CN117120081A

CN117120081A - 免疫原性融合蛋白

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Publication number: CN117120081A
Application number: CN202280027427.3A
Authority: CN
Inventors: 佩·博·佩德森费舍尔
Original assignee: Minervax Aps
Current assignee: Minervax Aps
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-11-24
Also published as: US20240173394A1; AU2022248869A1; CA3212987A1; IL307256A; EP4066854A1; BR112023019757A2; AU2022248869A9; WO2022207657A1; KR20230163500A; JP2024512722A; EP4313134A1; MX2023011502A

Abstract

本发明涉及一种免疫原性融合蛋白，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，该氨基酸序列由以下组成：i.由170个至178个氨基酸组成，优选地由174个至175个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO:7中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的第一氨基酸序列部分；ii.由165个至174个氨基酸组成，优选地由169个至170个氨基酸组成，并且与SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的第二氨基酸序列部分；以及任选地：iii.由1个至20个氨基酸组成并将第一氨基酸序列部分与第二氨基酸部分隔开的接头氨基酸序列部分。免疫原性融合蛋白优选地由335个至372个氨基酸组成，优选地由343个至353个氨基酸组成，更优选地由343个至347个氨基酸组成。本发明还涉及编码免疫原性融合蛋白的核酸分子；载体；宿主细胞；疫苗；以及针对B组链球菌感染的疫苗接种方法或治疗B组链球菌感染的方法。

Description

免疫原性融合蛋白

发明领域

本发明涉及微生物学以及疫苗技术领域，并且涉及能够赋予对B组链球菌(groupB Streptococcus)感染的免疫的免疫原性融合蛋白的开发。更具体地，本发明涉及一种免疫原性融合蛋白，所述免疫原性融合蛋白赋予对B组链球菌的侵入性菌株的免疫。它还涉及编码免疫原性融合蛋白的核酸分子；载体；宿主细胞；疫苗；以及针对B组链球菌感染的疫苗接种方法或治疗B组链球菌感染的方法。

发明背景

在新生儿期，B组链球菌(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))(GBS)是包括脑膜炎的侵入性细菌感染的主要原因。仅在美国，现在每年有约5000个由这种细菌引起的侵入性疾病的病例。这些感染具有约10％的总死亡率，并且很多幸存下来的婴儿具有永久性神经***后遗症。鉴于此，已经做出了大量的努力来寻找预防和治疗的方法以及来分析GBS藉以引起感染的机制。

GBS也可以引起奶牛中的乳腺炎，其是具有相当大的经济重要性的牛的疾病。针对GBS感染的疫苗的开发也因此在兽医学中是感兴趣的。

约20％的女性是GBS的***携带者，并且在由这种细菌引起的新生儿疾病中，来自母体生殖道的垂直传播可能是最常见的感染源。然而，出生时被GBS定植的婴儿中仅约1％受到严重感染的折磨。因此必然是除了出生时暴露于所述细菌以外的其他因素导致新生儿疾病的发展。

B组链球菌的菌株基于多糖荚膜的结构被分成九种血清型(Ia、Ib、以及II-VIII)。四种“经典的”血清型Ia、Ib、II、和III在正常菌群中的菌株之中以粗略地相等的比例存在，但是III型是临床上最重要的血清型，特别是因为III型引发了大多数脑膜炎的病例。因为荚膜是已知的毒力因子，已经对其进行了相当详细地研究，特别是在III型菌株中。已经做出努力以开发疫苗，其中III型多糖荚膜将是必要组分。

EP 0 866 133公开了能够保护受体不受B组链球菌引发的感染的疫苗。该发明涉及使用多糖和ε蛋白片段的组合。该发明还公开了流行病学数据表明类型特异性荚膜在对B组链球菌感染的免疫中起到重要作用(参见第7页第2-3行)。另外，在不同的蛋白与该申请中提到的多糖之间存在许多不同的组合，但是所有的权利要求都包含多糖，其示出该特定组分的重要性。然而，因为与人体组织的交叉反应，使用多糖荚膜作为疫苗可带来问题(Pritchard等人,Infect Immun 1992.60:1598)。如果人们可以开发基于蛋白而不是基于多糖的疫苗，这将因此是非常有价值的。

文献Gravekamp等人,Infection and Immunity,1997年12月,第5216-5221页公开了免疫原性的评估、以及阿尔法(α)C蛋白的重复单元数目和单独的N-末端部分的保护。发现免疫原性随着重复单元数目的增加而降低(参见图2B)。然而，在一个保护测定中还发现，与针对N-末端区域的抗体相比，针对重复单元区域的抗体是保护的主要原因(参见第5219页左列，倒数第6行，以及第5220页右列第26-29行)。

WO 9410317描述了GBS表面蛋白α蛋白在缀合物疫苗的开发中的用途。这种蛋白的缺点是它通常不被III型菌株表达，而III型菌株是许多严重的GBS感染的原因。因此，针对这些菌株的保护性免疫将不被α蛋白疫苗诱发。

WO 9421685描述了Rib蛋白在疫苗的开发中的用途，Rib蛋白是GBS表面蛋白。当与明矾一起施用时，这种蛋白引发免疫。然而，Rib蛋白具有缺点：它没有针对所有GBS菌株引起保护性免疫。

文献Lindahl等人，Nonimmunodominant Regions Are Effective As BuildingBlocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine,Cell Host&Microbe 2,427-434,2007年12月公开了包含B组链球菌表面蛋白Rib和AlpC的N-末端区域的融合蛋白。

类似地，WO 2008127179描述了融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到B组链球菌表面蛋白或其类似物、同源物、衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段的至少一种第二N-末端区域片段的B组链球菌表面蛋白或其类似物、同源物、衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段的至少一种第一N-末端区域片段，其中B组链球菌表面蛋白的第一和第二至少一种N-末端区域片段源自不同的B组链球菌菌株，并且其中融合蛋白能够引起针对B组链球菌的保护性免疫。

尽管适合GBS疾病预防的疫苗取得了进展，对适合于GBS感染的预防和治疗的另外的方法和疫苗仍然存在需求。因此，对探索能够引发针对广泛的GBS菌株的保护性免疫的疫苗策略仍存在需要。

因此，提供可以用在能够引发针对GBS感染的保护性免疫的疫苗中的免疫原性融合蛋白是本发明的主要目标。

提供引发针对许多临床重要的GBS菌株的保护性免疫的疫苗是本发明的进一步目标。

提供包含引发针对GBS感染的保护性免疫的单个或少数免疫原性融合蛋白的疫苗是本发明的另一目标。和包括许多蛋白的疫苗相比，单个或少数蛋白具有多种优势，例如生产成本和安全性。

本发明的另一个目标是提供能够提供针对GBS的改进的保护的免疫原性融合蛋白。

通过随后的发明描述，完成以上目标的每一个及其他目标的方法将变得明显。

发明概述

本发明基于本发明人对WO 2008127179中公开的融合蛋白的进一步工作。具体地，已经发现具有Rib和AlpC的N末端区域的较短氨基酸序列的免疫原性融合蛋白是合适的。这样的免疫原性融合蛋白可能更容易产生和用于疫苗接种。此外，如实施例4和5所示，这样的较短的融合蛋白将提供针对GBS的改进的保护，特别是通过提供针对内皮细胞黏附和/或侵袭的改进的保护。

另外，已经设计了编码免疫原性融合蛋白的密码子优化的对应核酸分子。这些可以在载体中提供。宿主细胞可以继而表达免疫原性融合蛋白或包含载体。免疫原性融合蛋白、核酸分子、载体和宿主细胞中的每一种都可以用于疫苗。免疫原性融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或疫苗可进一步用于针对B组链球菌感染的疫苗接种或治疗B组链球菌感染的方法。

因此，本发明的第一方面涉及包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的免疫原性融合蛋白，该氨基酸序列由以下组成：

i.由170个至178个氨基酸组成，优选地由174个至175个氨基酸组成，并且与SEQID NO:7中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的第一氨基酸序列部分；

ii.由165个至174个氨基酸组成，优选地由169个至170个氨基酸组成，并且与SEQID NO:14中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的第二氨基酸序列部分；以及任选地：

iii.由1个至20个氨基酸组成并将第一氨基酸序列部分与第二氨基酸部分隔开的接头氨基酸序列部分，

并且其中免疫原性融合蛋白优选地由335个至372个氨基酸组成，优选地由343个至353个氨基酸组成，更优选地由343个至347个氨基酸组成。

如上所述，免疫原性融合蛋白可以更容易产生和用于疫苗接种。免疫原性融合蛋白的优点是即使没有佐剂它也是免疫原性的，然而它也可以与佐剂诸如明矾或氢氧化铝(AlOH)一起使用以增加免疫原性。

免疫原性融合蛋白的另一个优点是，它可以与包含Alp1和Alp2的N-末端区域的另一种免疫原性融合蛋白组合。如实施例中看到的，当两种这样的免疫原性融合蛋白的组合用于免疫时，该组合对获得的抗体数量(抗体滴度)提供了协同作用。

下文将更详细地描述本发明。

附图简述

图1示出了在使用一剂单独的根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白，或其与根据本发明第五方面的疫苗所包含的另一免疫原性融合蛋白组合(以不同的剂量，有或没有佐剂)免疫后29天获得的IgG倍数增加。

图2示出了在使用第一剂量和第二剂量的单独的根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白，或其与根据本发明第五方面的疫苗所包含的另一免疫原性融合蛋白组合(以不同的剂量，有或没有佐剂氢氧化铝)免疫57天后获得的IgG倍数增加。

图3示出了小鼠幼仔在B组链球菌菌株BM110(8x 10³cfu)的新生小鼠细菌感染后的存活率。幼仔由用a)SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白与佐剂氢氧化铝(AlOH)一起、b)或对照(仅佐剂氢氧化铝)免疫的雌性小鼠产下。

图4A-图4E示出了在使用临床分离株和从使用SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白进行免疫获得的抗血清进行的人类上皮细胞侵袭研究中获得的结果。

图5A-图5C示出了根据WO2008127179的融合蛋白的表示，该融合蛋白包含根据SEQID NO:43的前导序列和根据SEQ ID NO:21的融合蛋白的较短氨基酸序列。

图6示出了SEQ ID NO:21的较短融合蛋白和α1β1-整联蛋白之间的相互作用。

发明详述

在本说明书中，除非另外指明，“一(a)”或“一(an)”意指“一种或更多种”。贯穿本说明书，任何和所有参考文献通过引用被特别并入本专利申请。

如以上，本发明的第一方面涉及包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的免疫原性融合蛋白，该氨基酸序列由以下组成：

术语“免疫原性的”旨在意指具有引发免疫应答的能力。本发明的免疫原性融合蛋白是免疫原性的并且其特征在于它引发针对至少含有所述免疫原性融合蛋白包含其N-末端区域的表面蛋白的GBS的保护性免疫应答的能力。引发针对B组链球菌的保护性免疫应理解为涵盖引发针对携带表面蛋白Rib和AlpC中的至少一种的B组链球菌的保护性免疫。“能够”意指免疫原性融合蛋白，如果以合适的剂量向具有免疫***的个体施用，则在该个体中引发保护性免疫。免疫原性融合蛋白优选地能够引发针对B组链球菌的保护性免疫。

与本发明有关的术语“保护性免疫”指的是在免疫期间被诱导的血清抗体和/或细胞毒性T细胞应答预防由诸如B组链球菌的传染性病原体(infectious agent)引起的疾病的能力。就是说，用本发明的疫苗免疫的脊椎动物将经历B组链球菌的有限的生长和传播。为了确定融合蛋白或疫苗是否诱导保护性免疫，可以使用本领域技术人员已知的技术。例如，为了确定用本发明的融合蛋白或疫苗的免疫是否诱导了针对B组链球菌感染的保护性免疫，可以用B组链球菌攻击免疫的测试动物，并且测量B组链球菌的生长和传播。例如为了确定保护性免疫是否被诱导，可以使用与下文实施例中描述的方法一致的方法。

为了本发明的目的，术语“融合蛋白”是指两个或更多个蛋白质区域或其片段的组装物。如上所述，免疫原性融合蛋白包含以下氨基酸序列(或优选地由以下氨基酸序列组成)，所述氨基酸序列由至少第一和第二氨基酸序列部分组成。这些部分分别与B组链球菌表面蛋白Rib和AlpC的N-末端区域相关。

组合氨基酸序列部分以获得融合蛋白可以通过将氨基酸序列部分在其一端或两端融合，即连接在一起(共价偶联、键合或连接，或缀合)，或通过将编码相应氨基酸序列部分的单独核酸分子连接在一起，从而当连接的核酸分子被翻译时产生单个连续表达产物来完成。

在融合蛋白中，第一和第二氨基酸序列部分可以被接头氨基酸序列部分隔开。

在本发明的上下文中，还设想通过交联氨基酸序列部分或通过在大分子结构上捕获它们来获得融合蛋白。

为了本发明的目的，术语“蛋白”指的是氨基酸的分子链。蛋白不具有特定长度，并且如果需要的话可以通过例如糖基化、酰胺化、羧基化或磷酸化在体内或体外被修饰。尤其，肽、寡肽和多肽包括在该定义内。

与本发明相关的术语“N-末端区域”指的是蛋白的N-末端区域(N)。

B组链球菌菌株，在本文也被称为GBS，是已知的并且可以从被感染的人类中分离。GBS是在美国新生儿败血症的最常见的原因，并且导致每年约5000病例。

命名“B组链球菌”源自链球菌已经基于在链球菌细胞表面上存在的特异性糖类抗原，被分成免疫组的事实。目前，A组至O组被识别。

在本发明书中还称为Rib和Rib蛋白的B组链球菌Rib蛋白是本领域已知的表面蛋白，并且例如在WO 9421685中所描述的。命名“Rib”是指：对蛋白酶、免疫、和B组的耐受性。Rib蛋白最初作为独特的95kDa蛋白从血清型III的B组链球菌菌株中被分离。Rib蛋白被引发了大多数脑膜炎的病例的血清型III的几乎全部临床重要的B组链球菌菌株表达，以及被诸如II的其他的血清型的一些菌株表达。此外，Rib被型III的高毒性克隆的全部菌株表达。已经设计出纯化蛋白Rib的方法并且已经证明针对这种蛋白的抗体保护免受表达蛋白Rib(关于进一步的详情，例如DNA和蛋白序列，参见WO 9421685)的菌株的致命的感染。

SEQ ID NO:7示出了Rib的较短的N-末端区域：

MAEVISGSAVTLNTNMTKNVQNGRAYIDLYDVKNGKIDPLQLITLNSPDLKAQYVIRQGGNYFTQPSELTTVGAASINYTVLKTDGSPHTKPDGQVDIINVSLTIYNSSALRDKIDEVKKKAEDPKWDEGSRDKVLISLDDIKTDIDNNPKTQSDIANKITEVTNLEKILVPRIP

编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核酸DNA分子在SEQ ID NO:1、3、5中示出，其中SEQ ID NO:3是为了在大肠杆菌(E.coli)中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:5是为了在灰仓鼠(Cricetulus griseu)(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的对应核酸RNA分子在SEQ ID NO:2、4、6中示出，其中SEQ ID NO:4是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:6是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

Rib的较短N-末端区域(即SEQ ID NO:7)，与在WO 2008127179中给出的Rib的N-末端的序列之间的差异是5个氨基酸长的前导序列GPLGS，SEQ ID NO:44。

B组链球菌AlpC蛋白，也称为α蛋白，是本领域已知的B组链球菌表面蛋白。WO9410317描述了包含α蛋白的结合疫苗组合物(conjugate vaccine composition)。如WO9410317中描述的天然B组链球菌AlpC前体蛋白具有108kDa的分子量。裂解41个氨基酸的推定信号序列产生104kDa的成熟蛋白质。(然而，注意，信号序列随后被示出为具有56个氨基酸残基的长度：Strlhammar-Carlemalm等人，J Exp Med 177,159 3；1993)。AlpC抗原的20kDa N-末端区域与先前描述的蛋白序列没有同源性，并且之后是占成熟蛋白的74％的一系列9个串联重复单元。每个重复单元(在此表示为“R”)是相同的，并且由82个氨基酸组成，具有约8500道尔顿的分子质量，每个重复单元由246个核苷酸编码。AlpC抗原的C-末端区域含有存在于许多革兰氏阳性表面蛋白中的细胞壁锚结构域基序。

SEQ ID NO:14示出了AlpC的较短的N-末端区域：

STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS

AlpC的较短N-末端区域(即SEQ ID NO:14)，与在WO 2008127179中给出的AlpC的N-末端的序列之间的差异是5个氨基酸长的前导序列GPLGS，SEQ ID NO:44。

编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列的核酸DNA分子在SEQ ID NO:8、10、12中示出，其中SEQ ID NO:10是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:12是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列的对应核酸RNA分子在SEQ ID NO:9、11、13中示出，其中SEQ ID NO:11是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:13是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

术语“序列同一性”代表在相同长度的两种氨基酸序列之间或在相同长度的两种核苷酸序列之间的同源性程度的定量测量。如果进行比较的两种序列不具有相同的长度，它们必需被对齐到最佳可能的配合。序列同一性可以，例如，通过BLAST程序例如BLASTP程序或BLASTN程序(Pearson W.R和D.J.Lipman(1988)PNAS USA 85:2444-2448)(www.ncbl.nlm.nlh.gov/BLAST)来计算。

优选地，免疫原性融合蛋白由以下氨基酸序列组成：

由170个至178个氨基酸组成，优选地由174个至175个氨基酸组成的第一氨基酸序列部分，与SEQ ID NO:7中示出的氨基酸序列的全长具有至少90％序列同一性。

由165个至174个氨基酸组成，优选地由169个至170个氨基酸组成的第二氨基酸序列部分，与SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列的全长具有至少90％序列同一性。

第一氨基酸序列部分应最多由178个氨基酸组成，诸如由170个至178个氨基酸组成，优选地由174个至175个氨基酸组成。如上所述，SEQ ID NO:7包含175个氨基酸。序列中的第一个M是任选的，因此在这些情况下导致174个氨基酸。

第一氨基酸序列部分与SEQ ID NO:7中示出的氨基酸序列具有至少90％、诸如至少95％、诸如至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

第二氨基酸序列部分应最多由174个氨基酸组成，诸如由165个至174个氨基酸组成，优选地由169个至170个氨基酸组成。如上所述，SEQ ID NO:14包含170个氨基酸。序列中的第一个A可以是任选的，因此在这些情况下导致169个氨基酸。

第二氨基酸序列部分与SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列具有至少90％、诸如至少95％、诸如至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

接头氨基酸序列部分是任选的。换句话说，接头氨基酸序列部分(如果包括)可以由0至20个氨基酸组成。接头氨基酸序列部分中的氨基酸可以随机选择，即获得无规卷曲形成。接头氨基酸序列部分(如果存在)将第一氨基酸序列部分与第二氨基酸部分隔开。换句话说，接头氨基酸序列部分被提供在第一氨基酸序列部分与第二氨基酸部分之间。

第一和第二氨基酸序列部分中的任一个可以在离第一和第二氨基酸序列部分中的另一个最远端提供有前导/尾随(leading/trailing)氨基酸序列部分。前导/尾随氨基酸序列部分可以包含一个或更多个氨基酸。

免疫原性融合蛋白优选地由335个至372个氨基酸组成，优选地由343个至353个氨基酸组成，更优选地由343个至347个氨基酸组成。

在根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白的优选实施方案中：

-第一氨基酸序列部分包含以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:7中示出的序列的氨基酸1-175或2-175，并且

-第二氨基酸序列部分包含以下或优选地由以下组成：SEQ DI NO:14中示出的序列的氨基酸1-170或2-170。

SEQ ID NO:7包含175个氨基酸。氨基酸2-175对应于SEQ ID NO:7中除第一个甲硫氨酸(M)之外的氨基酸序列。

在根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白的优选实施方案中，氨基酸序列包含接头氨基酸序列部分，并且接头氨基酸序列部分由1个至10个氨基酸组成，优选地由2个至5个氨基酸组成，更优选地由2个氨基酸组成，并且最优选地由氨基酸序列EF组成。

当接头氨基酸序列部分由氨基酸EF(谷氨酸-苯丙氨酸)组成时，则优选地第二氨基酸序列部分包含以下或优选地由以下组成：SEQ DI NO:14中示出的序列氨基酸2-170。

优选地，免疫原性融合蛋白与SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选地具有全部序列同一性。

在优选实施方案中，免疫原性融合蛋白由SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列组成，或可选地，免疫原性融合蛋白由SEQ ID NO:21的氨基酸2-347组成。

如关于图所示，这样的免疫原性融合蛋白比WO 2008127179中公开的免疫原性融合蛋白短，但具有良好的作用，并适合在针对GBS的疫苗中使用。

此外，如实施例4和5所示，这样的较短的氨基酸序列通过去除前导序列SEQ IDNO:43，将更有效和改进地提供针对GBS的保护，特别是通过提供更有效和/或改进的针对内皮细胞黏附和/或侵袭的保护。

SEQ ID NO:21对应于氨基酸序列：

MAEVISGSAVTLNTNMTKNVQNGRAYIDLYDVKNGKIDPLQLITLNSPDLKAQYVIRQGGNYFTQPSELTTVGAASINYTVLKTDGSPHTKPDGQVDIINVSLTIYNSSALRDKIDEVKKKAEDPKWDEGSRDKVLISLDDIKTDIDNNPKTQSDIANKITEVTNLEKILVPRIPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS

根据SEQ ID NO:21的较短融合蛋白，与WO 2008127179给出的融合蛋白的序列之间的差异是32个氨基酸长的前导序列：GPLGSASVLIGISFLGGFTQGQFNISTDTVFA-SEQ ID NO:43，该序列在SEQ ID NO:21中未发现。

在根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白的另一实施方案中，免疫原性融合蛋白通过糖基化、酰胺化、羧基化或磷酸化被修饰，或通过被缀合到如在下文的本发明第三方面进一步被描述的荚膜多糖或RSV抗原上被修饰。

这是有利的，因为这样的融合蛋白可以具有增强的免疫原性。不需要过度实验就可以使用以大幅度地增加融合蛋白的免疫原性的很多技术是本领域技术人员可获得的和已知的。例如，可以通过偶联到二硝基苯酚基团或阿散酸(arsanilic acid)，或通过用热和/或SDS变性来修饰融合蛋白。或者，融合蛋白可以偶联到免疫原性载体上。关于偶联策略中的一些一般考虑，参见Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory，E.Harlow和D.Lane编著(1988)。有用的免疫原性载体是本领域熟知的。这样载体的实例是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、诸如牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白的白蛋白、PPD(结核菌素纯化蛋白衍生物)、红细胞、破伤风类毒素、霍乱毒素、琼脂糖珠、活性炭、或膨润土。

在另外的实施方案中，免疫原性融合蛋白与荚膜多糖，优选地细菌多糖，更优选地B组链球菌多糖缀合。

多糖意指由单糖残基组成的任何线性的或支化的聚合物并因此包含寡糖，所述单糖残基通常通过糖苷键来连接。优选地，多糖将含有在2个和50个之间的单糖单元，更优选地在6个和30个之间的单糖单元。多糖组分可以基于或者源于来自许多诸如流感嗜血杆菌(H.influenzae)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌病原体的多糖荚膜的多糖组分。其他细菌(来自该细菌的多糖组分可以被缀合到本发明的融合蛋白)包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、和痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)。适合根据本发明的该方面使用的多糖组分包括Hib寡糖、来自铜绿假单胞菌的脂多糖、来自沙门氏菌的脂多糖和来自痢疾志贺氏菌的O-特异性多糖。

适合根据本发明使用的其他多糖组分将是本领域人员熟知的。

细菌荚膜多糖的片段可以通过任何合适的方法产生，例如通过酸水解或超声照射。多糖组分的制备的其他方法将是本领域人员熟知的。

多糖优选为来源于B组链球菌的荚膜多糖或其等同物。

多糖应优选通过共价连接被偶联到载体蛋白。偶联多糖和蛋白的特别优选地方法是通过还原胺化。其他方法包括：用溴化氰活化多糖，然后是与己二酸二酰肼(间隔物)反应，以及使用合适的碳化二亚胺缀合到载体蛋白的羰基基团；用己二酸二酰肼功能化载体蛋白，然后是偶联到溴化氰活化的多糖；载体蛋白和多糖的化学改性，然后是它们的偶联。

多糖分子可以通过间隔物分子例如己二酸被偶联到融合蛋白。可以使用这一间隔物分子来促进融合蛋白偶联到多糖。已经进行了偶联反应之后，可以通过渗滤或其他已知的方法来纯化缀合物以去除未反应的蛋白或多糖组分。

如果多糖是源自不同于GBS的细菌病原体，则缀合物可以引发针对两种或更多种病原体例如多种类型的细菌的免疫。这是免疫原性融合蛋白的潜在的重要的应用。

本发明的第二方面涉及包含编码根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白的多核苷酸的核酸分子。

这样的核酸分子可直接用于制备免疫原性融合蛋白，例如在从中分离和获得免疫原性融合蛋白的细胞培养物中，或间接用于制备免疫原性融合蛋白，例如在待表达免疫原性融合蛋白用于免疫的受试者中。

核酸分子可以是例如DNA分子或RNA分子。RNA分子可以是mRNA分子。

核酸分子可以包含以下或优选地由以下组成：与SEQ ID NO:1-6之一具有至少90％，诸如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％序列同一性的第一多核苷酸，该第一多核苷酸直接或经由接头多核苷酸序列与第二多核苷酸融合，该第二多核苷酸与SEQ ID NO:8-13之一具有至少90％，诸如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％的序列同一性。

接头多核苷酸序列是任选的，并且如果由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白在第一氨基酸序列部分和第二氨基酸序列部分之间提供接头，则包含接头多核苷酸序列。如果第一多核苷酸直接与第二多核苷酸融合，则核酸分子中不存在接头多核苷酸序列。

以上提及的SEQ ID NO:1-6中和SEQ ID NO:8-13的每一个可任选地通过去除编码由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白的第一氨基酸序列部分中的初始甲硫氨酸(M)和第二氨基酸序列部分中的初始丙氨酸(A)的前三个碱基来截短。

核酸分子可任选地包含一个或更多个终止密码子。

核酸分子可任选地包含一个或更多个起始密码子。

核酸分子可以是针对在特定生物体，诸如大肠杆菌或灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达密码子优化的。

在根据本发明第二方面的核酸分子的优选实施方案中，该核酸分子与SEQ ID NO:15-20之一示出的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。

优选地，核酸分子与SEQ ID NO:15-20之一示出的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％的序列同一性。这些优选实施方案中提及的SEQ ID NO:15-20中的每一个可以任选地通过去除编码由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白的第一氨基酸序列部分中的初始甲硫氨酸(M)的前三个碱基来截短。此外，这些优选实施方案中提及的SEQ ID NO:15-20中的每一个可以任选地通过去除两个终止密码子的最后1个至6个碱基来截短。这可以例如在核酸分子用作DNA或RNA疫苗时使用—转录和/或翻译将在核酸分子末端停止。

核酸分子可优选由1044个(不含初始M)至1047个碱基(含初始M)组成。

本发明的第三方面涉及包含根据本发明第二方面的核酸分子的载体。

在表达核酸分子时，可以采用各种各样的表达宿主/载体组合。用于真核宿主的有用的表达载体包括，例如，包含来自以下的表达控制序列的载体：SV40、牛***瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、和逆转录病毒。用于细菌宿主的有用的表达载体包括细菌质粒，例如那些来自大肠杆菌的细菌质粒，包括pBluescript、pGEX2T、pUC载体、col E1、pCR1、pBR322、pMB9和它们的衍生物；更广宿主范围质粒，例如RP4；噬菌体DNA，例如，许多λ噬菌体的衍生物，例如λGT10和λGT11，NM989，和其他的DNA噬菌体，例如M13和丝状单链DNA噬菌体。用于酵母细胞的有用的表达载体包括2μ质粒和其衍生物。用于昆虫细胞的有用的载体包括pVL 941。

另外，各种各样的表达控制序列中的任何一种都可以在这些载体中用于表达核酸分子。有用的表达控制序列包括与前述的表达载体的结构基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括，例如，SV40的或腺病毒的早期启动子和晚期启动子、lac***、trp***、TAC或TRC***、T3和T7启动子、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd包衣蛋白的控制区域、用于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶例如Pho5的启动子、酵母α-交配***的启动子、和已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其他组成型和诱导型启动子序列，及其各种组合。

本发明的第四方面涉及表达根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白，或者包含根据本发明第二方面的核酸分子或根据本发明第三方面的载体的宿主细胞。

宿主细胞可以是革兰氏阴性细菌细胞、***细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、非洲绿猴细胞、人类细胞或植物细胞。宿主细胞可选自由以下组成的组：大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、曲霉菌(aspergillus)、乳杆菌(lactobacillus)、志贺氏杆菌(shigella)、沙门氏菌(salmonella)、李斯特氏菌(listeria)、链球菌(streptococcus)、葡萄球菌(staphylococcus)和真菌。然而大肠杆菌是优选的。

另外，可以使用昆虫细胞诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9)、动物细胞诸如CHO和小鼠细胞、非洲绿猴细胞诸如COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10、人类细胞和组织培养的植物细胞。优选的宿主生物体包括细菌例如大肠杆菌和枯草杆菌(B.subtilis)，以及组织培养物中的哺乳动物细胞。

当宿主细胞用于产生免疫原性融合蛋白，或用于产生其第一和第二氨基酸序列部分，或用于产生接头氨基酸序列部分时，则可以使用包括以下的多种常规方法中的任何一种从微生物培养物或细胞培养物中分离产生的氨基酸序列部分并纯化：使用HPLC、FPLC等的液相层析例如正相液相层析或反相液相层析；亲和层析(诸如利用无机配体或单克隆抗体)；离子交换层析；尺寸排阻层析；固定化金属螯合层析；凝胶电泳；切向流动过滤等。本领域技术人员可以选择最合适的分离和纯化技术而不偏离本发明的范围。

另外，免疫原性融合蛋白、其第一和第二氨基酸序列部分或接头氨基酸序列部分可以通过几种化学技术中的任何一种产生。例如，它们可以使用固相合成技术制备，或者它们可以通过在溶液中合成来制备。

本发明的第五方面涉及包含以下的一种或更多种的疫苗：根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白、根据本发明第二方面的核酸分子、根据本发明第三方面的载体或根据本发明第四方面的宿主细胞。

免疫原性融合物、核酸分子、载体和/或宿主细胞中每一种的量优选为药学有效量，或能够引发针对B组链球菌的保护性免疫的量，或足以引发免疫应答的量。此外，该量可以是诸如足以减少并且最优选地防止接受疫苗的受试者的活性和响应出现临床显著缺陷的量。可选地，该量足以引起宿主或受试者临床上显著的状况的改善。

如本领域技术人员理解的，化合物的量可以根据它的比活性而改变。合适的剂量可以含有与必需的稀释剂即载体或添加剂结合的、被计算为产生期望的治疗效果的活性组合物的预先确定的量。此外，待施用的剂量将根据待使用的活性组分(the activeprinciple or principles to be used)、待治疗个体的年龄、重量等而改变。

该疫苗优选地能够引发针对B组链球菌的保护性免疫。

如附图所述，当向受试者施用时，免疫原性融合蛋白引发免疫应答。这样的免疫应答也可以通过将核酸分子作为用于随后转录和翻译以表达免疫原性融合蛋白的DNA核酸分子，或者作为用于翻译和表达免疫原性融合蛋白的RNA或mRNA核酸分子施用来间接获得。核酸分子可以在载体中提供用于增加转录和/或翻译控制，并且载体可以继而在宿主细胞中提供用于进一步控制和/或增加免疫原性融合蛋白的表达。

疫苗还可以包含药学上可接受的媒介物和任选的佐剂。术语“药学上可接受的媒介物”旨在意指在药物制剂中常用的任何合适的可接受的赋形剂、佐剂、载体、稀释剂。

疫苗可以涵盖疫苗组合物。

疫苗可以另外包含其他的药学上可接受的成分，诸如盐、缓冲液、免疫活性组分、佐剂(AlOH)、润湿剂、乳化和悬浮剂、或甜味剂、调味(flavouring)剂、芳香剂(perfumingagents)、或改进组合物功效所期望的其他物质。如果组合物的施用可以被受体个体耐受，组合物将被称为是“药学上可接受的”。

佐剂是可以用于特别地增强特异性免疫应答的物质。正常地，将佐剂和组合物在呈递给免疫***之前混合，或者将佐剂和组合物分别地呈递，但是它们进入被免疫的动物或人的相同的位点。根据佐剂的组成，可以将佐剂松散地分成若干组。这些组包含油佐剂(例如，弗氏完全和不完全佐剂)、矿物盐(例如，AlK(SO₄)₂、AlNa(SO₄)₂、AlNH₄(SO₄)、AlOH，二氧化硅、高岭土和碳)、多核苷酸(例如聚IC和聚AU酸)、和某些天然物质(例如来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的蜡D、以及在短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、或百日咳杆菌(Bordetella pertussis)，以及布鲁氏菌属(Brucella)的成员中发现的物质)。

Alhydrogel(例如，氢氧化铝，AlOH)是根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白的特别有效的佐剂，并且因此在根据本发明第五方面的疫苗中特别有用。

用于疫苗和疫苗组合物的制备和配制的方法是本领域技术人员熟知的。成分的选择将例如根据组合物的施用途径而变化。例如用于肠胃外施用的组合物包含无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液、和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、以及可注射的有机酯例如油酸乙酯。载体或封闭敷料可以被用于增加皮肤渗透性以及增强抗原吸收性。用于口服施用的液体剂型一般可以包含含有液体剂型的脂质体溶液。用于悬浮脂质体适合的形式包括含有本领域常用的惰性稀释剂例如纯净水的乳液、悬浮液、溶液、糖浆剂、和酏剂。

可以向人类或动物，包括哺乳动物和鸟类例如啮齿动物(小鼠、大鼠、豚鼠、或兔)、鸟类(火鸡、母鸡或小鸡)、其他农场动物(牛、马、猪或小猪)、宠物(狗、猫和其他宠物)、和人类，施用疫苗。虽然很多动物可以用本发明的疫苗来治疗，用于治疗的优选个体是人类、或有商业价值的动物、和牲畜例如鱼，诸如罗非鱼，和骆驼。

可以根据本领域已知的方法向个体施用疫苗。这样的方法包括例如肠胃外应用，诸如通过注射到皮肤或穿过皮肤的所有途径：例如肌肉内、静脉内、腹膜内、皮内、粘膜、粘膜下或皮下。同样，它们也可以通过表面应用(topical application)作为滴剂、喷雾剂、凝胶或软膏被应用至眼睛、鼻子、嘴巴、***、或***的黏膜上皮，或被应用到在身体的任何部位的外部皮肤的表皮上。其他可能的应用途径是使用通过经由呼吸道吸入的喷雾剂、气雾剂、或粉末应用。在该最后一种情况，使用的粒径将确定颗粒将渗透到呼吸道的深度。可选地，应用可以经由食物途径，通过与食物、饲料或饮用水结合例如作为粉末、液体、或片剂，或通过作为液体、凝胶、片剂、或胶囊直接施用在嘴中，或通过作为栓剂直接施用至***。

对于免疫的时间安排，存在很多不同的技术。可以多于一次施用疫苗或组分a-d，以增加由经免疫的动物表达的免疫球蛋白库的表达水平和多样性。通常，如果给予多于一次免疫，它们可以间隔一周到三个月，诸如间隔两周到两个月，诸如间隔一到两个月，或者间隔四周给予。

另外，可以施用疫苗或组分a-d的一次或可以更多次加强注射。优选地，可以在一次或更多次初始注射后的约1个月和6个月时施用加强注射。

根据本发明第五方面的疫苗可以优选地包含一种或更多种另外的免疫活性组分。另外的免疫活性组分可以是抗原、免疫增强物质、和/或疫苗；这些中的任一种可以包含佐剂。

因此，在根据本发明第五方面的疫苗的优选实施方案中，疫苗另外包含以下一种或更多种：

a)另一免疫原性融合蛋白，包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:42中示出的氨基酸序列具有至少90％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；

b)编码另一免疫原性融合蛋白的另一核酸分子，另一核酸分子优选地与SEQ IDNO:36-41之一中示出的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性；

c)包含另一核酸分子的另一载体；或

d)表达另一免疫原性融合蛋白或包含另一载体的另一宿主细胞。

如下面将进一步讨论的，另一免疫原性融合蛋白衍生自GBS表面蛋白Alp1和Alp2/3的N-末端区域，也如WO 2017/068112中公开的。如附图中示出并在下面讨论的，当使用包含免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白两者的疫苗时，存在协同作用。

此外，通过包含a-d的一种或更多种另外的组分，疫苗可以提供针对所有B组链球菌菌株的更宽覆盖的保护。

类似于以上描述的免疫原性融合蛋白，另一免疫原性融合蛋白可以由另一核酸分子、另一载体和另一宿主细胞间接表达。

a-d中每一种的量应优选为药学有效量，或能够引发针对B组链球菌的保护性免疫的量，或足以引发免疫应答的量，或至少足以增加对疫苗的一般免疫应答的量。

如上所述，另一免疫原性融合蛋白与SEQ ID NO:42中示出的氨基酸序列具有至少90％、诸如95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，该SEQ ID NO:42代表以下氨基酸序列：MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYSNPSEITTTGS ATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKWSDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL

编码SEQ ID NO:42的氨基酸序列的核酸DNA分子，即(b)所包含的，在SEQ ID NO:36、38和40中示出，其中SEQ ID NO:38是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:40是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

编码SEQ ID NO:42的氨基酸序列的对应核酸RNA分子在SEQ ID NO:37、39和41中示出，其中SEQ ID NO:39是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:41是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

如上提及的，另一免疫原性融合蛋白衍生自GBS表面蛋白Alp1和Alp2/3的N-末端区域。

Alp1蛋白也称为ε蛋白，并且是B组链球菌α蛋白样蛋白。

Alp1的N-末端区域的氨基酸序列由SEQ ID NO:28给出：

MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLP

编码SEQ ID NO:28的氨基酸序列的核酸DNA分子在SEQ ID NO:22、24和26中示出，其中SEQ ID NO:24是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:26是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

编码SEQ ID NO:28的氨基酸序列的对应核酸RNA分子在SEQ ID NO:23、25和27中示出，其中SEQ ID NO:25是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:27是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

Alp2蛋白是另一种α蛋白样蛋白。像家族的其他成员一样，Alp2蛋白具有N-末端结构域和若干朝向C-末端的重复的结构域。Alp2和Alp3的N-末端区域是相同的。Alp3是另一种α蛋白样蛋白，也称为R28。它与同样在酿脓链球菌(S.pyrogenes)中发现的R28蛋白非常相似。

Alp2的N-末端区域的氨基酸序列由SEQ ID NO:35给出：

STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYS

NPSEITTTGSATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKW

SDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL

编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的核酸DNA分子在SEQ ID NO:29、31和33中示出，其中SEQ ID NO:31是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:33是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的对应核酸RNA分子在SEQ ID NO:30、32和34中示出，其中SEQ ID NO:32是为了在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的，并且SEQ ID NO:34是为了在灰仓鼠(中国仓鼠卵巢)细胞中表达而进行密码子优化的。

因此，SEQ ID NO:42对应于通过由氨基酸EF组成的接头氨基酸序列部分融合至SEQ ID NO:35(Alp2/3的N末端)的SEQ ID NO:28(Alp1的N末端)。

因此，第二免疫原性融合蛋白可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含：

i.与SEQ ID NO:28中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的另一第一氨基酸序列部分；

ii.与SEQ ID NO:35中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的另一第二氨基酸序列部分；以及任选地：

iii.由1个至20个氨基酸组成并将另一第一氨基酸序列部分与另一第二氨基酸部分隔开的另一接头氨基酸序列部分。

在SEQ ID NO:28和42的每一个中，初始M可以是任选的。因此，在根据本发明第五方面的疫苗的优选实施方案中，疫苗包含：

a)根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白，其中该免疫原性融合蛋白由SEQ IDNO:21中示出的氨基酸序列组成，或可选地，其中所述免疫原性融合蛋白由SEQ ID NO:21的氨基酸2-347组成；以及

b)另一免疫原性融合蛋白，包含SEQ ID NO:42中示出的氨基酸序列，优选地由SEQID NO:42中示出的氨基酸序列组成，或可选地包含SEQ ID NO:42的氨基酸2-347，优选地由SEQ ID NO:42的氨基酸2-347组成。

在这些实施方案中，疫苗中优选不存在不同于所述免疫原性融合蛋白和所述另一免疫原性融合蛋白的其他蛋白质或氨基酸序列。

在根据本发明第五方面的疫苗的优选的实施方案中，疫苗还包含氢氧化铝作为佐剂。在这些实施方案中，疫苗优选地为药物组合物，并还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

本发明的第六方面涉及根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白、根据本发明第二方面的核酸分子、根据本发明第三方面的载体、根据本发明第四方面的宿主细胞或根据本发明第五方面的疫苗，用于i)针对B组链球菌感染的疫苗接种，或ii)治疗B组链球菌感染。

免疫原性融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞或疫苗可通过向有相应需要的受试者施用免疫原性融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞或疫苗用于这样的疫苗接种或治疗。

本发明对应的第七方面涉及i)针对B组链球菌感染的疫苗接种，或ii)治疗B组链球菌感染的方法，所述方法是通过向有相应需要的受试者施用根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白、根据本发明第二方面的核酸分子、根据本发明第三方面的载体、根据本发明第四方面的宿主细胞或根据本发明第五方面的疫苗。

本发明对应的第八方面涉及根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白、根据本发明第二方面的核酸分子、根据本发明第三方面的载体、根据本发明第四方面的宿主细胞在制备用于i)针对B组链球菌感染的疫苗接种或ii)治疗B组链球菌感染的药物组合物或药物(诸如疫苗)中的用途。

因此，根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白、根据本发明第二方面的核酸分子、根据本发明第三方面的载体、根据本发明第四方面的宿主细胞或根据本发明第五方面的疫苗可用于预防或治疗由B组链球菌引起的感染的方法。

早已提出使用疫苗的母体免疫预防作为潜在的途径，用于在母亲及婴儿中保护免受B组链球菌感染。

因此，在本发明第六、第七和第八方面的优选实施方案中，将根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白、根据本发明第二方面的核酸分子、根据本发明第三方面的载体、根据本发明第四方面的宿主细胞或根据本发明第五方面的疫苗向雌性人类受试者施用。

所述施用因此能够赋予人类雌性的未出生后代对GBS感染的免疫力。此外，如果雄性年龄较大，也可以对雄性进行施用。

根据该实施方案，在足以导致产生用于保护雌性和胎儿或新生儿(通过抗体穿过胎盘的被动转移)两者的抗体的时间和量的条件下，将免疫原性融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞或疫苗向非妊娠雌性或妊娠雌性施用。

与本发明有关的术语“预防或治疗”以其各种语法形式指预防、治愈、逆转、减弱、减轻、改善、抑制(inhibiting)、最小化、遏制(suppressing)、或停止(1)与B组链球菌感染相关的紊乱的有害影响、(2)紊乱进展、或(3)紊乱病原体(B组链球菌)。此外，预期术语“预防或治疗”包括个体对B组链球菌感染建立完全或部分免疫。

本发明的第九方面涉及一种用于预防或治疗由B组链球菌引起的感染的方法，该方法包括向有相应需要的个体施用有效量的抗体，该抗体是从第二个体暴露于根据本发明的第一至第五方面的免疫原性融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞或疫苗引发的。

根据这一方面，通过被动免疫，即回收引发的抗血清并直接提供给怀疑患有由B组链球菌引起的感染的接受者，赋予个体对B组链球菌的抗性或免疫力。预期这样的抗血清可以在足以使得抗血清将用来保护胎儿或新生儿(通过穿过胎盘的抗体的被动掺入)的时间和量的条件下施用给怀孕雌性(在分娩时或在分娩前)。

因此，可以在感染发作前(从而预防或减弱预期的感染)或实际感染开始之后，提供本发明的疫苗或抗血清。

本发明第十方面涉及生产免疫原性融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供根据本发明第四方面的宿主细胞，

-繁殖宿主细胞，

-纯化根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白，和

-获得免疫原性融合蛋白。

可选地可以在无细胞表达***中生产免疫原性融合蛋白。这样的***包含从适当的重组核酸表达的所有要素，所述重组核酸可操作地连接至将在该特定***中起作用的启动子。

实施例1-健康妇女的免疫

用单独的或与根据SEQ ID NO:42的另一免疫原性融合蛋白一起的由SEQ ID NO:21组成的免疫原性融合蛋白，并且在有或没有佐剂氢氧化铝的情况下，对成年健康女性进行免疫。

图1示出了在使用一剂单独的或与根据本发明第五方面的疫苗所包含的另一免疫原性融合蛋白组合的根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白(以不同的剂量，有或没有佐剂氢氧化铝)免疫后29天获得的IgG倍数增加。

在图1中，前7个结果是通过施用单独的或与佐剂氢氧化铝(0.5mg)一起的由SEQID NO:21组成的免疫原性融合蛋白而获得的。

如图1所示，氢氧化铝的使用是有益的，因为它将10μg剂量的IgG倍数增加提高到与50μg剂量的IgG倍数增加相似的值。类似地，50μg剂量与氢氧化铝一起提供了与250μg剂量相似的倍数增加。

图1进一步示出，当使用包含氢氧化铝以及根据SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白和根据SEQ ID NO:42的另一免疫原性融合蛋白两者的疫苗时，则25μg剂量的每种免疫原性融合蛋白提供与250μg剂量的根据SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白相比相同或更高倍数的增加。使用氢氧化铝和50μg每种免疫原性融合蛋白在第29天提供了最高的倍数增加。

图中给出了每个实验的受试者数量(n)。

图2示出了在使用第一剂量和第二剂量的单独的或与根据本发明第五方面的疫苗所包含的另一免疫原性融合蛋白组合的根据本发明第一方面的免疫原性融合蛋白(以不同的剂量，有或没有佐剂氢氧化铝)免疫57天后获得的IgG倍数增加。

在图2中，前7个实验是通过施用单独的或与佐剂氢氧化铝(0.5mg)一起的由SEQID NO:21组成的免疫原性融合蛋白而获得的。

如图2所示，50μg和100μg两个剂量的由SEQ ID NO:21组成的免疫原性融合蛋白与氢氧化铝一起提供了约100的倍数增加。然而，当使用包含氢氧化铝以及根据SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白和根据SEQ ID NO:42的另一免疫原性融合蛋白两者的疫苗时，观察到甚至更高的倍数增加，即使每种免疫原性融合蛋白的剂量仅为25μg或50μg。

图中给出了每个实验的受试者数量(n)。

实施例2-免疫雌性小鼠以保护幼仔

图3示出了小鼠幼仔在B组链球菌菌株BM110(8x 10³cfu)的新生儿细菌感染后的存活率。幼仔由用a)SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白与佐剂氢氧化铝(AlOH)一起、或b)对照(仅佐剂氢氧化铝)免疫的雌性小鼠产下。如在图3中观察到的，贯穿整个实验(感染后0-48小时)，用根据SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白(虚线)免疫的母鼠产下的小鼠幼仔比接受对照(虚线)的母鼠产下的小鼠幼仔具有显著更高的存活率。因此，当向雌性小鼠施用时，SEQ ID NO:21的免疫原性融合蛋白为这些雌性小鼠产下的小鼠幼仔提供了针对GBS感染和死亡的显著保护。因此，免疫原性融合蛋白提供了针对GBS感染和死亡的保护作用，类似于对Lindahl等人，Nonimmunodominant Regions Are Effective As BuildingBlocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine,Cell Host&Microbe 2,427-434,2007年12月的图2的图C和图E中的小鼠报告的保护作用。

实施例3-上皮细胞侵袭研究

图4A-图4E示出了在使用临床分离株和从使用SEQ ID NO:21的免疫原性融合物进行免疫获得的抗血清的人类上皮细胞侵袭研究中获得的结果。相应的条形示出了对照(无血清)、第0天的免疫前阶段(D0)和第57天的免疫后阶段(D57)的上皮细胞侵袭的相对百分比。示出了抑制内皮细胞侵袭的良好作用。因此，免疫原性融合蛋白提供了对上皮细胞侵袭的抑制作用，类似于Lindahl等人，Nonimmunodominant Regions Are Effective AsBuilding Blocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine,Cell Host&Microbe2,427-434,2007年12月的图3的图B中报告的。

因此，图1和图2示出了将免疫原性融合蛋白与另一融合蛋白一起施用是有利的，并且使用佐剂例如氢氧化铝也是有利的。

然而，在低剂量(10μg)和无佐剂的情况下，免疫原性融合蛋白也引发了免疫应答，例如IgG倍数增加。

此外，图3和图4A-图4E示出免疫原性融合蛋白提供了与对Lindahl等人Nonimmunodominant Regions Are Effective As Building Blocks In A StreptococcalFusion Protein Vaccine,Cell Host&Microbe 2,427-434,2007年12月和WO 2008127179中公开的免疫原性融合蛋白所观察到的相似的作用。

免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白(如果施用的话)中的每一种对于人类的剂量可以在10μg至250μg，诸如10μg至100μg，诸如15μg至75μg，优选地25μg至75μg，诸如25μg至50μg的范围内。

因此，在存在佐剂诸如氢氧化铝的情况下，免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白(如果施用的话)中的每一种对于人类的优选剂量在10μg至250μg、优选地10μg至150μg、优选地25μg至100μg或25μg至75μg的范围内。

如果免疫原性融合蛋白与另一免疫原性融合蛋白一起施用，并且是在存在佐剂诸如氢氧化铝的情况下，则每种融合蛋白的剂量优选地在15μg至75μg，优选地25μg至75μg，诸如25μg至50μg的范围内。

在不存在佐剂诸如氢氧化铝的情况下，则免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白(如果施用的话)中的每一种对于人类的剂量将为10μg至1000μg，优选地50μg至500μg，或优选地100μg至250μg。

如果免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白(如果施用的话)是通过施用对应的核酸分子、载体或宿主细胞来间接施用的，则对应的核酸分子、载体或宿主细胞的剂量优选选择为使得获得与将免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白(如果施用的话)直接施用给受试者时所获得的免疫应答相似的免疫应答。

优选地，重复免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白(如果施用的话)中的每一种的剂量。因此，免疫原性融合蛋白和另一免疫原性融合蛋白(如果施用的话)以第一剂量施用，并在第一剂量后一段时间作为第二剂量重复施用。第一剂量和第二剂量可以相隔一周到三个月，诸如相隔两周到两个月，诸如相隔一到两个月，或者相隔四周。

实施例4-根据SEQ ID NO:21的融合蛋白减少了对RibN末端保守区域的筛选

如最初所述，本发明基于对WO 2008127179中公开的融合蛋白的进一步工作。这项工作鉴定了免疫原性融合蛋白序列，SEQ ID NO:21，其比WO 2008127179中公开的免疫原性融合蛋白短，但具有良好的作用，并且适于在针对GBS的疫苗中使用，如上面讨论的附图中所示。

本实施例提供了对较短的免疫原性融合蛋白和WO 2008127179的融合蛋白之间的差异的进一步的见解。

具体地，序列之间的差异在于32个氨基酸长的前导序列：GPLGSASVLIGISFLGGFTQGQFNISTDTVFA–SEQ ID NO:43，该序列在SEQ ID NO:21中不存在。

对WO 2008127179的包含根据SEQ ID NO:43的前导序列的免疫原性融合蛋白的序列进行计算机模拟。模拟是基于分子动力学，其中***中的每个原子都被明确建模。相邻原子作用在每个原子上的力也被计算出来，并用于以短时间间隔(通常是飞秒)更新每个原子的相对位置。模拟产生一个分子轨迹，其中整个构象以指定的时间间隔被写出。

具体地，使用Alphafold2，版本v2.1.0，Jumper等人，Nature volume 596，Pages583-589(2021)制备WO 2008127179的全长融合蛋白的高质量模型。C-末端结构域，即AlpC的N-末端由于远离前导序列而被去除，留下包含32个氨基酸的前导序列(SEQ ID NO:43)并总共204个氨基酸的N-末端rib结构域。Gromacs 2021.5用于如下准备***：在立方晶胞中使用水(gmx溶剂化物)溶剂化Alphafold2模型，并添加离子使***中性(gmx genion)。通过限制重原子，然后进行平衡步骤(压力和温度(300K))，能量被最小化。在进行如下主要模拟之前，***被验证为处于稳态。全局***的分子运动被模拟100ns，增量时间为2fs，总共5000万步，并且每5000步存储***构象，从而产生具有10000个模型的轨迹。MDanalysisv2.0.0用于分析全局轨迹，验证rib结构域围绕基态振荡，指示分子在当前条件下是稳定的。重复分析三次(Sim1-3)。

作为部分结果，发现前导序列(氨基酸1-32)经历了大的构象变化，然后在约60ns后找到稳定的构象。使用Gromacs mindist(gmx mindist)计算前导序列之间的相互作用。为了发现前导序列和rib结构域之间紧密而稳定的相互作用，考虑了模拟的最后30ns(3000个模型)，并计算了在三个模拟中平均的至少30％的时间发生的相互作用(900个模型或更多模型中的相互作用)。此时的相互作用被定义为氨基酸的任何原子之间的最小距离为0.3nm或更小。结果在下面的表1中呈现，并在图5A中示出，其示出了表面表示的RibN末端，以及以球和棒表示的前导序列。RibN末端的表面表示已经从对应频繁接触(高比例)的白色覆盖为对应无或不频繁接触的黑色。

图5B示出了RibN末端(以卡通表示示出)和前导序列(以球和棒表示示出)的替代表示。RibN末端的卡通表示已经从对应频繁接触(高比例)的白色覆盖为对应无或不频繁接触的黑色。

另外，rib结构域的氨基酸保守性计算如下：从PatricBRC下载了144个完整的无乳链球菌基因组，并且在这些中使用blastp 2.9.0+发现了95个rib结构域。使用Musclev3.8.1551比对95个序列，并使用logomaker 0.8计算每个氨基酸的标准化信息内容。保守性评分在下表1中的保守性(Cons.)列中报告，并在图5C中示出，图5C示出了表面表示的RibN末端，以及以球和棒表示的前导序列。RibN末端的表面表示已经从对应高保守性评分的白色覆盖为对应无或低保守性评分的黑色。

表1

表1示出了前导序列(氨基酸1-32)和rib结构域(氨基酸33-204)之间的稳定相互作用。列出了在模拟的最后30ns中至少有30％的时间相互作用的前导序列和rib结构域之间的每个氨基酸对。每个前导序列氨基酸的最高比例加粗。估计并在“保守性”列中报告了氨基酸保守性。

如在表1中观察到的，四个结构元件对主导相互作用；第一个是最接近包裹在Rib结构域的主要β-折叠(129-133)上的结构域的前导序列链段(29-32)。第二个元件在与连接两个β-折叠的Rib结构域的环区域(126-127)相互作用的前导序列氨基酸23-26之间。第三个相互作用在与几个β-折叠(84，113，127)相互作用的前导序列氨基酸12-16之间。最后，前导序列的第一部分(1-5)与Rib结构域的环(90-93)相互作用。

这些相互作用对涉及Rib的N-末端具有高比例保守氨基酸的部分，该高比例显示这些部分对于Rib蛋白的预期目的是重要的，该预期目的是促进GBS细菌对细胞的感染。

因此，表1中的结果示出，WO 2008127179的RibN-AlpCN融合蛋白的32个氨基酸前导序列以非不显著程度包裹到融合蛋白的Rib部分的这些重要部分上并与之相互作用。因此，在时间上，即至少30％的时间，前导序列与这些部分相互作用并减少对这些部分的接近。因此，当用于引发免疫应答时，前导序列的存在会减少免疫***对Rib蛋白这些重要部分的接近。

相反，根据SEQ ID NO:21的较短的免疫原性融合蛋白不包含前导序列。因此，不会存在任何相互作用减少免疫***对这些重要部分的接近，并且作为结果将获得更好的免疫应答。

值得注意的是，前导序列和Rib结构域之间的相互作用发生在前导序列的不同氨基酸处。因此，WO 2008127179的免疫原性融合蛋白的缩短将在每种情况下为免疫***提供对免疫原性融合蛋白的RibN结构域的所有部分的减少的相互作用和更好的接近。因此，前导序列的微小缩短，诸如去除较少数量的氨基酸，也将为免疫***对免疫原性融合蛋白的RibN结构域提供更好的接近。

如图5A-图5C中示出的，前导序列与Rib N-末端的一个端帽相互作用。在下面的实施例5中研究了该观察的重要性。

实施例5-当Rib蛋白与α1β1-整联蛋白相互作用以黏附和侵袭上皮细胞时，通过前导序列筛选的Rib N-末端的保守区域参与了该相互作用。

研究了实施例4中发现的Rib的N-末端的保守区域的意义。假设保守区域可能参与促进上皮细胞的黏附和侵袭，注意到Rib是一种GBS表面蛋白，并且抗RibN的抗体提供了针对GBS感染的保护，包括上皮细胞侵袭。

α1β1-整联蛋白的α折叠结构从Bolduc等人，Microbiology(2007)，153，4039-4049中提及的序列获得，并进行了包含在根据SEQ ID NO:21的融合部分中的Rib的N末端与α1β1-整联蛋白之间的相互作用模拟。图6示出了结果，其中α1β1-整联蛋白以黑色表面表示示出，并且Rib的N-末端以浅灰色表面表示示出。在图6A中，Rib的N-末端以与图5A-图5C相似的方向示出。因此，虽然图6中没有示出，但前导序列将在Rib的N-末端的右端帽处提供。与图5A-图5C的比较进一步示出，实施例4中鉴定的保守区域参与与α1β1-整联蛋白的结合。结果进一步示出，N-末端与α1β1-整联蛋白的结构域2(冯·维勒布兰德因子，A型)和结构域3结合。

因此，实施例4和实施例5示出，前导序列与Rib的N-末端的保守区域相互作用并筛选该保守区域，该保守区域参与与α1β1-整联蛋白的结合，并且从而参与上皮细胞黏附和侵袭。

因此，由于前导序列的筛选作用，用具有前导序列的Rib的N-末端区域免疫将导致这些保守区域的减少的暴露。这将导致针对保守区域的免疫***和/或抗体应答效率较低。

相反，如果使用其中前导序列(SEQ ID NO:43)被去除或至少被缩短的Rib的N-末端进行免疫，单独使用这样的N末端或作为本发明第一方面的融合蛋白或SEQ ID NO:21的一部分，则这些保守区域将更容易被免疫***接近。因此，经免疫的宿主将更容易形成针对保守区域的抗体。更有效和完全地中和保守区域将增加针对通过α1β1-整联蛋白的上皮细胞黏附和侵袭的保护。

总之，使用根据本发明第一方面的融合蛋白，如通过SEQ ID NO:21举例说明的，其中Rib成分的前导序列(SEQ ID NO:43)被去除或至少被缩短，将提供针对GBS的改进的保护，特别是通过提供针对内皮细胞的黏附和/或侵袭的改进的保护。

序列表

<110> 米纳瓦克斯有限责任公司

<120> 免疫原性融合蛋白

<130> P30709PC

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 525

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 1

atggctgaag taatttcagg aagtgctgtt acgttaaaca caaatatgac taaaaatgtt 60

cagaatggta gagcatatat agatttatat gatgtgaaaa atgggaaaat agatccatta 120

caattaatta cgttaaattc acctgattta aaagctcagt atgtcattag gcaaggcggc 180

aattatttca cacaaccttc tgaattgact actgttggtg cagctagtat taattataca 240

gtattgaaga cagatggaag tcctcatacg aagcctgatg gacaagtgga tattataaac 300

gtttcattga ctatttacaa ttcttcagct ttgagagata aaatagatga agttaaaaag 360

aaagcggaag accctaaatg ggacgaggga agtcgcgata aagttttgat aagtttagat 420

gatatcaaaa cagatattga taataatcct aagacgcaat cagacattgc caataaaata 480

actgaagtta ctaatttaga aaaaatacta gtacctcgaa tccca 525

<210> 2

<211> 525

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 2

auggcugaag uaauuucagg aagugcuguu acguuaaaca caaauaugac uaaaaauguu 60

cagaauggua gagcauauau agauuuauau gaugugaaaa augggaaaau agauccauua 120

caauuaauua cguuaaauuc accugauuua aaagcucagu augucauuag gcaaggcggc 180

aauuauuuca cacaaccuuc ugaauugacu acuguuggug cagcuaguau uaauuauaca 240

guauugaaga cagauggaag uccucauacg aagccugaug gacaagugga uauuauaaac 300

guuucauuga cuauuuacaa uucuucagcu uugagagaua aaauagauga aguuaaaaag 360

aaagcggaag acccuaaaug ggacgaggga agucgcgaua aaguuuugau aaguuuagau 420

gauaucaaaa cagauauuga uaauaauccu aagacgcaau cagacauugc caauaaaaua 480

acugaaguua cuaauuuaga aaaaauacua guaccucgaa uccca 525

<210> 3

<211> 525

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 3

atggccgaag ttattagcgg tagcgcagtt accctgaata ccaatatgac caaaaatgtg 60

cagaatggcc gtgcctatat tgatctgtat gatgtgaaaa atggcaaaat cgatccgctg 120

cagctgatta ccctgaattc tccggatctg aaagcacagt atgttattcg tcagggtggt 180

aactatttta cccagccgag cgaactgacc accgttggtg cagcaagcat taactatacc 240

gttctgaaaa ccgatggtag tccgcatacc aaaccggatg gtcaggttga tattatcaat 300

gttagcctga ccatctataa tagcagcgca ctgcgtgata aaattgatga agtgaaaaag 360

aaagccgaag atccgaaatg ggatgaaggt agccgtgata aagttctgat tagcctggat 420

gatatcaaaa ccgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatattgc aaacaaaatt 480

accgaagtga ccaatctgga aaaaattctg gttccgcgta ttccg 525

<210> 4

<211> 525

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 4

auggccgaag uuauuagcgg uagcgcaguu acccugaaua ccaauaugac caaaaaugug 60

cagaauggcc gugccuauau ugaucuguau gaugugaaaa auggcaaaau cgauccgcug 120

cagcugauua cccugaauuc uccggaucug aaagcacagu auguuauucg ucaggguggu 180

aacuauuuua cccagccgag cgaacugacc accguuggug cagcaagcau uaacuauacc 240

guucugaaaa ccgaugguag uccgcauacc aaaccggaug gucagguuga uauuaucaau 300

guuagccuga ccaucuauaa uagcagcgca cugcgugaua aaauugauga agugaaaaag 360

aaagccgaag auccgaaaug ggaugaaggu agccgugaua aaguucugau uagccuggau 420

gauaucaaaa ccgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauauugc aaacaaaauu 480

accgaaguga ccaaucugga aaaaauucug guuccgcgua uuccg 525

<210> 5

<211> 525

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 5

atggccgaag tgatctccgg ctctgctgtg accctgaaca ccaacatgac caagaacgtg 60

cagaacggca gagcctacat cgacctgtac gatgtgaaga acggcaagat cgaccctctg 120

cagctgatca ccctgaactc tcccgatctg aaggcccagt acgtgatcag acaaggcggc 180

aactacttca cccagccttc cgagctgacc accgtgggag ccgcctctat caattacacc 240

gtgctgaaaa ccgacggctc ccctcacacc aagcctgatg gacaggtgga catcatcaac 300

gtgtccctga ccatctacaa cagcagcgcc ctgcgggaca agatcgatga agtgaagaag 360

aaggccgagg atcccaagtg ggacgagggc tctagagaca aggtgctgat ctccctggac 420

gacatcaaga ccgacatcga caacaacccc aagacacagt ccgatatcgc caacaagatc 480

accgaagtga ccaacctcga gaagatcctg gtgcctcgga tcccc 525

<210> 6

<211> 525

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 6

auggccgaag ugaucuccgg cucugcugug acccugaaca ccaacaugac caagaacgug 60

cagaacggca gagccuacau cgaccuguac gaugugaaga acggcaagau cgacccucug 120

cagcugauca cccugaacuc ucccgaucug aaggcccagu acgugaucag acaaggcggc 180

aacuacuuca cccagccuuc cgagcugacc accgugggag ccgccucuau caauuacacc 240

gugcugaaaa ccgacggcuc cccucacacc aagccugaug gacaggugga caucaucaac 300

gugucccuga ccaucuacaa cagcagcgcc cugcgggaca agaucgauga agugaagaag 360

aaggccgagg aucccaagug ggacgagggc ucuagagaca aggugcugau cucccuggac 420

gacaucaaga ccgacaucga caacaacccc aagacacagu ccgauaucgc caacaagauc 480

accgaaguga ccaaccucga gaagauccug gugccucgga ucccc 525

<210> 7

<211> 175

<212> PRT

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 7

Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu Asn Thr Asn Met

1 5 10 15

Thr Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val

20 25 30

Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr Leu Asn Ser Pro

35 40 45

Asp Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly Asn Tyr Phe Thr

50 55 60

Gln Pro Ser Glu Leu Thr Thr Val Gly Ala Ala Ser Ile Asn Tyr Thr

65 70 75 80

Val Leu Lys Thr Asp Gly Ser Pro His Thr Lys Pro Asp Gly Gln Val

85 90 95

Asp Ile Ile Asn Val Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Ser Ser Ala Leu Arg

100 105 110

Asp Lys Ile Asp Glu Val Lys Lys Lys Ala Glu Asp Pro Lys Trp Asp

115 120 125

Glu Gly Ser Arg Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp Asp Ile Lys Thr

130 135 140

Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Ala Asn Lys Ile

145 150 155 160

Thr Glu Val Thr Asn Leu Glu Lys Ile Leu Val Pro Arg Ile Pro

165 170 175

<210> 8

<211> 516

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 8

tctacaattc cagggagtgc agcgacctta aatacaagca tcactaaaaa tatacaaaac 60

ggaaatgctt acatagattt atatgatgta aaattaggta aaatagatcc attacaatta 120

attgttttag aacaaggttt tacagcaaag tatgttttta gacaaggtac taaatactat 180

ggggatgttt ctcagttgca gagtacagga agggctagtc ttacctataa tatatttggt 240

gaagatggac taccacatgt aaagactgat ggacaaattg atatagttag tgttgcttta 300

actatttatg attcaacaac cttgagggat aagattgaag aagttagaac gaatgcaaac 360

gatcctaagt ggacggaaga aagtcgtact gaggttttaa caggattaga tacaattaag 420

acagatattg ataataatcc taagacgcaa acagatattg atagtaaaat tgttgaggtt 480

aatgaattag agaaattgtt agtattgtca taataa 516

<210> 9

<211> 516

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 9

ucuacaauuc cagggagugc agcgaccuua aauacaagca ucacuaaaaa uauacaaaac 60

ggaaaugcuu acauagauuu auaugaugua aaauuaggua aaauagaucc auuacaauua 120

auuguuuuag aacaagguuu uacagcaaag uauguuuuua gacaagguac uaaauacuau 180

ggggauguuu cucaguugca gaguacagga agggcuaguc uuaccuauaa uauauuuggu 240

gaagauggac uaccacaugu aaagacugau ggacaaauug auauaguuag uguugcuuua 300

acuauuuaug auucaacaac cuugagggau aagauugaag aaguuagaac gaaugcaaac 360

gauccuaagu ggacggaaga aagucguacu gagguuuuaa caggauuaga uacaauuaag 420

acagauauug auaauaaucc uaagacgcaa acagauauug auaguaaaau uguugagguu 480

aaugaauuag agaaauuguu aguauuguca uaauaa 516

<210> 10

<211> 516

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 10

agcaccattc cgggtagcgc agcaacactg aatacaagca ttaccaaaaa cattcagaac 60

ggcaacgcat atatcgatct gtacgacgtt aaactgggta aaattgatcc tctgcaactg 120

atcgttctgg aacagggttt taccgcaaaa tatgtgtttc gtcagggcac caaatactat 180

ggtgatgtta gccagctgca gagcaccggt cgtgcaagcc tgacctataa catttttggt 240

gaagatggtc tgccgcatgt taaaaccgat ggccagattg atatcgttag cgttgcactg 300

acgatttatg atagcaccac cctgcgcgat aaaatcgaag aagttcgtac caacgcaaac 360

gatcctaaat ggaccgaaga aagccgtacc gaagttctga ccggtctgga taccattaaa 420

acggatatcg acaataatcc taaaacgcag acagatattg atagcaaaat tgtggaagtg 480

aatgaactgg aaaaactgct ggttctgagc taataa 516

<210> 11

<211> 516

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 11

agcaccauuc cggguagcgc agcaacacug aauacaagca uuaccaaaaa cauucagaac 60

ggcaacgcau auaucgaucu guacgacguu aaacugggua aaauugaucc ucugcaacug 120

aucguucugg aacaggguuu uaccgcaaaa uauguguuuc gucagggcac caaauacuau 180

ggugauguua gccagcugca gagcaccggu cgugcaagcc ugaccuauaa cauuuuuggu 240

gaagaugguc ugccgcaugu uaaaaccgau ggccagauug auaucguuag cguugcacug 300

acgauuuaug auagcaccac ccugcgcgau aaaaucgaag aaguucguac caacgcaaac 360

gauccuaaau ggaccgaaga aagccguacc gaaguucuga ccggucugga uaccauuaaa 420

acggauaucg acaauaaucc uaaaacgcag acagauauug auagcaaaau uguggaagug 480

aaugaacugg aaaaacugcu gguucugagc uaauaa 516

<210> 12

<211> 516

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 12

agcacaatcc ctggatctgc cgccacactg aacacctcta tcaccaagaa catccagaat 60

gggaacgctt acatcgatct ctacgacgtc aagctgggca agattgatcc cctccagctc 120

atcgtgctgg aacagggctt caccgccaaa tacgtgttcc ggcagggcac caagtactac 180

ggggatgtgt cacagctgca gtccaccggc agagcttccc tgacctacaa catcttcggc 240

gaggatggcc tgcctcacgt gaaaacagat ggccagatcg acatcgtgtc tgtggctctg 300

acaatctacg actccaccac actgcgcgat aagattgagg aagtgcggac caacgccaac 360

gatcctaagt ggaccgagga atccagaacc gaggtgctga ccggcctgga caccattaag 420

acagatattg ataacaatcc taagactcag acagacatcg attccaagat cgtggaagtc 480

aacgagctgg aaaagctgct ggtgctgtcc tgatga 516

<210> 13

<211> 516

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 13

agcacaaucc cuggaucugc cgccacacug aacaccucua ucaccaagaa cauccagaau 60

gggaacgcuu acaucgaucu cuacgacguc aagcugggca agauugaucc ccuccagcuc 120

aucgugcugg aacagggcuu caccgccaaa uacguguucc ggcagggcac caaguacuac 180

ggggaugugu cacagcugca guccaccggc agagcuuccc ugaccuacaa caucuucggc 240

gaggauggcc ugccucacgu gaaaacagau ggccagaucg acaucguguc uguggcucug 300

acaaucuacg acuccaccac acugcgcgau aagauugagg aagugcggac caacgccaac 360

gauccuaagu ggaccgagga auccagaacc gaggugcuga ccggccugga caccauuaag 420

acagauauug auaacaaucc uaagacucag acagacaucg auuccaagau cguggaaguc 480

aacgagcugg aaaagcugcu ggugcugucc ugauga 516

<210> 14

<211> 170

<212> PRT

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 14

Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys

1 5 10 15

Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Leu

20 25 30

Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Val Leu Glu Gln Gly Phe Thr

35 40 45

Ala Lys Tyr Val Phe Arg Gln Gly Thr Lys Tyr Tyr Gly Asp Val Ser

50 55 60

Gln Leu Gln Ser Thr Gly Arg Ala Ser Leu Thr Tyr Asn Ile Phe Gly

65 70 75 80

Glu Asp Gly Leu Pro His Val Lys Thr Asp Gly Gln Ile Asp Ile Val

85 90 95

Ser Val Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Thr Leu Arg Asp Lys Ile

100 105 110

Glu Glu Val Arg Thr Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Thr Glu Glu Ser

115 120 125

Arg Thr Glu Val Leu Thr Gly Leu Asp Thr Ile Lys Thr Asp Ile Asp

130 135 140

Asn Asn Pro Lys Thr Gln Thr Asp Ile Asp Ser Lys Ile Val Glu Val

145 150 155 160

Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Ser

165 170

<210> 15

<211> 1047

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 15

atggctgaag taatttcagg aagtgctgtt acgttaaaca caaatatgac taaaaatgtt 60

cagaatggta gagcatatat agatttatat gatgtgaaaa atgggaaaat agatccatta 120

caattaatta cgttaaattc acctgattta aaagctcagt atgtcattag gcaaggcggc 180

aattatttca cacaaccttc tgaattgact actgttggtg cagctagtat taattataca 240

gtattgaaga cagatggaag tcctcatacg aagcctgatg gacaagtgga tattataaac 300

gtttcattga ctatttacaa ttcttcagct ttgagagata aaatagatga agttaaaaag 360

aaagcggaag accctaaatg ggacgaggga agtcgcgata aagttttgat aagtttagat 420

gatatcaaaa cagatattga taataatcct aagacgcaat cagacattgc caataaaata 480

actgaagtta ctaatttaga aaaaatacta gtacctcgaa tcccagaatt ctctacaatt 540

ccagggagtg cagcgacctt aaatacaagc atcactaaaa atatacaaaa cggaaatgct 600

tacatagatt tatatgatgt aaaattaggt aaaatagatc cattacaatt aattgtttta 660

gaacaaggtt ttacagcaaa gtatgttttt agacaaggta ctaaatacta tggggatgtt 720

tctcagttgc agagtacagg aagggctagt cttacctata atatatttgg tgaagatgga 780

ctaccacatg taaagactga tggacaaatt gatatagtta gtgttgcttt aactatttat 840

gattcaacaa ccttgaggga taagattgaa gaagttagaa cgaatgcaaa cgatcctaag 900

tggacggaag aaagtcgtac tgaggtttta acaggattag atacaattaa gacagatatt 960

gataataatc ctaagacgca aacagatatt gatagtaaaa ttgttgaggt taatgaatta 1020

gagaaattgt tagtattgtc ataataa 1047

<210> 16

<211> 1047

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 16

auggcugaag uaauuucagg aagugcuguu acguuaaaca caaauaugac uaaaaauguu 60

cagaauggua gagcauauau agauuuauau gaugugaaaa augggaaaau agauccauua 120

caauuaauua cguuaaauuc accugauuua aaagcucagu augucauuag gcaaggcggc 180

aauuauuuca cacaaccuuc ugaauugacu acuguuggug cagcuaguau uaauuauaca 240

guauugaaga cagauggaag uccucauacg aagccugaug gacaagugga uauuauaaac 300

guuucauuga cuauuuacaa uucuucagcu uugagagaua aaauagauga aguuaaaaag 360

aaagcggaag acccuaaaug ggacgaggga agucgcgaua aaguuuugau aaguuuagau 420

gauaucaaaa cagauauuga uaauaauccu aagacgcaau cagacauugc caauaaaaua 480

acugaaguua cuaauuuaga aaaaauacua guaccucgaa ucccagaauu cucuacaauu 540

ccagggagug cagcgaccuu aaauacaagc aucacuaaaa auauacaaaa cggaaaugcu 600

uacauagauu uauaugaugu aaaauuaggu aaaauagauc cauuacaauu aauuguuuua 660

gaacaagguu uuacagcaaa guauguuuuu agacaaggua cuaaauacua uggggauguu 720

ucucaguugc agaguacagg aagggcuagu cuuaccuaua auauauuugg ugaagaugga 780

cuaccacaug uaaagacuga uggacaaauu gauauaguua guguugcuuu aacuauuuau 840

gauucaacaa ccuugaggga uaagauugaa gaaguuagaa cgaaugcaaa cgauccuaag 900

uggacggaag aaagucguac ugagguuuua acaggauuag auacaauuaa gacagauauu 960

gauaauaauc cuaagacgca aacagauauu gauaguaaaa uuguugaggu uaaugaauua 1020

gagaaauugu uaguauuguc auaauaa 1047

<210> 17

<211> 1047

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 17

atggccgaag ttattagcgg tagcgcagtt accctgaata ccaatatgac caaaaatgtg 60

cagaatggcc gtgcctatat tgatctgtat gatgtgaaaa atggcaaaat cgatccgctg 120

cagctgatta ccctgaattc tccggatctg aaagcacagt atgttattcg tcagggtggt 180

aactatttta cccagccgag cgaactgacc accgttggtg cagcaagcat taactatacc 240

gttctgaaaa ccgatggtag tccgcatacc aaaccggatg gtcaggttga tattatcaat 300

gttagcctga ccatctataa tagcagcgca ctgcgtgata aaattgatga agtgaaaaag 360

aaagccgaag atccgaaatg ggatgaaggt agccgtgata aagttctgat tagcctggat 420

gatatcaaaa ccgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatattgc aaacaaaatt 480

accgaagtga ccaatctgga aaaaattctg gttccgcgta ttccggaatt tagcaccatt 540

ccgggtagcg cagcaacact gaatacaagc attaccaaaa acattcagaa cggcaacgca 600

tatatcgatc tgtacgacgt taaactgggt aaaattgatc ctctgcaact gatcgttctg 660

gaacagggtt ttaccgcaaa atatgtgttt cgtcagggca ccaaatacta tggtgatgtt 720

agccagctgc agagcaccgg tcgtgcaagc ctgacctata acatttttgg tgaagatggt 780

ctgccgcatg ttaaaaccga tggccagatt gatatcgtta gcgttgcact gacgatttat 840

gatagcacca ccctgcgcga taaaatcgaa gaagttcgta ccaacgcaaa cgatcctaaa 900

tggaccgaag aaagccgtac cgaagttctg accggtctgg ataccattaa aacggatatc 960

gacaataatc ctaaaacgca gacagatatt gatagcaaaa ttgtggaagt gaatgaactg 1020

gaaaaactgc tggttctgag ctaataa 1047

<210> 18

<211> 1047

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 18

auggccgaag uuauuagcgg uagcgcaguu acccugaaua ccaauaugac caaaaaugug 60

cagaauggcc gugccuauau ugaucuguau gaugugaaaa auggcaaaau cgauccgcug 120

cagcugauua cccugaauuc uccggaucug aaagcacagu auguuauucg ucaggguggu 180

aacuauuuua cccagccgag cgaacugacc accguuggug cagcaagcau uaacuauacc 240

guucugaaaa ccgaugguag uccgcauacc aaaccggaug gucagguuga uauuaucaau 300

guuagccuga ccaucuauaa uagcagcgca cugcgugaua aaauugauga agugaaaaag 360

aaagccgaag auccgaaaug ggaugaaggu agccgugaua aaguucugau uagccuggau 420

gauaucaaaa ccgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauauugc aaacaaaauu 480

accgaaguga ccaaucugga aaaaauucug guuccgcgua uuccggaauu uagcaccauu 540

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gaacaggguu uuaccgcaaa auauguguuu cgucagggca ccaaauacua uggugauguu 720

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cugccgcaug uuaaaaccga uggccagauu gauaucguua gcguugcacu gacgauuuau 840

gauagcacca cccugcgcga uaaaaucgaa gaaguucgua ccaacgcaaa cgauccuaaa 900

uggaccgaag aaagccguac cgaaguucug accggucugg auaccauuaa aacggauauc 960

gacaauaauc cuaaaacgca gacagauauu gauagcaaaa uuguggaagu gaaugaacug 1020

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<210> 19

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<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 19

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<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 20

auggccgaag ugaucuccgg cucugcugug acccugaaca ccaacaugac caagaacgug 60

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<210> 21

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<212> PRT

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 21

Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu Asn Thr Asn Met

1 5 10 15

Thr Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val

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Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr Leu Asn Ser Pro

35 40 45

Asp Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly Asn Tyr Phe Thr

50 55 60

Gln Pro Ser Glu Leu Thr Thr Val Gly Ala Ala Ser Ile Asn Tyr Thr

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Val Leu Lys Thr Asp Gly Ser Pro His Thr Lys Pro Asp Gly Gln Val

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Asp Ile Ile Asn Val Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Ser Ser Ala Leu Arg

100 105 110

Asp Lys Ile Asp Glu Val Lys Lys Lys Ala Glu Asp Pro Lys Trp Asp

115 120 125

Glu Gly Ser Arg Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp Asp Ile Lys Thr

130 135 140

Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Ala Asn Lys Ile

145 150 155 160

Thr Glu Val Thr Asn Leu Glu Lys Ile Leu Val Pro Arg Ile Pro Glu

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Phe Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr

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Lys Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys

195 200 205

Leu Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Val Leu Glu Gln Gly Phe

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Thr Ala Lys Tyr Val Phe Arg Gln Gly Thr Lys Tyr Tyr Gly Asp Val

225 230 235 240

Ser Gln Leu Gln Ser Thr Gly Arg Ala Ser Leu Thr Tyr Asn Ile Phe

245 250 255

Gly Glu Asp Gly Leu Pro His Val Lys Thr Asp Gly Gln Ile Asp Ile

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Val Ser Val Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Thr Leu Arg Asp Lys

275 280 285

Ile Glu Glu Val Arg Thr Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Thr Glu Glu

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Ser Arg Thr Glu Val Leu Thr Gly Leu Asp Thr Ile Lys Thr Asp Ile

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Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Thr Asp Ile Asp Ser Lys Ile Val Glu

325 330 335

Val Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Ser

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<210> 22

<211> 519

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 22

atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt 60

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aatctgattg ttctgcctcc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt 180

cgcattttca ccaatgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac 240

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ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag 360

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cgcauuuuca ccaauguuaa ucagcugcag acaccgggua cagcaaccau uaccuauaac 240

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<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

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<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

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<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

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<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 28

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<211> 522

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<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

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<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

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<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

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agcacaatcc ctggatctgc cgccacactg aacacctcca tcaccaagaa tatccagaac 60

gggaacgctt acatcgacct gtatgatgtc aagaacgggc tgatcgatcc ccagaatctg 120

attgtgctca acccctcctc ctactctgct aattactata ttaagcaggg cgccaagtac 180

tactctaacc cctccgagat caccaccacc ggctccgcca ccatcacatt caatattctg 240

gatgagacag gcaaccctca caagaaggct gacggacaga ttgacattgt gtctgtgaac 300

ctgaccatct acgattccac cgctctgcgg aaccggatcg atgaagtgat caacaacgct 360

aatgacccta agtggagtga cggctccaga gatgaggtgc tgaccggcct ggaaaagatc 420

aagaaggata tcgataacaa tcctaaaact cagatcgata ttgacaacaa gatcaacgaa 480

gtcaacgaga tcgagaagct cctggtcgtg tctctgtgat ga 522

<210> 34

<211> 522

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 34

agcacaaucc cuggaucugc cgccacacug aacaccucca ucaccaagaa uauccagaac 60

gggaacgcuu acaucgaccu guaugauguc aagaacgggc ugaucgaucc ccagaaucug 120

auugugcuca accccuccuc cuacucugcu aauuacuaua uuaagcaggg cgccaaguac 180

uacucuaacc ccuccgagau caccaccacc ggcuccgcca ccaucacauu caauauucug 240

gaugagacag gcaacccuca caagaaggcu gacggacaga uugacauugu gucugugaac 300

cugaccaucu acgauuccac cgcucugcgg aaccggaucg augaagugau caacaacgcu 360

aaugacccua aguggaguga cggcuccaga gaugaggugc ugaccggccu ggaaaagauc 420

aagaaggaua ucgauaacaa uccuaaaacu cagaucgaua uugacaacaa gaucaacgaa 480

gucaacgaga ucgagaagcu ccuggucgug ucucugugau ga 522

<210> 35

<211> 172

<212> PRT

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 35

Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys

1 5 10 15

Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Asn

20 25 30

Gly Leu Ile Asp Pro Gln Asn Leu Ile Val Leu Asn Pro Ser Ser Tyr

35 40 45

Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Ala Lys Tyr Tyr Ser Asn Pro

50 55 60

Ser Glu Ile Thr Thr Thr Gly Ser Ala Thr Ile Thr Phe Asn Ile Leu

65 70 75 80

Asp Glu Thr Gly Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Gly Gln Ile Asp Ile

85 90 95

Val Ser Val Asn Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Leu Arg Asn Arg

100 105 110

Ile Asp Glu Val Ile Asn Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser Asp Gly

115 120 125

Ser Arg Asp Glu Val Leu Thr Gly Leu Glu Lys Ile Lys Lys Asp Ile

130 135 140

Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ile Asp Ile Asp Asn Lys Ile Asn Glu

145 150 155 160

Val Asn Glu Ile Glu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu

165 170

<210> 36

<211> 1047

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 36

atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt 60

agcggtggca aagcctatat cgacatctat gatgtgaaaa acggcaaaat tgatccgctg 120

aatctgattg ttctgcctcc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt 180

cgcattttca ccaatgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac 240

attctggatg aaaatggcaa cccgtatacc aaaagtgatg gccagattga tattgttagc 300

ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag 360

aatgccaacg acccgaaatg gtcagatgat agccgtaaag atgttctgag caaaatcgag 420

gtgatcaaaa acgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatatcga caacaaaatt 480

gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccgg aatttagcac cattccgggt 540

tcagcagcca cactgaatac cagcattacc aaaaacattc agaatggcaa cgcctacatt 600

gatctgtacg atgtaaaaaa tggtctgatc gatccgcaga acctgatcgt gctgaatccg 660

agcagctatt cagccaatta ttatattaaa caaggcgcaa aatactatag caacccgagc 720

gaaattacca ccaccggtag cgccaccatt acgtttaata tcctggacga aaccggtaac 780

ccgcataaaa aagcagatgg tcaaattgat atcgtgagcg ttaacctgac gatttatgat 840

agcacagccc tgcgtaatcg tattgatgaa gtgattaata acgcgaatga tcctaaatgg 900

tccgatggta gtcgtgatga agtactgacc ggtctggaaa aaatcaaaaa agacatcgac 960

aataatccga aaacgcagat tgacattgac aataaaatca acgaggtgaa cgagatcgag 1020

aaactgctgg tagttagcct gtaataa 1047

<210> 37

<211> 1047

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 37

auggccgaag uuauuagcgg uagcgcagca acccugaaua gcgcacuggu uaaaaauguu 60

agcgguggca aagccuauau cgacaucuau gaugugaaaa acggcaaaau ugauccgcug 120

aaucugauug uucugccucc gagcaauuau agcgccaacu auuauaucaa acaggguggu 180

cgcauuuuca ccaauguuaa ucagcugcag acaccgggua cagcaaccau uaccuauaac 240

auucuggaug aaaauggcaa cccguauacc aaaagugaug gccagauuga uauuguuagc 300

cugguuacca ccguuuauga uaccaccgaa cugcgcaaua acaucaacaa aguuauugag 360

aaugccaacg acccgaaaug gucagaugau agccguaaag auguucugag caaaaucgag 420

gugaucaaaa acgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauaucga caacaaaauu 480

guggaaguga acgagcugga aaaacugcug guucugccgg aauuuagcac cauuccgggu 540

ucagcagcca cacugaauac cagcauuacc aaaaacauuc agaauggcaa cgccuacauu 600

gaucuguacg auguaaaaaa uggucugauc gauccgcaga accugaucgu gcugaauccg 660

agcagcuauu cagccaauua uuauauuaaa caaggcgcaa aauacuauag caacccgagc 720

gaaauuacca ccaccgguag cgccaccauu acguuuaaua uccuggacga aaccgguaac 780

ccgcauaaaa aagcagaugg ucaaauugau aucgugagcg uuaaccugac gauuuaugau 840

agcacagccc ugcguaaucg uauugaugaa gugauuaaua acgcgaauga uccuaaaugg 900

uccgauggua gucgugauga aguacugacc ggucuggaaa aaaucaaaaa agacaucgac 960

aauaauccga aaacgcagau ugacauugac aauaaaauca acgaggugaa cgagaucgag 1020

aaacugcugg uaguuagccu guaauaa 1047

<210> 38

<211> 1047

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 38

atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt 60

agcggtggca aagcctatat cgacatctat gatgtgaaaa acggcaaaat tgatccgctg 120

aatctgattg ttctgacccc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt 180

cgtattttca ccagcgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac 240

attctggatg aaaatggcaa cccgtatacc aaaagtgatg gccagattga tattgttagc 300

ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag 360

aatgccaacg acccgaaatg gtcagatgat agccgtaaag atgttctgag caaaatcgag 420

gtgatcaaaa acgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatatcga caacaaaatt 480

gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccgg aatttagcac cattccgggt 540

tcagcagcca cactgaatac cagcattacc aaaaacattc agaatggcaa cgcctacatt 600

gatctgtacg atgtaaaaaa tggtctgatc gatccgcaga acctgatcgt gctgaatccg 660

agcagctatt cagccaatta ttatattaaa caaggcgcaa aatactatag caacccgagc 720

gaaattacca ccaccggtag cgccaccatt acgtttaata tcctggacga aaccggtaac 780

ccgcataaaa aagcagatgg tcaaattgat atcgtgagcg ttaacctgac gatttatgat 840

agcacagccc tgcgtaatcg tattgatgaa gtgattaata acgcgaatga tcctaaatgg 900

tccgatggta gtcgtgatga agtactgacc ggtctggaaa aaatcaaaaa agacatcgac 960

aataatccga aaacgcagat tgacattgac aataaaatca acgaggtgaa cgagatcgag 1020

aaactgctgg tagttagcct gtaataa 1047

<210> 39

<211> 1047

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 39

auggccgaag uuauuagcgg uagcgcagca acccugaaua gcgcacuggu uaaaaauguu 60

agcgguggca aagccuauau cgacaucuau gaugugaaaa acggcaaaau ugauccgcug 120

aaucugauug uucugacccc gagcaauuau agcgccaacu auuauaucaa acaggguggu 180

cguauuuuca ccagcguuaa ucagcugcag acaccgggua cagcaaccau uaccuauaac 240

auucuggaug aaaauggcaa cccguauacc aaaagugaug gccagauuga uauuguuagc 300

cugguuacca ccguuuauga uaccaccgaa cugcgcaaua acaucaacaa aguuauugag 360

aaugccaacg acccgaaaug gucagaugau agccguaaag auguucugag caaaaucgag 420

gugaucaaaa acgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauaucga caacaaaauu 480

guggaaguga acgagcugga aaaacugcug guucugccgg aauuuagcac cauuccgggu 540

ucagcagcca cacugaauac cagcauuacc aaaaacauuc agaauggcaa cgccuacauu 600

gaucuguacg auguaaaaaa uggucugauc gauccgcaga accugaucgu gcugaauccg 660

agcagcuauu cagccaauua uuauauuaaa caaggcgcaa aauacuauag caacccgagc 720

gaaauuacca ccaccgguag cgccaccauu acguuuaaua uccuggacga aaccgguaac 780

ccgcauaaaa aagcagaugg ucaaauugau aucgugagcg uuaaccugac gauuuaugau 840

agcacagccc ugcguaaucg uauugaugaa gugauuaaua acgcgaauga uccuaaaugg 900

uccgauggua gucgugauga aguacugacc ggucuggaaa aaaucaaaaa agacaucgac 960

aauaauccga aaacgcagau ugacauugac aauaaaauca acgaggugaa cgagaucgag 1020

aaacugcugg uaguuagccu guaauaa 1047

<210> 40

<211> 1047

<212> DNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 40

atggccgaag tgatctccgg ctctgctgct accctgaact ctgccctggt caagaatgtg 60

tctggcggca aggcctacat cgacatctac gacgtgaaga acggcaagat cgaccctctg 120

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agaatcttca cctccgtgaa ccagctgcag acccctggca ccgctaccat cacctacaac 240

atcctggacg agaatggcaa cccctacacc aagtccgacg gccagatcga tatcgtgtcc 300

ctggtcacca ccgtgtacga caccaccgag ctgcggaaca acatcaacaa agtgatcgag 360

aacgccaacg atcccaagtg gagcgacgac tctagaaagg acgtgctgtc caagatcgaa 420

gtcatcaaga acgacatcga caacaacccc aagacacagt ccgacattga taacaagatc 480

gtggaagtga acgagctgga aaagctgctg gtgctgcccg agttcagcac aatccctgga 540

tctgccgcca cactgaacac ctccatcacc aagaatatcc agaacgggaa cgcttacatc 600

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tcctcctact ctgctaatta ctatattaag cagggcgcca agtactactc taacccctcc 720

gagatcacca ccaccggctc cgccaccatc acattcaata ttctggatga gacaggcaac 780

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aagctcctgg tcgtgtctct gtgatga 1047

<210> 41

<211> 1047

<212> RNA

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 41

auggccgaag ugaucuccgg cucugcugcu acccugaacu cugcccuggu caagaaugug 60

ucuggcggca aggccuacau cgacaucuac gacgugaaga acggcaagau cgacccucug 120

aaccugaucg ugcugacccc uuccaacuac uccgccaacu acuacaucaa gcaaggcggc 180

agaaucuuca ccuccgugaa ccagcugcag accccuggca ccgcuaccau caccuacaac 240

auccuggacg agaauggcaa ccccuacacc aaguccgacg gccagaucga uaucgugucc 300

cuggucacca ccguguacga caccaccgag cugcggaaca acaucaacaa agugaucgag 360

aacgccaacg aucccaagug gagcgacgac ucuagaaagg acgugcuguc caagaucgaa 420

gucaucaaga acgacaucga caacaacccc aagacacagu ccgacauuga uaacaagauc 480

guggaaguga acgagcugga aaagcugcug gugcugcccg aguucagcac aaucccugga 540

ucugccgcca cacugaacac cuccaucacc aagaauaucc agaacgggaa cgcuuacauc 600

gaccuguaug augucaagaa cgggcugauc gauccccaga aucugauugu gcucaacccc 660

uccuccuacu cugcuaauua cuauauuaag cagggcgcca aguacuacuc uaaccccucc 720

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aacaauccua aaacucagau cgauauugac aacaagauca acgaagucaa cgagaucgag 1020

aagcuccugg ucgugucucu gugauga 1047

<210> 42

<211> 347

<212> PRT

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 42

Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Ser Ala Leu

1 5 10 15

Val Lys Asn Val Ser Gly Gly Lys Ala Tyr Ile Asp Ile Tyr Asp Val

20 25 30

Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Asn Leu Ile Val Leu Thr Pro Ser

35 40 45

Asn Tyr Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Arg Ile Phe Thr

50 55 60

Ser Val Asn Gln Leu Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ile Thr Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Leu Asp Glu Asn Gly Asn Pro Tyr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Ile

85 90 95

Asp Ile Val Ser Leu Val Thr Thr Val Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Arg

100 105 110

Asn Asn Ile Asn Lys Val Ile Glu Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser

115 120 125

Asp Asp Ser Arg Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Glu Val Ile Lys Asn

130 135 140

Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Asp Asn Lys Ile

145 150 155 160

Val Glu Val Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Pro Glu Phe Ser

165 170 175

Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys Asn

180 185 190

Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Asn Gly

195 200 205

Leu Ile Asp Pro Gln Asn Leu Ile Val Leu Asn Pro Ser Ser Tyr Ser

210 215 220

Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Ala Lys Tyr Tyr Ser Asn Pro Ser

225 230 235 240

Glu Ile Thr Thr Thr Gly Ser Ala Thr Ile Thr Phe Asn Ile Leu Asp

245 250 255

Glu Thr Gly Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Gly Gln Ile Asp Ile Val

260 265 270

Ser Val Asn Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Leu Arg Asn Arg Ile

275 280 285

Asp Glu Val Ile Asn Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Arg Asp Glu Val Leu Thr Gly Leu Glu Lys Ile Lys Lys Asp Ile Asp

305 310 315 320

Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ile Asp Ile Asp Asn Lys Ile Asn Glu Val

325 330 335

Asn Glu Ile Glu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu

340 345

<210> 43

<211> 32

<212> PRT

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 43

Gly Pro Leu Gly Ser Ala Ser Val Leu Ile Gly Ile Ser Phe Leu Gly

1 5 10 15

Gly Phe Thr Gln Gly Gln Phe Asn Ile Ser Thr Asp Thr Val Phe Ala

20 25 30

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 链球菌属物种(Streptococcus sp.)

<400> 44

Gly Pro Leu Gly Ser

1 5

Claims

1.一种免疫原性融合蛋白，包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由以下组成：

i.由170个至178个氨基酸组成，优选地由174个至175个氨基酸组成，并且与SEQ IDNO:7中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的第一氨基酸序列部分；

ii.由165个至174个氨基酸组成，优选地由169个至170个氨基酸组成，并且与SEQ IDNO:14中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的第二氨基酸序列部分；以及任选地：

并且其中所述免疫原性融合蛋白优选地由335个至372个氨基酸组成，优选地由343个至353个氨基酸组成，更优选地由343个至347个氨基酸组成。

2.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中：

-所述第一氨基酸序列部分包含以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:7中示出的序列的氨基酸1-175或2-175，并且

-所述第二氨基酸序列部分包含以下或优选地由以下组成：SEQ DINO:14中示出的序列的氨基酸1-170或2-170。

3.根据任一前述权利要求所述的免疫原性融合蛋白，其中所述氨基酸序列包含所述接头氨基酸序列部分，并且其中所述接头氨基酸序列部分由1个至10个氨基酸组成，优选地由2个至5个氨基酸组成，更优选地由2个氨基酸组成，最优选地由氨基酸序列EF组成。

4.根据任一前述权利要求所述的免疫原性融合蛋白，其中所述免疫原性融合蛋白与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性。

5.根据任一前述权利要求所述的免疫原性融合蛋白，其中所述免疫原性融合蛋白由SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列组成，或可选地，其中所述免疫原性融合蛋白由SEQ IDNO:21的氨基酸2-347组成。

6.一种核酸分子，包含编码根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性融合蛋白的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中所述核酸分子与SEQ ID NO:15-20之一示出的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。

8.一种载体，包含根据权利要求6-7中任一项所述的核酸分子。

9.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性融合蛋白，或包含根据权利要求6-7中任一项所述的核酸分子或根据权利要求8所述的载体。

10.一种疫苗，包含以下的一种或更多种：根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性融合蛋白、根据权利要求6-7中任一项所述的核酸分子、根据权利要求8所述的载体或根据权利要求9所述的宿主细胞。

11.根据权利要求10所述的疫苗，还包含以下的一种或更多种：

a)另一免疫原性融合蛋白，包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:42中示出的氨基酸序列具有至少90％，诸如95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

b)编码所述另一免疫原性融合蛋白的另一核酸分子，所述另一核酸分子优选地与SEQID NO:36-41之一中示出的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性；

c)包含所述另一核酸分子的另一载体；或

d)表达所述另一免疫原性融合蛋白或包含所述另一载体的另一宿主细胞。

12.根据权利要求11所述的疫苗，其中所述疫苗包含：

a)根据权利要求5所述的免疫原性融合蛋白；和

b)另一免疫原性融合蛋白，包含SEQ ID NO:42中示出的氨基酸序列，优选地由SEQ IDNO:42中示出的氨基酸序列组成，或可选地包含SEQ ID NO:42的氨基酸2-347，优选地由SEQID NO:42的氨基酸2-347组成。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的疫苗，还包含氢氧化铝作为佐剂。

14.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性融合蛋白、根据权利要求6-7中任一项所述的核酸分子、根据权利要求8所述的载体、根据权利要求9所述的宿主细胞或根据权利要求10-13中任一项所述的疫苗，用于i)针对B组链球菌感染的疫苗接种，或ii)治疗B组链球菌感染的用途。

15.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性融合蛋白、根据权利要求6-7中任一项所述的核酸分子、根据权利要求8所述的载体、根据权利要求9所述的宿主细胞或根据权利要求10-13中任一项所述的疫苗，用于根据权利要求14所述的用途，其中根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性融合蛋白、根据权利要求6-7中任一项所述的核酸分子、根据权利要求8所述的载体、根据权利要求9所述的宿主细胞或根据权利要求10-13中任一项所述的疫苗被施用至雌性人类受试者。