CN117070375B - 一种复合微生物菌剂及其在土壤生态修复中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合菌微生物剂，其包括黑曲霉CA‑5、波兰青霉CFP‑2、类芽孢杆菌CBP‑2以及链霉菌CS13‑6，该复合菌剂具有良好的盐碱耐受性，定殖能力强，有效释放土壤中的硅、磷、钾等元素，降低土壤pH和盐分含量，增加土壤肥力，显著促进植物生长。在土壤生态修复，尤其是在盐碱地土壤修复中具有切实的经济效益和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一种复合菌剂及其在土壤生态修复中的应用。
背景技术
土地盐渍化会造成土壤板结，透气性、透水性差、含盐量高、pH高，造成农田养分损失严重，氮磷养分利用效率偏低，不利于农作物生长，易造成农作物减产甚至死亡。盐碱地治理作为一项世界性难题，全球有超100个国家受到盐渍化土的困扰。中国的盐渍土面积约有1亿hm2，其中可进行治理、修复及利用的各类盐渍土面积0.36亿hm2，可开发利用为农业发展前景的盐碱地超0.067亿hm2。中国作为盐渍化土壤分布面积大、区域广、污染严重的国家之一，迫切需要推进盐渍化土壤的生态化治理与盐渍化防控理论和技术研究。
通过人们长期对盐碱地的治理，主要修复方法有以下三类：(1)物理修复法，主要通过排水、冲洗、松土、施肥和铺沙压碱等措施；(2)化学修复法，主要通过土壤胶粒和外源添加物之间发生的化学反应对盐碱地进行修复，如添加沸石、泥碳、磷石膏、风化煤等物质；(3)生物修复法，以种植耐盐植物为主对盐碱地进行修复，同时利用微生物进行修复盐碱地的报道也很多。
目前，已经发现的耐盐碱促生菌株有假单胞菌、固氮螺菌、节杆菌、芽孢杆菌、肠杆菌等，但是由于土壤***相当于一个复杂的微生态***，每种菌的修复机理并不完全相同，就需要根据实际需要去大量挖掘新型高效功能微生物，以及利用不同微生物修复机理进行组合，有效提高土壤修复效率。开发低成本又不污染环境的微生物修复菌剂，提升土壤质量，对发展绿色生态农业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有良好的高盐耐受性，定殖能力强，且显著促进植物生长的复合菌剂，同时也提供了上述复合菌剂在土壤生态修复中的应用。
本发明涉及如下技术方案：
一种复合菌剂，其包括黑曲霉CA-5、波兰青霉CFP-2、类芽孢杆菌CBP-2以及链霉菌CS13-6。
进一步的，所述黑曲霉CA-5、波兰青霉CFP-2、类芽孢杆菌CBP-2以及链霉菌CS13-6的孢子数之比为30～55∶20～40∶10～20∶15～25。
进一步的，所述复合菌剂中，总孢子数不低于1×109CFU/g。
其中，所述黑曲霉(Aspergillus niger)CA-5的保藏编号为CGMCC No.40271，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年8月12日。
其中，所述波兰青霉(Penicillium polonicum)CFP-2的保藏编号为CGMCCNo.40494，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏日期为2023年2月8日。
其中，所述类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)CBP-2的保藏编号为CGMCC No.26727，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏日期为2023年3月3日。
其中，所述链霉菌(Streptomyces sp.)CS13-6的保藏编号为CGMCC No.25523，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏日期为2022年8月12日。
一种上述复合菌剂的制备方法，将黑曲霉CA-5、波兰青霉CFP-2分别在PDA固体平板培养基生长至产孢，类芽孢杆菌CBP-2在PB液体培养基生长至产芽孢，链霉菌CS3-16用高氏1号培养基培养至产孢。用无菌水清洗孢子，统计孢子悬液中各孢子含量，按比例进行混合，获得复合菌孢子液。
一种上述复合菌剂在土壤生态修复中的应用。
应用中，所述土壤为盐碱地土壤，也可以用于碱性尾矿区土壤。
本发明的有益效果在于：本发明的复合菌剂由多种益生菌组成，具有良好的酸碱和高盐耐受性，定殖能力强，各菌种相互配合、协同增效，使土壤内有益菌群大量增加，可恢复土壤微生物群落的多样性，同时具有释硅作用，还能解磷、解钾、固氮、产嗜铁素和IAA，不仅改善土壤养分、降低土壤pH和盐分含量，增加土壤团粒结构和有机质含量，而且显著促进植物生长，在盐碱地土壤修复中具有切实的经济效益和广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
实施例1复合菌剂的制备
(1)黑曲霉CA-5孢子液的制备
黑曲霉(Aspergillus niger)CA-5的保藏编号为CGMCC No.40271，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年8月12日。
用接种环挑取部分黑曲霉CA-5孢子均匀接种于PDA固体平板培养基上，35℃，培养3～5d，长满黑色孢子后，刮取PDA固体培养基表面孢子置于20mL含有玻璃珠的无菌水中，35℃、200rpm摇床振荡20～30min制成孢子悬液，血球计数板计数，黑曲霉CA-5孢子液浓度≥1×109CFU·mL-1。
PDA培养基(g/L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L，pH自然。固体培养基需加琼脂15～20g。
(2)波兰青霉菌CFP-2孢子液的制备
所述波兰青霉(Penicillium polonicum)CFP-2的保藏编号为CGMCC No.40494，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏日期为2023年2月8日。
用接种环挑取部分波兰青霉CFP-2孢子均匀接种于PDA固体平板培养基上，25℃，培养3～5d，长满绿色孢子后，刮取PDA固体培养基表面孢子置于20mL含有玻璃珠的无菌水中，25℃、200rpm摇床振荡20～30min制成孢子悬液，血球计数板计数，波兰青霉菌CFP-2孢子液浓度≥1×109CFU·mL-1。
PDA培养基(g/L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L，固体培养基需加琼脂15～20g，pH自然。
(3)类芽孢杆菌CBP-2孢子液制备
所述类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)CBP-2的保藏编号为CGMCCNo.26727，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏日期为2023年3月3日。
用接种环挑取部分类芽孢杆菌CBP-2接种于PB液培养基上，28℃，培养2～3d，涂片显微镜观察，当80％以上的为芽孢时，停止培养，平板计数，使类芽孢杆菌CBP-2孢子液浓度≥1×109CFU·mL-1。
PB液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、蒸馏水1L，pH 7.0～7.2。
(4)链霉菌CS13-6孢子液的制备
所述链霉菌(Streptomyces sp.)CS13-6的保藏编号为CGMCC No.25523，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏日期为2022年8月12日。
用接种环挑取部分链霉菌CS13-6孢子均匀接种于高氏1号固体平板培养基上，28℃，培养5～8d，长满孢子后，刮取固体培养基表面孢子置于20mL含有玻璃珠的无菌水中，25℃、200rpm摇床振荡20～30min制成孢子悬液，血球计数板计数，链霉菌CS13-6孢子液浓度≥1×109CFU·mL-1。
高氏1号培养基：KNO3 1g、可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸馏水1L，pH为7.4～7.6，固体培养基需加琼脂15～20g。
(4)复合菌剂的混合
按照表1所示，对黑曲霉CA-5、波兰青霉CFP-2、类芽孢杆菌CBP-2以及链霉菌CS13-6的孢子悬液进行混合，得到复合微生物菌剂，复合菌剂中总孢子数不低于1×109CFU/mL。
表1复合菌剂的配比
对比例
实施例1中制备得到的黑曲霉CA-5孢子作为对比菌剂1。
实施例1中制备得到的波兰青霉CFP-2孢子作为对比菌剂2。
实施例1中制备得到的类芽孢杆菌CBP-2孢子作为对比菌剂3。
实施例1中制备得到的链霉菌CS13-6孢子作为对比菌剂4。
上述各对比菌剂中，总孢子数量不低于1×109CFU/g。
实验例1复合菌剂对生菜生长的影响
随机挑选大小均匀、子粒饱满的健康生菜种子，利用70％乙醇和3％ NaClO水溶液进行种子表面消毒。生菜育苗：将购买商品育苗基质均匀平铺到育苗盘中，种子均匀洒在育苗盘上，在上面覆盖约0.5cm左右基质，浇水后不露种子即可。播种完成后育苗盘用水浇透，置于温室中培育。
生菜定植：待生菜长到三叶一心时，从育苗盘中选取大小一致的生菜苗移栽到直径15cm的花盆中，盆栽土壤取自河北沧州盐碱地，土壤含盐量0.41％，pH为8.2。实验设置9个处理，空白对照CK不加菌剂，另外8个处理将复合菌剂1～4和四种单一菌剂(对比菌剂1～4)拌入土壤中，每克土壤中孢子浓度为2×106CFU，每处理10盆，重复三次，白天室温设置为28℃，光照12h，夜间室温设置为24℃，黑暗时间为12h，25～30d测定生菜的单株产量、株高、叶片数、叶长和叶宽。
不同菌剂对盆栽生菜生长的影响如表2所示，添加微生物菌剂的处理对生菜的生长均有显著促进作用，生菜的各项生长指标均有明显提升，其中复合菌剂的效果显著优于单一菌剂处理，单一菌剂处理显著优于对照组。说明，在盐碱地种植生菜，施用复合菌剂对生菜生长有更显著的促进作用。
表2菌剂对生菜植株生长的影响
注：结果为重复测定值的平均值(标准误)；不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
实验例2复合菌剂对玉米生长及土壤性质的影响
土壤取自河北沧州盐碱地，土壤含盐量0.45％，pH为8.7。实验设置9个处理，空白对照CK不加任何菌剂，另外8个处理将复合菌剂1～4和四种单一菌剂(对比菌剂1～4)拌入土壤中，每克土壤中孢子浓度为2×106CFU，每处理10盆,重复三次，置于25℃温室中，在种子萌发后保留每盆中生长最为良好的三株幼苗，每组设6个重复，定期补水。另外，添加菌剂组每隔15d，在每个盆中浇施补充2～5mL孢子悬液，对照补充相同数量的无菌水，定期观察记录植株的形态特征。40d后对土壤和植株(玉米)的地上指标及根系生长状况进行测定。
表3不同菌剂对玉米植株生长的影响
注：结果为重复测定值的平均值(标准误)；不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
表4不同菌剂对土壤性质的影响
注：结果为重复测定值的平均值(标准误)；不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
结果显示(见表3和表4)：添加菌剂处理的玉米在植株长势及根系方面都要显著优于对照处理，添加复合菌剂的处理显著优于单一菌剂处理。土壤中有效硅、速效钾、有效磷和全氮的含量显著提高，单一菌剂比对照提高20％以上，复合菌剂比对照提高35％以上。同时，土壤中的盐含量和pH显著下降。进一步说明在土壤中施入功能微生物菌剂，不仅可以显著提高植物产量，降低土壤pH和盐分含量，而且可以显著提升土壤肥力和土壤质量，可以用于生物有机肥的生产应用或盐碱土壤改良。
根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种复合菌剂，其特征在于，其包括黑曲霉CA-5、波兰青霉CFP-2、类芽孢杆菌CBP-2以及链霉菌CS13-6；
所述黑曲霉CA-5的保藏编号为CGMCC No.40271，所述波兰青霉CFP-2的保藏编号为CGMCC No.40494，所属的类芽孢杆菌CBP-2的保藏编号为CGMCC No.26727，所述链霉菌CS13-6的保藏编号为CGMCC No.25523。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述黑曲霉CA-5、波兰青霉CFP-2、类芽孢杆菌CBP-2以及链霉菌CS13-6的孢子数之比为30~55∶20~40∶10~20∶15~25。
3.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，总孢子数不低于1×109 CFU/g。
4.一种如权利要求1~3任一项所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，将黑曲霉CA-5、波兰青霉CFP-2在PDA固体平板培养基生长至产孢；类芽孢杆菌CBP-2在PB液体培养基生长至产芽孢；链霉菌CS13-6在固体高氏1号培养基生长至产孢；用无菌水从平板上将孢子洗下，统计孢子悬液中的孢子含量，按比例进行混合，获得复合菌孢子液。
5.一种如权利要求要求1~3任一项所述复合菌剂在土壤生态修复中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述土壤为盐碱地土壤。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述土壤为碱性尾矿区土壤。
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