928mg，0.405mmol)在THF/水/MeOH(15mL/2.5mL/4.5mL)的混合物中的溶液中添加1，2，2，6，6-五甲基哌啶(0.367mL，2.02mmol)和3，5-双(三氟甲基)苯甲酰氯(0.11mL，0.61mmol)。3h后，添加另外的0.025mL的双(三氟甲基)苯甲酰氯。搅拌过夜后，将反应混合物用EtOAc(60mL)处理。将所得胶状固体通过倾析分离，并且溶解于MeOH/CH2Cl2(2mL/8mL)的混合物中。向溶液中添加EtOAc(50mL)。将所得沉淀物通过过滤分离，用EtOAc冲洗，并且在真空中干燥20min。将所得固体用MeCN/EtOAc(7.5mL/7.5mL)的混合物处理。将浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(2.5mL/2.5mL)的混合物冲洗。将滤饼在真空中干燥1h，以得到550mg的目标产物65。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝17.16(s，1P)，17.11(s，1P)，16.97(s，1P)
MS(ESI)m/z：[M+H]+针对C54H71F6N25O14P3的计算值1500.47；实测值1500.22。
实例5.3：DNA的延长
5-mer：偶联
将起始材料65(550mg，0.367mmol)和反应物H2(783mg，0.99mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(19mL)中。向所得溶液中添加分子筛(1.7g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.22mL，1.47mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌1小时，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(30mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(6mL)冲洗。向所得浆料中添加另外的EtOAc(50mL)。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。10min后，将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用EtOAc/MeCN(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥3天，以得到790mg的目标产物67。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.76(s，1P)，17.10(s，1P)，17.02(s，1P)，16.90(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M-DMT+2H]+针对C64H84F6N27O20P4S的计算值1820.50；实测值1820.18。
5-mer：脱保护
将起始材料67(0.790g，0.347mmol)溶解于1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(8mL)、2，2，2-三氟乙醇(2mL)、CH2Cl2(10mL)和三乙基硅烷(6mL)的混合物中。将反应混合物在环境温度下搅拌3h，并且添加另外的1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(2mL)、2，2，2-三氟乙醇(0.5mL)、CH2Cl2(2.5mL)和三乙基硅烷(1.5mL)的混合物。再搅拌1h后，将反应混合物用EtOAc(150mL)、随后MTBE(75mL)处理。将所得沉淀物通过离心(3500rpm，35min)收集，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将沉淀物用MeCN(25mL)处理以制备浆料。搅拌5min后，添加EtOAc(25mL)。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(10mL/10mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥过夜，以提供646mg的目标产物68。
MS(ESI)m/z：[M-H]-针对C64H82F6N27O20P4S的计算值1818.48；实测值1818.37。
6-mer：偶联
将起始材料68(646mg，0.327mmol)和反应物H2(777mg，0.982mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(16mL)中。向所得溶液中添加分子筛(2g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.25mL，1.64mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌2h，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(35mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(4mL)冲洗。向所得浆料中添加另外的EtOAc(40mL)。将沉淀物通过过滤分离，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将所得固体用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用EtOAc/MeCN(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥过夜，以提供0.90g的目标产物69。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C95H113F6N29O28P5S2的计算值1220.32；实测值1220.47。
6-mer：脱保护
向起始材料69(0.90g，0.328mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(10.8mL)、2，2，2-三氟乙醇(2.7mL)、三乙基硅烷(8.1mL)和CH2Cl2(13.5mL)的混合物。在环境温度下搅拌过夜后，将反应混合物用EtOAc(150mL)、随后MTBE(100mL)处理。将所得沉淀物通过过滤分离，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(25mL)处理以制备浆料。搅拌5min后，添加EtOAc(25mL)。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(10mL/10mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥1h，以提供800mg的目标产物70。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C74H98F6N29O26P5S2的计算值1070.76；实测值1070.66。
7-mer：偶联
将起始材料70(950mg，0.389mmol)和反应物H1(1042mg，1.17mmol)溶解于1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(23.8mL)中。向所得溶液中添加分子筛(1g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.35mL，2.33mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌16h，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(40mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)冲洗。向所得浆料中添加另外的EtOAc(35mL)。将沉淀物通过过滤分离，并且用MeCN/EtOAc(10mL/10mL)冲洗。将所得固体用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用EtOAc/MeCN(7.5mL/7.5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥4h，以提供1.20g的目标产物71。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.13(s，1P)，56.94(s，2P)，17.05(s，1P)，16.98(s，1P)，16.79(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C112H130F6N32O34P6S3的计算值1431.35；实测值1431.26。
7-mer：脱保护
向起始材料71(1.20g，0.361mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(14.4mL)、2，2，2-三氟乙醇(3.6mL)、三乙基硅烷(10.8mL)和CH2Cl2(18mL)的混合物。在环境温度下搅拌过夜后，将所得溶液用EtOAc(100mL)、随后MTBE(50mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(25mL)、随后EtOAc(25mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(10mL/10mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥3h，以提供1.0g的目标产物72。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C84H108F6N32O31P6S3的计算值1228.27；实测值1228.50。
8-mer：偶联
向起始材料72(300mg，0.103mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(9.0mL)中的溶液中添加反应物H1(276mg，0.309mmol)。向所得溶液中添加分子筛(1.0g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气，并且将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.11mL，0.72mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌4h，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(25mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(4.5mL)冲洗。向所得浆料中添加另外的EtOAc(20mL)。将沉淀物通过过滤分离，并且用MeCN/EtOAc(7.5mL/7.5mL)冲洗。将所得固体用MeCN(10mL)、随后EtOAc(10mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用EtOAc/MeCN(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥过夜，以提供0.36g的目标产物73。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.36(s，1P)，57.31(s，1P)，56.90(s，1P)，56.27(s，1P)16.96(s，1P)，16.94(s，1P)，16.67(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C122H144F6N35O39P7S4的计算值1591.37；实测值1591.35。
8-mer：脱保护
向起始材料73(360mg，0.095mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(4.3mL)、2，2，2-三氟乙醇(1.1mL)、三乙基硅烷(3.2mL)和CH2Cl2(5.4mL)的混合物。将所得溶液在环境温度下搅拌17h，并且用EtOAc(75mL)、随后MTBE(15mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(5mL/5mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(15mL)、随后EtOAc(15mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥2h，以提供0.305g的目标产物74。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C94H122F6N35O36P7S4的计算值1388.29；实测值1388.26。
9-mer：偶联
向起始材料74(305mg，0.090mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(12mL)中的溶液中添加反应物H1(241mg，0.270mmol)。向所得溶液中添加分子筛(1g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.11mL，0.72mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌2.5天，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(20mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(4mL)冲洗。向所得浆料中添加另外的EtOAc(20mL)。将所得沉淀物通过离心(3500rpm，30min)收集。将所得沉淀物用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)的混合物冲洗，并且用MeCN(15mL)、随后EtOAc(15mL)处理。将所得浆料进行离心(3500rpm，10min)。将沉淀物用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)的混合物冲洗，并且在真空中干燥1h。获得385mg的目标产物75。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.44(s，1P)，57.35(s，1P)，56.88(s，2P)，56.17(s，1P)16.95(s，1P)，16.92(s，1P)，16.74(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C132H158F6N38O44P8S5的计算值1751.89；实测值1751.73。
9-mer：脱保护
/>
向起始材料75(385mg，0.090mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(4.6mL)、2，2，2-三氟乙醇(1.2mL)、三乙基硅烷(3.5mL)和CH2Cl2(5.8mL)的混合物。将所得溶液在环境温度下搅拌过夜，并且用EtOAc(90mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼在真空中干燥5h，以提供320mg的目标产物76。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C104H136F6N38O41P8S5的计算值1547.81；实测值1547.81。
10-mer：偶联
向起始材料76(320mg，0.083mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(13mL)中的溶液中添加反应物30b(225mg，0.249mmol)。向所得溶液中添加分子筛(1.0g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.112mL，0.746mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌17小时，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(20mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)冲洗。向所得浆料中添加另外的EtOAc(20mL)。将所得浆料离心(3500rpm，30min)。向沉淀物中添加MeCN(20mL)，随后添加EtOAc(20mL)。将所得浆料离心(3500rpm，20min)。将沉淀物用EtOAc/MeCN(5mL/5mL)冲洗，并且在真空中干燥1h。获得420mg的目标产物77，并且将其不经进一步纯化而直接用于下一步。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.29(s，1P)，56.99(s，1P)，56.95(s，1P)，56.78(s，2P)，56.23(s，1P)，16.95(s，2P)，16.72(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C142H170F6N43O48P9S6的计算值1915.41；实测值1915.21。
10-mer：脱保护
向起始材料77(理论上为430mg，0.84mmol)中添加1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(4.8mL)、2，2，2-三氟乙醇(1.2mL)、三乙基硅烷(3.6mL)和CH2Cl2(6.0mL)的混合物。将所得溶液在环境温度下搅拌30min，并且用EtOAc(90mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼在真空中干燥过夜，以提供316mg的目标产物78。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C121H152F6N43O46P9S6的计算值1764.34；实测值1764.19。
11-mer：偶联
向起始材料78(316mg，0.071mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(12.6mL)中的溶液中添加反应物79(189mg，0.213mmol)。向所得溶液中添加分子筛(1.4g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.11mL，0.71mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌过夜，并且添加另外的反应物79(92mg)。搅拌2天后，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将所得滤液添加至EtOAc(20mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(3mL)冲洗。将所得浆料混合物离心(3500rpm，30min)。将所得沉淀物用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在环境温度下在真空中干燥4h，以提供375mg的目标产物80。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.27(s，1P)，56.95(s，1P)，56.91(s，1P)，56.83(s，1P)，56.81(s，1P)，56.75(s，1P)，56.24(s，1P)，16.95(s，2P)，16.71(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C156H187F6N48O54P10S7的计算值1414.96；实测值1414.94
11-mer：脱保护
将起始材料80(375mg，0.071mmol)溶解于1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(4.5mL)、2，2，2-三氟乙醇(1.1mL)、三乙基硅烷(3.4mL)和CH2Cl2(5.6mL)的混合物中。将所得溶液在环境温度下搅拌40min，并且用EtOAc(75mL)、随后MTBE(25mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥过夜，以提供343mg的目标产物81。
MS(ESI)m/z：[M-2H]2-针对C135H170F6N48O52P10S7的计算值1971.88；实测值1971.73。
12-mer：偶联
向起始材料81(343mg，0.068mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(12mL)中的溶液中添加反应物H2(189mg，0.239mmol)。向所得溶液中添加分子筛(1.5g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.113mL，0.753mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌23h，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(20mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)冲洗。添加另外的EtOAc(20mL)。将所得浆料离心(3500rpm，30min)。将所得沉淀物用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在环境温度下在真空中干燥3h，以提供目标产物82。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.28(s，1P)，57.24(s，1P)，56.94(s，1P)，56.81(s，2P)，56.74(s，2P)，56.22(s，1P)，16.95(s，2P)，16.70(s，1P)
MS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C166H200F6N50O60P11S8的计算值1521.63；实测值1521.41
12-mer：脱保护
将起始材料82(理论上为396mg，0.068mmol)溶解于1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(4.8mL)、2，2，2-三氟乙醇(1.2mL)、三乙基硅烷(3.6mL)和CH2Cl2(6.0mL)的混合物中。将所得溶液在环境温度下搅拌16h，并且用EtOAc(100mL)处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(5mL/5mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥1h，以提供310mg的目标产物83。
MS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C145H182F6N50O58P11S8的计算值1421.26；实测值1421.32。
13-mer：偶联
向起始材料83(310mg，0.057mmol)在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(11mL)中的溶液中添加反应物30b(179mg，0.198mmol)。向所得溶液中添加分子筛(1.2g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.102mL，0.678mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌过夜，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(20mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(5mL)冲洗。添加另外的EtOAc(20mL)。将所得浆料离心(3500rpm，30min)。将所得沉淀物用MeCN(20mL)、随后EtOAc(20mL)处理。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在环境温度下在真空中干燥3天，然后用25mL MeCN处理以制备浆料。搅拌30min后，将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。将滤饼在真空中干燥1h，以提供365mg的目标产物84。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.22(s，1P)，56.96(s，2P)，56.89(s，1P)，56.78(s，2P)，56.74(s，2P)，56.27(s，1P)，16.96(s，2P)，16.72(s，1P)。
MS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C183H216F6N55O65P12S9的计算值1666.32；实测值1666.24。
13-mer：脱保护
/>
将起始材料84(365mg，0.057mmol)溶解于1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(4.4mL)、2，2，2-三氟乙醇(1.1mL)、三乙基硅烷(3.3mL)和CH2Cl2(5.5mL)的混合物中。将所得溶液在环境温度下搅拌20min，并且用125mL EtOAc处理。将所得沉淀物通过过滤收集，并且用EtOAc/MeCN(10mL/10mL)的混合物冲洗。将滤饼用MeCN(20mL)、随后EtOAc(10mL)处理。将所得浆料离心(4000rpm，60min)。将所得沉淀物通过倾析分离，并且用MeCN/EtOAc(5mL/5mL)冲洗。在真空中干燥过夜，以提供328mg的目标产物85。
MS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C162H198F6N55O63P12S9的计算值1565.61；实测值1565.65。
实例5.4：13+5偶联
/>
向起始材料85(100mg，0.016mmol)和反应物55(139mg，0.058mmol)的混合物中添加1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(3.5mL)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸三次(每次2mL)。向所得溶液中添加分子筛(0.40g)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。搅拌30min后，将所得混合物用DBU(0.032mL，0.21mmol)处理。将反应混合物在环境温度下搅拌3天，然后通过注射器过滤器过滤。将滤液添加至EtOAc(15mL)中，用1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(2.5mL)冲洗。将所得浆料离心(3500rpm，20min)。将沉淀物溶解于EtOH(3mL)和CH2Cl2(6mL)中。向所得溶液中添加EtOAc(20mL)。将所得浆料通过玻璃过滤器过滤，并且用MeCN(10mL)冲洗。将滤饼在环境温度下在真空中干燥0.5h，以提供0.13g的目标产物87。
31P NMR(162MHz，甲醇-d4)δ＝57.30(s，1P)，57.19(s，1P)，56.91(s，2P)，56.80(s，2P)，56.73(s，2P)，56.62(s，1P)，56.18(s，1P)，17.07(s，2P)，16.94(s，2P)，16.91(s，1P)，16.85(s，1P)，16.67(s，1P)
MS(ESI)m/z：[M-4H]4-针对C255H309F6N86O88P17S10的计算值1736.38：实测值1736.31。
实例5.5：最终的脱保护
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向起始材料87(0.130mg，0.015mmol)在甲醇(4.6mL)和28％氢氧化铵(4.6mL)的混合物中的溶液中添加DL-二硫苏糖醇(0.024g，0.15mmol)。将所得混合物在53℃-55℃下搅拌23h，并且冷却至环境温度。添加MeCN/EtOAc(20mL/20mL)的混合物，并且将所得浆料进行离心(4000rpm，90min)。将所得沉淀物分离并溶解于水(30mL)中。将水溶液进行超滤(Amicon Ultra-15，ultracel 3K，3500rpm，35min)。将剩余溶液用水(30mL)稀释，并且进行超滤(Amicon Ultra-15，ultracel 3K，3500rpm，35min)。将剩余溶液通过注射器过滤器过滤，并且用水冲洗。将滤液(约5mL)进行离心(4000rpm，30min)，并且将上清液使用表6中的条件和表7中的条件通过制备型HPLC纯化。
表6：RP-HPLC条件
表7：IEX-HPLC条件
用Amicon Ultra-15、Ultracel-3K(3500rpm，45min)对纯化产物进行4次脱盐。将所得溶液(12.5mL)冷冻干燥2天，以提供18mg的目标产物132m。
HRMS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C192H266N86O78P17S10的计算值1957.7415；实测值1957.7418。
实例5.6：化合物132n的制备
在制备5’翼5-mer(化合物53)时用化合物52b代替化合物52a，通过与化合物132f所述相同的反应顺序制备化合物132n。
HRMS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C192H266N86O78P17S10的计算值1957.7415；实测值1957.7422。
实例5.7：化合物132f的制备
在制备5’翼5-mer(化合物53)时，用((2R，3S，5R)-3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(2-异丁酰胺基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基二甲基氯氨基磷酸酯(52)代替化合物52a，通过与化合物132m所述相同的反应顺序制备化合物132f。
HRMS(ESI)m/z：[M-3H]3-针对C192H266N86O78P17S10的计算值1957.7415；实测值1957.7439。
实例6：与脂质缀合的PMO-缺口体的制备
具有3’脂质的PMO-缺口体的制备-PEG接头的安装
/>
向在4mL小瓶中的起始材料91(9mg，1.523μmol)中添加1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(1.5mL)。超声处理约1min后，将所得混合物用NaHCO3饱和水溶液(8％，0.5mL)和水(0.25mL)处理。向所得浆料中添加2，5-二氧代吡咯烷-1-基1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2，7，10-三氧杂-4-氮杂十三烷-13-酸酯(9.1mg，0.018mmol)。将反应混合物在35℃下搅拌过夜(约18h)，用水(20mL)稀释，并且进行三次超滤(Amicon Ultra-15，ultracel 3K，3500rpm，45min)。将在水(约3mL)中的粗产物(约30％产物和约70％起始材料的混合物)再次经受四次以上上述反应条件，直到转化率达到＞90％。
将在水(约3mL)中的偶联产物用1.0M NaOH(0.7mL)水溶液处理，并且在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过注射器过滤器过滤，用水(30mL)稀释，并且进行两次超滤(Amicon Ultra-15，ultracel 3K，3500rpm，45min)。将所得在水(2.5mL)中的产物(92)不经进一步纯化而用于下一步。
MS(ESI)m/z：[M+5H]5+针对C200H303N73O87P17S8的计算值1180.3；实测值1180.9
与棕榈酰脂质缀合
/>
向起始材料92(9.24mg，1.521μmol)在水(2.5mL)中的溶液中添加NaHCO3饱和水溶液(8％)(0.5mL)、DMSO(1.5mL)、乙腈(1.5mL)、TEA(0.050mL，0.36mmol)，然后添加全氟苯基棕榈酸酯(32.1mg，0.076mmol)。将所得混合物在35℃下搅拌2天，用8mL水稀释，通过注射器过滤器过滤，并且进行两次超滤(Amicon Ultra-15，ultracel 3K，3500rpm，45min)。将所得溶液(约4mL)再次经受上述偶联条件。将粗产物用Sep-Pak Vac C18 6cc/1g纯化，用在水中的MeCN(从0％至40％)洗脱。将含有所需产物的级分合并，浓缩，溶解于水(约3mL)中，并且进行冷冻干燥2天。2.2mg的产物93。
MS(ESI)m/z：[M+5H]5+针对C216H333N73O88P17S8的计算值1227.7；实测值1227.9
实例7：具有5’脂质的PMO-缺口体的制备
TBDPS的脱保护
在室温下，向起始材料94(290mg，0.105mmol)在吡啶(2mL)和TEA(2mL)中的溶液中添加TEA-3HF(0.257mL，1.576mmol)。将所得溶液搅拌过夜，并且用甲氧基三甲基硅烷(1mL，7.254mmol)处理。在室温下搅拌1h后，添加1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(2mL)以制备澄清溶液。将所得溶液添加至EtOAc(12mL)中，并且缓慢添加MTBE(36mL)。30min后，将浆料通过烧结玻璃过滤器过滤，用MTBE/EtOAc(3/1，10mL)冲洗。将饼状物在真空中干燥，以提供245mg的目标产物95。MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C110H143N28O32P5的计算值1261.75；实测值1261.45。
己氨基接头的安装
将化合物95(225mg，0.089mmol)溶解于MeCN(5.6mL)和6mL DCM中，并且在真空中浓缩。将该过程再重复两次。将所得残余物溶解于DCM(9.0mL)和MeCN(5.6mL)中。向所得溶液中添加MMT-己氨基接头亚磷酰胺(158mg，0.268mmol)和4，5-二氰基咪唑(42.1mg，0.357mmol)。1h后，添加另外的MMT-己氨基接头亚磷酰胺(50mg)和4，5-二氰基咪唑(10mg)。30min后，添加叔丁基氢过氧化物在癸烷(5.5M，0.081mL，0.446mmol)中的溶液。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物添加至35mL MTBE中，用4mL DCM冲洗。然后添加另外的7mL MTBE，并将所得固体通过过滤收集，并且用MTBE/DCM(4/1，15mL)的混合物冲洗。将饼状物在真空中干燥过夜，以给出270mg的化合物96。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C139H176N30O36P6的计算值1513.56；实测值1513.88。
MMT和DMT基团的脱保护
向化合物96(270mg，0.089mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加乙醇(0.5mL，8.563mmol)和TFA(0.5mL，6.49mmol)。1h后，在室温下，将反应混合物添加至EtOAc(30mL)中，并且添加30mL MTBE。30min后，将固体通过过滤收集，并且用MTBE/EtOAc(1/1，10mL)冲洗。将饼状物在真空中干燥2h，以提供210mg的目标产物(97)。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C98H142N30O33P6的计算值1226.44；实测值1226.68。
棕榈酰脂质的安装
向起始材料97(210mg，0.082mmol)在MeCN(10.5mL)和甲醇(3.4mL)中的溶液中添加TEA(0.103mL，0.736mmol)和全氟苯基棕榈酸酯(114mg，0.27mmol)。1h后，在室温下，将反应混合物用120mL MTBE分批处理。将所得固体通过过滤收集，并且用MTBE冲洗。将饼状物在室温下在真空中干燥2天，以给出169mg的目标产物(98)。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C114H172N30O34P6的计算值1345.55；实测值1345.53。
用(-)-PSI激活
将起始材料98(169mg，0.063mmol)和(-)-PSI试剂(奥德里奇公司，CAS：2245335-70-8，56.1mg，0.126mmol)溶解于THF(3mL)中，并且在真空中浓缩。将该过程再重复两次。在室温下，将所得残余物溶解于THF(4mL)中，并且用DBU(0.014mL，0.094mmol)处理。将反应混合物搅拌1h，并且用MTBE(20mL)处理。将所得浆料过滤，用MTBE(2x3mL)冲洗。将饼状物在室温下在真空中干燥过夜，以给出187mg的目标产物99。
MS(ESI)m/z：[M+2H]2+针对C124H187N30O35P7S2的计算值1468.57；实测值1468.93
12+6偶联
/>
向起始材料99(100mg，0.019mmol)和反应物100(187mg，0.064mmol)的混合物中添加1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(4mL)。将所得混合物在30℃-33℃下与甲苯共沸四次(每次2.5mL)。向所得溶液中添加分子筛(250mg)。将反应烧瓶置于真空中并充入氮气。将该过程再重复两次。向所得混合物中添加吗啉(0.034mL，0.386mmol)，然后添加DBU(0.041mL，0.27mmol)。在室温下搅拌24h后，将反应混合物通过注射器过滤器过滤，并且将滤液添加至EtOAc(15mL)中，用4mL 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮冲洗。将所得浆料混合物离心(3000rpm，20min)。将所得沉淀物通过倾析收集，溶解于DCM/EtOH(10mL/5mL)的混合物中，并且用EtOAc(20mL)处理。将所得固体通过过滤收集，并且用EtOAc/DCM(4mL/2mL)的混合物冲洗。将饼状物在室温下在真空中干燥1h，以提供123mg被剩余的起始材料(100)污染的目标产物101。将该材料不经进一步纯化而用于下一步。
MS(ESI)m/z：[M-4H]4-针对C249H345F6N73O93P18S8的计算值1693.19；实测值1693.6。
最终的脱保护/纯化
/>
向起始材料101(0.123g)在甲醇(5mL)中的溶液中添加28％氢氧化铵(5mL)和DL-二硫苏糖醇(0.024g，0.15mmol)。将所得混合物在53℃-55℃下搅拌24h，并且冷却至室温。添加MeCN/EtOAc(60mL/20mL)的混合物，并且将所得浆料离心(3500ppm，20min)。将所得沉淀物分离并溶解于水(约10mL)中。将水溶液进行五次超滤(Amicon Ultra-15，ultracel3K，3500rpm，45min)。将所得溶液用4mL水稀释，并且在表8中描述的以下条件下通过IEX-HPLC纯化。
表8：IEX-HPLC条件
用Amicon Ultra-15、Ultracel-3K(3500rpm，45min)对纯化产物进行5次脱盐。将所得溶液(5mL)冷冻干燥2天，以提供4.2mg的目标产物102。
MS(ESI)m/z：[M+5H]5+针对C215H334N73O88P18S8的计算值1231.93；实测值1232.4。
实例8：靶向MAPT基因转录物的PMO-缺口体的体外活性
所披露的PMO-缺口体减少基因翻译的能力是通过测量其减少MAPT基因转录物表达的能力进行评估的，这些转录物与Tau蛋白的表达相关。
实例8.1：5-8-5 PMO-缺口体对SH-SY5Y细胞中人Tau的抑制
在体外测试了靶向Tau的反义寡核苷酸对人Tau mRNA的抑制作用。使用具有10、30或100 nM反义寡核苷酸的Endo-Porter转染培养的SH-SY5Y细胞。2天的处理期后，使用RSC simply RNA细胞/组织试剂盒从细胞中分离RNA，并合成cDNA。使用对人MAPT(测定ID Hs00902194_m1)和人GAPDH(测定ID HS99999905m1)特异的TaqMan探针，通过定量实时PCR测量Tau mRNA水平。将Tau mRNA水平相对于内源参考基因GAPDH的水平归一化。结果以用媒介物处理的对照细胞的相对表达量表示。
通过测定相对于内源参考基因GAPDH的表达归一化的Tau mRNA的相对表达，测量七十个合成的靶向MAPT基因转录物的立体无规的5-8-5 PMO-缺口体及其降低所述转录物的表达的能力。17个立体无规的5-8-5 PMO-缺口体在10nM、30nM或100nM浓度下的体外活性如表9所示：
表9
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实例8.2：4-10-4 PMO-缺口体对SH-SY5Y细胞中人Tau的抑制
在体外测试了靶向tau的反义寡核苷酸对人Tau mRNA的抑制作用。使用具有30、100或300nM反义寡核苷酸的Endo-Porter转染培养的SH-SY5Y细胞。2天的处理期后，使用RSC simply RNA细胞/组织试剂盒从细胞中分离RNA，并合成cDNA。使用对人MAPT(测定ID Hs00902194_m1)和人GAPDH(测定ID HS99999905_m1)特异的TaqMan探针，通过定量实时PCR测量Tau mRNA水平。将Tau mRNA水平相对于内源参考基因GAPDH的水平归一化。这些4-10-4 PMO-缺口体的结果如表10所示。
表10
实例8.1和8.2中报道的立体无规的PMO-缺口体的体外评估结果表明，所披露的PMO-缺口体能够结合MAPT基因转录物并诱导RNA酶H活性，从而降低MAPT mRNA的表达。
实例8.3：MALDI-质量(MALDI-MASS)分析
对十七个5-8-5 PMO-缺口体和十二个4-10-4缺口体进行了MALDI-质量分析，结果分别显示在表11和表12中。在Autoflex MALDI-TOF-MS光谱仪上通过负模式获得质谱，该光谱仪由标准寡核苷酸(Bruker)校准。以添加柠檬酸氢二铵的3-羟基吡啶甲酸作为基质。
表11-5-8-5 PMO-缺口体的MALDI-质量
/>
表12-4-10-4 PMO-缺口体的MALDI-质量
实例9：PMO-缺口体对人Tau的体内敲除
使用图6中提到的手性对选定的反义寡核苷酸进行体内测试。还测试了具有随机手性的反义寡核苷酸。这些中的每一个都是具有(SEQ ID NO：12)的4-10-4 PMO-缺口体。通过脑室内(ICV)推注向每组4只人MAPT敲入小鼠(Saito等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，23；294(34)：12754-12765)施用60或100ug的选定的反义寡核苷酸。对照组的4只小鼠同样用生理盐水处理。所有手术都在布托啡诺、美托咪定和咪达***的麻醉下进行，并符合IACUC的规定。
对于ICV推注，将反义寡核苷酸注射到人MAPT敲入小鼠的左侧脑室。注射十微升含有60或100μg的寡核苷酸的盐溶液。寡核苷酸施用后3天收集组织。从海马提取RNA，并且通过实时PCR分析检测人tau mRNA表达。使用对人MAPT和小鼠Gapdh特异的TaqMan探针测量人tau mRNA水平。表13a和表13b中所示的结果计算为与对照小鼠相比，相对于Gapdh水平归一化的人tau mRNA表达的抑制。
表13a
13b
1“C”意指胞嘧啶，并且“mC”意指5-甲基胞嘧啶。
尽管已根据具体示例性实施例和实例来描述实施例，但本文披露的实施例只是出于说明性目的，并且本领域的技术人员可以在不偏离如以下权利要求中所陈述的本发明的精神和范围的情况下作出不同的修改和改变。
引用文献
本文的所有引用文献，包括以下这些，均通过援引以其全文并入本文。
1.WO 2018057430 A1.
2.U.S.Patent No.10,457,698.
3.U.S.Patent No.10,836,784
4.C.F.Bennett，Annu.Rev.Med.2019，70，307.

Claims (80)

1.一种缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，该缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐包含：
缺口区域，其中该缺口区域含有通过硫代磷酸酯键彼此连接的脱氧核糖核苷；
位于该缺口区域5’末端处的5’翼区域，其中该5’翼区域含有通过磷二酰胺键彼此连接的吗啉代单体；以及
位于该缺口区域3’末端处的3’翼区域，其中该3’翼区域含有通过磷二酰胺键彼此连接的吗啉代单体。
2.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该脱氧核糖核苷由以下结构组成：
其中P*表示立构中心，该立构中心处于(R)或(S)构型；
其中该吗啉代单体由以下结构组成：
其中P*表示立构中心，该立构中心处于(R)或(S)构型；
其中该脱氧核糖核苷和吗啉代单体结构中的碱基独立地选自由以下组成的组：
其中R选自H、C(O)R1或C(O)OR1，
其中R1选自C1-C6烷基或芳基，并且其中该芳基任选地被选自下组的取代基取代，该组由卤素、硝基和甲氧基组成。
3.根据权利要求2所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐具有以下结构：
其中n和p是1与5之间的整数，
m是6与10之间的整数；并且
B是碱基。
4.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该硫代磷酸酯键和磷二酰胺键各自具有独立地处于R或S构型的磷，并且其中每个R或S构型为至少90％纯。
5.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该硫代磷酸酯键和磷二酰胺键各自具有独立地处于R或S构型的磷，并且其中每个R或S构型为至少95％纯。
6.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该硫代磷酸酯键和磷二酰胺键各自具有独立地处于R或S构型的磷，并且其中每个R或S构型为至少99％纯。
7.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该5’和3’翼区域各自由通过磷二酰胺键彼此连接的3-7个吗啉代单体组成。
8.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域由通过硫代磷酸酯键彼此连接的6-12个脱氧核糖核苷组成。
9.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少90％纯。
10.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少95％纯。
11.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少99％纯。
12.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的硫代磷酸酯键中的至少一个含有具有Rp构型的磷原子。
13.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的所有硫代磷酸酯键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少95％纯。
14.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的所有硫代磷酸酯键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少99％纯。
15.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少90％纯。
16.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少95％纯。
17.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少99％纯。
18.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中这些硫代磷酸酯键和磷二酰胺键都具有立体无规的磷原子。
19.根据权利要求1所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中这些缺口体与脂质缀合。
20.根据权利要求19所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该脂质是棕榈酰脂质。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该脂质在这些缺口体的5’末端缀合。
22.根据权利要求19或权利要求20所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中这些硫代磷酸酯键和磷二酰胺键都具有立体无规的磷原子。
23.根据权利要求19或权利要求20所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该5’和3’翼区域的所有磷二酰胺键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少90％纯。
24.根据权利要求19或权利要求20所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的所有硫代磷酸酯键都含有具有S构型的磷原子，并且其中每个S构型为至少90％纯。
25.根据权利要求19或权利要求20所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐，其中该缺口区域中的硫代磷酸酯键具有R与S磷构型的混合，并且其中每个R和S构型为至少90％纯。
26.根据前述权利要求中任一项所述的缺口体或药学上可接受的盐，其中该缺口体是5-8-5缺口体。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的缺口体或药学上可接受的盐，其中该缺口体是4-10-4缺口体。
28.一种药物组合物，该药物组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐。
29.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求19或权利要求20所述的缺口体或该缺口体的药学上可接受的盐。
30.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物、缺口体、或缺口体的药学上可接受的盐在药物制备中的用途。
31.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物、缺口体、或缺口体的药学上可接受的盐在疾病或障碍的治疗中的用途。
32.一种用于通过固相合成制备立体无规的聚吗啉代寡核苷酸(PMO)缺口体的方法，其中该方法包括：
-将吗啉代单体附接至固体支持体，
-将第一吗啉代-二甲基氯氨基磷酸酯在固体支持体上与吗啉代单体偶联，从而产生5’-翼区域，
-将该5’-翼区域延长至第一个所需的核苷酸长度，
-将反向DNA-亚磷酰胺与该延长的5’-翼区域偶联，从而产生DNA缺口区域，
-将该DNA缺口区域延长至第二个所需的核苷酸长度，
-将吗啉代-氨基磷酸酯与该DNA缺口区域偶联，从而产生3’-翼区域
-用吗啉代-二甲基氯氨基磷酸酯将该3’-翼区域延长至最终所需的核苷酸长度，从而形成完全延长的立体无规的PMO-缺口体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中延长该5’-翼区域、该DNA缺口区域和/或该3’-翼区域进一步包括脱三苯甲基化步骤，其中该脱三苯甲基化步骤包括在3wt/v％三氯乙酸(TCA)在二氯甲烷(CH2Cl2)中的混合物中处理该延长的5’-翼区域、该延长的DNA缺口区域和/或该延长的3’-翼区域。
34.根据权利要求32所述的方法，其中延长该5’-翼区域和/或延长该3’-翼区域进一步包括中和该延长的5’-翼区域和/或该延长的3’-翼区域，其中该中和包括用比率为10∶45∶45的N，N-二异丙基乙胺(iPr2NEt)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)和CH2Cl2的混合物洗涤该延长的5’-翼区域和/或该延长的3’-翼区域。
35.根据权利要求32所述的方法，其中延长该5’-翼区域包括在DMI中的1，2，2，6，6-五甲基哌啶(PMP)的存在下，将吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与该延长的5’-翼区域的吗啉代单体偶联。
36.根据权利要求32所述的方法，其中延长该5’-翼区域进一步包括对该延长的5’-翼区域进行封端，其中该封端步骤包括将该延长的5’-翼区域与四氢呋喃(THF)、2，6-二甲基吡啶和乙酸酐(Ac2O)的混合物，16％1-甲基咪唑和THF的混合物，或其组合混合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中对该延长的5’-翼区域进行封端包括通过将该延长的5’-翼区域与吗啉在DMI中的0.4M溶液混合，从该延长的5’-翼区域去除Ac2O。
38.根据权利要求32所述的方法，其中延长该DNA缺口区域包括将反向DNA-亚磷酰胺与该延长的5’-翼区域在亚酰胺和5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)在乙腈中的混合物中偶联。
39.根据权利要求32所述的方法，其中延长该DNA缺口区域包括硫化步骤，其中该硫化步骤包括在((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1，2，4-二噻唑啉-3-硫酮(DDTT)在吡啶和乙腈中的混合物中处理该延长的DNA缺口区域。
40.根据权利要求32所述的方法，其中延长该DNA缺口区域进一步包括封端步骤，其中该封端步骤包括将该延长的DNA缺口区域与10vol％乙酸酐在THF中的混合物、比率为10∶80∶10(w/w/w)的1-甲基咪唑-THF-吡啶的混合物、或其组合混合。
41.根据权利要求32所述的方法，其中延长该3’-翼区域包括在DMI中的PMP的存在下，将吗啉代-二甲基氯氨基磷酸酯与该延长的3’-翼区域的吗啉代单体偶联。
42.根据权利要求32所述的方法，其中延长该3’-翼区域进一步包括对该延长的3’-翼区域进行封端，其中该封端步骤包括将该延长的3’-翼区域与THF、2，6-二甲基吡啶和Ac2O的混合物，16％1-甲基咪唑和THF的混合物，或其组合混合。
43.根据权利要求42所述的方法，其中延长该3’-翼区域包括从该延长的3’PMO-缺口体翼区域去除Ac2O，其中该Ac2O的去除包括将该延长的3’-翼区域与吗啉在DMI中的0.4M溶液混合。
44.根据权利要求32所述的方法，其中延长该3’-翼区域包括将该延长的3’-翼区域用CH2Cl2洗涤。
45.根据权利要求32所述的方法，其中该方法进一步包括从该固体支持体上切割该完全延长的立体无规的PMO-缺口体。
46.根据权利要求45所述的方法，其中该切割步骤包括将附接至该固体支持体的该完全延长的立体无规的PMO-缺口体与20vol％二乙胺在乙腈(CH3CN)中的混合物或比率为3∶1的28％氢氧化铵(NH4OH)和乙醇(EtOH)的混合物混合。
47.根据权利要求32所述的方法，其中该方法进一步包括通过反相液相色谱法纯化该完全延长的立体无规的PMO-缺口体。
48.根据权利要求32所述的方法，其中该方法进一步包括用脱盐步骤、阴离子交换步骤、浓缩步骤或其任何组合纯化该完全延长的立体无规的PMO-缺口体。
49.一种用于通过溶液相合成方法制备立体定义的聚吗啉代寡核苷酸(PMO)缺口体的方法，其中该方法包括：
-合成第一长度的立体定义的5’-片段，
-合成第二长度的立体定义的3’-片段，
-将该立体定义的5’-片段和该立体定义的3’-片段在溶液中偶联，以产生延长的立体特异性PMO-缺口体，
-使该延长的立体特异性PMO-缺口体脱保护，以及
-纯化该脱保护的、延长的立体特异性PMO-缺口体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中合成该立体定义的5’-片段进一步包括进行一系列步骤，这些步骤包括偶联步骤、脱保护步骤、活化步骤或其组合，直到合成该第一长度的立体定义的5’-片段。
51.根据权利要求50所述的方法，其中该系列的偶联步骤包括将立体定义的吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯与1-mer吗啉代或聚吗啉代寡核苷酸偶联。
52.根据权利要求50所述的方法，其中该系列的偶联步骤包括在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮中并且在1，2，2，6，6-五甲基哌啶(PMP)的存在下混合吗啉代-或反向DNA-二甲基氯氨基磷酸酯。
53.根据权利要求50所述的方法，其中该系列的偶联步骤包括在通过沉淀法完成偶联步骤后分离立体定义的5’-片段中间体。
54.根据权利要求53所述的方法，其中该沉淀法包括在偶联基本完成后向该偶联反应中添加甲基叔丁基醚、正庚烷、EtOAc或其组合。
55.根据权利要求50所述的方法，其中该系列的脱保护步骤包括在DCM、乙醇和三氟乙酸(TFA)的溶液中混合立体定义的5’-片段中间体。
56.根据权利要求50所述的方法，其中该系列的脱保护步骤包括在4-氰基吡啶/TFA在DCM/TFE/EtOH中的溶液中混合立体定义的5’-片段中间体。
57.根据权利要求55所述的方法，其中该系列的脱保护步骤进一步包括向DCM、乙醇和三氟乙酸(TFA)的脱保护溶液中添加甲基叔丁基醚、正庚烷和/或EtOAc，直到目标产物沉淀为TFA盐。
58.根据权利要求57所述的方法，该方法进一步包括：
任选地用MeOH，将该TFA盐溶解于DCM溶液中；
向该溶液中添加PMP，以及
通过添加由EtOAc、MTBE、和正庚烷组成的组中的至少一个成员，将该目标产物沉淀为游离碱。
59.根据权利要求50所述的方法，其中该系列的活化步骤包括在活化溶液中混合立体定义的5’-片段中间体，该活化溶液包含(2S，3aS，6R，7aS)-3a-甲基-2-((全氟苯基)硫代)-6-(丙-1-烯-2-基)六氢苯并[d][1，3，2]氧杂硫杂磷杂茂2-硫化物((-)-PSI试剂)或(2R，3aR，6S，7aR)-3a-甲基-2-((全氟苯基)硫代)-6-(丙-1-烯-2-基)六氢苯并[d][1，3，2]氧杂硫杂磷杂茂2-硫化物((+)-PSI试剂)。
60.根据权利要求59所述的方法，其中该活化溶液进一步包含分子筛、DBU、DMI、DCM、MeCN、和/或THF。
61.根据权利要求50所述的方法，其中该系列的活化步骤包括在包含2-氯-“螺环”-4，4-五亚甲基-1，3，2-氧硫杂磷杂环戊烷的活化溶液中混合立体定义的5’-片段中间体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中该活化溶液进一步包含二异丙基乙胺、THF、DCM和元素硫。
63.根据权利要求49所述的方法，其中合成该立体定义的3’-片段进一步包括进行一系列步骤，这些步骤包括合成立体定义的聚吗啉代寡聚物、碱基保护基团的脱保护步骤、N-保护步骤、5’-O-保护基团脱保护步骤、偶联步骤、DMT脱保护步骤或其组合，直到合成所需长度的立体定义的3’-片段。
64.根据权利要求63所述的方法，其中该系列的碱基保护基团的脱保护步骤包括在包含甲醇和/或28％氢氧化铵的脱保护溶液中混合立体定义的3’-片段中间体。
65.根据权利要求64所述的方法，其中该碱基保护基团的脱保护步骤进一步包括向该脱保护溶液中添加由EtOAc、MeCN、MTBE、及其组合组成的组中的至少一个成员，直到目标产物从溶液中沉淀出来。
66.根据权利要求65所述的方法，其中该系列的N-保护步骤包括在包含THF、水和甲醇的N-保护溶液中混合脱保护的立体定义的3’-片段中间体。
67.根据权利要求66所述的方法，其中该N-保护溶液进一步包含1，2，2，6，6-五甲基哌啶和3，5-双(三氟甲基)苯甲酰氯。
68.根据权利要求65所述的方法，其中该系列的5’-O-保护基团脱保护步骤包括在脱保护溶液中混合立体定义的3’-片段中间体，该脱保护溶液包含1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、吡啶、TEA、甲醇和/或三乙胺三氢氟酸盐(TEA-3HF)。
69.根据权利要求68所述的方法，其中该5’-O-保护基团脱保护步骤进一步包括向该脱保护溶液中添加由EtOAc、MeCN、EtOAc、MTBE、正庚烷、及其组合组成的组中的至少一个成员，直到该立体定义的3’-片段沉淀。
70.根据权利要求65所述的方法，其中该DNA偶联步骤包括将手性P(V)活化的核苷与包含立体定义的硫代磷酸酯键的脱氧核糖核苷酸和立体定义的聚吗啉代寡聚物中的任一种偶联。
71.根据权利要求66所述的方法，其中该系列的DNA偶联步骤包括将(+)-或(-)-PSI-缀合的核苷与包含立体定义的硫代磷酸酯键的立体定义的PMO-缺口体中间体或立体定义的PMO偶联以产生PMO-缺口体中间体。
72.根据权利要求71所述的方法，其中(+)-或(-)-PSI-缀合的核苷与包含立体定义的硫代磷酸酯键的立体定义的PMO-缺口体中间体或立体定义的PMO的偶联发生在1，3-二甲基-2-咪唑啉酮的溶液中。
73.根据权利要求71所述的方法，其中将该PMO-缺口体中间体通过沉淀纯化过程从该系列的DNA偶联步骤中分离。
74.根据权利要求73所述的方法，其中该沉淀纯化过程包括向EtOAc中添加该PMO-缺口体中间体的偶联反应溶液，然后添加MTBE和正庚烷的混合物，直到产物沉淀。
75.根据权利要求65所述的方法，其中该系列的DMT脱保护步骤包括在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇、2，2，2-三氟乙醇、DCM和/或三乙基硅烷的脱保护混合物中混合立体定义的3’-片段中间体。
76.根据权利要求75所述的方法，其中该DMT脱保护步骤进一步包括向该脱保护混合物中添加由EtOAc、甲基叔丁基醚、正庚烷及其组合组成的组中的一个成员，直到目标产物沉淀出来。
77.根据权利要求49所述的方法，其中该立体定义的5’-片段的第一长度为6-mer和5-mer中的一者，并且该立体定义的3’-片段的第二长度为12-mer、13-mer和14-mer中的一者。
78.根据权利要求77所述的方法，其中该12-mer、13-mer或14-mer立体定义的3’-片段进一步包含磷二酰胺连接的吗啉代单体和/或硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷。
79.根据权利要求78所述的方法，其中该5-mer或6-mer立体定义的5’-片段包含磷二酰胺连接的吗啉代单体和/或磷二酰胺连接的脱氧核糖核苷。
80.根据权利要求49所述的方法，其中该纯化步骤包括过滤沉淀物，洗涤沉淀物，干燥沉淀物，将溶液用硅胶色谱法纯化，过滤浆料，将该浆料或溶液离心，将该溶液用IEX-HPLC纯化，将溶液脱盐，将溶液冷冻干燥，和/或其组合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2019217682A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Ohio State Innovation Foundation Cyclic cell-penetrating peptides with one or more hydrophobic residues
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WO2024002006A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 大睿生物医药科技(上海)有限公司 具有增强的稳定性的核苷酸替代物
WO2024010870A2 (en) * 2022-07-07 2024-01-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. Crystalline monomers for preparing antisense oligonucleotides and methods of their preparation and use
WO2024015924A2 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 Entrada Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
CN113461733A (zh) 2015-08-05 2021-10-01 卫材R&D管理有限公司 用于制备均一低聚物的手性试剂
EP3515445A4 (en) 2016-09-20 2020-05-27 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate SYNTHESIS OF SKELETON AND CHIMERIC MODIFIED MORPHOLINO OLIGONUCLEOTIDES USING PHOSPHORAMIDITY CHEMISTRY
US20220175817A1 (en) * 2019-04-08 2022-06-09 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Pharmaceutical Composition for Treating Muscle Disease

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