CN117106783B - 一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用 - Google Patents
一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117106783B CN117106783B CN202311376891.6A CN202311376891A CN117106783B CN 117106783 B CN117106783 B CN 117106783B CN 202311376891 A CN202311376891 A CN 202311376891A CN 117106783 B CN117106783 B CN 117106783B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promoter
- recombinant
- lysc
- gene
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 title claims abstract description 42
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 29
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 9
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 49
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 8
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 7
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000723382 Corylus Species 0.000 description 1
- 235000007466 Corylus avellana Nutrition 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037354 amino acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- -1 histidinol aldehyde Chemical class 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 235000021134 protein-rich food Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/345—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Brevibacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
- C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/265—Micrococcus
- C12R2001/28—Micrococcus glutamicus ; Corynebacterium glutamicum
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用。本发明通过筛选和突变提供了一种启动子,所述启动子的序列如SEQ ID NO:3或28所示;所述启动子可以提高lysC基因表达量。本发明还提供了:一种基因表达框,包括所述启动子和lysC基因;一种重组载体,所述重组载体包含所述启动子或表达框;以及包含启动子、表达框或重组载体的重组菌株。本发明开发新型的启动子,通过提高lysC基因表达量,使重组菌株的赖氨酸产量获得明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体涉及一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用。
背景技术
赖氨酸是人类和哺乳动物的必需氨基酸之一,在机体内无法合成,必须从食物中补充。而只有L-赖氨酸才能被生物体所利用,因此常说的赖氨酸指的是L-赖氨酸。赖氨酸作为组成蛋白质的成分之一,广泛存在于富含蛋白质的食物中,赖氨酸含量比较高的食物为动物性食物、豆类、和一些常见的坚果如杏仁、榛子、花生仁、南瓜子仁等。
赖氨酸具有促进人体生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化、缓解焦虑等作用,对人体和动物体健康具有积极作用。L-赖氨酸因为其必需氨基酸的特性和功能性,已成为世界第二大氨基酸生产品种,并广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中约90%用于饲料工业,10%用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂,L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸,从而提高饲料质量。
因为赖氨酸需要大规模生产,所以主要以微生物发酵法生产赖氨酸,具有原料成本低、反应条件温和、易实现大规模生产等优点。但目前赖氨酸菌种的发酵性能和转化率仍有较大提升空间,通过增强氨基酸代谢通路上一些基因的表达,可以使赖氨酸的产量和转化率提升,其中一些关键位置的基因表达量增强可以提高酶的表达水平和基因转录的抗反馈能力。CN111635879B公开了一种L-赖氨酸生产菌株的构建方法,其特征在于,遗传改造所述L-赖氨酸生产菌株细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种,使之在胞内弱化或失活,生产菌株的赖氨酸产量显著提高。
天冬氨酸激酶(LysC)是控制赖氨酸合成的第一个酶,也是关键限速步骤,这个步骤受到严格的酶活和基因转录的反馈抑制。启动子作为一个影响转录水平的重要因子,研发人员通常会对其进行人工编辑,以期达到提升基因表达量的作用。CN111909944A公开了对谷氨酸棒杆菌中的lysC基因的启动子区域序列进行点突变形成,提高了L-赖氨酸产量,且菌株稳定性好,作为L-赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。该方法是对lysC基因的原始启动子进行的突变改造,可改造空间较小。
因此,开发新型启动子,在LysC编码区前端替代原有启动子使基因表达水平进一步提高,并且达到解除反馈抑制的效果,是大幅提高赖氨酸产量的一个重要方向。
发明内容
为了解决上述技术问题,开发新型的启动子,本发明通过在天冬氨酸激酶基因前端替换其他启动子,通过筛选,确定有效提高基因的表达量的启动子,还对筛选的启动子进行突变,进一步提高基因的表达量,从而使赖氨酸产量获得明显提高。
本发明提供了一种启动子,所述启动子的序列如SEQ ID NO:3或28所示。
本发明还提供了所述启动子在提高lysC基因表达量的应用,所述启动子作为lysC基因表达的启动子。
本发明还提供了一种基因表达框,包含所述的启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列;优选地,所述编码序列为lysC基因的编码序列。
本发明还提供了一种重组载体,所述重组载体包含所述启动子或表达框;优选地,所述重组载体是在载体pBAD-MCS-pBBR1或pK18mobsacB上连接所述启动子或基因表达框的基因片段而获得。
本发明还提供了所述表达框或重组载体在提高生产赖氨酸的菌株的赖氨酸产量的应用。
本发明还提供了一种重组菌株,所述重组菌株包含上述的启动子、表达框或重组载体;优选地,所述重组菌株为重组谷氨酸棒状杆菌,更优选为谷氨酸棒状杆菌FF-lys101。
本发明还提供了所述重组菌株的的构建方法,包括如下步骤:制备包含所述启动子和编码序列的基因片段,与载体连接获得重组载体,电转入棒状杆菌获得可增强lysC基因表达量的菌株。
本发明提供了所述重组菌株在生产赖氨酸的应用。本发明提供了一种生产赖氨酸的方法,包括:使用所述的重组菌株进行生产赖氨酸。
与现有技术相比,本发明的有益效果至少包括:
(1)本发明筛选新型的启动子增强lysC基因表达量,从而提高菌株的赖氨酸产量。
(2)本发明还对筛选出的启动子进行突变,筛选增强lysC基因表达量的优选突变,进一步提高了lysC基因表达量和赖氨酸产量。
附图说明
图1为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-05+lysC的质粒图谱;
图2为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-06+lysC的质粒图谱;
图3为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-07+lysC的质粒图谱;
图4为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-08+lysC的质粒图谱;
图5为4种菌株中lysC基因的表达量结果;
图6为PFF-07突变启动子重组菌株中lysC基因的表达量结果;
图7为各重组菌株摇瓶发酵生产L-赖氨酸的结果;
图8为各重组菌株5L发酵罐生产L-赖氨酸的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解,在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明,旨在用于解释本发明,而不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围。
实施例1 重组载体和重组菌株的构建
启动子PFF-05:
以产氨棒杆菌(CJHB100)基因组为模板,启动子PFF-05(序列如SEQ ID NO:1所示)上游、下游同源臂引物为PFF-05-F/PFF-05-R;基因片段lysC(如SEQ ID NO:5所示)上游、下游同源臂引物为PlysC1-F/PlysC1-R;用以上两个片段为模板,以PFF-05-F/PlysC1-R引物对进行PCR扩增,得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-05+lysC片段,在扩增的过程中,引入相应的酶切位点片段用HindIII、XbaI进行双酶切。载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切,两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接,获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-05+lysC(质粒图谱如图1所示)。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中,并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基中上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中,培养温度为30℃,200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对(序列如SEQ ID NO:22和23所示)进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析,获得改造菌株分别命名为FF-lys195。
启动子PFF-06:
以黄色短杆菌(ATCC 15168)基因组为模板,启动子PFF-06(序列如SEQ ID NO:2所示)上游、下游同源臂引物为PFF-06-F/PFF-06-R;基因片段lysC上游、下游同源臂引物为PlysC2-F/PlysC2-R;用以上两个片段为模板,以PFF-06-F/PlysC2-R引物对进行PCR扩增,得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-06+lysC片段;片段用HindIII、XbaI进行双酶切,载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切,两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接,获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-06+lysC(质粒图谱如图2所示)。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中,并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中,培养温度为30℃,200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析,获得改造菌株分别命名为FF-lys196。
启动子PFF-07:
以氨根棒状杆菌(MGYG-HGUT-01533)基因组为模板,启动子PFF-07(序列如SEQ IDNO:3所示)上游、下游同源臂引物为PFF-07-F/PFF-07-R;基因片段lysC上游、下游同源臂引物为PlysC3-F/PlysC3-R;用以上两个片段为模板,以PFF-07-F/PlysC3-R引物对进行PCR扩增,得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-07+lysC片段;片段用HindIII、XbaI进行双酶切,载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切,两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接,获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-07+lysC(质粒图谱如图3所示)。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中,并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中,培养温度为30℃,200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析,获得改造菌株分别命名为FF-lys197。
启动子PFF-08:
以棒状芽孢杆菌(ATCC21170)基因组为模板,启动子PFF-08(序列如SEQ ID NO:4所示)上游、下游同源臂引物为PFF-08-F/PFF-08-R;基因片段PlysC上游、下游同源臂引物为PlysC4-F/PlysC4-R;用以上两个片段为模板,以PFF-08-F/PlysC4-R引物对进行PCR扩增,得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-08+lysC片段;片段用HindIII、XbaI进行双酶切,载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切,两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接,获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-08+lysC(图4)。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中,并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中,培养温度为30℃,200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析,获得改造菌株分别命名为FF-lys198。
实施例1中使用的引物序列如下表所示:
引物名称 | 引物序列(5’→3’) | SEQ ID NO. |
PFF-05-F | CCCAAGCTTAGAAACATCCCAGCGCTA | 6 |
PFF-05-R | GTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 7 |
PlysC1-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 8 |
PlysC1-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGC | 9 |
PFF-06-F | CCCAAGCTTAACAGGAATGTTCCTTTC | 10 |
PFF-06-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGGGTAAAAAATCCTTTCGTAG | 11 |
PlysC2-F | TACGAAAGGATTTTTTACCCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 12 |
PlysC2-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 13 |
PFF-07-F | CCCAAGCTTAGAAACAGCCCAGCCCGACAA | 14 |
PFF-07-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCTTCCTTTCGTTAGGGGTACGT | 15 |
PlysC3-F | CGTACCCCTAACGAAAGGAAGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 16 |
PlysC3-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 17 |
PFF-08-F | CCCAAGCTTAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTT | 18 |
PFF-08-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 19 |
PlysC4-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 20 |
PlysC4-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 21 |
。
实施例2 重组菌株中lysC基因的表达量
通过实时荧光定量PCR,观察基因工程重组菌株FF-lys195、FF-lys196、FF-lys197、FF-lys198中lysC基因的表达量。使用Thermo公司的MaximaTM SYBR Green/ROXqPCR Maxter Mix(2×)试剂盒进行qRT-PCR。qRT-PCR反应体系采用20如下所示:MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Maxter Mix(2 x) 10 µL,QpcrLysC-F 1µL,QpcrLysC-R 1 µL,DNA模板 5 µL,ddH2O (RNase free) 3 µL。其中,QpcrLysC-F序列如SEQ ID NO:24所示,QpcrLysC-R如SEQ ID NO:25所示。
体系充分混匀后分装至96孔板,将96孔板放到ABI仪器中。
PCR反应程序的条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72℃延伸30 s,72 ℃最后延伸5 min;循环40次
16s rRNA:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性15 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,72 ℃最后延伸5 min;循环40次。
溶解曲线设置:95 ℃,1 min;65 ℃,1 min;95 ℃,20 s,stepping 0.5℃/s;30℃,1 min。
4种菌株中lysC基因的表达量结果见图5。由图5可知,FF-lys197基因工程重组菌株中的PFF-07启动子具有更高的活性,可以增强lysC基因的表达。进一步地,选用该启动子进行随机突变用于合成活性更高的启动子,从而获得更高产赖氨酸的生产菌株。
实施例3 PFF-07突变启动子
利用不同程度的连续易错 PCR进行定向进化的方法,配制StarMut Enhancer 1\5\20 μL易错PCR体系;将配制好的PCR反应体系放入PCR仪中进行扩增,以最适的启动子PFF-07为模板通过易错PCR获得一系列突变启动子PFF-07-6、PFF-07-10、PFF-07-15、PFF-07-16、PFF-07-23、PFF-07-25、PFF-07-31。
PCR进行定向进化的具体参数如下:
1) PCR 反应体系:
向 PCR 薄壁管中依次加入下列试剂
组分 | 体积 |
Template Plasmid(1-10 ng/μL) | 1 μL |
2xStarMut Random PCR Mix | 25 μL |
正向引物(10μM) | 1 μL |
反向引物(10μM) | 1 μL |
StarMut Enhancer | 1\5\20 μL |
Sterile Water 补足至 | 50 μL |
。
2) 混匀后短暂离心,放入 PCR 仪。
3) PCR 循环参数的设置:
流程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 2 min |
变性 | 94℃ | 30 s |
退火 | 55℃ | 1 min |
延伸 | 72℃ | 1 min/kb |
终延伸 | 72℃ | 7 min |
取 1-5 μL PCR 产物电泳检测条带浓度和特异性,易错PCR产物电泳结果。
其中,正向引物eppcrPFF-07-F序列如SEQ ID NO:26所示,反向引物eppcrPFF-07-R如SEQ ID NO:27所示。
实施例4 PFF-07突变启动子重组载体和重组菌株的构建
将易错 PCR 产物电泳,切胶回收目标 DNA 片段。通过PCR扩增,得到包含突变型的活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的目的片段PFF-07-6+lysC、PFF-07-10+lysC、PFF-07-15+lysC、PFF-07-16+lysC、PFF-07-23+lysC、PFF-07-25+lysC、PFF-07-31+lysC与载体pBAD-MCS-pBBR1进行连接,构建过表达重组质粒,通过电转将过表达重组质粒转入谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析,获得改造菌株分别命名为FF-lys199、FF-lys200、FF-lys201、FF-lys202、FF-lys203、FF-lys204、FF-lys205。
实施例5 PFF-07突变启动子重组菌株中lysC基因的表达量
通过实时荧光定量PCR,FF-lys199、FF-lys200、FF-lys201、FF-lys202、FF-lys203、FF-lys204、FF-lys205中lysC基因的表达量。表达量的qRT-PCR的方法如实施例2。
PFF-07突变启动子重组菌株中lysC基因的表达量结果见图6。根据lysC基因的表达量最终选择活性最好的PFF-07-16启动子,选最好的基因工程菌株FF-lys202用以后续实验。其他突变启动子效果较差,选取PFF-07-16启动子进行测序,序列如SEQ ID NO:28所示。
实施例6 包含PFF-07-16启动子的重组载体和重组菌株的构建
目的基因启动子PFF-05敲除质粒的构建,以CJHB100基因组为模板,扩增启动子基因的上游同源臂片段PFF-05-up(序列如SEQ ID NO:29所示)和下游同源臂片段PFF-05-down(序列如SEQ ID NO:30所示),在扩增的过程中,引入相应的酶切位点片段用HindIII、XbaI进行双酶切,载体pK18mobsacB用同样的限制性酶切酶进行双酶切,两个酶切产物以T4 DNALigase进行连接,获得重组质粒pK18mobsacB-PFF-05。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中,并在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含卡那霉素的LB培养基中,培养温度为30℃,200rpm振荡培养。此培养过程转化子,转化子发生第二次重组,通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4 ),稀释液涂布在含有10%蔗糖的LB固体培养基上,30℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带***的载体序列。通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析,获得目的突变菌株,并命名为FF-lys206。以菌株FF-lys202基因组为模板,以PFF-07-16-F/R引物对(序列如SEQ ID NO:31/32所示)进行PCR扩增,得到启动子PFF-07-16;利用同源重组将启动子PFF-07-16整合到敲除菌株FF-lys206,得到我们最终的生产菌株,命名为FF-lys207。
将重组菌株FF-lys195、FF-lys197、FF-lys202与初始菌株(FF-lys101)置于500ml三角摇瓶中进行发酵培养,培养温度30℃,培养时间14~15小时,每组实验设置三个平行。所述发酵培养基组分如下:葡萄糖60g/L,(NH4)2SO4 25g/L,KH2PO4 2.0g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,豆粕水解液10g/L,CaCO330g/L,NaOH调pH=7.0。各重组菌株摇瓶发酵生产L-赖氨酸的结果如图7所示;各重组菌株5L发酵罐生产L-赖氨酸的结果如图8所示。
结果表明,PFF-07启动子相对于PFF-05启动子提高了重组菌株生产L-赖氨酸的产量,PFF-07-16突变启动子相对于突变前的PFF-07启动子,进一步提高了重组菌株生产L-赖氨酸的产量。
本发明涉及的序列:
名称 | 序列 | SEQ ID NO |
PFF-05启动子 | AGAAACATCCCAGCGCTACTAATAGGGAGCGTTGACCTTCCTTCCACGGACCGGTAATCGGAGTGCCTAAAACCGCATGCGGCTTAGGCTCCAAGATAGGTTCTGCGCGGCCGGGTAATGCATCTTCTTTAGCAACAAGTTGAGGGGTAGGTGCAAATAAGAACGACATAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTTAATCAACATACACCACCACCTAAAAATTCCCCGACCAGCAAGTTCACAGTATTCGGGCACAATATCGTTGCCAAAATATTGTTTCGGAATATCATGGGATACGTACCCAACGAAAGGAAACACTC | 1 |
PFF-06启动子 | AACAGGAATGTTCCTTTCGAAAATTGAGGAAGCCTTAAGCCCTACAACCCTACTTAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTGTGACCAGCTACCCAATAAATAGGTGGGCTGAAAAATTTCGTTGCAATATCAACAAAAAGGCCTATCATTGGGAAGTGTCGCACCAAGTACTTTTGCGAAGCGCCATCTGACGGATTTTCAAAAGATGTATATGCTCGGTGCGGAAACCTACGAAAGGATTTTTTACCC | 2 |
PFF-07启动子 | AGAAACAGCCCAGCCCGACAATGAGCGAGCGCTGGCCTTCCTTCCAGGGCCCAGTAATTGGGGTGCCCAAAACTGCGTGCGGCTGAGGATCCAAAATAGGTTCTGAGCGGCCGGGCAGAGCATCTTCTTTAGCAACTAGTTGTGGTGCGGGAGCAAATAAGAACGACATAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTTACTCAACTTACACCACGGGCAAAATATTCCACGACCAGCAAGTTCACAGTATTCGGTCACAATATCGTTGCCAAAATAATCTTTCGACATATCATGGGGAACGTACCCCTAACGAAAGGAA | 3 |
PFF-08启动子 | AGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTTAATCAACATACACCACCACCTAAAAATTCCCCGACCAGCAAGTTCACAGTATTCGGGCACAATATCGTTGCCAAAATATTGTTTCGGAATATCATGGGATACGTACCCAACGAAAGGAAACACTC | 4 |
LysC | GCTTCAGGTTCAGGGCAACTGGACCAATGTGCTTTACGACGACCAGGTCGGCAAAGTCTCCCTCGTGGGTGCTGGCATGAAGTCTCACCCAGGTGTTACCGCAGAGTTCATGGAAGCTCTGCGCGATGTCAACGTGAACATCGAATTGATTTCCACCTCTGAGATCCGCATTTCCGTGCTGATCCGTGAAGATGATCTGGATGCTGCTGCACGTGCACTGCACGAGCAGTTCCAGCTTGGCGGCGAAGACGAAGCCGTCGTTTATGCAGGCACCGGACGCTAA | 5 |
PFF-05-F | CCCAAGCTTAGAAACATCCCAGCGCTA | 6 |
PFF-05-R | GTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 7 |
PlysC1-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 8 |
PlysC1-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGC | 9 |
PFF-06-F | CCCAAGCTTAACAGGAATGTTCCTTTC | 10 |
PFF-06-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGGGTAAAAAATCCTTTCGTAG | 11 |
PlysC2-F | TACGAAAGGATTTTTTACCCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 12 |
PlysC2-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 13 |
PFF-07-F | CCCAAGCTTAGAAACAGCCCAGCCCGACAA | 14 |
PFF-07-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCTTCCTTTCGTTAGGGGTACGT | 15 |
PlysC3-F | CGTACCCCTAACGAAAGGAAGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 16 |
PlysC3-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 17 |
PFF-08-F | CCCAAGCTTAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTT | 18 |
PFF-08-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 19 |
PlysC4-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 20 |
PlysC4-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 21 |
pBAD-F | TACTCCCGCCATTCAGAG | 22 |
pBAD-R | GCGTTTAAGGGCACCAAT | 23 |
QpcrLysC-F | TGTTACCGCAGAGTTCAT | 24 |
QpcrLysC-R | GCATCCAGATCATCTTCAC | 25 |
eppcrPFF-07-F | AGAAACAGCCCAGCCCGACAATG | 26 |
eppcrPFF-07-R | TTCCTTTCGTTAGGGGTACGTTC | 27 |
PFF-07-16 | agaaacatccctgcggtacaatagcgagcgttgccatcctaccacgcaccgctaatcggagagccttatacggcatgcggctaggctccaagataggtctgcgcggccgggtaatgcatcttctttagcaacaagttgaggggtaggtgcaaataagaacgacatagaaatcgtctcctttctgtttttaatcaacatacaccaccacctaaaaattccccgaccagcaagttcacagtattcgggcacaatatcgttgccaaaatattgtttcggaatatcatgggatacgtacccaacgaaaggaaacactc | 28 |
PFF-05-up | GCACTACCAAGAGGGTGCCGAAACCAAGTGCTACTGTTTGTAAGAAATATGCCAGCATCGCGGTACTCATGCCTGCCCACCACATCGGTGTCATCAGAGCATTGAGTAAAGGTGAGCTCCTTAGGGAGCCATCTTTTGGGGTGCGGAGCGCGATCCGGTGTCTGACCACGGTGCCCCATGCGATTGTTAATGCCGATGCTAGGGCGAAAAGCACGGCGAGCAGATTGCTTTGCACTTGATTCAGGGTAGTTGACTAAAGAGTTGCTCGCGAAGTAGCACCTGTCACTTTTGTCTCAAATATTAAATCGAATATCAATATATGGTCTGTTTATTGGAACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATCCGCTAAAGCCCCAGGAACCCTGTGCAGAAAGAAAACACTCCTCTGGCTAGGTAGACACAGTTTATAAAGGTAGAGTTGAGCGGGTAACTGTCAGCACCTAGATCGAAAGGTGCACAAAGGGATCAAGGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC | 29 |
PFF-05-down | ATATGGCCCTGGTCGTACAGAAATATGGCGGTTCCTCGCTTGAGAGTGCGGAACGCATTAGAAACGTCGCTGAACGGATCGTTGCCACCAAGAAGGCTGGAAATGATGTCGTGGTTGTCTGCTCCGCAATGGGAGACACCACGGATGAACTTCTAGAACTTGCAGCGGCAGTGAATCCCGTTCCGCCAGCTCGTGAAATGGATATGCTCCTGACTGCTGGTGAGCGTATTTCTAACGCTCTCGTCGCCATGGCTATTGAGTCCCTTGGCGCAGAAGCCCAATCTTTCACGGGCTCTCAGGCTGGTGTGCTCACCACCGAGCGCCACGGAAACGCACGCATTGTTGATGTCACTCCAGGTCGTGTGCGTGAAGCACTCGATGAGGGCAAGATCTGCATTGTTGCTGGTTTCCAGGGTGTTAATAAAGAAACCCGCGATGTCACCACGTTGGGTCGTGGTGGTTCTGACACCACTGCAGTTGCGTTGGCAGCTGCTTTGAACGCTGATGTGTGTGAGAT | 30 |
PFF-07-16-F | AGAAACATCCCTGCGGTAC | 31 |
PFF-07-16-R | GAGTGTTTCCTTTCGTTGG | 32 |
。
最后说明的是,以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案,并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种启动子,其特征在于,所述启动子的序列如SEQ ID NO:28所示。
2.权利要求1所述的启动子在提高lysC基因表达量的应用,其特征在于,所述启动子作为lysC基因表达的启动子。
3.一种基因表达框,其特征在于,包含权利要求1所述的启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列,所述编码序列为lysC基因的编码序列。
4.一种重组载体,其特征在于,所述重组载体包含:权利要求1所述的启动子,或权利要求3所述的基因表达框。
5.如权利要求4所述的重组载体,其特征在于,所述重组载体是在载体pBAD-MCS-pBBR1或pK18mobsacB上连接所述启动子或基因表达框的基因片段而获得。
6.权利要求4或5所述的重组载体在提高生产赖氨酸的菌株的赖氨酸产量的应用,其特征在于,所述菌株为谷氨酸棒状杆菌。
7.一种重组菌株,其特征在于,所述重组菌株包含权利要求1所述的启动子、权利要求3所述的基因表达框,或权利要求4或5所述的重组载体;所述重组菌株为重组谷氨酸棒状杆菌。
8.权利要求7所述重组菌株的的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:制备包含权利要求1所述启动子和lysC基因编码序列的基因片段,与载体连接获得重组载体,电转入谷氨酸棒状杆菌获得可增强lysC基因表达量的重组菌株。
9.一种生产赖氨酸的方法,其特征在于,包括使用权利要求7所述重组菌株。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311376891.6A CN117106783B (zh) | 2023-10-24 | 2023-10-24 | 一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311376891.6A CN117106783B (zh) | 2023-10-24 | 2023-10-24 | 一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117106783A CN117106783A (zh) | 2023-11-24 |
CN117106783B true CN117106783B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=88811394
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311376891.6A Active CN117106783B (zh) | 2023-10-24 | 2023-10-24 | 一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117106783B (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102010862A (zh) * | 2004-12-16 | 2011-04-13 | Cj第一制糖株式会社 | 启动子核酸、表达盒和载体、宿主细胞和使用该细胞表达基因的方法 |
CN111197021A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-26 | 江南大学 | 一种l-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法 |
CN111909944A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-11-10 | 内蒙古伊品生物科技有限公司 | 一种lysC基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 |
CN112980867A (zh) * | 2021-03-09 | 2021-06-18 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产l-氨基酸的应用 |
WO2022017221A1 (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用 |
-
2023
- 2023-10-24 CN CN202311376891.6A patent/CN117106783B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102010862A (zh) * | 2004-12-16 | 2011-04-13 | Cj第一制糖株式会社 | 启动子核酸、表达盒和载体、宿主细胞和使用该细胞表达基因的方法 |
CN111197021A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-26 | 江南大学 | 一种l-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法 |
CN111909944A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-11-10 | 内蒙古伊品生物科技有限公司 | 一种lysC基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 |
WO2022017221A1 (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用 |
CN112980867A (zh) * | 2021-03-09 | 2021-06-18 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产l-氨基酸的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Corynebacterium ammoniagenes isolate MGYG-HGUT-01533 genome assembly, chromosome: 1,ACCESSION:LR698967;GenBank;GenBank;第1-2页 * |
lysC 定点突变及lysC、asdA 串联表达对谷氨酸棒杆菌 L- 苏氨酸积累的影响;黄勤勤等;生物技术通报;第35卷(第2期);第93-100页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117106783A (zh) | 2023-11-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6219481B2 (ja) | L−リジン生産能を有する微生物を用いてl−リジンを生産する方法 | |
CN105734004B (zh) | 重组菌株及其制备方法、应用 | |
CN110249054A (zh) | 产生imp的微生物和使用其产生imp的方法 | |
CN110607313B (zh) | 一种高产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
CN113322218A (zh) | 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 | |
CN110951662A (zh) | 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用 | |
CN112695036A (zh) | 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用 | |
CN111979164B (zh) | 一种产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
CN110423734A (zh) | 具有增强的l-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生物产生l-赖氨酸的方法 | |
HUE030771T2 (en) | A method of producing an improved promoter and an improved promoter using L-lysine | |
CN111411092A (zh) | 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用 | |
CN116547297A (zh) | 表达奥奈达湖希瓦氏菌衍生蛋白的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法 | |
CN106635945B (zh) | 重组菌株及其制备方法和生产l-苏氨酸的方法 | |
CN106701649B (zh) | 生产l-谷氨酰胺的菌株和生产l-谷氨酰胺的方法 | |
CN109913397A (zh) | 产生5′-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物和使用该微生物制备5′- 黄苷一磷酸的方法 | |
CN117106783B (zh) | 一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用 | |
CN111961635A (zh) | 一种产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
CN110846312A (zh) | 一种sdaA基因的启动子核酸序列、含有该核酸序列的重组菌株及其应用 | |
CN116769808A (zh) | 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用 | |
CN110804617B (zh) | 一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 | |
RU2811504C1 (ru) | Микроорганизмы с усиленной способностью продуцировать l-аминокислоты с разветвленной цепью и способ получения l-аминокислот с разветвленной цепью с их применением | |
CN115960801B (zh) | 一种高产l-苏氨酸的基因工程菌及其应用 | |
CN112662603B (zh) | 一种用于发酵生产l-赖氨酸的基因工程菌及其构建方法 | |
KR102263091B1 (ko) | L-분지쇄 아미노산 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 l-분지쇄 아미노산 생산방법 | |
KR102311391B1 (ko) | L- 분지쇄 아미노산 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용하여 l-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |