CN117106856A - 一种抗Xa活性测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗Xa活性测定试剂盒。它包括R1试剂和R2试剂；所述R1试剂包括：发色底物、缓冲体系、抗干扰成分和防腐剂；所述R2试剂包括：兔Xa因子、缓冲体系、蛋白保护剂和防腐剂。本发明克服了现有技术准确性差、成本高的缺点；具有准确度高、线性范围宽、重复性和稳定性好，制备成本低的优点。

Description

一种抗Xa活性测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体地说它是一种抗Xa活性测定试剂盒及应用。更具体地说它是一种肝素(盐)或者低分子量肝素(盐)效价的抗Xa活性测定试剂盒及制备方法。
背景技术
普通肝素(UFH)、低分子肝素(LMWH)、肝素衍生物及其他Xa抑制剂药物，主要用于血栓栓塞性疾病的防治。这些药物的共同点是抑制Xa活性的抗凝作用,不同的是不同抗凝药物所含抗Xa活性含量或浓度不同,其中,普通肝素和低分子肝素,是目前应用最为广泛的抗凝药物。
因子Xa是一种丝氨酸蛋白酶,其位于血液凝集的级联反应上游。因子Xa恰好处在内源性凝血途径和外源性凝血途径的中心位置。因此,Xa因子抑制剂既能阻断内源性凝血,也能抑制外源性凝血。
由于肝素具有复杂的药代动力学和药效学特性,导致治疗浓度范围窄和个体差异极大,需要频繁的实验室监测和剂量调整。活化部分凝血活酶时间(APTT)测定是传统监测UFH的方法，该方法虽然操作简单、快速、便宜，但准确性差，难以标准化，不同实验室之间的差异会较大,并且其相关临床治疗范围尚未达成统一共识。目前,测量结果稳定、结果可标准化,治疗范围达成共识的抗Xa(凝血因子)活性测定试剂盒成为UFH监测的更优选择，但抗Xa活性测定试剂盒成本高、且操作复杂。
由于现有技术的缺点/不足：(1)APTT这种检测方法无法确保检测结果的精准程度，误差大，没有统一的判断标准，根据测定结果判断主观性大、准确性差；(2)现有进口抗Xa活性测定试剂盒(发色底物法)抗干扰性及稳定性差、成本高。
因此，开发一种准确度高、制备成本低的肝素(盐)或者低分子量肝素(盐)效价的抗Xa活性测定试剂盒及制备方法很有必要。
发明内容
本发明的第一目的是为了克服背景技术的不足之处，而提供一种抗Xa活性测定试剂盒(发色底物法)，为一种肝素(盐)或者低分子量肝素(盐)效价的抗Xa活性测定试剂盒，准确度高、线性范围宽、重复性和稳定性好，制备成本低，相对于现有的进口抗Xa活性测定试剂盒(发色底物法)的价格，本发明能节省60％～70％的成本(即，本发明制备的试剂盒的价格仅为现有的进口试剂盒价格的30％～40％)。本发明通过血浆中的肝素(或其他类似物质)与抗凝血酶(AT)形成复合物，抑制过量添加的因子Xa，剩余的因子Xa与其特异的底物作用，在405nm波长处测量对硝基苯胺(pNA)吸收度，pNA生成的量与待测血浆中肝素(或其他类似物质)的浓度成反比,确保检测结果的精准程度及稳定性；以解决目前市面上所使用APTT检测准确性差，以及抗Xa活性测定试剂盒(发色底物法)抗干扰性及稳定性差、成本高的问题。
本发明的第二目的是为了提供抗Xa活性测定试剂盒的制备方法。
为了实现上述本发明的第一目的，本发明的技术方案为：一种抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂，主要包括：发色底物、缓冲体系、抗干扰成分和防腐剂；
所述R2试剂，主要包括：兔Xa因子、缓冲体系、蛋白保护剂和防腐剂。
在上述技术方案中，R1试剂和R2试剂中缓冲体系选自HEPES、Tris或磷酸缓冲盐溶液中的至少一种；R1试剂和R2试剂中缓冲体系的浓度为10mM-100mM(nmol/L，缩写：nM)，pH为7.2-7.6；
R1试剂和R2试剂中防腐剂选自叠氮化钠、Proclin300、Prionex中的至少一种；R1试剂和R2试剂防腐剂的加入不影响试剂测试，仅对试剂中细菌或真菌等起到抑制或杀灭作用，保证试剂质量的稳定。
在上述技术方案中，R1试剂和R2试剂中防腐剂选用浓度为0.1～0.5g/L的ProClin300。
在上述技术方案中，R1试剂和R2试剂中缓冲体系的最佳工作浓度为50nM；
R1试剂和R2试剂中防腐剂ProClin300的最佳工作浓度为0.2ml/L。
在上述技术方案中，R1试剂抗干扰成分主要为亚硝酸盐、非离子型表面活性剂吐温-20，其中亚硝酸盐浓度为：1.0-5.0g/L,吐温-20浓度为：1.0-4.0ml/L；
R1试剂中的发色底物为Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCI(S-2765)，浓度为：1-3nM。
在上述技术方案中，亚硝酸盐的最佳工作浓度为：3.0g/L；吐温-20的最佳工作浓度为：2.0ml/L；
R1试剂中的发色底物S-2765的最佳工作浓度为：2nM。
在上述技术方案中，R2试剂蛋白保护剂主要是明胶、甘油、聚乙二醇600(PEG600)、氯化钠等，其中明胶浓度为：0.5-1.5g/L，甘油浓度为：4.0-12.0ml/L、PEG600浓度为：10.0-30.0ml/L、氯化钠浓度为：1.0～10.0g/L；
R2试剂中兔Xa因子(活性蛋白)的浓度为：220.0-440.0IU/mL。
在上述技术方案中，R2试剂蛋白保护剂中的明胶的最佳工作浓度为：1.0g/L，甘油的最佳工作浓度为：8.0ml/L、PEG600的最佳工作浓度为：20.0ml/L、氯化钠的最佳工作浓度为：5.0g/L；
R2试剂中活性蛋白兔Xa因子的最佳工作浓度为：330.0IU/mL。
以上试剂或溶液的使用电导率≤1μs/cm(25℃)的纯化水。
为了实现上述本发明的第二目的，本发明的技术方案为：所述的抗Xa活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
步骤一：领取原辅料；
步骤二：按照生产工艺流程及质量控制点制备R1试剂、R2试剂；对辅料进行清洗及烘干瓶、盖等处理；
R1试剂包括50mmol/L Hepes缓冲液、2.0ml/L吐温-20、3.0g/L亚硝酸盐、2.0mg/LS-2765、0.2ml/L Proclin 300；
R1试剂的制备方法如下：
(1)配置缓冲液：配制50mmol/L缓冲体系(按配制1L R1试剂进行说明)，称取11.9gHepes试剂加入900ml纯化水匀速搅拌充分溶解后，用5mol/L NaOH；
调节pH至7.4±0.2；
(2)称量吐温-20：2.0ml及亚硝酸盐：3.0g，匀速搅拌至充分溶解；
(3)称取S-2765：1.5mg(规格：11.0mg≈15nM)，由于加入量比较少，可以使用高浓度储存液(比如150mg溶解10ml纯化水中，取0.1ml加入1L中，即为浓度：1.5mg/L)；
(4)加入0.2ml Proclin300防腐剂，充分搅拌；
(5)用纯化水定容到1L，即为R1试剂；
R2试剂的制备方法如下：
R2试剂包括50mmol/L Hepes缓冲液、1g/L明胶、8ml/L甘油、20ml/L聚乙二醇600、5g/L氯化钠、330IU Xa因子、0.2ml/L Proclin300；
(1)配置缓冲液：配制50mmol/L缓冲体系(按配制1L R1试剂进行说明)，称取11.9gHepes试剂加入900ml纯化水匀速搅拌充分溶解后，用5mol/L NaOH；
调节pH至7.4±0.2；
(2)配置蛋白保护剂：称取1g明胶、5g氯化钠，量取8ml甘油、20ml聚乙二醇600，0.330.0IU Xa因子匀速搅拌至充分溶解；
(3)加入0.2ml Proclin300防腐剂，充分搅拌；
步骤三：对制备的R1试剂、R2试剂分别进行调试，并检验，检验合格后分装在西林瓶中；检验不合格，则返工进行再次调试；
步骤四：对分装后的产品进分装检验，检验合格后加盖密封并贴标、放入说明书等进行包装；
步骤五：对包装后的产品进行包装检验，检验合格后作为抗Xa活性测定试剂盒成品入库。
本发明的具有如下有益效果：
本发明提供的一种测定抗Xa活性测定试剂盒，通过使用蛋白保护剂增强兔Xa因子活性的稳定性和发色底物S-2765为试剂原料，二者搭配使用时，使得本发明的试剂盒的线性范围宽、抗干扰能力强、重复性好、稳定性好，可以实现对进口抗Xa活性测定试剂盒的替代(相对于现有的进口抗Xa活性测定试剂盒(发色底物法)的价格，本发明能节省60％～70％的成本(即，本发明制备的试剂盒的价格仅为现有的进口试剂盒价格的30％～40％))，充分满足临床检验的需求，还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用。
附图说明
图1为本发明实施例定标的相关线性回归；
图2为本发明实施例测试线性范围的相关线性回归；
图3为本发明对比例3测试线性范围的相关线性回归；
图4为本发明对比例4测试线性范围的相关线性回归。
图5为本发明中抗Xa活性测定试剂盒的制备流程图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的实施情况，但它们并不构成对本发明的限定，仅作举例而已。同时通过说明使本发明的优点更加清楚和容易理解。
本发明提供了一种抗Xa活性测定试剂盒(发色底物法),通过样本中肝素和抗凝血酶(AT)形成复合物,此复合物可抑制试剂中Xa因子的活性，残留的Xa因子可以分解发色底物S-2765而释放出对硝基苯胺(PNA)，后者在405nm波长处有吸收峰，其反应动力学与样本中UFH水平成反比。因此，可以通过对硝基苯的生成量来计算出肝素活性。本发明中S-2765是化学合成的活化X因子(FXa)特异性底物，分子式是：Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCI，分子量是：714.6Da。本发明中FXa系兔血浆X因子经鲁氏蝰蛇X因子激活剂活化后的产物，通过离子交换和凝胶过滤层析方法纯化得到。FXa在体内与其它凝血因子一起激活凝血酶原，产生凝血酶，引发凝血瀑布反应。
本发明试剂盒为全液态试剂,使用方便、成本低廉、线性范围宽、稳定性好。可实现对进口抗Xa活性测定试剂盒的替代,充分满足临床检验的需求的同时降低医院购买检测试剂的成本,减少病人的检测费用。
本发明方法主要是利用测定产色物质的吸光度变化来推算所测定物质的含量。一般产色物质选用PNA，游离的PNA呈黄色，测定波长为405nm，而连接PNA的化合物为无色，本试验选用发色底物S-2765。亚硝酸盐作为还原剂可以增加抗血红蛋白能力；多聚环氧乙烷脂肪醇类、多聚环氧乙烷-环氧丙烷脂肪醇类、聚乙二醇烷基醚类、十二烷基苯磺酸钠、混合脂肪酸甘油酯类等非离子型表面活性剂抗乳糜干扰；通过表面活性剂乳化、洗涤等效果,去除溶血样本的干扰物质，同时消除总胆红素的影响。通过本发明优化获得了一种准确、抗干组分。
由于Xa因子主要是蛋白质，因此要保持蛋白质的活性，主要就是保持蛋白质的空间结构的稳定。影响蛋白质活性的因素主要有溶液的PH值、盐分和糖分的浓度、微生物的作用及空气的氧化等。一方面，氨基酸是很好的抗氧化剂；各种糖能起到保护蛋白质活性的作用:离子整合剂有多重功效，如抗氧化、防腐，亦可防止一些离子沉积；甘油、山梨醇可以保持抗原抗体表面的滋润，使其不至于因失水而失活。另外一些水溶性杂蛋白或化学惰性的高分子物质的聚合物(如PEG等)因其分子量大，能够在蛋白质表面形成一种保护膜，使蛋白结构免遭破坏。另一方面，随着保存时间的延长，抗原抗体及稳定剂中的氨基酸、糖类等有机物易受到空气、水中微生物的腐蚀，因此，本发明加入一定的防腐剂。
为了验证本申请试剂盒最适缓冲体系、稳定性和抗干扰效果，本发明将实施例及对比例进行验证,其测定采用德国BE公司生产的全自动凝血分析仪XRM，下面结合具体实施例及对比例对本发明进行详细说明：
实施例
本实施例一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，各试剂的组成如表1：
表1实施例R1试剂和R2试剂配制
所述的抗Xa活性测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
步骤一：领取原辅料；
步骤二：按照生产工艺流程及质量控制点制备R1试剂、R2试剂；对辅料进行清洗及烘干瓶、盖等处理；
R1试剂的制备方法如下：
(1)配置缓冲液：配制50mmol/L缓冲体系(按配制1L R1试剂进行说明)，称取11.9gHepes试剂加入900ml纯化水匀速搅拌充分溶解后，用5mol/L NaOH；
调节pH至7.4±0.2。
(2)称量吐温-20：2.0ml及亚硝酸盐：3.0g，匀速搅拌至充分溶解。
(3)称取S-2765：1.5mg，由于加入量比较少，可以使用高浓度储存液(比如150mg溶解10ml纯化水中，取0.1ml加入1L中，即为浓度：1.5mg/L)。
(4)加入0.2ml Proclin300防腐剂，充分搅拌。
(5)用纯化水定容到1L，即为R1试剂。
R2试剂的制备方法如下：
(1)R2试剂包括50mmol/L Hepes缓冲液、1g/L明胶、8ml/L甘油、20ml/L聚乙二醇600、5g/L氯化钠、330IU Xa因子、0.2ml/LProclin 300；
(2)配置缓冲液：配制50mmol/L缓冲体系(按配制1L R1试剂进行说明)，称取11.9gHepes试剂加入900ml纯化水匀速搅拌充分溶解后，用5mol/L NaOH；
调节pH至7.4±0.2；
(3)配置蛋白保护剂：称取1g明胶、5g氯化钠，量取8ml甘油、20ml聚乙二醇600，0.330.0IU Xa因子匀速搅拌至充分溶解；
(4)加入0.2ml Proclin300防腐剂，充分搅拌；
步骤三：对制备的R1试剂、R2试剂分别进行调试，并检验，检验合格后分装在西林瓶中；检验不合格，则返工进行再次调试；
步骤四：对分装后的产品进分装检验，检验合格后加盖密封并贴标、放入说明书等进行包装；
步骤五：对包装后的产品进行包装检验，检验合格后作为抗Xa活性测定试剂盒成品入库(如图5所示)。
对比例1
对比例1中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂缓冲体系为10mmol/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例的制备方法同实施例。
对比例2
对比例2中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂缓冲体系为100mmol/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例一种抗Xa活性测定试剂盒的制备方法同实施例。
对比例3
对比例3中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂S-2765浓度为：1.0mg/L和R2试剂中Xa因子浓度为：220IU/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例一种抗Xa活性测定试剂盒的制备方法同实施例。
对比例4
对比例4中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂S-2765浓度为：3.0mg/L和R2试剂中Xa因子浓度为：440IU/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例一种抗Xa活性测定试剂盒的制备方法同实施例。
对比例5
对比例5中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂中含吐温-20浓度为：1ml/L；亚硝酸盐浓度为：1g/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例一种抗Xa活性测定试剂盒的制备方法同实施例。
对比例6
对比例6中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂中含吐温-20浓度为：3ml/L；亚硝酸盐浓度为：5g/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例一种抗Xa活性测定试剂盒的制备方法同实施例。
对比例7
对比例7中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R2试剂中含明胶浓度为：0.5g/L；甘油浓度为：4ml/L；聚乙二醇600浓度为:10.0ml/L；氯化钠浓度为：1.0g/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例一种抗Xa活性测定试剂盒的制备方法同实施例。
对比例8
对比例8中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R2试剂中含明胶浓度为：1.5g/L；甘油浓度为：12ml/L；聚乙二醇600浓度为:30.0ml/L；氯化钠浓度为：10.0g/L，其它组分与实施例保持一致。本对比例一种抗Xa活性测定试剂盒的制备方法同实施例。
对比例9
对比例9中一种抗Xa活性测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂中不含Proclin 300防腐剂，其它组分与实施例保持一致。
实施例及对比例1-9的检测结果如下所示：
(1)定标及其结果
将配制实施例及对比例1-9进行吸光度度变化率检测。检测样本为理论浓度为0、0.8、2.0IU/ml的肝素校准品。校准品吸光度参考范围见表2(肝素校准品品牌：沃芬；批号：N0714558；效期：2024.08.01)。
检测仪器可以选择各种品牌型号的血凝仪,如法国Stago的STAR-MAX仪器、日本希森美康的CS5100仪器、美国沃芬的T0P750仪器、德国BE的XRM仪器等。具体参数可根据不同仪器进行适当调整，以BE的XRM仪器为例的检测数据如表3所示。定标结果应符合要求：标准曲线的线性回归方程R2≥0.98，校准品测定结果在校准品吸光度参考范围内。
表2校准品吸光度参考范围
校准品肝素浓度 吸光度(△OD/min)
0IU/ml 0.78-0.88
0.8IU/ml 0.38-0.48
2.0IU/ml 0.10-0.20
表3实施例及对比例测试肝素校准品
从表3的测试结果线性回归分析,实施例及对比例3-9校准品线性回归方程满足R2≥0.98,符合要求(其中本发明实施例测试线性范围的相关线性回归如图2所示)；而对比例1和对比例2校准品线性回归方程的R2<0.98，不符合要求。从校准品吸光度参考范围结果看，对比例1-3不在参考范围内。具体对各对比例分析，相比较与实施例，对比例1中配制的低缓冲体系及比例2中配制的高缓冲体系均对校准品测定有影响，根据缓冲体系的缓冲能力常识及试验对比结果，选择实施例浓度的缓冲体系是最优缓冲体系。对比例3和对比例4中发色底物S-2765及Xa因子浓度不同，由测试结果可以发现对比例3中R2＝0.9972，对比例4中R2＝0.9868，均符合要求(其中，对比例3测试线性范围的相关线性回归如图3所示，对比例4测试线性范围的相关线性回归如图4所示)，而对比例3中测定校准品吸光度高于参考范围外，说明发色底物S-2765及Xa因子浓度低，反应不充分，而对比例4中测定校准品吸光度在参考范围内，对比例4中发色底物S-2765及Xa因子可以满足测试要求，综合实用及经济考虑，实施例浓度为最适浓度。对比例5-9中均满足标准曲线的线性回归方程R2≥0.98，校准品测定结果在校准品吸光度参考范围内，说明试剂中的抗干扰成分、蛋白保护剂和防腐剂对校准品吸光度影响较小。综合分析，抗Xa活性测定试剂定标最佳浓度如实施例配制。
(2)抗干扰测试
将实施例配制的试剂与对比例5和对比例6配制的试剂，同时检测对比样本(正常混合血浆，外加少量肝素)及对比样本加入不同浓度的干扰物样本(含有150mg/dL、300mg/dL、450mg/dL人血红蛋白(Hb),含有10mg/dL、15mg/dL、20mg/dL胆红素(DB),含有200mg/dL、400mg/dL、600mg/dL、800mg/dL甘油三酯(TG)),干扰物样本测试结果与对比样本测试结果做比较，计算回收率,检测仪器以BE的XRM仪器为例，检测结果如表4：
表4抗干扰测试结果
表4中的数据是实施例、对比例5、对比例6测试加干扰物样本与对比样本(未加干扰物样本)的对比数据，实施例、对比例5、对比例6测试对比样本会有差异，样本不变，但测试试剂不同，回收率＝(加干扰物样本-对比样本)/对比样本100％。
从表4中抗干扰测试结果分析,实施例抗干扰能力明显优于对比例5，而实施例与对比例6抗干扰能力差异不是很显著，实施例与对比例5和对比例6的差异就在R1试剂中吐温-20和亚硝酸盐浓度的不同，从回收率结果可以看出(加干扰物样本与对比样本(未加干扰物样本)的比值)，加入抗干扰物(吐温-20和亚硝酸盐)增强了试剂的抗干扰能力，但随着抗干扰物浓度的增加并没有继续增加抗干扰能力，即抗干扰能力进入平台期、并不会一直上升，因此，抗Xa活性测定试剂盒中的R1试剂抗干扰成分吐温-20和亚硝酸盐的最佳浓度如实施例配制，达到预期抗干扰能力的同时降低成本。
(3)稳定性测试
本实验例进行长期稳定性和加速稳定性测试。
将实施例和对比例7、对比例8中R1试剂及R2试剂在2-8℃，避光环境中贮存12个月，跟踪各组12个月内的稳定性；同时将各组在37℃不同天数做热加速破坏后取出检测,检测理论浓度为0、0.8、2.0IU/ml的肝素校准品(肝素校准品品牌：沃芬；批号：N0714558；效期：2024.08.01)。检测仪器以BE的XRM仪器为例，检测结果如表5长期稳定性测试结果和表6加速稳定性测试结果，并与第一次测试(时间为：0)比较其相对偏差(RD)，要求相对偏差变化小于10％。测试结果见表5和表6：
表5加速稳定性测试结果
表6长期稳定性测试结果
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注：S1，即校准品S1，肝素浓度：0IU/mL；S2，即校准品S2，肝素浓度：0.8IU/mL；S3，即校准品S3，肝素浓度：2.0IU/mL；吸光度单位：△OD/min。根据表5可知，37℃的保存条件下，实施例和对比例8保存9天相对偏差变化小于10％，而对比例7保存6天相对偏差变化小于10％，第9天相对偏差变化大于10％，即实施例稳定性在37℃可以保存9天，实施例和对比例8比对比例7稳定性好。
根据表6可知，2-8℃的保存条件下，实施例和对比例8保存12个月相对偏差变化小于10％，而对比例7保存6个月相对偏差变化小于10％，第9个月相对偏差变化大于10％，即实施例和对比例8在2-8℃保存条件下长期稳定性可以保存12个月，对比例7可以保存6个月，实施例和对比例8比对比例7稳定性好。即2-8℃的保存条件下，实施例可以保存12个月。由上述加速稳定性和长期稳定性测试发现，实施例与对比例7和对比例8配制中成分差异就在R2试剂中明胶、甘油、聚乙二醇600(PEG600)、氯化钠蛋白保护剂浓度的不同；可见，明胶、甘油、聚乙二醇600(PEG600)、氯化钠等蛋白保护剂可以显著增加试剂的稳定性，使试剂的保存时间更长。对比例8蛋白保护剂浓度比实施例高，但稳定相关没有明显差异。综合分析，R2试剂中的蛋白保护剂明胶、甘油、聚乙二醇600(PEG600)、氯化钠的最佳浓度如实施例配制。
(4)线性范围
将接近线性范围上限的高浓度样本用生理盐水倍比稀释成至少5个不同浓度的样本，每个浓度重复测定3次，以理论浓度为(x)，实测结果均值为(y)，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(r)，要求线性相关系数r≥0.9900，测试结果如表7所示：
表7实施例、对比例3和对比例4测试线性范围
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从表7的测试结果分析，实施例及对比例4的线性相关系数R2≥0.99，说明实施例的试剂均符合上述线性范围要求；而对比例3的线性范围R2＝0.9794，不符合要求，且线性范围要窄很多，即高浓度肝素时测试结果的吸光度比理论值大，由试剂配制可知，R1试剂中发色底物S-2765和R2试剂兔Xa因子浓度比实施例低，不能使高浓度肝素样本发生充分反应；对比例4线性回归方程分析和线性范围与实施例差不多，但对比例4中R1试剂中发色底物S-2765和R2试剂Xa因子浓度比实施例高，说明发色底物和Xa因子加入过量，没有充分利用。综合分析，抗Xa活性测定试剂盒中的R1试剂中发色底物S-2765和R2试剂兔Xa因子的最佳浓度如实施例配制。
(5)校准曲线绘制
绘制校准曲线时，溶解校准品。实施例配制试剂检测结果显示出吸光度与肝素浓度的对应关系，肝素浓度越高，吸光度度越低，反之肝素浓度越低，吸光度度越强，如附图1为实施例检测肝素校准品浓度与吸光度对数的校准品曲线。
以吸光度为纵坐标(Y轴)，其相应肝素校准品浓度为横坐标(X轴)，绘制相应的标准曲线，计算得到肝素浓度校准曲线的回归方程。
由校准曲线可以看出，校准品浓度与实施例试剂测量结果的定量关系的良好，实施例配制的R1试剂进而R2试剂能够满足测试需要。
综上，采用本发明R1试剂和R2试剂的组分以及配制方法，抗Xa活性测定试剂盒进行定标、抗干扰性、稳定性以及线性范围测试，证明本发明实施例是最优选择。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
其它未说明的部分均属于现有技术。

Claims (9)

1.一种抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂，包括：发色底物、缓冲体系、抗干扰成分和防腐剂；
所述R2试剂，包括：兔Xa因子、缓冲体系、蛋白保护剂和防腐剂。
2.根据权利要求1所述的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：R1试剂和R2试剂中缓冲体系选自HEPES、Tris或磷酸缓冲盐溶液中的至少一种；R1试剂和R2试剂中缓冲体系的浓度为10mM-100mM，pH为7.2-7.6；
R1试剂和R2试剂中防腐剂选自叠氮化钠、Proclin300、Prionex中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：R1试剂和R2试剂中防腐剂选用浓度为0.1～0.5g/L的ProClin300。
4.根据权利要求3所述的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：R1试剂和R2试剂中缓冲体系的浓度为50nM；
R1试剂和R2试剂中防腐剂ProClin300的浓度为0.2ml/L。
5.根据权利要求4所述的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：R1试剂抗干扰成分包括亚硝酸盐、非离子型表面活性剂吐温-20，其中亚硝酸盐浓度为：1.0-5.0g/L,吐温-20浓度为：1.0-4.0ml/L；
R1试剂中的发色底物为S-2765，浓度为：1-3nM。
6.根据权利要求5所述的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：亚硝酸盐的浓度为：3.0g/L；吐温-20的浓度为：2.0ml/L；
R1试剂中的发色底物S-2765的浓度为：2nM。
7.根据权利要求6所述的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：R2试剂蛋白保护剂包括明胶、甘油、聚乙二醇600、氯化钠，其中明胶浓度为：0.5-1.5g/L，甘油浓度为：4.0-12.0ml/L、聚乙二醇600浓度为：10.0-30.0ml/L、氯化钠浓度为：1.0～10.0g/L；
R2试剂中兔Xa因子浓度为：220.0-440.0IU/mL。
8.根据权利要求7所述的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于：R2试剂蛋白保护剂中的明胶的浓度为：1.0g/L，甘油的浓度为：8.0ml/L、PEG600的浓度为：20.0ml/L、氯化钠的浓度为：5.0g/L；
R2试剂中活性蛋白兔Xa因子的浓度为：330.0IU/mL。
9.根据权利要求1-8中任一权利要求所述的抗Xa活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
步骤一：领取原辅料；
步骤二：按照生产工艺流程及质量控制点制备R1试剂、R2试剂；对辅料进行清洗及烘干瓶、盖处理；
R1试剂的制备方法如下：
(1)配置缓冲液：配制50mmol/L缓冲体系，称取11.9g Hepes试剂加入900ml纯化水匀速搅拌充分溶解后，用5mol/L NaOH；
调节pH至7.4±0.2；
(2)称量吐温-20：2.0ml及亚硝酸盐：3.0g，匀速搅拌至充分溶解；
(3)称取S-2765：1.5mg，由于加入量比较少，可以使用高浓度储存液；
(4)加入0.2ml Proclin300防腐剂，充分搅拌；
(5)用纯化水定容到1L，即为R1试剂；
R2试剂的制备方法如下：
(1)配置缓冲液：配制50mmol/L缓冲体系，称取11.9g Hepes试剂加入900ml纯化水匀速搅拌充分溶解后，用5mol/L NaOH；
调节pH至7.4±0.2；
(2)配置蛋白保护剂：称取1g明胶、5g氯化钠，量取8ml甘油、20ml聚乙二醇600，0.330.0IU Xa因子匀速搅拌至充分溶解；
(3)加入0.2ml Proclin300防腐剂，充分搅拌；
步骤三：对制备的R1试剂、R2试剂分别进行调试，并检验，检验合格后分装在西林瓶中；检验不合格，则返工进行再次调试；
步骤四：对分装后的产品进分装检验，检验合格后加盖密封并贴标、放入说明书进行包装；
步骤五：对包装后的产品进行包装检验，检验合格后作为抗Xa活性测定试剂盒成品入库。
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