CN117074450A - 一种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，该方法包括以下步骤：步骤一、猕猴桃花粉形态学P/E指标数据收集；步骤二、猕猴桃花粉形态学P/E指标数据分布范围可视化。本发明的有益效果是：能通过较低倍数下的指标参数区分猕猴桃花粉形态学，可以同时将种间和种内的雌株花粉和雄株花粉一起评价，高效快速地直观地筛选猕猴桃突变体，为解决传统筛选猕猴桃突变体中的繁琐和缓慢过程，提高猕猴桃突变体筛选的效率和精度，为猕猴桃突变体筛选提供一种新方法，指向性地选育杂交亲本，为猕猴桃杂交以及新品种的选育提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及品种选育技术领域，具体涉及一种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法。
背景技术
猕猴桃隶属于猕猴桃科猕猴桃属，具有丰富的种质资源和多样性的材料，而种质资源遗传差异大小直接影响性状改良的效果，品种选育与种质创新依赖于优异基因的发掘，在方法上体现为突变材料的筛选与杂交亲本的选择。不同来源的材料种间和种内差异大，在新品种选育和种质创新方面的资源开发利用潜力很大。现有的育种方法多样，包括传统的实生选育，还有杂交育种、芽变选择、辐射诱变、生物技术育种等，但是新品种的选育主要以从野生资源和它们的实生子代中筛选材料培育为主，传统筛选的方法主要是针对实生苗的叶片、果实、根茎等组织结构进行外观的性状分析研究。近年来随着扫描电镜技术在猕猴桃属植物的孢粉学方面的应用，相关研究表明，猕猴桃花粉携带的遗传信息具有稳定的遗传共性特征，同时也具有多样性和差异性。
而在品种选育的过程中，现有猕猴桃突变体筛选技术中所存在的问题或缺陷：
1、传统筛选方法中，叶片、果实、根茎等组织结构需要根据季节或者年限来观察，很多时候突变体性状的表现不会出现在F1代，有可能要反复繁育好几代才会有所表现，在众多的实生苗中筛选突变体工作量非常大，筛选过程比较繁琐和缓慢，大大降低了筛选的效率和精度。
2、扫描电镜观察技术在花粉形态学上的应用，都有两个方面的缺点，一方面是需要测量花粉形态的多项指标，极轴长度(P)、赤道轴长度(E)、萌发沟长度、极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)、花粉粒大小(P×E)、萌发沟宽度、外壁纹饰等多项特征，根据多项指标进行平均值与标准差分析，或者计算变异系数，或者进行聚类分析，从而研究亲缘关系。这方面的不足之处在于，其一，在实际育种工作和科学研究中，基于猕猴桃属植物种间和种内资源的多样性，花粉种类和数量很多的情况下，因为观察测量各项指标较多导致工作量太大，会需要大量繁琐的人力和时间进行。其二，花粉外壁纹饰的观察对上机样品和拍摄条件要求高，现有技术条件下，一般在扫描电镜放大10000×倍以上进行观察，如果样品含水量或者导电性不佳，需要预先处理样品，费时费力；同时由于外壁纹饰的结构复杂多样，相关研究都是依赖于观察者的主观判断，没有定量指标，在大量筛选工作中不利于标准化的执行和工作效率的提高。其三，最终呈现的结果多为变异系数、聚类分析等，未能将数据可视化，解读实验结果需要筛选人员具备统计学基础，对分析人员的要求高。另外一方面的缺点是受限于现有方法，开展的相关研究几乎都是针对猕猴桃雄株的花粉进行相关研究，但是猕猴桃雌株也会产生花粉，且王明忠等从龙门山南段的美味猕猴桃突变种彩色猕猴桃中筛选出了具有生产利用价值的两性花(雌雄同花)品种龙山红，现有方法中未见将雌株花粉和雄株花粉一起评价筛选的研究报道。
因此，现提出一种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，能通过较低倍数下的指标参数区分猕猴桃花粉形态学，在猕猴桃新品种选育过程中，高效快速地直观地筛选猕猴桃突变体，指向性地选育杂交亲本，为猕猴桃杂交以及新品种的选育提供理论基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，该方法能通过较低倍数下的指标参数区分猕猴桃花粉形态学，在猕猴桃新品种选育过程中，高效快速地直观地筛选猕猴桃突变体，为解决传统筛选猕猴桃突变体中的繁琐和缓慢过程，提高猕猴桃突变体筛选的效率和精度提供一种新方法，指向性地选育杂交亲本，为猕猴桃杂交以及新品种的选育提供理论基础。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、猕猴桃花粉形态学P/E指标数据收集
分别进行不同猕猴桃雌株花和雄株花粉收集，使用扫描电子显微镜进行花粉粒样品的形态学观察拍照，使用软件ImageJ对照片进行花粉粒的极轴长度(P)和同一粒花粉对应的赤道轴长度(E)测量，然后进行极轴长度和赤道轴长度的比值(P/E)测量计算，得雌株花粉和雄株花粉的P/E指标数据；
步骤二、猕猴桃花粉形态学P/E指标数据分布范围可视化
将步骤步骤一中所得雌株花粉和雄株花粉的P/E指标数据同时使用软件Origin软件制作正态分布曲线轴须图。
进一步地，本方案中，所述的基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法还包括步骤三；
步骤三、图像分析
对正态分布曲线轴须图的正态分布范围的差异情况进行分析，筛选出猕猴桃突变体。
猕猴桃的雌株花粉和雄株花粉形状差异大，雌株花粉粒多为近球形或扁球形，雄株花粉粒多为超长球形或长球形，极轴长度和赤道轴长度的比值(P/E)数值差异明显，正态分布曲线轴须图不会有重合交集，而在猕猴桃新品种选育过程中，雌株猕猴桃突变体的正态分布图就会与同种雄花有所重合，雄株猕猴桃突变体的正态分布图会与同种雌花有所重合。且在轴须图中，猕猴桃突变体的正态分布范围较未突变的猕猴桃花粉更广。
在猕猴桃新品种选育中，有大量的猕猴桃野生资源和其实生子代样品需要筛选和评价时，现有方法或是因为需要根据季节或者年限来观察，或是因为对样品和操作人员要求过高，或是因为观察测量各项指标较多导致工作量太大，往往不能满足实际猕猴桃新品种选育筛选突变体工作的需要。而本方案通过较低倍数下的指标参数区分猕猴桃花粉形态学，可在猕猴桃新品种选育中，实现实生子代样品的筛选和评价。
由于本方案是在较低数倍数下进行，一张电镜图中可显示较多数量的花粉颗粒数，从而本方案无需拍摄多张照片进行数据提取，减少了工作量，且电镜扫描费时少，大大提高了猕猴桃突变体筛选的效率，且本方案将数据可视化，能高效快速且直观地筛选猕猴桃突变体，且筛选精度高。
在优选的实施方案中，所述的步骤步骤一中，扫描电子显微镜进行花粉粒的形态学观察拍照的放大倍数300～800倍。
在优选的实施方案中，所述的步骤步骤一中，利用软件ImageJ测量出每颗花粉粒对应的极轴长(P)、赤道长(E)，再用软件Excel计算出对应的极赤比(P/E)，每种花粉粒样品的个数不少于100个。
在优选的实施方案中，所述的步骤步骤一中，猕猴桃雌株花粉和雄株花粉收集的具体操作为：
在猕猴桃的初花期，采摘即将开放的花蕾，将花药用镊子剥至有盖培养皿中，在25℃恒温烘箱中放置24h，轻轻摇晃培养皿，待花粉完全散出后，放置在玻璃样品瓶内，-20℃条件下密闭保存备用。
在优选的实施方案中，所述的步骤步骤一中，使用扫描电子显微镜进行花粉粒形态学观察拍照的具体操作为：
将干燥的花粉粒样品黏在贴有导电胶布的样品载台上，用离子溅射仪喷金，在表面形成一层导电膜，喷金时间为1min，上机选取视野中的典型花粉粒进行观察、拍照。
本发明的有益效果是：
本方案方法能利用扫描电子显微镜在较低倍数下进行花粉粒形态学观察拍照，使用软件ImageJ对照片进行花粉粒的极轴长度(P)和同一粒花粉对应的赤道轴长度(E)测量，然后进行极轴长度和赤道轴长度的比值(P/E)测量计算，收集雌株花粉和雄株花粉的P/E指标数据；再使用软件Origin软件制作正态分布曲线轴须图，将猕猴桃花粉形态学P/E指标数据分布范围可视化，通过对正态分布曲线轴须图进行分析，区分猕猴桃花粉形态学，在猕猴桃新品种选育过程中，可以高效快速地直观地筛选猕猴桃突变体，为解决传统筛选猕猴桃突变体中的繁琐和缓慢过程，提高猕猴桃突变体筛选的效率和精度提供一种新方法，指向性地选育杂交亲本，为猕猴桃杂交以及新品种的选育提供理论基础。
附图说明
图1为中华猕猴桃不同花粉的P/E比值分布轴须图；
图2为中华猕猴桃不同花粉的扫描电镜形态图；
图3为美味猕猴桃不同花粉的P/E比值分布轴须图；
图4为美味猕猴桃不同花粉的扫描电镜形态图；
图5为软枣猕猴桃不同花粉的P/E比值分布轴须图；
图6为软枣、毛花猕猴桃不同花粉的扫描电镜形态图；
图7为毛花、葛枣、四萼、京梨猕猴桃不同花粉的P/E比值分布轴须图；
图8为葛枣、四萼、京梨猕猴桃不同花粉的扫描电镜形态图；
图9为中华猕猴桃雌株花粉在不同倍数下的扫描电镜形态图；
图10为中华猕猴桃雄株花粉在不同倍数下的扫描电镜形态图；
图11为中华猕猴桃的猕猴桃雄株花粉在200×的扫描电镜形态图；
图12为PCA分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
参阅表1，基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法包括以下步骤：
步骤一：花粉收集
将供试的猕猴桃花粉11份材料编号为样品1～11，在猕猴桃的初花期，采摘即将开放的花蕾，将花药用镊子剥至有盖培养皿中，在25℃恒温烘箱中放置24h，轻轻摇晃培养皿，待花粉完全散出后，放置在玻璃样品瓶内，-20℃条件下密闭保存备用；
步骤二：用扫描电子显微镜在500×的放大倍数下进行花粉粒的形态学观察拍照
取出步骤一干燥后的花粉粒样品黏在贴有导电胶布的样品载台上，用离子溅射仪喷金，在表面形成一层导电膜，喷金时间为1min，上机后选取视野中的典型花粉粒进行观察、拍照；
步骤三：P/E指标数据收集
利用软件ImageJ测量出步骤二所得照片中的每颗花粉粒对应的极轴长(P)、赤道长(E)，再用软件Excel计算出对应的极赤比(P/E)，每种样品花粉粒的个数不少于100个，得雌株花粉和雄株花粉的P/E指标数据；
步骤四：P/E指标数据分布范围可视化
将步骤三中所得雌株花粉和雄株花粉的P/E指标数据同时使用软件Origin软件制作正态分布曲线轴须图，如图1所示；
步骤五：图像分析
对正态分布曲线轴须图的正态分布范围的差异情况进行分析，筛选出猕猴桃突变体。
本实施例中，雌株猕猴桃10号样品的正态分布图与同种雄花有所重合，雄株猕猴桃4号样品的正态分布图与同种雌花有所重合，且图1中4号样品和10号样品的正态分布范围较其余猕猴桃花粉更广。
具体的，本实施例中，图1所示中华猕猴桃的雌株花粉7、8、9、11号样品材料的X值约分布在0.60到1.25之间，分布范围较窄且集中，重合度较高；雄株花粉1、2、3、5、6号材料的X值约分布在1.60至2.60之间，分布范围同样较窄且集中，重合度较高，同于雌株株花粉中的7、8、9、11号材料的分布趋势。
而雌株花粉中的10号材料、雄株花粉中的4号材料分布趋势差异较大。10号材料的X分布范围为0.60到1.80，分布范围很宽，与大部分的雌株花粉重合度不高，有部分值却和雄株花粉重合在一起，比值分布集中在1.25左右，该区域几乎不含有雌株花粉和雄株花粉的比值。雄株花粉中的4号材料X分布范围为1.50到2.50左右，分布范围有部分与其他雄株花粉不重合，靠近于雌株花粉这边，与雌株花粉中的10号材料有部分重合，从分布轴须图中可见4号、10号材料不同于其他材料，在猕猴桃新品种选育过程中，可判断4号、10号材料为突变植株。
进一步地，本实施例中，以样品的P/E正态分布曲线的最高点对应的P/E值为该样品的Xm；雄株群体中，样品4的Xm值与雄株群体Xm的大小差异大于0.50；雌株群体中，样品10的Xm值与雌株群体Xm的大小差异大于0.25。差异明显。
表1不同猕猴桃花粉的形态特征与大小
扫描电镜图观察实验
本实验利用扫描电镜图观察实施例1中的1、2、4、7、9、10号材料的花粉形态，根据花粉形态是否一致判断样品是否发生了突变。
利用扫描电镜图观察样品突变情况时，通常需在1000×及以上的放大倍数下观察，因此，采用扫描电子显微镜在1000×放大倍数下拍摄中华猕猴桃不同花粉的扫描电镜形态图，结果如图2所示。图中，A、B、C分别为中华猕猴桃雌株花粉7、9、10号材料，图D、E、F分别为中华猕猴桃雄株花粉1、2、4号材料。
从图2的扫描电镜图中可看出，A、B雌株花粉的形态一致，D、E雄株花粉的形态一致，几乎没有变化，而C、F图中的4号材料、10号材料花粉形态与其他花粉粒不一致(箭头所示花粉粒)，例如，图2中F图示的雄性花粉粒的极轴长度P变短，赤道轴长度E变长；图2中C图示雌性花粉粒极轴长度P变长，而赤道轴长度E变短，相应地在花粉形态上发生了突变，与实施例1中的判断结果一致，因此，本方案能在较低倍数下的指标参数区分猕猴桃花粉形态学，进而本方案可用于猕猴桃新品种选育过程中猕猴桃突变株筛选。
此外，本实验还通过扫描电子显微镜对中华猕猴桃雌株花粉，在放大倍数分别为500×、1000×、3500×、15000×时进行拍照，结果如图9所示；对中华猕猴桃雄株花粉，在放大倍数分别为500×、1000×、3500×、10000×时进行拍照，结果如图10所示；并对中华猕猴桃的猕猴桃雄株花粉，在放大倍数为200×时进行拍照，结果如图11所示。
从图9、图10中可看出，在放大倍数为500×时，花粉数量较多，花粉粒图像较小，花粉形态不易直观观察，从图11中可看出，在放大倍数为200×时，花粉粒的形态无法清晰观察，但花粉粒的颗粒轮廓清晰，花粉粒的极轴长度(P)和赤道轴长度(E)仍然可清晰测量，因此，可知在放大倍数为200倍时，可以满足本方案的实验要求，在200倍可通过本方案实现猕猴桃突变体的快速筛选，较传统突变株的选育方法而言，本方案方法可实现更低倍数下的突变株筛选。
实施例2
本实施例与实施例1的操作步骤相同，本实施例与实施例1的区别仅在于本实施例供试的猕猴桃花粉材料与实施例1不同，参阅表1，本实施例的猕猴桃花粉材料为编号12～25。
本实施例所得美味猕猴桃不同花粉的P/E比值分布轴须图如图3所示，图3中所示美味猕猴桃的花粉分布范围，总的来说，雌株花粉21、22、23、24号材料X分布在0.50到1.50左右，雄株花粉12、13、14、15、16、18、19、20号材料X分布在1.50至2.75左右，雌株花粉和雄株花粉几乎不重合，较为集中地分布在两个区域。
而雄株花粉17号材料X分布范围为0.60到2.00左右，分布范围广，分布范围包含雌株花粉和雄株花粉的分布范围，且与雌株花粉重合区域更多；25号材料为两性花龙山红样本，比值约分布在0.50到1.75之间，分布范围也较广，包含雌株花粉和雄株花粉，很大一部分区域与17号材料重合在一起，在猕猴桃新品种选育过程中，可判断17号材料、25号材料为突变植株。
进一步地，本实施例中，同样以样品的P/E正态分布曲线的最高点对应的P/E值为该样品的Xm；雄株群体中，样品17的Xm值与雄株群体Xm的大小差异大于0.50；样品25的Xm值与雌株群体Xm的大小差异大于0.25。差异明显。
图4为美味猕猴桃不同花粉的扫描电镜形态图(放大倍数为1000×)，图中，A、B分别为美味猕猴桃雌株花粉22、23号材料，C为美味猕猴桃突变体两性花25号材料，D、E、F分别为美味猕猴桃雄株花粉16、18、17号材料；扫描电镜图中也可看出17号材料、25号材料在形态上区别较大(箭头所示)，花粉形态上发生了突变，与本方案的判断结论一致。
实施例3
本实施例与实施例1的操作步骤相同，本实施例与实施例1的区别仅在于本实施例供试的猕猴桃花粉材料与实施例1不同，参阅表1，本实施例的猕猴桃花粉材料为编号26～39。
本实施例中，26～30号材料作为一组样本进行了突变体筛选，31～39号材料作为一组样本进行了突变体筛选，所得美味猕猴桃不同花粉的P/E比值分布轴须图分别如图5、图6所示。
图5软枣猕猴桃的雌株X分布范围约在0.60到1.50之间，雄株分布范围约在1.60到2.60之间。图7所示毛花猕猴桃、葛枣猕猴桃、四萼猕猴桃、京梨猕猴桃的雌株分布范围约在0.50到1.50之间，雄株分布范围约在1.50到2.75之间。
从图5、图7可看出，比值分布均表现为分布范围较为集中且重合区域较大，雌株和雄株花粉分布在不同的区域，且区域之间几乎不重合，判断26～39猕猴桃花粉材料中无突变体。
图6为软枣猕猴桃、毛华猕猴不同花粉的扫描电镜形态图(放大倍数为1000×)，其中A2、B2分别为软枣猕猴桃雌株花粉29、30号材料，C2为毛花猕猴桃32号材料，D2、E2分别为软枣猕猴桃雄株花粉27、28号材料，F2为毛花猕猴桃31号材料。
图8为葛枣猕猴桃、四萼猕猴桃、京梨猕猴桃不同花粉的扫描电镜形态图(放大倍数为1000×)，其中A3为葛枣猕猴桃雌株花粉34号材料，B3为四萼猕猴桃雌株花粉36号材料，图C3为京梨猕猴桃雌株花粉39号材料，D3为葛枣猕猴桃雄株花粉33号材料，E3为四萼猕猴桃雄株花粉35号材料，F3为京梨猕猴桃37号材料。
从图6、图8的扫描电镜图也可看出，雄株或雌株花粉在形态上一致，几乎没有差异，未发生突变，与本方案的判断结论一致。
主成分分析((PCA,principal component analysis))实验
本实验的目的在于利用PCA分析验证本发明方法
实施例1～实施例3共39份供试材料，包括7种猕猴桃花粉，在极轴长度(P)、赤道轴长度(E)、萌发沟长度、极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)、花粉粒大小(P×E)、萌发沟宽度、外壁纹饰7项花粉特征指标中，为了降低扫描电镜操作要求，提高工作效率，选择在较低倍数下(500×)拍照观察，舍去在高倍数下观察的萌发沟宽度和外壁纹饰两项特征，增加观察群体数量的同时减少测量指标数量。然后为了探究较低倍数下的极轴长度(P)、赤道轴长度(E)、萌发沟长度、极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)、花粉粒大小(P×E)5项指标(低倍数下)是否可行以及相关指标的降维，运用软件Grapad Prism 9.5进行主成分(PCA)分析，PCA分析图示如图12所示，图中，A0为PCA陡坡图，B0为PCA方差比例图，C0为PCA得分图，D0为PCA载荷图，陡坡图、方差比例图显示前两个主成分的贡献度总方差为96.27％，几乎可以涵盖原始变量的信息，得分图中样本间有一定的程度的聚类，雌株花粉和雄株花粉存在明显分离，二者之间相似度不大，载荷图表明5项指标中极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)与赤道轴长度(E)夹角最大，冗余信息很少，二者具有区分意义，由此说明较低倍数下的指标参数可以区分猕猴桃花粉形态学。
在较低倍数的5项指标中，极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)这项指标在花粉形态学上起着关键的作用，特别是在突变体的花粉形态上具有重要参考价值，发生改变的花粉形态会与群体有一定程度上的差异，为此，在利用ImageJ软件快速测量多组极轴长度与赤道轴长度比值(P/E)以后，采用软件Origin2021绘制极轴长度与赤道长度比值(P/E)的正态曲线分布轴须图，将所有数据简单明了地可视化呈现出来，从不同猕猴桃花粉的P/E比值的正态分布区间中分析得出4、10、17、25号材料差异较大，4号材料为中华猕猴桃雄株花粉，10号材料为中华猕猴桃雌株花粉，17号为美味猕猴桃雄株花粉，25号材料为美味猕猴桃的突变体两性花龙山红猕猴桃花粉，再对照相应的扫描电镜图片(1000倍数)，均可在群体中找到形状差异较大的突变花粉粒，验证该种方法可以同时将种间和种内的雌株花粉和雄株花粉一起评价，高效快速地直观地筛选猕猴桃突变体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、猕猴桃花粉形态学P/E指标数据收集
分别进行不同猕猴桃雌株花和雄株花粉收集，使用扫描电子显微镜进行花粉粒样品的形态学观察拍照，使用软件ImageJ对照片进行花粉粒的极轴长度(P)和同一粒花粉对应的赤道轴长度(E)测量，然后进行极轴长度和赤道轴长度的比值(P/E)测量计算，得雌株花粉和雄株花粉的P/E指标数据；
步骤二、猕猴桃花粉形态学P/E指标数据分布范围可视化
将步骤步骤一中所得雌株花粉和雄株花粉的P/E指标数据同时使用软件Origin软件制作正态分布曲线轴须图。
2.根据权利要求1所述的种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，其特征在于，所述的基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法还包括步骤三；
步骤三、图像分析
对正态分布曲线轴须图的正态分布范围的差异情况进行分析，筛选出猕猴桃突变体。
3.根据权利要求1或2任一项所述的种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，其特征在于，所述的步骤步骤一中，扫描电子显微镜进行花粉粒的形态学观察拍照的放大倍数为300～800倍。
4.根据权利要求2所述的种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，其特征在于，所述的步骤步骤一中，利用软件ImageJ测量出每颗花粉粒对应的极轴长(P)、赤道长(E)，再用软件Excel计算出对应的极赤比(P/E)，每种花粉粒样品的个数不少于100个。
5.根据权利要求2所述的种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，其特征在于，所述的步骤步骤一中，猕猴桃雌株花粉和雄株花粉收集的具体操作为：
在猕猴桃的初花期，采摘即将开放的花蕾，将花药用镊子剥至有盖培养皿中，在25℃恒温烘箱中放置24h，轻轻摇晃培养皿，待花粉完全散出后，放置在玻璃样品瓶内，-20℃条件下密闭保存备用。
6.根据权利要求5所述的种基于花粉形态学筛选猕猴桃突变体的方法，其特征在于，所述的步骤步骤一中，使用扫描电子显微镜进行花粉粒形态学观察拍照的具体操作为：
将干燥的花粉粒样品黏在贴有导电胶布的样品载台上，用离子溅射仪喷金，在表面形成一层导电膜，喷金时间为1min，上机选取视野中的典型花粉粒进行观察、拍照。
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