CN117050208A - 一种猕猴桃幼果多糖提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高活性的猕猴桃幼果多糖提取物，并且提供了该提取物的制备方法和用途。本发明充分利用资源，使用疏果得到的猕猴桃幼果制备多糖。通过单因素实验和Box‑Behnken中心组合设计‑响应面法优化了微波辅助低共熔溶剂(DES)提取猕猴桃幼果多糖的提取参数，获得了更高的提取率和更短的提取时间。并且微波辅助DES提取的多糖比传统水提提取多糖具有更低的分子量以及更高的糖醛酸含量，抗氧化活性和免疫活性。本发明减少了猕猴桃产业链的资源浪费，并且提高了猕猴桃副产物(疏果/幼果)的商业价值。

Description

一种猕猴桃幼果多糖提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种猕猴桃幼果多糖提取物及其制备方法和用途。
背景技术
猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.)，是猕猴桃科猕猴桃属的多年生木本植物，幼枝有白色绒毛；叶纸质，呈倒阔卵形；聚伞花序，花片小，卵形；果黄褐色，球形或倒卵形。猕猴桃口感丰富、酸甜可口，深受人们喜爱，并在世界范围内广泛种植。中国的猕猴桃种植面积和产量排名世界第一。成熟的猕猴桃果实中，富含维生素C、类胡萝卜素、多酚、黄酮、多糖、蛋白质、氨基酸和钙、硒、锗等对人体有益的微量元素。在相关研究中，猕猴桃成熟果具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、减肥和治疗溃疡等作用，这些作用与猕猴桃中富含的营养物质和活性成分密不可分。多糖是猕猴桃成熟果中重要的活性成分之一，在对猕猴桃成熟果的研究报道中证实了不同品种、不同产地的猕猴桃成熟果多糖均具有不错的抗氧化活性、抗糖基化和益生元活性，但目前还没有针对猕猴桃幼果多糖的相关研究。
猕猴桃幼果作为猕猴桃种植业的副产物，一般在生理落果或人工疏果时产生。由于猕猴桃的自然着果率较高，导致果实瘦小，所以果农会在猕猴桃花落后十五天左右进行疏果，一颗果树中一半的幼果都会被摘除。这些幼果成熟度低，无法正常食用，通常被随意丢弃在果园，这不仅造成宝贵资源的极大浪费，也会因此成为一些病原菌的寄主，加速果树病虫害的传播。但其实这些幼果其实有着可观的营养价值，其功能活性物质含量不弱于成熟果实。申请号：CN201811505053.3，发明名称：猕猴桃幼果提取物在鲜肉保鲜中的应用，公开了猕猴桃幼果提取物在鲜肉保鲜中的应用，猕猴桃幼果提取物与蒸馏水混合均匀，配制成保鲜剂，然后采用喷淋方式，将保鲜剂对鲜肉进行处理，可以延长肉制品的货架期，但针对猕猴桃幼果中的活性物质及其效用目前尚无文献报道。
植物多糖的传统提取法为热水提取法，但是其提取率较低。低共熔溶剂(Deepeutectic solvent，DES)是一种由氢键受体和氢键供体组成的绿色溶剂。与传统溶剂相比DES所提取的多糖具有提取率高、结构完整、生物活性高，有一定的选择提取性等优点。一些研究中还会使用微波，超声或高压均质来辅助提取，使用微波辅助提取具有升温快，提取时间短，高效节能，易控制等优点。因此，可以使用微波辅助低共熔溶剂提取法高效制备高活性的猕猴桃幼果多糖。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种高活性的猕猴桃幼果多糖提取物。本发明的另一技术方案是提供了该猕猴桃幼果多糖提取物的高效制备方法及用途。
本发明提供了一种猕猴桃幼果多糖提取物，它是由猕猴桃幼果为原料提取、分离得到的猕猴桃幼果多糖，其中：
猕猴桃幼果多糖中每100mg含总糖：(92.53±1.29)–(94.28±0.72)mg；猕猴桃幼果多糖的酯化度为：(32.68±0.32)％–(46.29±0.35)％；
猕猴桃幼果多糖的分子量为：(1.265±0.015)×105–(6.081±0.03)×105Da，多分散系数为2.312–2.686；猕猴桃幼果多糖的组成糖主要含有以下单糖：半乳糖、***糖、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖，各单糖的摩尔比为：(2.26–3.33)︰(0.94–1.99)︰1.00︰(0.16–0.49)︰(0.12–0.38)︰(0.29–0.30)︰(0.21–0.26)。
其中，所述提取物中含总糖醛酸：(23.51±0.81)–(30.50±1.63)mg；总蛋白：(3.31±0.41)–(3.42±0.43)mg；总酚：(1.01±0.01)–(6.64±0.26)mg GAE(没食子酸当量)。
进一步优选地，它是采用微波辅助低共熔溶剂提取制备；
所述的猕猴桃幼果多糖中每100mg含总糖：92.53±1.29mg；总糖醛酸30.50±1.63mg；总蛋白：3.42±0.43mg；总酚：6.64±0.26mg GAE(没食子酸当量)；
所述的猕猴桃幼果多糖的分子量为：1.265×105–1.406×105Da，多分散系数为2.686–2.947；猕猴桃幼果多糖的组成糖主要含有以下单糖：半乳糖、***糖、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖，各单糖的摩尔比为：2.26–2.86︰0.94–1.24︰1.00︰0.16–0.17︰0.12–0.13︰0.30–0.52︰0.26–0.30。
其中，猕猴桃幼果来源于猕猴桃经疏果后的幼果。
本发明还提供了一种制备所述的猕猴桃幼果多糖的提取方法，它包括如下步骤：
a取猕猴桃幼果冷冻干燥，打粉，过筛；
b粉末中添加乙醇，超声除去醇溶性成分，得沉淀；
c热水提取：取b步骤制备的沉淀加水，水浴提取，得提取液；
或微波辅助低共熔溶剂提取法：取b步骤制备的沉淀加入配好的提取溶剂，微波提取，得提取液；
d浓缩液中加入α-淀粉酶、糖化酶除去淀粉；
e取上清液加入乙醇，醇沉，过夜；离心后得沉淀，再用乙醇洗沉淀；
f加水复溶，透析，干燥，即得猕猴桃幼果多糖。
进一步优选地，
a步骤中冷冻干燥条件是-30至–70℃下冷冻干燥40至70小时；过筛目数为60至120目；
b步骤中添加乙醇的浓度为20％至90％乙醇；粉末与乙醇的重量体积比为：1：(10–30)；超声功率为300–800W；
c步骤中水与原料的配比为10–60mL/g；水浴提取2–6小时；
或微波辅助低共熔溶剂提取法：低共熔溶剂与水的体积比为(3–15)：(17–5)；提取溶剂与原料的配比为10–60mL/g，微波提取的功率为480–720W，提取时间6–30min；
d步骤中α-淀粉酶、糖化酶除去淀粉的条件分别为：5–20μ/mLα-淀粉酶，60–95℃，3–12h；5–20μ/mL糖化酶，40–65℃，10–14h；
e步骤中醇沉提取液与乙醇体积比1：(2–5)，所用乙醇浓度为50–100％乙醇；洗沉淀所用乙醇为50–95％乙醇；
f步骤中透析去除小分子的截留分子量为2000–10000Da。
更进一步优选地，
a步骤中在-40℃的条件下，冷冻干燥48h；过筛数目为80目；
b步骤中添加乙醇为80％乙醇；粉末与乙醇重量体积比为1：10；超声功率为640W；
c步骤中水与原料的配比为30mL/g；水浴提取时间为4h；
或微波辅助低共熔溶剂提取法：DES与水的体积比为16：9；提取溶剂与原料的配比为30mL/g，微波提取的功率为635W，提取时间17min；
d步骤中α-淀粉酶添加量为5μ/mL，80℃，60h；糖化酶添加量5μ/mL，59℃，12h；
e步骤中醇沉所用体积比为1：4；所用乙醇为95％乙醇；洗沉淀所用乙醇为76％乙醇；
f步骤中透析去除小分子的截留分子量为3500Da。
本发明还提供了所述的猕猴桃幼果多糖提取物在制备具有抗氧化功能的保健食品或药品中的用途。
本发明还提供了所述的猕猴桃幼果多糖提取物在制备具有增强免疫功能的保健食品或药品中的用途。
本发明提供了一种具有抗氧化功能或增加免疫功能的组合物，它包括所述的猕猴桃幼果多糖提取物，以及食品或药品中可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
本发明猕猴桃幼果多糖提取物可作为益生元，通过为有益菌提供营养和生长环境，促进它们的增殖和活性，从而对肠道健康产生积极影响。
本发明充分利用资源，使用疏果得到的猕猴桃幼果制备多糖。通过单因素实验和Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化了微波辅助DES提取猕猴桃幼果多糖的提取参数，获得了更高的提取率和更短的提取时间。并且微波辅助DES提取的多糖比传统水提提取多糖具有更高的糖醛酸含量，抗氧化活性和免疫活性，以及更低的分子量。本发明减少了猕猴桃产业链的资源浪费，并且提高了猕猴桃副产物的商业价值。
附图说明
图1.微波辅助低共熔溶剂提取的工艺流程图
图2.低共熔溶剂含水量(A)，微波功率(B)和提取时间(C)对微波辅助低共熔溶剂提取法提取猕猴桃幼果多糖提取率的影响，以及各因素(D,E,F)对猕猴桃幼果多糖提取率的响应面三维立体图
图3.传统热水提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-H)和微波辅助低共熔溶剂提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-DM)的尺寸排除色谱图(A)，组成单糖的高效液相色谱图(B)和傅里叶变换红外光谱图(C)
图4.传统热水提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-H)和微波辅助低共熔溶剂提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-DM)的1H核磁共振波谱和13C核磁共振波谱光谱图
图5.传统热水提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-H)和微波辅助低共熔溶剂提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-DM)对ABTS的清除率(A)和对DPPH的清除率(B)，以及它们的总还原力(C)和对益生菌增殖的影响(D)
图6.传统热水提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-H)和微波辅助低共熔溶剂提取的猕猴桃幼果多糖(YKP-DM)RAW 264.7巨噬细胞细胞毒性(A)、一氧化氮(NO)的产生(B)、白介素-6(IL-6)的产生(C)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生(D)的影响
具体实施方式
实施例1本发明热水提取法提取猕猴桃幼果粗多糖(YKP-H)
热水提取法：将得到的猕猴桃幼果在-40℃下冷冻干燥48h，而后使用打粉机将冻干后的样品打粉后过80目筛。取猕猴桃幼果粉末添加80％乙醇(1：10,w/v)，放入超声波清洗池在超声功率640W的条件下，超声30min去除其中的醇溶性成分。取沉淀加入超纯水(1：30,w/v)，再放入水浴锅中提取4h。再使用旋转蒸发器将提取液浓缩至原体积的1/3。加入高温α-淀粉酶(5μ/mL,80℃，6h)和糖化酶(5μ/mL,59℃，12h)除去淀粉，95℃下灭活30min。再用四倍体积的95％乙醇(v\v)在4℃下醇沉过夜。而后离心得沉淀，将沉淀用76％的乙醇进行清洗，再用超纯水重新溶解。取上清液透析去除小分子(截留分子量,3500Da)。最后，冷冻干燥后得到水提猕猴桃幼果粗多糖(YKP-H)。
实施例2本发明微波辅助低共熔溶剂提取的猕猴桃幼果粗多糖(YKP-DM)的制备
将得到的猕猴桃幼果在-40℃下冷冻干燥48h，而后使用打粉机将冻干后的样品打粉后过80目筛。取猕猴桃幼果粉末添加20％乙醇(1：10,w/v)，放入超声波清洗池在超声功率640W的条件下，超声30min去除其中的醇溶性成分。取沉淀加入配置好的提取溶剂(DES与水的体积比为16：9)，放入实验室微波炉中进行提取(提取条件参考实施例5)。加入高温α-淀粉酶(5μ/mL,80℃，6h)和糖化酶(5μ/mL,59℃，12h)除去淀粉，95℃下灭活30min。再用四倍体积的95％乙醇(v\v)在4℃下醇沉过夜。而后离心得沉淀，将沉淀用76％的乙醇进行清洗，再用超纯水重新溶解。取上清液透析去除小分子(截留分子量,3500Da)。最后，冷冻干燥后得到微波辅助DES提取的猕猴桃幼果粗多糖(YKP-DM)。工艺流程图见图1。
实施例3本发明热水提取法提取猕猴桃幼果粗多糖
将得到的猕猴桃幼果在-30℃下冷冻干燥40h，而后使用打粉机将冻干后的样品打粉后过60目筛。取猕猴桃幼果粉末添加20％乙醇(1：10,w/v)，放入超声波清洗池在超声功率300W的条件下，超声30min去除其中的醇溶性成分。取沉淀加入超纯水(1：10,w/v)，再放入水浴锅中提取2h。再使用旋转蒸发器将提取液浓缩至原体积的1/3。加入高温α-淀粉酶(5μ/mL，60℃，3h)和糖化酶(5μ/mL，40℃，10h)除去淀粉，95℃下灭活30min。再用二倍体积的50％乙醇(v\v)在4℃下醇沉过夜。而后离心得沉淀，将沉淀用50％的乙醇进行清洗，再用超纯水重新溶解。取上清液透析去除小分子(截留分子量,2000Da)。最后，冷冻干燥后得到水提猕猴桃幼果粗多糖。
实施例4本发明热水提取法提取猕猴桃幼果粗多糖
将得到的猕猴桃幼果在-70℃下冷冻干燥70h，而后使用打粉机将冻干后的样品打粉后过120目筛。取猕猴桃幼果粉末添加90％乙醇(1：30,w/v)，放入超声波清洗池在超声功率800W的条件下，超声30min去除其中的醇溶性成分。取沉淀加入超纯水(1：60,w/v)，再放入水浴锅中提取6h。再使用旋转蒸发器将提取液浓缩至原体积的1/3。加入高温α-淀粉酶(20μ/mL，95℃，12h)和糖化酶(20μ/mL，65℃，14h)除去淀粉，95℃下灭活30min。再用五倍体积的100％乙醇(v\v)在4℃下醇沉过夜。而后离心得沉淀，将沉淀用95％的乙醇进行清洗，再用超纯水重新溶解。取上清液透析去除小分子(截留分子量,10000Da)。最后，冷冻干燥后得到水提猕猴桃幼果粗多糖。
实施例5本发明微波辅助低共熔溶剂提取法条件参数筛选试验
微波辅助低共熔溶剂提取法：向沉淀中加入配好的提取溶剂(氯化胆碱：乙二醇＝1：3),置于实验室微波炉中提取。其他条件与热水提取相同。而后，采用单因素实验设计优化提取方法，考察条件如表1所示。总之，就是先确定提取微波功率和DES含水量，然后优化提取时间。确定提取时间和DES含水量，然后优化提取微波功率。确定提取时间和提取功率，然后优化DES含水量。
表1.单因素实验设计表
其次，采用三因素响应面设计进一步优化各个提取参数对猕猴桃多糖提取率的影响。自变量包括提取时间(X1，12，18，24min)，提取功率(X2，560，640，720mL/g)，DES含水量(X3，15，30，45％)。本研究设计了17次实验，响应面因素编码如表2所示，然后利用Design-Expert对响应面的实验数据进行分析。将得到的数据通过二阶多项式模型进行拟合，如表2，图2：
表2.响应面实验设计和结果
相较于传统提取法，微波在提取多糖上，具有高效节能，无毒无害等优点。所以本发明利用微波并结合DES作为提取溶剂提取猕猴桃幼果多糖。DES含水量，提取功率和提取时间都会显著影响微波辅助DES提取猕猴桃幼果多糖的提取率。当DES含水量高时，会影响DES与多糖的相互作用。而含水量低时，DES作为溶剂又会过于黏稠。最后优化出的最佳条件是30％。微波的功率越大，微波的穿透力也越大，样品也会升温更快。所以在微波功率从400W到640W时，多糖提取率逐渐升高。但越大的微波功率，也可能造成多糖的降解。所以在功率提升到720W时，多糖的提取率下降。随着提取时间从6min增加到18min，YKP-DM提取率上升。是随着微波时间的加长，多糖逐渐从样品中溶出。而18min后，提取率逐渐降低。是可能因为随着提取时间的加长，微波会导致多糖的降解。
根据单因素的结果进一步采用了Box–Behnken实验设计优化YKP-DM的提取率。最后BBD实验数据如表3所示。并且得出的二阶多项式方程如下：
其中Y代表提取率；X1，X2和X3分别是提取时间(min)、微波功率(W)和DES含水量(％)。
表3.微波辅助低共熔溶剂提取的回归模型的方差分析
注：X1,提取时间(min)；X2,料液比(mL/g)；X3:DES含水量(％,v/v)；
MDE,R2＝0.9808,R2 adj＝0.9561,变异系数(CV)＝2.88％,and adeq.precision＝21.4226.
*显著差异(p<0.05)，**极显著差异(p<0.01)。
根据表3所示，使用单因素方差分析(ANOVA)用来评估提取参数对猕猴桃幼果多糖提取率的影响以及拟合模型的有效性。根据P值(<0.0001)和F值(39.24)，拟合模型极为显著。此外，根据失拟项、决定系数和矫正决定系数的值，证明该模型具有较高的拟合度。另外，根据变异系数和适度精度的值，也证明该拟合模型具有良好的重复性和可靠性。此外，所有提取因素的线性系数、交互系数和二次项系数的p值都小于0.05，表明所有提取参数都能显著影响猕猴桃幼果多糖的提取率。事实上，三维响应曲面图还表明提取时间与提取功率、提取时间与DES水含量以及提取功率与DES水含量之间的相互作用是显著的。所有这些数据表明，提取时间、微波功率和DES水含量是影响猕猴桃幼果多糖提取的重要参数。
根据实验结果的分析，确定了预测的最佳提取条件如下：提取时间为17min，提取功率为635W，DES水含量为35％。在此条件下进行了验证实验，实际提取率为10.04％±0.16％，非常接近预测值9.991％。优化后的MDE提取率相较于传统水提法提取猕猴桃幼果多糖提取率更高，并且提取时间也更短。此外，与成熟的猕猴桃相比，猕猴桃幼果中多糖含量更高，表明猕猴桃幼果是一种提供多糖的良好资源。总的来说，这些结果表明MDE可以作为一种在食品工业中从猕猴桃幼果中制备多糖的高效方法。
实施例6本发明制备的猕猴桃幼果多糖的化学成分、分子量及单糖等结构表征实验
采用比色法检测猕猴桃幼果多糖的总糖，总糖醛酸，总酚和总蛋白。采用SEC-MALLS-RID(Wyatt Technology Co.,Santa Barbara,CA,USA)检测YKP-H和YKP-DM的分子量和分散性。采用高效液相色谱法(L-20A,Shimadzu,Japan)结合1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)柱前衍生的方法测定多糖样品的单糖组成。通过傅里叶变换红外光谱(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)分析样品的官能团和酯化度。利用核磁共振图谱(Bruker,Rheinstetten,Germany)分析多糖的糖苷键。具体方法参考：作者：Ding-Tao Wu，Meng-Xi Fu,Huan Guo,Yi-Chen Hu,Xiao-Qin Zheng,Ren-You Gan andLiang Zou；题目：Microwave-Assisted Deep Eutectic Solvent Extraction,StructuralCharacteristics,and Biological Functions of Polysaccharides from Sweet Tea(Lithocarpus litseifolius)Leaves；期刊名称：ANTIOXIDANTS，卷11期8；DOI：10.3390/antiox11081578。
表4.不同提取方法提取的猕猴桃幼果多糖的化学成分、分子量和单糖组成
YKP-H和YKP-DM分别表示通过热水提取和微波辅助低共熔溶剂提取的猕猴桃幼果多糖；YKP-H和YKP-DM之间的上标(a-b)表示二者之间差异显著(p<0.05)。
实验结果表明，YKP-H和YKP-DM的总糖分别为94.28mg/100mg和92.53mg/100mg，糖醛酸含量分别为23.51mg/100mg和30.50mg/100mg，说明依据本发明方法提取的样品是以多糖为主要成分，并且富含果胶多糖。糖醛酸的含量可以一定程度上反应多糖的结果和活性，通常，糖醛酸的含量越高，多糖的生物活性就越好。蛋白质作为多糖的杂质之一，在两种方法提取的样品中，蛋白质的含量并不多，说明蛋白质对于样品的影响并不大。此外，与YKP-H相比YKP-DM中的多酚含量要更高，可能是因为DES对于多酚的溶解性要高于水。多酚是一类具有抗氧化和降血糖作用的活性物质。通常，多糖中的多酚含量越高其活性越好。
分子量与多糖的生物活性也有一定的相关性。如表4所示YKP-DM的分子量(1.265×105Da)要低于YKP-H(6.081×105Da)的分子量。说明不同的提取方法会影响样品的分子量。此外，一般分子量较低的样品活性也就越好。
为了进一步了解YKP-H和YKP-DM的化学结构，通过高效液相色谱仪、傅里叶变换红外光谱仪和核磁共振波谱仪研究了它们的单糖组成、官能团和糖苷键。YKP-H和YKP-DM的单糖组成类型相似，主要单糖均为半乳糖，***糖和半乳糖醛酸，这也与猕猴桃成熟果实中的多糖单糖组成类似。根据单糖组成的摩尔比，推测猕猴桃幼果多糖中可能存在半乳糖组成的多糖(HG)、鼠李糖醛酸和半乳糖单糖组成的多糖(RG I)、***糖和半乳糖单糖组成的多糖(AG)。根据半乳糖醛酸/鼠李糖(MR1比)的比值，可以揭示HG和RG I果胶结构域的比例，发现猕猴桃幼果多糖富含HG果胶结构域。此外，甘露糖和葡萄糖是半纤维素的基本单糖组成，因此猕猴桃幼果多糖中可能还存在少量的半乳甘露聚糖。
YKP-H和YKP-DM的FT-IR光谱相似，具有果胶多糖的典型信号，包括3415、2932、1743、1636、1437、1249、1037和1019cm-1，表明它们的功能基团相似。特别是，1743cm-1处的吸收峰对应于酯化羧基(C＝O)的非对称伸缩振动，而1636cm-1处的强吸收峰则归因于自由羧基的非对称伸缩振动。综上所述，这些结果表明猕猴桃幼果多糖中存在糖醛酸，猕猴桃幼果中含有果胶多糖。此外，根据1743cm-1和1636cm-1处信号的强度，计算出YKP-H和YKP-DM的酯化度分别为46.29％和32.68％，表明MDE可以明显降低猕猴桃幼果多糖的酯化度(结果见图3)。
YKP-H和YKP-DM的NMR光谱也相似，进一步确认了它们的主要化学结构。并且从1HNMR观察到了果胶多糖的典型信号，包括HG、RG I和AG，例如，5.10至5.44ppm范围的1H NMR信号归因于α-L-Araf和α-L-Rhap残基，4.40至4.53ppm范围的1H NMR信号归因于β-D-Galp残基，而3.81ppm和4.97ppm的1H NMR信号归因于GalAMe残基。4.97ppm、170.59ppm和100.35ppm处的信号表明存在1,4-α-D-GalAMep，而GalA-OCH3的信号在3.81ppm和52.78ppm处测得。2.08ppm和19.87ppm处的信号表明存在O-acetyl。5.15ppm和107.38ppm处的信号表明存在T-α-L-Araf，而5.10ppm、5.44ppm和5.24ppm处的信号分别表明存在1,5-α-L-Araf、1,3-α-L-Araf和1,3,5-α-L-Araf。实际上，109.30ppm处的信号也表明存在1,3-α-L-Araf和1,5-α-L-Araf。5.32/1.25ppm和5.27/1.31ppm处的信号表明存在1,2-α-L-Rhap和1,2,4-α-L-Rhap。4.53ppm和103.10ppm处的信号表明存在1,3,6-β-D-Galp，4.46ppm和103.22ppm处的信号表明存在1,3-β-D-Galp，而4.40ppm处的信号表明存在T-β-D-Galp。根据单糖组成和NMR分析的结果，发现YKP-H和YKP-DM中确实存在HG、RG I和AG(结果见图4)。研究还表明，成熟猕猴桃中提取的多糖也同样含有HG、RG I和AG。
以下通过功效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明猕猴桃幼果多糖的抗氧化活性
通过ABTS，DPPH自由基清除率和总还原力评价不同方法提取的猕猴桃幼果的抗氧化活性。以不同浓度的YKP-H和YKP-DM进行实验，最后得出IC50值。并且以VC和BHT作为阳性对照。
如图所示，YKP-DM的抗氧化活性比YKP-H要高得多。YKP-DM的ABTS和DPPH自由基清除能力的IC50值分别为0.285mg/mL和0.351mg/mL，远低于YKP-H的值(ABTS，1.741mg/mL；DPPH，2.507mg/mL)。此外，YKP-DM的总还原力的值也比YKP-H高得多(结果见图5)。
试验例2本发明猕猴桃幼果多糖的促进益生菌增殖
随后，使用发酵乳杆菌(CGMCC 1.15608)、植物乳杆菌(CGMCC 1.12974)、鼠李糖乳杆菌(ATCC 53103)和青春双歧杆菌(ATCC 15703)4种益生菌，建立了体外发酵模型并且以菊糖(FOS)作为阳性对照，研究了YKP-H和YKP-DM对益生菌增殖的影响。
研究表明，植物多糖可以作为益生元，通过为有益菌提供营养和生长环境，促进它们的增殖和活性，从而对肠道健康产生积极影响。我们研究了YKP-H和YKP-DM对于发酵乳杆菌(CGMCC 1.15608)、植物乳杆菌(CGMCC 1.12974)、鼠李糖乳杆菌(ATCC 53103)和双歧杆菌(ATCC 15703)生长的影响。如图5所示，不同方法提取的猕猴桃幼果多糖均能促进益生菌的增殖。因此猕猴桃幼果多糖具有潜在的益生元活性(结果见图5)。
试验例3本发明猕猴桃幼果多糖的免疫刺激作用
通过将RAW 264.7巨噬细胞培养在RPMI-1640培养基中建立模型。随后，通过MTT比色法测定YKP-H和YKP-DM对巨噬细胞增殖的影响。使用Griess试剂检测巨噬细胞所释放的NO含量。最后，使用ELISA试剂盒测定巨噬细胞的白细胞素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌。
细胞免疫活性的实验结果显示，在浓度范围为12.5μg/mL至50.0μg/mL时，YKP-H和YKP-DM对RAW 264.7巨噬细胞没有细胞毒性作用。此外，样品在不同浓度下均能刺激RAW264.7巨噬细胞产生NO、IL-6和TNF-α。YKP-DM对RAW 264.7巨噬细胞的免疫调节效应比YKP-H要强，这与之前的研究结果相似。实际上，许多实验结果表明，果胶多糖的物理和化学特性可以影响其免疫调节效应。因此，观察到的YKP-H和YKP-DM的免疫调节效应的不同可能是因为它们不同的结构。YKP-DM较高的醛酸含量和较低的分子量也可能是导致免疫调节效应比较强的因素(结果见图6)。
综上所述，本发明将猕猴桃幼果这一猕猴桃种植业的副产物重新回收利用。并优化了从中提取多糖的方法，使用本方法提取的YKP-DM活性高于使用传统水提法提取的YKP-H。本研究减少了猕猴桃产业链的资源浪费，并且提高了猕猴桃的商业价值，为后续利用猕猴桃幼果开发产品提供了参考。

Claims (10)

1.一种猕猴桃幼果多糖提取物，其特征在于：它是由猕猴桃幼果为原料提取、分离得到的猕猴桃幼果多糖，其中：
猕猴桃幼果多糖中每100mg含总糖：(92.53±1.29)–(94.28±0.72)mg；猕猴桃幼果多糖的酯化度为：(32.68±0.32)％–(46.29±0.35)％；
猕猴桃幼果多糖的分子量为：(1.265±0.015)×105–(6.081±0.03)×105Da，多分散系数为2.312–2.686；猕猴桃幼果多糖的组成糖主要含有以下单糖：半乳糖、***糖、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖，各单糖的摩尔比为：(2.26–3.33)︰(0.94–1.99)︰1.00︰(0.16–0.49)︰(0.12–0.38)︰(0.29–0.30)︰(0.21–0.26)。
2.根据权利要求1所述的猕猴桃幼果多糖提取物，其特征在于：所述提取物中含总糖醛酸：(23.51±0.81)–(30.50±1.63)mg；总蛋白：(3.31±0.41)–(3.42±0.43)mg；总酚：(1.01±0.01)–(6.64±0.26)mg GAE(没食子酸当量)。
3.根据权利要求2所述的猕猴桃幼果多糖提取物，其特征在于：它是采用微波辅助低共熔溶剂提取制备；
所述的猕猴桃幼果多糖中每100mg含总糖：92.53±1.29mg；总糖醛酸30.50±1.63mg；总蛋白：3.42±0.43mg；总酚：6.64±0.26mg GAE(没食子酸当量)；
所述的猕猴桃幼果多糖的分子量为：1.265×105–1.406×105Da，多分散系数为2.686–2.947；猕猴桃幼果多糖的组成糖主要含有以下单糖：半乳糖、***糖、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖，各单糖的摩尔比为：2.26–2.86︰0.94–1.24︰1.00︰0.16–0.17︰0.12–0.13︰0.30–0.52︰0.26–0.30。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的猕猴桃幼果多糖提取物，其特征在于：猕猴桃幼果来源于猕猴桃经疏果后的幼果。
5.一种制备权利要求1-4任意一项所述的猕猴桃幼果多糖的提取方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a取猕猴桃幼果冷冻干燥，打粉，过筛；
b粉末中添加乙醇，超声除去醇溶性成分，得沉淀；
c热水提取：取b步骤制备的沉淀加水，水浴提取，得提取液；
或微波辅助低共熔溶剂提取法：取b步骤制备的沉淀加入配好的提取溶剂，微波提取，得提取液；
d浓缩液中加入α-淀粉酶、糖化酶除去淀粉；
e取上清液加入乙醇，醇沉，过夜；离心后得沉淀，再用乙醇洗沉淀；
f加水复溶，透析，干燥，即得猕猴桃幼果多糖。
6.根据权利要求5所述的猕猴桃幼果多糖提取物的制备方法，其特征在于：
a步骤中冷冻干燥条件是-30至–70℃下冷冻干燥40至70小时；过筛目数为60至120目；
b步骤中添加乙醇的浓度为20％至90％乙醇；粉末与乙醇的重量体积比为：1：(10–30)；超声功率为300–800W；
c步骤中水与原料的配比为10–60mL/g；水浴提取2–6小时；
或微波辅助低共熔溶剂提取法：低共熔溶剂与水的体积比为(3–15)：(17–5)；提取溶剂与原料的配比为10–60mL/g，微波提取的功率为480–720W，提取时间6–30min；
d步骤中α-淀粉酶、糖化酶除去淀粉的条件分别为：5–20μ/mLα-淀粉酶，60–95℃，3–12h；5–20μ/mL糖化酶，40–65℃，10–14h；
e步骤中醇沉提取液与乙醇体积比1：(2–5)，所用乙醇浓度为50–100％乙醇；洗沉淀所用乙醇为50–95％乙醇；
f步骤中透析去除小分子的截留分子量为2000–10000Da。
7.根据权利要求6所述的猕猴桃幼果多糖提取物的制备方法，其特征在于：
a步骤中在-40℃的条件下，冷冻干燥48h；过筛数目为80目；
b步骤中添加乙醇为80％乙醇；粉末与乙醇重量体积比为1：10；超声功率为640W；
c步骤中水与原料的配比为30mL/g；水浴提取时间为4h；
或微波辅助低共熔溶剂提取法：DES与水的体积比为16：9；提取溶剂与原料的配比为30mL/g，微波提取的功率为635W，提取时间17min；
d步骤中α-淀粉酶添加量为5μ/mL，80℃，6h；糖化酶添加量5μ/mL，59℃，12h；
e步骤中醇沉所用体积比为1：4；所用乙醇为95％乙醇；洗沉淀所用乙醇为76％乙醇；
f步骤中透析去除小分子的截留分子量为3500Da。
8.权利要求1-4任意一项所述的猕猴桃幼果多糖提取物在制备具有抗氧化功能的保健食品或药品中的用途。
9.权利要求1-4任意一项所述的猕猴桃幼果多糖提取物在制备具有增强免疫功能的保健食品或药品中的用途。
10.一种具有抗氧化功能或增加免疫功能的组合物，其特征在于：它包括权利要求1-4任意一项所述的猕猴桃幼果多糖提取物，以及食品或药品中可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
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