CN117045798A - Shp2变构抑制剂的抗感染作用及其应用 - Google Patents

Shp2变构抑制剂的抗感染作用及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及了SHP2变构抑制剂的抗感染作用及其应用，具体涉及SHP2变构抑制剂(例如结构如式I所示的化合物SHP099或其衍生物)或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗对象的感染性疾病及其相关病症和/或征状的产品中的用途。本申请还涉及包含SHP2变构抑制剂(例如SHP099或其衍生物)或其药学上可接受的盐的药物组合物，采用SHP2变构抑制剂或其药学上可接受的盐来预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的方法。

Description

SHP2变构抑制剂的抗感染作用及其应用
技术领域
本申请属于医药和生物技术领域。具体而言，本申请涉及SHP2变构抑制剂(例如化合物SHP099及其衍生物)在感染性疾病(如细菌感染)中的抗感染作用、机制、实施方法和用途。
背景技术
感染是临床常见的疾病，可导致机体局部和全身的感染性表现，甚至导致感染性休克、内毒素性休克以及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)等严重后果。重度感染导致的休克或者多器官功能衰竭，死亡率高达50-80％。常见的临床细菌感染，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌感染等均可以导致机体局部和全身的炎症反应，引起不同程度的感染性疾病。对于细菌感染的患者，医生一般采用抗生素治疗，但是抗生素的滥用也增加了多药耐药菌感染的风险。
天然免疫***是机体抵抗入侵病原体的第一道防线。当病原体入侵宿主时，天然免疫细胞，如中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞可以吞噬和清除病原体，维持细胞稳态，并促进特异性的促炎和抗炎过程【Ostrowski，P.等，Dev Cell.2016；38:135-146；Doherty，G.J.等，Annu Rev Biochem.2009；78:857-902】。病原体的内吞作用已成为抗菌信号转导过程中的一个关键控制步骤。哺乳动物细胞内吞作用通过多种机制发生，包括网格蛋白依赖性内吞作用、微胞吞作用、吞噬作用和小泡依赖性内吞作用。
病原体被吞噬到细胞内后，被运送至溶酶体，在溶酶体酶的酸性环境中被水解酶降解【Moretti，J.等，Curr Opin Immunol.2014；26:100-110】。病原体的部分降解产物由巨噬细胞、树突状细胞(DC)等抗原提呈细胞提呈给组织相容性复合体(MHC)分子，随后被T细胞表面的受体识别，进而激活CD4+和CD8+的T细胞启动适应性免疫【Cao，X等，Nat RevImmunol.2016；16:35-50】。同时，巨噬细胞等天然免疫细胞表面的Toll样受体、RIG-I样受体、NOD样受体等模式识别受体(PRR)识别病原体的病原相关分子模式(PAMP)，激活下游多条信号通路，促进炎性细胞因子的产生和释放【Liu，J.等，Immunity.2016；45:15-30】。炎性细胞因子可以招募和激活天然免疫细胞和淋巴细胞，进一步促进对病原体的吞噬和清除【Flannagan，R.S.等，Annu Rev Pathol.2012；7:61-98】。
如果机体不能够及时有效地清除病原体，则可能会导致病原体过度增殖，进而导致机体的细胞因子风暴，这是导致多器官衰竭易感性增加和死亡率升高的主要潜在因素【Zhao,Q.等，Adv.Sci.2023；10：e2205097】。在某些疾病(如晚期脓毒症患者)免疫抑制阶段，由于细菌清除障碍，患者难以清除入侵的病原体，使他们容易发生危及生命的医院感染【Hoffman，D.Immunity.2021；54:2712-2723】。这表明，吞噬细胞的激活和细菌的高效和及时的清除可能在对抗脓毒症中起着关键作用。探索巨噬细胞内吞作用的调控机制可能为治疗细菌感染和脓毒症提供新的治疗靶点。此外，病原体不及时清除还会导致机体产生慢性炎症(如结核病、慢性肝炎、慢性肾炎以及慢性胃肠道疾病)，引起机体免疫***功能的紊乱，并且长期的慢性炎症可以引起继发的多种临床疾病【Cook，D.N.等，Nat Immunol.2004，5:975-979】。研究发现，多种自身免疫病、过敏性疾病、动脉粥样硬化、甚至包括多种肿瘤均与慢性炎症密切相关，其发病机制涉及TLR的信号传导异常【Cook，D.N.等，NatImmunol.2004，5:975-979】。
SHP2是非受体酪氨酸磷酸酶的成员。SHP2普遍表达，不仅在正常细胞发育过程中调控细胞表面激酶活性，而且在与细胞存活和增殖相关的信号通路中发挥重要作用。目前SHP2已成为抗肿瘤领域中的崭新靶点。SHP2抑制剂SHP099是由诺华研发出的一种肿瘤抑制剂，该化合物能结合到2个SH2结构域和PTP结构域三者之间(称为“隧道”位点)而抑制SHP2活性。在SHP099的基础上，各药物开发团队陆续研发出了诸如TNO155、SHP389、SHP394、RMC-4550、IACS-15414、RMC-4630、IACS-15509等衍生物，并证明了它们的SHP2变构抑制活性和/或抗肿瘤活性。
然而，关于SHP2抑制剂(例如SHP099及其衍生物)在天然免疫，尤其是细胞内吞等感染性疾病防治方面的研究目前仍没有报道。
综上所述，本领域迫切需要开发出一种可有效促进细胞吞噬和清除致感染病原体(例如细菌)的免疫学活性物质。
发明内容
本文中提供了SHP2变构抑制剂(例如SHP099或其衍生物或其药学上可接受的盐)在抗感染中的新用途。
在本文的一些方面中，提供了SHP2变构抑制剂(例如SHP099、其衍生物或其药学上可接受的盐)在制备用于预防和/或治疗对象的感染性疾病(例如细菌感染)及其相关病症和/或征状的产品中的用途。
在本文的一些方面中，还提供了一种抗感染药物组合物，其包含：
(A)治疗或预防有效量的SHP2变构抑制剂(例如SHP099、其衍生物或其药学上可接受的盐)；
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；
(C)可任选地，一种或多种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的其它活性物质。
在一些实施方式中，在给予本申请的SHP2变构抑制剂之前、同时或之后，给予具有预防或治疗感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质。
在本文的一些方面中，还提供了一种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的方法，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的SHP2变构抑制剂。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本申请的发明构思和保护范围。本申请的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本申请作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本申请的实施方案，而不是为了局限本申请的范围。
图1：SHP099预处理的巨噬细胞吞噬能力增强：
A：巨噬细胞中的大肠杆菌克隆数分析；
B：巨噬细胞中的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌克隆数分析；
C：左图为实验组和对照组的代表性细胞免疫荧光图谱；右图为10个视野下平均每个细胞吞噬的细菌数；
D：平均荧光强度分析；
图中，“*”表示P<0.05。
图2：SHP099预处理的巨噬细胞杀菌能力增强：巨噬细胞内活菌数占初始(0小时)吞噬菌数的比例(相对CFU)：
A：巨噬细胞内活大肠杆菌数占初始(0小时)吞噬菌数的比例(大肠杆菌
相对CFU)；
B：巨噬细胞内活金黄色葡萄球菌数占初始(0小时)吞噬菌数的比例(金
黄色葡萄球菌相对CFU)；
图中，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
图3：SHP099预处理的小鼠抗细菌感染能力增强
A：生存率分析；
B：脾脏中大肠杆菌克隆计数；
C：肝脏中大肠杆菌克隆计数；
D：大肠杆菌感染后6h血清中TNF-α和IL-6ELISA分析；
图中，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001；“Vehicle”表示生理盐水。
图4：SHP2变构剂TNO155预处理提高细菌感染的小鼠生存率；
图中，“**”表示P<0.01。
图5：细菌感染的小鼠经SHP099或TNO155治疗后生存率提高；
图中，“*”表示P<0.05。
实施方式
本申请人通过大量的研究和细胞及动物模型试验，发现SHP2变构抑制剂(如SHP099、TNO155等)在感染性疾病中能有效促进机体吞噬和清除细菌、改善器官功能状态、提高患者的生存率。由此，本申请中揭示了以SHP099为代表的SHP2变构抑制剂(包括SHP099、其具有SHP2变构抑制的衍生物(如TNO155)、或其药学上可接受的盐)的新功能，即促进感染时机体对病原体的吞噬和清除、保护机体的脏器功能、提高感染个体的生存率的抗感染作用。本申请还提供了一种可有效促进感染时机体吞噬和清除病原体的能力、提高感染个体的生存率的新型药物。
具体而言，针对影响巨噬细胞吞噬和清除功能的相关药物进行应用研究是分子生物学和细胞生物学研究的热点，将促进吞噬和清除的化合物应用于感染性疾病的预防和治疗是有效的技术，因此相关的药物研究均具有广阔地应用前景。
发明人通过研究发现：SHP099及其衍生物(如TNO155)能够明显增强小鼠巨噬细胞吞噬和清除病原体(例如细菌)的能力。在大肠杆菌(E.coli)诱导的感染反应中，观察到SHP099能够显著减少巨噬细胞产生前炎性细胞因子。此外，SHP099不仅仅可以促进内吞和杀灭细菌，还维持机体适度产生炎症反应。并且，动物体内实验也进一步证明了SHP099及其衍生物具有抗感染的保护和治疗作用，能够显著提高动物在病原体攻击下的存活率。这些发现提示SHP2变构抑制剂可具备预防和治疗感染性疾病的应用前景。由此，本申请提供了将SHP099类SHP2变构抑制剂应用于感染性疾病的预防和治疗中的方法和策略。
本申请针对具有抗感染作用的新型SHP2变构抑制剂(例如化合物SHP099及其衍生物TNO155等)，对免疫细胞中巨噬细胞对细菌的吞噬和清除的效应进行了研究，并且验证了应用该化合物对病原体感染动物的治疗和保护作用。实验证明：1)SHP099预处理的巨噬细胞吞噬和清除细菌的能力增强；2)SHP099预处理的小鼠抗感染能力更强；3)SHP099或TNO155预处理和/或治疗能够提高细菌感染的小鼠的生存率。
本申请针对SHP2变构抑制剂(例如SHP099、其衍生物及其药学上可接受的盐)，用以促进巨噬细胞吞噬和清除细菌，提高小鼠的抗细菌感染能力。这些发明证实SHP2变构抑制剂可望成为治疗和预防感染性疾病的有效手段。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本申请提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
SHP2变构抑制剂
如本文所用，术语“SHP2”是指含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)，其为蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族成员，其包括N端两个串联的SH2结构域(N-SH2和C-SH2)、一个具有催化活性的PTP结构域和包含两个酪氨酸磷酸化位点(Tyr542和Tyr580)的C末端尾部。
SHP2在静息状态下保持自抑制的闭合构象，此时N-SH2结构域的D'E环和两侧的βD'及βE链伸入PTP催化位点的裂缝中，与催化口袋的P环、pTyr环和Q环形成相互作用，从而阻止底物与催化位点结合。当受到生长因子或细胞因子刺激时，两个SH2结构域表面暴露的磷酸酪氨酸(pTyr)识别位点与RTK或细胞因子受体表面特定的酪氨酸基序结合，导致N-SH2域与PTP域分离从而诱导SHP2的闭合构象改变成开放型构象，让底物有机会与暴露的催化位点结合，最终实现去磷酸化。
如本文所用，术语“SHP2变构抑制剂”是指能够抑制SHP2构象变化的物质，例如SHP099、其衍生物及其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述SHP2变构抑制剂选自：
(A)式(I)所示的SHP099(即CAS:1801747-42-1；6-(4-氨基-4-甲基-1-哌啶基)-3-(2,3-二氯苯基)-2-吡嗪酰胺；C16H19Cl2N5)：
(B)以SHP099为先导化合物衍生的SHP2变构抑制剂；
(C)(A)或(B)中物质的药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，以SHP099为先导化合物衍生的SHP2变构抑制剂可例如为如下文献中所记载的一种或多种SHP099衍生物：堵桐弘等，SHP2变构抑制剂的研究进展，药物化学，2022,10(2),211-223)；中国药科大学的专利CN113248449B(芳香螺环衍生物)、专利申请CN114539223A(芳基并氮杂七元环衍生物)、专利申请CN114478403A(芳香胍基衍生物)、专利CN114524772B(杂环串联衍生物)。
在一些实施方式中，以SHP099为先导化合物衍生的SHP2变构抑制剂包括但不限于选自下组的SHP2变构抑制剂：
TNO 155SHP389/>SHP394RMC-4550/>IACS-15414RMC-4630、IACS-15509。
在一些实施方式中，以SHP099为先导化合物衍生的SHP2变构抑制剂包括但不限于选自下组的SHP2变构抑制剂：
(a)SHP099的末端为胍基的含甲脒的芳基螺环衍生物；
(b)SHP099的芳香并氮杂七元环类衍生物；
(c)SHP099的含芳香胍基的衍生物；
(d)SHP099的末端具有杂环串联的衍生物。
在一些实施方式中，药学上可接受的盐选自无机酸盐或有机酸盐。在一些实施方式中，药学上可接受的盐选自：a’)无机酸盐，例如与选自下组的无机酸形成的盐：盐酸、磷酸、硼氢酸、硝酸和硫酸；或b’)有机酸盐，例如与选自下组的有机酸形成的盐：乳酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和酸性氨基酸(如甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)。
SHP2变构抑制剂的促巨噬细胞吞噬功能以及抗感染应用
本申请中首次公开了SHP2变构抑制剂促巨噬细胞吞噬功能，以及预防或治疗感染性疾病的活性，及其在抗感染中的作用。由此，在本文的一些方面中，提供了SHP2变构抑制剂在制备促进巨噬细胞吞噬作用的产品中的应用。在本文的一些方面中，提供了SHP2变构抑制剂在制备用于预防和/或治疗对象的感染性疾病及其相关病症和/或征状的产品中的用途。在本文的一些方面中，提供了用于预防和/或治疗对象的感染性疾病及其相关病症和/或征状的SHP2变构抑制剂。
在一些实施方式中，对象为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、宠物(如猫、狗、鼠)、家畜(如马、牛、羊、猪、兔)等等。
在一些实施方式中，感染由病原体、化学物质、物理因素或其组合引起，例如所述感染由选自下组的一种或多种病原体引起：细菌、真菌、支原体、衣原体和寄生虫。
在一些实施方式中，病原体为能够通过巨噬细胞清除(例如通过巨噬细胞的吞噬清除)的病原体。
在一些实施方式中，病原体为细菌，例如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
在一些实施方式中，所述病原体选自下组中的一种或多种：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、芽孢杆菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肉毒杆菌、炭疽芽孢杆菌、肠杆菌、奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、念珠菌或其组合。
在一些实施方式中，所述相关病症和/或征状为选自下组中的一种或多种：所述感染相关病症和/或症状为选自下组中的一种或多种：感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡；感染引起的器官炎性损伤；感染引起的多器官功能衰竭。
在一些实施方式中，所述炎症因子为选自下组的一种或多种：TNFα、IL-1、IL-6、IFN-β，优选TNFα、IFN-β或IL-6。
在一些实施方式中，所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠。
在一些实施方式中，所述产品为药物组合物，其含有有效量的SHP2变构抑制剂(例如SHP099、其衍生物或其药学上可接受的盐)，以及药学上可接受的载体或赋形剂。关于药物组合的进一步描述可参见下文。
药物组合物
本申请提供了一种药物组合物，所述的组合物含有有效量的本申请的SHP2变构抑制剂(例如SHP099、其衍生物或其药学上可接受的盐)，以及药学上可接受的载体。
在较佳的实施方案中，所述药物组合物可用于治疗与现有技术中已知可治疗或预防感染性疾病，例如细菌感染后体内细菌的吞噬和清除；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭。
如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
本申请的组合物中SHP099及其药学上可接受的盐有效成分占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本申请的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
在本申请的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中SHP099及其药学上可接受的盐的含量可为0.01～2000mg/剂，优选0.1～1500mg/剂，更优选1～1000mg/剂。在本申请的另一个优选例中，每天施用1～6剂本申请的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。
应理解，所用SHP099及其药学上可接受的盐有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。
本申请的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接注射法；(2)口服法；(3)与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹SHP2变构抑制剂后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)SHP2变构抑制剂与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运SHP2变构抑制剂可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将SHP2变构抑制剂体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将其载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将SHP2变构抑制剂导入靶细胞。
此外，本申请的组合物中还可含有用于改善和治疗细菌感染性疾病的其它活性物质，所述的其它活性物质选自下组：临床常用抗生素(包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)的一种或多种。
本申请的SHP2变构抑制剂相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于感染性疾病(例如细菌感染)的预防和治疗。
由此，本申请中还进一步提供了如下的实施方式：
在一些实施方式中，所述产品为片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂、或注射剂。在一些实施方式中，所述产品的形式使其适于采用选自下组的方式给予：口服、注射(例如直接注射法、脂质体包裹化合物注射法)、喷雾、吸入。
在本文的一些方面中，还提供了一种抗感染药物组合物，其包含：
(A)治疗或预防有效量的SHP2变构抑制剂(例如SHP099、其衍生物或其药学上可接受的盐)；
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；
(C)可任选地，一种或多种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的其它活性物质。
在一些实施方式中，在给予本申请的SHP2变构抑制剂之前、同时或之后，给予具有预防或治疗感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质。
在一些实施方式中，治疗或预防感染性疾病及其相关病症和/或征状的其它活性物质包括但不限于：临床常用抗生素(包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物中SHP2变构抑制剂占药物组合物总重量的0.001～99.9wt％。
在一些实施方式中，所述药物组合物中SHP2变构抑制剂占药物组合物总重量的1～95wt％，优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。
在本文的一些方面中，提供了一种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的方法，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的SHP2变构抑制剂。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本领域技术人员可对本申请做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本申请的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：SHP099预处理的巨噬细胞吞噬细菌的能力增强
1.巨噬细胞的获得
给C57小鼠(6～8周，18～22g体重，雌性)腹腔注射2ml肉汤(购自Merck)，四天后颈椎脱臼处死小鼠，以DMEM培养基冲洗腹腔后抽出，将培养基置于离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，用带血清的培养基重悬后吹打混匀形成单细胞悬液，然后对细胞进行计数和铺板。细胞板放入37℃，5％ CO2的孵箱中培养，3h后换液去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为小鼠原代腹腔巨噬细胞。
2.SHP2变构剂预处理或后处理
SHP099(货号S6388)、TNO155(货号S8987)均购自Selleck。大肠杆菌(E.coli)(ATCC25923)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC6538)或肺炎链球菌(S.pneumoniae)(ATCC6303)均购自ACTT。
2.1.细胞实验
对于SHP099预处理的细胞实验：先用设定浓度SHP099预处理细胞1小时，对照组加入同体积的溶剂(DMSO)处理1小时，再加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌(MOI分别为10)，然后进行后续实验。
2.2.动物实验
将小鼠随机分为对照组和实验组，所有实验均采用年龄、性别匹配的对照。
对于SHP099或TNO155预处理的小鼠实验：先腹腔注射SHP099(50mg/kg)或TNO155(60mg/kg)，对照组腹腔注射同体积的溶剂(Vehicle，生理盐水)，24小时后腹腔注射大肠杆菌(5×106CFU/g)，然后进行后续实验。
对于感染后SHP099或TNO155治疗的小鼠实验：先腹腔注射大肠杆菌(5×106CFU/g)，12小时后腹腔注射SHP099(50mg/kg)或TNO155(60mg/kg)，对照组腹腔注射同体积的溶剂(Vehicle，生理盐水)，然后进行后续实验。
3.测试方法
3.1.巨噬细胞吞噬的细菌克隆数测试：
用设定浓度的SHP099预处理巨噬细胞1小时后，用大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)或肺炎链球菌(S.pneumoniae)分别感染小鼠的腹腔巨噬细胞(细菌:细胞＝10:1)1h，然后将细胞置于冰上，用庆大霉素(100μg/ml)培养30min去除细胞外活菌，再通过细胞裂解液(含0.1％Triton的PBS溶液)的克隆形成数(colony-forming units，CFU)来分析细胞内的细菌数量，以检测巨噬细胞的吞噬能力。
3.2.免疫荧光测定：
将PI标记的大肠杆菌(E.coli)与小鼠的腹腔巨噬细胞(细菌:细胞＝10:1)孵育1h，在冰上用预冷的PBS洗两次，然后将细胞用4％多聚甲醛固定，最后用DAPI染色，用激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬情况。
3.3.酵母聚糖细胞吞噬试验：
用带荧光标记的酵母聚糖(zymosan，购自Merck，货号IAK0111)与巨噬细胞共孵育1h后，用PBS洗去多余的酵母聚糖，将细胞消化下来之后进行流式分析检测。
4.结果与讨论
巨噬细胞吞噬的细菌克隆数如图1的A和B中所示：SHP099预处理的巨噬细胞吞噬活菌的数量增加，该增加具有剂量依赖性，且在5μM SHP099处理浓度时与未经预处理组形成了显著性差异。
免疫荧光结果如图1的C中所示：SHP099预处理的巨噬细胞中细菌所产生的荧光明显增强，表明巨噬细胞吞噬细菌的数量增加。
酵母聚糖细胞吞噬试验的平均荧光强度测定结果如图1的D中显示：SHP099预处理的巨噬细胞吞噬病原体模拟物酵母聚糖的数量明显增加，该增加具有剂量依赖性，且在5μMSHP099处理浓度时与未经预处理组形成了显著性差异。该结果与巨噬细胞吞噬的细菌克隆数测试结果相符。
该实施例表明：SHP099增强了巨噬细胞吞噬细菌的能力。
实施例2：SHP099预处理的巨噬细胞清除细菌的能力增强
1.巨噬细胞内杀菌效率分析：
用大肠杆菌或金黄色葡萄球菌分别感染小鼠的腹腔巨噬细胞(细菌:细胞＝10:1)1h后，通过CFU计算巨噬细胞吞噬细菌的数量(记为0h)，用庆大霉素(100μg/ml)培养30min将胞外菌杀死后，继续培养3h～6h，分别计算3h或6h后巨噬细胞内活菌数占0h吞噬菌数的百分比。
2.结果与讨论：
巨噬细胞内杀菌效率分析如图2中所示：经SHP099预处理的巨噬细胞在3h时即可显示出极显著降低的相对CFU，6h时也仍保持明显提高的杀菌效果。该结果表明SHP099能够显著提高巨噬细胞的杀菌效率。
实施例3：SHP099预处理增强小鼠抵抗大肠杆菌感染的能力
1.小鼠预处理
6～8周龄C57小鼠(雌性，实验组和对照组各10只)购自毕凯生物科技发展有限公司，在海军军医大学SPF级动物房饲养一周后，实验组小鼠腹腔注射SHP099溶液(50mg/kg)，对照组小鼠注射等量溶剂(Vehicle)。
2.测试方法
2.1.小鼠生存率观察：
注射SHP099(50mg/kg)或等量溶剂(Vehicle)后，采用(5×106CFU/g)大肠杆菌腹腔注射小鼠，动态观察小鼠的生存率；
2.2.血清炎性因子含量测定：
在不同时间眼球取血，用CBA(购自BD公司)检测血清中TNF-α和IL-6含量；
2.3.脾脏和肝脏细菌数量检测：
用细菌培养法检测脾脏和肝脏中大肠杆菌数量(CFU)。
3.结果与讨论
感染大肠杆菌后小鼠生存率如图3的A中所示。结果显示：SHP099预处理小鼠更晚开始死亡，且SHP099预处理小鼠的存活率显著高于对照小鼠。
脾脏和肝脏中的大肠杆菌数量如图4的B和C中所示。结果显示：SHP099预处理小鼠体内大肠杆菌CFU极显著降低，表明SHP099限制细菌在小鼠体内的增殖和扩散。
对血清中炎性因子TNFα、IL-6产量的CBA分析结果如图3的D中所示。结果显示：SHP099预处理的小鼠在感染大肠杆菌后产生的炎性因子TNFα、IL-6明显减少。
该实施例表明：SHP099预处理的小鼠抵抗大肠杆菌感染能力增强。
实施例4：TNO155预处理增强细菌感染小鼠的生存率
1.动物处理
6～8周龄C57小鼠(雌性，实验组和对照组小鼠各9只)购自毕凯生物科技发展有限公司，在海军军医大学SPF级动物房饲养一周后，实验组小鼠腹腔注射TNO155溶液(60mg/kg)，对照组小鼠注射等体积溶剂(Vehicle)。
2.测试方法
注射TNO155(60mg/kg)或等量溶剂(Vehicle)后，采用(5×106CFU/g)大肠杆菌腹腔注射小鼠，动态观察小鼠的生存率。
3.结果与讨论
感染大肠杆菌后小鼠生存率如图4的A中所示。结果显示：TNO155预处理小鼠更晚开始死亡，且TNO155预处理小鼠的存活率显著高于对照小鼠。
该实施例表明：TNO155预处理极显著提高了细菌感染小鼠的生存率。
实施例5：SHP099和TNO155治疗增强细菌感染小鼠的生存率
1.动物处理
6～8周龄C57小鼠(雌性，实验组和对照组小鼠各10只)购自毕凯生物科技发展有限公司，在海军军医大学SPF级动物房饲养一周后，实验组小鼠腹腔注射SHP099(50mg/kg)或TNO155溶液(60mg/kg)，对照组小鼠注射等体积溶剂(Vehicle)。
2.测试方法
采用(5×106CFU/g)大肠杆菌腹腔注射小鼠，12小时后注射TNO155(60mg/kg)或SHP099(50mg/kg)或等量溶剂(Vehicle)，动态观察小鼠的生存率；
3.结果与讨论
感染大肠杆菌后小鼠生存率如图5的A中所示。结果显示：SHP099或TNO155治疗的小鼠更晚开始死亡，且SHP099或TNO155治疗的小鼠存活率显著高于对照小鼠。
该实施例表明：SHP099或TNO155的治疗提高了细菌感染小鼠的生存率。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.SHP2变构抑制剂在制备用于预防和/或治疗对象的感染性疾病及其相关病症和/或征状的产品中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中，感染由病原体、化学物质、物理因素或其组合引起，例如所述感染由选自下组的一种或多种病原体引起：细菌、真菌、支原体、衣原体和寄生虫；和/或
所述对象为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、宠物、家畜。
3.如权利要求1所述的用途，其中，所述感染相关病症和/或症状为选自下组中的一种或多种：感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡；感染引起的器官炎性损伤；感染引起的多器官功能衰竭；
例如，所述感染后过量产生的炎症因子为选自下组的一种或多种：TNFα、IL-1、IL-6、IFN-β，优选TNFα、IFN-β或IL-6；
例如，所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠。
4.如权利要求2所述的用途，其中，所述病原体选自下组中的一种或多种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、芽孢杆菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肉毒杆菌、炭疽芽孢杆菌、肠杆菌、奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、念珠菌或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其中，所述SHP2变构抑制剂选自：
(A)式(I)所示的SHP099：
(B)以SHP099为先导化合物衍生的SHP2变构抑制剂，
例如选自下组的SHP2变构抑制剂：
TNO 155SHP389/>
SHP394RMC-4550/>
IACS-15414RMC-4630、IACS-15509；或
(C)(A)或(B)中物质的药学上可接受的盐。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述药学上可接受的盐选自：无机酸盐或有机酸盐，例如：
a’)无机酸盐，例如与选自下组的无机酸形成的盐：盐酸、磷酸、硼氢酸、硝酸和硫酸；或
b’)有机酸盐，例如与选自下组的有机酸形成的盐：乳酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和酸性氨基酸(如甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)。
7.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品为药物组合物，其含有有效量的SHP2变构抑制剂(例如SHP099、其衍生物或其药学上可接受的盐)，以及药学上可接受的载体或赋形剂；和/或
所述产品为片剂、胶囊、注射剂、粉末剂、颗粒剂、混悬剂、栓剂、口服液；和/或
所述产品的形式适于采用选自下组的方式给予：口服、注射(例如直接化合物注射法、脂质体包裹化合物注射法)、喷雾、吸入。
8.如权利要求1所述的应用，其中，所述产品还包括一种或多种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的其它活性物质，例如临床常用抗生素(例如β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)。
9.一种药物组合物，其包含：
(A)治疗或预防有效量的SHP2变构抑制剂，例如SHP099或其药学上可接受的盐；
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；以及
(C)一种或多种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的其它活性物质。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其中，所述其它活性物质选自：临床常用抗生素(例如β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)。
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