CN117051087A - 一种egfr胞外结构域区域突变的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，公开了一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法，包括以下步骤：一、设计ARMS特异性引物；二、血液或组织样本提取；三、PCR反应设置；四、PCR扩增反应；五、实时荧光信号检测；六、数据分析。本方案提供的EGFR基因突变检测体系，具有极高的特异性和灵敏性，且操作简单快速，并且结果判读简单客观，便于分析，适用于大规模推广应用，EGFR胞外突变检测可以为个体化治疗提供指导，预测预后和治疗反应，早期诊断和筛查，以及肿瘤监测和治疗效果评估。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，更具体地说，涉及一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法。
背景技术
EGFR胞外突变指的是表皮生长因子受体(EGFR)基因的胞外(细胞膜外)区域发生的突变。这些突变在肿瘤发生和进展中起着重要作用，特别是在某些癌症类型中。
EGFR基因7号外显子上，存在p.A289V(c.866C>T)、p.A289T(c.865G>A)、p.A289D(c.866C>A)等突变，它们编码EGFR蛋白胞外区氨基酸，主要在胶质母细胞瘤患者中被发现，目前相关研究报道较少，一些非小细胞肺癌病例中也有零星的报道。
现有的临床数据和动物实验表明，携带EGFRA289突变的胶质母细胞瘤患者，其肿瘤具有更高的侵袭性，总体生存期更短。细胞实验表明，EGFRA289变异的细胞株对厄洛替尼敏感，具有成为新的肿瘤标志物和治疗靶点的潜力。
故提出一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法，用以解决背景技术问题。
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法，包括以下步骤：
一、设计ARMS特异性引物：设计能够与EGFR基因的A289V和A289T突变位点匹配的ARMS特异性引物；
二、血液或组织样本提取：从患者的血液或肿瘤组织中提取DNA作为PCR反应的模板；
三、PCR反应设置：根据PCR实验室常规操作进行反应体系的设置，然后添加含有特异性引物和Taqman探针的PCRmix。
四、PCR扩增反应：将DNA模板与PCRmix一起加入PCR管或板中，并在实时荧光定量PCR平台上进行PCR扩增反应；
五、实时荧光信号检测：在PCR过程中，荧光定量PCR平台实时监测扩增产物，利用Taqman探针对扩增片段进行特异性标记，荧光信号会根据突变位点是否存在而释放出不同的信号；
六、数据分析：通过实时荧光定量PCR平台的软件，可以分析每个样本的荧光信号曲线，并根据标准曲线或阈值设定来判断样本中是否存在EGFRA289突变。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述ARMS特异性引物的3'末端匹配突变碱基，且引入倒数第二/三位的错配碱基，阻滞野生型模板扩增。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述血液或组织样本提取可以根据实验室常规的DNA提取方法进行。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本方案提供的EGFR基因突变检测体系，具有极高的特异性和灵敏性，且操作简单快速，并且结果判读简单客观，便于分析，适用于大规模推广应用，EGFR胞外突变检测可以为个体化治疗提供指导，预测预后和治疗反应，早期诊断和筛查，以及肿瘤监测和治疗效果评估。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为采用EGFRA289T阳性质粒与血液基因组DNA制成阳性样本的测试图；
图3为采用EGFRA289V阳性质粒与血液基因组DNA制成阳性样本的测试图；
图4为样本A检出突变的曲线图；
图5为样本H检出突变的曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法，包括以下步骤：
一、设计ARMS特异性引物：设计能够与EGFR基因的A289V和A289T突变位点匹配的ARMS特异性引物，根据TaqDNA聚合酶无3'→5'外切酶活性，不能修正引物3'碱基错配的特性，设计ARMS特异性引物，使其3'末端匹配突变碱基及引入倒数第二/三位的错配碱基，阻滞野生型模板扩增；
二、血液或组织样本提取：从患者的血液或肿瘤组织中提取DNA作为PCR反应的模板，提取方法可以根据实验室常规的DNA提取方法进行；
三、PCR反应设置：根据PCR实验室常规操作进行反应体系的设置，然后添加含有特异性引物和Taqman探针的PCRmix；
四、PCR扩增反应：将DNA模板与PCRmix一起加入PCR管或板中，并在实时荧光定量PCR平台上进行PCR扩增反应，反应条件根据实验室已优化的程序进行；
五、实时荧光信号检测：在PCR过程中，荧光定量PCR平台实时监测扩增产物，利用Taqman探针对扩增片段进行特异性标记，荧光信号会根据突变位点是否存在而释放出不同的信号；
六、数据分析：通过实时荧光定量PCR平台的软件，可以分析每个样本的荧光信号曲线，并根据标准曲线或阈值设定来判断样本中是否存在EGFRA289V或A289T突变。
工作原理：基于实时荧光定量PCR平台，利用ARMS扩增技术对特定突变进行富集扩增，同时利用Taqman探针(5'含有荧光报告基团，3'含有荧光淬灭基团)对扩增片段进行特异性标记；
根据TaqDNA聚合酶无3'→5'外切酶活性，不能修正引物3'碱基错配的特性，设计ARMS特异性引物使其3'末端匹配突变碱基及引入倒数第二/三位的错配碱基，阻滞野生型模板扩增，特异偏向扩增突变模板，放大突变模板含量，结合特异性Taqman探针，通过荧光信号释放，鉴别特定突变位点存在。
实验例1：ARMS荧光定量PCR反应体系建立及验证
EGFR突变体质粒构建所用载体为pUC57，全长2710bp，突变型质粒片段260bp分别与载体连接，合成质粒。
采用EGFR A289T阳性质粒与血液基因组DNA按照拷贝数比例配制成5％、2.5％、1％、0.5％的阳性样本，并将样本浓度调整为10ng/μl，使用2μl进行测试，测试结果如图2所示：
同理，采用EGFR A289V阳性质粒与血液基因组DNA按照拷贝数比例配制成5％、2.5％、1％、0.5％的阳性样本，并将样本浓度调整为10ng/μl，使用2μl进行测试，测试结果如图3所示：
按上述实施例1的方法进行EGFR基因是否含p.A289V(c.866C>T)、p.A289T(c.865G>A)等突变检测，反应体系如下：
| 组分 | 体积μl | 终浓度 |
| 2×AceQ qPCR Probe Master Mix | 10 | 1× |
| 引物F+R,5μM | 1 | 250nM |
| 探针P,4μM | 1 | 200nM |
| DNA模板 | 2* | |
| 无酶水 | 6 |
其中，*表示模板用量与DNA浓度相关，实验中使用模板浓度为5～10ng/μl，用量2μl。
反应流程图表如下表所示：
72℃时采集荧光信号。
结果判定：
如果内参Ct<15，表明投入模板量过高，需进行浓度调整；如果内参>25，表明模板可能存在降解情况或实验中可能存在抑制因素，此时不利于对突变的判定，需考虑重新获取模板或重新实验。
实验例2：石蜡切片样本的验证
实验中分别选取了12例临床样本(FFPE DNA)进行EGFR A289T和A289V突变检测，Ct结果如下表：
在EGFR A289T的实施案例中，所有样本内参均正常检出，样本A检出突变，FAM通道出现S型扩增曲线，Ct值符合阳性判定，其余样本未发生明显扩增(图4)；
在EGFR A289V的实施案例中，所有样本内参均正常检出，样本H检出突变，FAM通道出现S型扩增曲线，Ct值符合阳性判定，其余样本未发生明显扩增或Ct值判定为阴性(图5)；
所有检测样本同时采用NGS方法进行检测，并比较实验结果。实验检测结果与NGS数据结果相符合。对比结果如下表所示：
另外，引物和探针的核苷酸序列如下表所示：
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
一、设计ARMS特异性引物：设计能够与EGFR基因的A289V和A289T突变位点匹配的ARMS特异性引物；
二、血液或组织样本提取：从患者的血液或肿瘤组织中提取DNA作为PCR反应的模板；
三、PCR反应设置：根据PCR实验室常规操作进行反应体系的设置，然后添加含有特异性引物和Taqman探针的PCRmix。
四、PCR扩增反应：将DNA模板与PCRmix一起加入PCR管或板中，并在实时荧光定量PCR平台上进行PCR扩增反应；
五、实时荧光信号检测：在PCR过程中，荧光定量PCR平台实时监测扩增产物，利用Taqman探针对扩增片段进行特异性标记，荧光信号会根据突变位点是否存在而释放出不同的信号；
六、数据分析：通过实时荧光定量PCR平台的软件，可以分析每个样本的荧光信号曲线，并根据标准曲线或阈值设定来判断样本中是否存在EGFRA289突变。
2.根据权利要求1所述的一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法，其特征在于：所述ARMS特异性引物的3'末端匹配突变碱基，且引入倒数第二/三位的错配碱基，阻滞野生型模板扩增。
3.根据权利要求1所述的一种EGFR胞外结构域区域突变的检测方法，其特征在于：所述血液或组织样本提取可以根据实验室常规的DNA提取方法进行。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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