CN117043184A - 抗人血清白蛋白(hsa)的纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了特异性结合人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体及其应用,具体公开了能够结合人血清白蛋白(HSA)的羊驼及人源化纳米抗体或其抗原结合片段,并且与人、鼠、猴血清白蛋白具有较好的亲和力,对癌症和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。
Description
本发明涉及抗体领域,具体而言,涉及HSA羊驼纳米抗体及其人源化抗体。
药代动力学是药物研发过程中的一个重要参数。对大分子药物而言,更长的血清半衰期意味着更低的给药频率和剂量,药物的生物利用度也会相应的提高,进而产生更好的治疗效果。目前,延长药物半衰期的方法有Fc融合、聚乙二醇PEG偶联以及人血清白蛋白(HSA)融合。
HSA是一种分子量为67kD的新型分子,构成了血清蛋白质量的三分之二,具有许多生理特性。血清白蛋白载有许多内源性物质,如无机离子、脂肪酸、胆红素、维生素、激素和类固醇。同时,也是许多外源性药物的载体。HSA蛋白内部存在17个二硫键,使得整个蛋白具有很好的稳定性,HSA具有延长半衰期、促进药物透过血脑屏障等优点,不易透过肾小球,在血浆中的半衰期长达2周,在体内分布广泛且没有免疫原性,是一种比较理想的蛋白药物载体。但HSA融合蛋白因其分子量较大,表达量较低以及纯化困难等原因,在一定程度上限制了其应用范围。
单域抗体,是指天然缺失轻链而只有重链可变区的一类抗体,其相对分子量只有15kD,仅为普通抗体分子量的1/10左右,因此也被称为纳米抗体或VHH抗体。纳米抗体是目前可以得到的具有完整功能的抗原结合最小单位。因其分子量小,稳定性好,化学性质灵活,常被用作搭建双特异抗体的一种理想形式。
开发靶向HSA的纳米抗体,并以其作为结构嵌段构建融合蛋白用于延长活性药物的半衰期,成为一种重要的药物开发策略,如靶向IL6R的蛋白药物Vobarilizumab,其中即含有抗HSA纳米抗体作为其结构嵌段。
本发明涉及到一种全新序列的人源化HSA纳米抗体,该抗体可特异性识别人、猴、鼠的血清白蛋白,且具有良好的结合活性。
发明内容
本发明公开提供HSA纳米抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体、细胞、组合物、制备方法、制药用途以及疾病治疗方法。
在一些实施方案中,特异性结合人血清白蛋白(HSA)的分离的纳米抗体或抗原结合片段,所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区的CDRs组合,所述CDRs组合包含:HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的序列组合:
各个HCDR1、HCDR2和HCDR3为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码;优选地,所述替换为保守氨基酸的替换。
特别地,例如本发明的纳米抗体或抗原结合片段,其中:
(1)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.31、32、33所示序列;
(2)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.34、35、36所示序列;
(3)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.37、38、36所示序列;
(4)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.39、40、41所示序列;
(5)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.42、43、44所示序列;
(6)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.45、46、44所示序列;
(7)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.47、48、49所示序列;
(8)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.50、51、52所示序列;
(9)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.53、54、52所示序列;或,
(10)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3为具有与上述(1)-(9)序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的序列组合;优选为替换,更优选为保守氨基酸残基的替换。
在另一个具体实施方案中,本发明的纳米抗体或抗原结合片段的重链可变区的框架区来源于人种系重链,其中:
(1)框架区序列来源于人种系重链IGHV3-23*04和IGHJ2*01的组合序列;其包含SEQ ID NO:28所示IGHV3-23*04的FR1、FR2、FR3区和SEQ ID NO:29所示IGHJ2*01的FR4区;
(2)框架区序列来源于人种系重链IGHV3-23*04和IGHJ3*01的组合序列;其包含SEQ ID NO:28所示IGHV3-23*04的FR1、FR2、FR3区和SEQ ID NO:30所示IGHJ3*01的FR4区。
在另一个具体实施方案中,本发明的纳米抗体或抗原结合片段的重链可变区的框架区根据Kabat编号还包含选自下组的一种或多种突变:
(1)E1Q、S30N、V37F、I70V、S75A、Q82E、S85N、A97R、K98Q、W109R或L114Q;优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q和W109R;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和E1Q;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R 和S75A;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和Q82E;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和S85N;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和L114Q;
(2)E1Q、A23V、F27V、T28D、S30R、S75A、R87K、A88F、T91M、A97V、K98Q、W111P或M116Q;优选包括E1Q、F27V、T28D、S30R、S75A、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括F27V、T28D、S30R、S75A、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括F27V、T28D、S30R、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括F27V、T28D、S30R、R87K、A88F、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括E1Q、A23V、F27V、T28D、S30R、S75A、A97V、K98Q和W111P;优选包括A23V、F27V、T28D、S30R、S75A、A97V、K98Q和W111P;优选包括F27V、T28D、S30R、R87K、A88F、T91M、A97V、K98Q和W111P;
(3)V2L、T28A、S75A、R87K、A88P、A97S、K98I或W104S;优选包括A97S和K98I;优选包括A97S、K98I和W104S;优选包括V2L、A97S、K98I和W104S;优选包括T28A、A97S、K98I和W104S;优选包括V2L、T28A、A97S、K98I和W104S;优先包括R87K、A88P、A97S、K98I和W104S;优先包括V2L、T28A、S75A、A97S、K98I和W104S;优先包括V2L、T28A、R87K、A88P、A97S、K98I和W104S。
特别地,本发明的纳米抗体或抗原结合片段还包含:
(1)可变区具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27所示序列;
(2)与上述(1)所示序列具有至少90%同一性的氨基酸序列,优选为至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性;或,
(3)所述纳米抗体或抗原结合片段的框架区与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27所示氨基酸序列的框架区具有至少90%同一性,优选为至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性。
在一个优选实施方案中,本发明的纳米抗体或抗原结合片段与人血清白蛋白、猴血清白蛋白和/或大鼠血清白蛋白结合;可选地,所述抗体或抗原结合片段结合人血清白蛋白、猴血清白蛋白和/或大鼠血清白蛋白的解离常数(KD)小于1.00E-8M、2.00E-8M、3.00E-8M、1.00E-9M、2.00E-09M、3.00E-9M、4.00E-09M、5.00E-09M、6.00E-09M、7.00E-09M、8.00E-09M、9.00E-09M、1.00E-10M、2.00E-10M、3.00E-10M、4.00E-10M、5.00E-10M、6.00E-10M、7.00E-10M、8.00E-10M、9.00E-10M、1.00E-11M、2.00E-11M、3.00E-11M、4.00E-11M、5.00E-11M、6.00E-11M、7.00E-11M、8.00E-11M、9.00E-11M、1.00E-12M、2.00E-12M、3.00E-12M、4.00E-12M、5.00E-12M、6.00E-12M、7.00E-12M、8.00E-12M或9.00E-12M;
可选地,所述纳米抗体或抗原结合片段与小鼠血清白蛋白结合或不结合。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段包含抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定区的序列;优选包含抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段进一步包含不存在CH1片段的抗体恒定区序列。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段进一步包含具有CH2和CH3片段的抗体恒定区序列,或,所述抗体或抗原结合片段进一步包含抗体Fc区;
所述抗体恒定区或抗体Fc区通过或不通过连接肽连接所述抗体或抗原结合片段;
可选地,所述抗体恒定区或抗体Fc区来自骆驼科、小鼠、大鼠、兔、羊或人;
可选地,所述抗体恒定区或抗体Fc区来自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段是嵌合的或人源化的或全人源的;优选地,所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、裸抗体、缀合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂;优选地,所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂,所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
在一个优选实施方案中,本发明还提供一种多特异性抗原结合分子;优选地,所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块,所述第一抗原结合模块包含上述任一项所述的抗体或抗原结合片段,所述第二抗原结合模块特异性结合HSA以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的HSA抗原表位;
优选地,所述其他抗原选自CD2,CD3,CD4,CD5,CD7,CD8,CD11a,CD11b,CD18,CD19,CD20,CD23,CD25,CD33,CD38,CD40,CD45,CDW52,CD69,CD70,CD134(OX40),ICOS,BCMP7,CD137,CD27L,CDCP1,DPCR1,DPCR1,dudulin2,FLJ20584,FLJ40787,HEK2,KIAA0634,KIAA0659,KIAA1246,KIAA1455,LTBP2,LTK,MAL2,MRP2,MSLN;
优选地,所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
在一个优选实施方案中,本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR);优选地,所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域,所述细胞外抗原结合结构域包含上述任一项所述HSA抗体或抗原结合片段。
在一个优选实施方案中,本发明提供一种免疫效应细胞;优选地,所述免疫效应细胞包含上述所述嵌合抗原受体或包含上述所述嵌合抗原受体的核酸片段;
优选地,所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞;所述T细胞可选自炎性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞;
优选地,所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
在一个优选实施方案中,本发明提供一种分离的核酸分子,所述核酸分子编码本发明上述任一项所述的纳米抗体、抗原结合片段、或其任意组合,上述所述的多特异性抗原结合分子或上述所述的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中,本发明提供一种表达载体,其包含本发明上述所述分离的核酸分 子。
在一些实施方案中,本发明提供一种宿主细胞,其包含本发明上述所述分离的核酸分子或表达载体。
在一个优选实施方案中,所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞;更优选,所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌;更优选,所述宿主细胞选自Expi293F细胞。
在一些实施方案中,本发明提供一种抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子的制备方法,在适当的条件下培养本发明上述所述的宿主细胞,并分离抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
在一些实施方案中,本发明提供一种免疫效应细胞的制备方法,将上述所述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞,优选地,所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达上述所述的CAR。
在一些实施方案中,本发明提供一种药物组合物,组合物包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞,或本发明上述所述方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段),以及药学上可接受的载体。
在一个优选实施方案中,所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂;更优选地,所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在一些实施方案中,本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物在在制备预防和/或***疾病或炎性疾病的药物中的用途,所述肿瘤疾病优选黑色素瘤、透明细胞肉瘤、头部和颈部癌症、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、***癌、涎腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、或脑癌;所述炎性疾病优选多发性硬化、银屑病、重症肌无力、葡萄膜炎、***性红斑狼疮、或类风湿性关节炎。
在一些实施方案中,本发明提供一种预防和/或***疾病或炎性疾病的方法,包含向有此需要的患者施用本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品、或本发明上述所述的药物组合物;所述肿瘤疾病优选黑色素瘤、透明细胞肉瘤、头部和颈部癌症、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、***癌、涎腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、或脑癌;所述炎性疾病优选多发性硬化、银屑病、重症肌无力、葡萄膜炎、***性红斑狼疮、或类风湿性关节炎。
在一些实施方案中,本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物用于预防和/或***疾病或炎性疾病;所述肿瘤疾病优选黑色素瘤、透明细胞肉瘤、头部和颈部癌症、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、***癌、涎腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、或脑癌;所述炎性疾病优选多发性硬化、银屑病、重症肌无力、葡萄膜炎、***性红斑狼疮、或类风湿性关节炎。
在一些实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的多特异性抗原结合分子、本发明上述所述的嵌合抗原受体、本发明上述所述的免疫效应细胞、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、或本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述的药物组合物,以及使用说明。
术语定义和说明
除非另外说明,本文所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。对于本文中明确定义的术语,则该术语的含义以所述定义为准。
如本文所用,术语“抗体”(Ab)是指与目标抗原特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子,包括抗体的多克隆、单克隆、基因工程化和其他修饰形式(包括但不限于嵌合抗体,人源化抗体,全人源抗体,异源偶联抗体(例如双特异性、三特异性和四特异性抗体,双抗体,三抗体和四抗体),抗体缀合物以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外,除非另有说明,否则术语“单克隆抗体”(mAb)意指包括能够特异性结合靶蛋白的完整抗体分子以及不完整的抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段,它们缺少完整抗体的Fc片段(从动物循环中更快地清除),因此缺乏Fc介导的效应功能(effector function)(参见Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316,1983;其内容援引加入本文))。
本文“抗体”可以来源于任何动物,包括但不限于人和非人动物,所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物,例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文术语“单特异性”是指具有一个或多个结合位点,其中每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
本文术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点,所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此,诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”可互换使用,是指其具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
如本文所用,术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多 个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于:(i)Fab片段,一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab)2片段,一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(V)包含VH和VL结构域的dAb;(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989);(vii)由VH或VL结构域组成的dAb;(viii)分离的互补决定区(CDR);以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合,所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的,但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合,该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人,Science 242:423-426,1988以及Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得,并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
如本文所用,术语“血清白蛋白”是指是最丰富的血液蛋白并作为血液中类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的运载体蛋白质工作,并在稳定胞外流体体积中起主要作用。仅为了命名的目的而非限制,人血清白蛋白的示例性序列示于NCBI GenBank登陆号AEE60908中。应当理解的是,述及“血清白蛋白”或“白蛋白”包括前原白蛋白(preproalbumin),其包含N端肽、原白蛋白(proalbumin)和分泌型白蛋白。白蛋白包含三个同源结构域,其中各结构域是具有共同结构基序的两个亚结构域的产物。结构域I、II和III可以参照人血清白蛋白定义。例如,结构域I包含人血清白蛋白的氨基酸1(±1至15个氨基酸)至194(±1至15个氨基酸),结构域II包含人血清白蛋白的氨基酸192(±1至15个氨基酸)至387(±1至15个氨基酸),和结构域III包含人血清白蛋白的氨基酸残基381(±1至15个氨基酸)至585(±1至15个氨基酸)。短语“±1至15个氨基酸”指氨基酸残基可能与所指氨基酸位置的C末端和/或N末端偏离1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15个氨基酸。Dockal等(The Journal of Biological Chemistry,1999,第274(41)卷:29303-29310)和Kjeldsen等(Protein Expression andPurification,1998,第13卷:163-169)描述了示例性结构域I、II和III。
如本文所用,术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有单克隆结合特异性的抗体,其通常是人或人源化的抗体。在本发明中,结合特异性之一可以针对HSA的抗原表位而被检测,另一个可以针对HSA的另一个抗原表位或除HSA任何其他抗原,例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源蛋白或细菌表面蛋白等而被检测。
如本文所用,术语“嵌合”抗体是指以下抗体,其具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如,Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7;Oi等人,1986,Bio Techniques 4:214-221;Gillies等人,1985J Immunol Methods 125:191-202;以上通过援引加入并入本文。
如本文所用,术语“纳米抗体”是指天然的缺失轻链的重链抗体,克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体,也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody),它是最小的功能性抗原结合片段。关于VHH和纳米抗体的进一步描述,参考Muyldermans的综述文章(2001,Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302),以及参考作为一般背景技术提及的以下专利申请:布鲁塞尔自由大学的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103;联合利华的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193;Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527;Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO03/050531;加拿大国家研究理事会的WO 01/90190;Institute of Antibodies的WO 03/025020(=EP 1433793);以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825,和Ablynx N.V.的进一步公开的专利申请。还参考了这些申请中提及的另外的现有技术,特别是国际申请WO 06/040153第41-43页上提及的参考文献列表,所述列表和参考文献通过引用并入本文。如这些参考文献中所述,纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)尤其可以通过在一个或更多个框架序列中存在一个或更多个“特征残基”来表征。可在例如WO 08/101985和WO 08/142164中发现纳米抗体的进一步描述,包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化,以及其他的修饰,部分或片段,衍生物或“纳米抗体融合”,多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和增加纳米抗体及其制剂的半衰期的不同修饰。对于纳米抗体的进一步的一般描述,参考本文引用的现有技术,例如WO08/020079(第16页)中所述。
如本文所用,术语“互补决定区”(CDR)指在轻链和重链可变结构域中均发现的高变区。可变结构域中更高保守性的部分称为框架区(FR)。如本领域所理解的,表示抗体的高变区的氨基酸位置可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置,因为这些位置可以被认为是在一组标准(如IMGT或KABAT)下的高变区之内,而被认为在不同组的标准(如KABAT或IMGT)下的高变区之外。这些位置中的一个或更多个也可以在延伸的高变区中找到。本发明包括在这些杂合高变的位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用片层构型的四个框架区,其通过三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)连接,这三个CDR形成连接片层结构的环,并且在一些情况下形成片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密保持在一起,并且与来自其他抗体链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987;其通过援引加入并入本文)。
本文术语“Kabat编号***”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号***(参见,例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号***”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号***,其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见,例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
本文术语“IMGT编号***”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号***,其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见,例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
如本文所用,术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体,而不限于该抗体的产生方法。
如本文所用,术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。术语“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分,其不直接参与抗体与抗原的结合,但是表现出效应子功能,诸如与Fc受体的相互作用,其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含以下之一:CH1结构域,铰链区,CH2结构域,CH3结构域,或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”,前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构,而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地,典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成;当抗体为IgE时,其还包括CH4结构域;当抗体为重链抗体时,则其不包括CH1结构域。示例性地,典型的“重链恒定区片段”可选自CH1、Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分,其不直接参与抗体与抗原的结合,所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文术语“Fc”是指完整抗体经木瓜蛋白水解而成的抗体羧基端部分,典型地,其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化,但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号***的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中,或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去,因此,Fc区可包括或不包括Lys447。
本文术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体),全部或部分的非CDR区(例如,可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质,包括但不限于,抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外,如果抗体包含恒定区,则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本 文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而,本文“全人抗体”不意图包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“裸抗体”是指不与另一种作用剂或分子(例如标记或药物)、肽或多肽连接、融合或缀合的抗体。在具体的实施方案中,由哺乳动物宿主细胞表达的裸抗体可被宿主细胞的糖基化机器(例如糖基化酶)糖基化。在某些实施方案,当通过不具有其自身糖基化机器(例如糖基化酶)的宿主细胞表达时,裸抗体不被糖基化。在某些实施方案中,裸抗体是完整抗体,而在其它实施方案中,裸抗体是完整抗体的抗原结合片段,例如Fab抗体。
本文术语“缀合抗体”是指可与药学上可接受的载体或稀释剂缔合的抗体,其可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
本文术语“双抗体”是指二价的双特异性抗体,可以与相同或不同抗原上的不同表位结合。
如本文所用,术语“百分比(%)序列一致性”是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如,为了最佳比对,可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位,并且出于比较的目的,可以忽略非同源序列)之后,候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的,可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对,例如使用公众可得的计算机软件,如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如,用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出50%-100%的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30%(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时,则这些分子在那个位置是相同的。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例:
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
如本文所用,术语“特异性结合”是指一种结合反应,其决定抗原在蛋白质和其他生物分子的一个异质性群体中的存在状况,所述蛋白质和其他生物分子例如被抗体或其抗原结 合片段特异性识别。与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD与抗原结合。例如,与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以高达100nM((例如,1pM至100nM之间)的KD与抗原结合。不显示与特定抗原或其表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段将显示对该特定抗原或其表位的大于100nM(例如,大于500nM、1μM、100μΜ、500μΜ或1mM)的KD。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。例如,常规地使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。参见,Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1988)以及Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1999),其描述了可以用于确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件。
如本文所用,术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。例如抗体-药物缀合物(ADC),其中药物分子就是所述的另一个分子。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指这样的重组蛋白,其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域,例如抗体的可变重链或轻链,(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域,和(3)胞内信号传导结构域。在某些实施方式中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含scFv。scFv可以源自融合抗体的可变区。替代地或另外,scFv可以衍生自Fab’s(而不是抗体,例如获自Fab文库)。在某些实施方式中,将scFv融合至跨膜结构域,然后融合至细胞内信号传导结构域。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基,特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常,核酸分子由碱基的序列描述,由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中,术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA),包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA),特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式,以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外,术语核酸分子包括有义链和反义链二者,以及单链和双链形式。而且,本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子,其适合作为载体用于在体外和/或体内,例如在宿主或患者中,直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如,可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达,从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人,Nature Medicine 2017,published online2017年6月12日,doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。
如本文所用,术语“载体”包括核酸载体,例如DNA载体(如质粒),RNA载体,病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于 表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列,其增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点,以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可以含有以下多核苷酸,该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞,包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代,而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同,而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂,其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在,并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状,例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症,或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时,治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时,治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量,而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“适当的条件”指适合培养各种宿主细胞的条件,其中宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。
本文术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“抗肿瘤剂”指抗肿瘤药物,其为***疾病的一类药物,有化疗药物、生物制剂等。
与现有技术相比,本发明的技术方案至少具有以下之一的有益效果:
1.与羊驼抗体相比,本发明所述人源化抗体不但具有结合HSA的能力,在保证分子稳定性和生物学功能符合要求的同时还降低了免疫原性,有助于降低人受试者使用时的免疫排斥风险。
2.本发明所述人源化抗体显示与人、鼠和/或猴血清白蛋白的良好结合能力,有利于提高其治疗效果和/或开展临床前的动物实验。
3.在与人、鼠和/或猴血清白蛋白结合方面,意外发现本发明所述人源化抗体与其亲本羊驼抗体相当或更优,优于常规的人源化抗体(常规人源化抗体的结合能力较之亲本抗体降低2~3倍)。
除非本发明另外定义,与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
图1为巢式PCR两轮扩增羊驼纳米抗体基因序列的电泳图,泳道M为蛋白Marker条带。
图2为转化子数目平板图,左侧平板为稀释1000倍的菌液转化子数目,右侧平板为稀释10000倍的转化子数目。
图3为菌落PCR对电转后的克隆进行***率检测的电泳图,泳道M为蛋白Marker条带。
图4为HSA对照抗体纯化后的SDS-PAGE和SEC-HPLC纯度检测。
图5为SEC-HPLC方法检测本发明羊驼VHH-Fc抗体纯度图谱。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 针对人血清白蛋白纳米抗体的筛选
1.1羊驼的免疫和血清效价检测
选择1只1.5-3周岁的羊驼(Alpaca),免疫前采血10ml,留作阴性对照血清。第一次免疫采用首免剂量加倍原则,将0.5mg人血清白蛋白(成都蓉生,国药准字S10940024)与弗氏佐剂(Sigma,F5881)充分混合后皮下注射免疫。三周后,进行第二次免疫,0.25mg蛋白与弗式佐剂混合后皮下免疫,一周后取血清测定效价。第三次免疫0.25mg蛋白与弗式佐剂混合后皮下免疫,一周后取血清测定效价。为增加人鼠交叉结合的概率,第四次免疫采用人血清白蛋白和鼠血清白蛋白(Alpha Diagnist,ALB14-N-10)各0.25mg混合免疫,一周后0.5mg冲击免疫。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中针对人血清白蛋白的抗体效价和特异性,第三次和第四次免疫的羊驼血清效价结果如表1所示,表中的数据为OD450nm值。
表1.ELISA检测人血清白蛋白免疫后的羊驼血清抗体效价
1.2抗人血清白蛋白纳米抗体文库的构建
采集第三次免疫和四次免疫之后的羊驼外周血共50mL,采用淋巴细胞分离液分离PBMC。用RNAiso Plus试剂(Takara,9108/9109)提取三次免疫和四次免疫后的总RNA。按照逆转录试剂盒PrimeScript
TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara,6210A)说明书,共转录5μg RNA。以cDNA为模板,采用巢式PCR扩增纳米抗体(VHH)片段。图1显示为VHH片段第一轮和第二轮扩增后的结果,结果显示第一轮扩增后的目的条带大小约750bp,第二轮扩增后的目的条带大小约500bp。PCR产物经过纯化后,使用限制性内切SfiI酶(NEB,R0123L)将其连接入噬菌体展示载体pComb3Xss(成都阿帕克公司,P001)中。随后进行连接产物电转TG1感受态细胞,共进行了10次电击转化,电击之后立即向电击杯中加入1mL 2YT培养基(生工,A507019-0250)复苏,吸出电击产物并用2YT培养基(生工,A507019-0250)洗净电击杯,共计获得100ml TG1细胞复苏产物。TG1细胞复苏产物37℃,180rpm复苏45min,取100ml TG1菌液梯度稀释10
3倍和10
4倍,测定纳米抗体库的转化子数目,将10
3和10
4倍稀释的TG1菌液涂布于90mm的平板上,其余菌液离心,并加入8mL 2YT培养基(生工,A507019-0250)重悬,菌液涂布于8块200mm的平板上。梯度稀释的转化子数目结果如图2所示,在测定纳米抗体库转化子数目的平板“NB116 10
-4”上共有200个克隆,计算库容的大小为2.0×10
9。图3显示为随机从测库转化子数目滴度平板上挑取48个克隆进行鉴定,目的蛋白的DNA条带大小约为500bp。结果显示48个克隆全部为阳性,表明***率为100%。
第一轮扩增上游引物LD-F:
第一轮扩增下游引物CH2-R:
第二轮扩增上游引物为Primer F:
第二轮扩增下游引物Primer R1:
第二轮扩增下游引物Primer R2:
1.3针对人血清白蛋白纳米抗体的淘选
将生物素标记后的抗原分子(东仁化学,LK55)用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/mL,按100μL/孔加入酶标孔中,4℃包被过夜;第二天每孔加入300μL 3%OVA-PBS封闭液,37℃封闭1h后,加入100μL噬菌体文库,37℃孵育1h;之后用PBST洗涤6次,PBS洗涤2次,以洗掉不结合的噬菌体。最后加入100μL Gly-HCl洗脱液,37℃孵育8min,洗脱特异性结合的噬菌体。将洗脱的噬菌体继续感染TG1菌株,经过多轮的淘选,阳性噬菌体在淘选的过程中不断富集,以便筛选出特异性好、亲和力高的纳米抗体。
1.4噬菌体酶联免疫方法筛选特异性单个阳性克隆
淘洗后,随机挑选96个克隆接种于2YT培养基(生工,A507019-0250)中,随后按1:20的稀释比例加入M13K07噬菌体(NEB,N0315S),37℃培养45min。第二天取培养基上清,用于单克隆ELISA鉴定。将靶分子人、小鼠、猴的白蛋白抗原用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL,按100μL/孔加入酶标孔中,4℃包被过夜。随后每孔加入35μL噬菌体培养菌液上清和1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(义翘神州,11973-MM05T-H),洗涤之后加入TMB显色液(索莱宝,PR1200)显色,于450nm下测光密度。挑选同时结合人、鼠、猴白蛋白(Abcam,ab184894)的阳性克隆进行测序。经过多轮的优化和筛选,共获得3个能够同时识别人、鼠、猴白蛋白的阳性克隆,分别命名为sdAb-76、sdAb-220和sdAb-350。其序列的CDRs分别用KABAT、Chothia或IMGT软件分析,对应的序列信息如下表2-3所示,其中表2示出3个羊驼纳米抗体分子氨基酸表示的抗体序列,表3示出3个羊驼纳米抗体分子CDRs的IMGT、Kabat和Chothia分析结果。
表2.抗HSA羊驼纳米抗体的氨基酸具体序列信息
表3.IMGT、KABAT和Chothia软件分析HSA羊驼纳米抗体的CDRs具体序列信息
实施例2 对照抗体的制备
2.1 HSA对照抗体重组表达
本发明中所采用的对照抗体取自于Vobarilizumab中的具有抗HSA抗体功能的嵌段结构(序列来自于Ablynx公司已公开发表的专利WO2018/029182),序列见下表4。将对照抗体可变区序列克隆到带有人Fc铰链区和恒定区序列的pTT5载体(优宝生物,VT2202),与抗体恒定区融合表达,形成VHH-Fc表达顺序,并制备质粒。抗体质粒经PEI(Polysciences,24765-1)瞬时转染到Expi293F(Gibco,A14527)细胞,培养7天后收集上清,按实施例2.2方式纯化抗体。所得HSA对照抗体命名为aHSA-Fc。如图4所示,aHSA-Fc抗体还原状态下分子量约40kD,非还原状态下分子量约80kD,运用SEC-HPLC方法检测纯度为95%。
表4.对照抗体序列表
备注:**代表终止密码子。
2.2 Protein A亲和层析纯化Fc标签纳米抗体
首先高速离心收取表达抗体的细胞培养上清。ProteinA(博格隆,AA0273)蛋白层析柱利用0.1M NaOH洗3-5倍柱体积,然后利用纯水清洗3-5倍柱体积。利用1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积。细胞上清低流速上样结合,控制流速使保留时间约1min或更长时间,结合完毕后利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线。利用50mM柠檬酸/柠檬酸钠(pH3.0-3.5)缓冲液进行样品洗脱,根据紫外检测收集洗脱峰,洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换,如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系,或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系,或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
实施例3 重组纳米抗体表达纯化及亲和力检测
3.1重组纳米抗体的表达纯化
将获得的羊驼纳米抗体序列分别克隆到带有Fc标签的真核表达载体pTT5(优宝生物,VT2202,Fc序列见表4)上,经PEI(Polysciences,24765-1)瞬转Expi293F细胞(Gibco,A14527),培养6天后收集上清,经过protein A蛋白(博格隆,AA0273)亲和纯化,收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体,得到对应的重组纳米抗体(VHH-Fc),分别命名为ch-sdAb-76、ch-sdAb-220和ch-sdAb-350。运用SEC-HPLC方法对纯化得到的抗体进行检测,经过Protein A一步纯化后的结果如图5所示,结果表明三个抗体的纯度皆大于95%。
3.2重组纳米抗体的亲和力测定
应用BIAcore 8K仪器,采用Protein A捕获法检测抗体与抗原的结合强度。首先,应用氨基偶联法将Protein A固定到CM4芯片(厂家:GE,货号BR-1005-34)上,根据Amine Coupling Kit试剂盒(厂家:GE,货号BR100633)的指导,以HBS-EP+pH7.4为流动相,将NHS和EDC混合后,活化芯片约600秒,用10mM乙酸钠pH4.5将Protein A稀释至50μg/mL,注射600s,最后用乙醇胺对剩余的活化位点进行封闭。然后,采用多循环动力学法测定抗体与抗原的亲和力,在每一个循环中,首先用Protein A芯片捕获待测抗体,然后注入单一浓度的抗原蛋白,记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程,最后用Glycine pH1.5完成芯片再生,其中流动相为HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA, 0.05%surfactant P20),流速30μL/min,再生时间为30s,检测温度为25℃;最后,根据1:1 binding模型,对数据进行分析,拟合抗体抗原结合动力学参数,包括结合速率常数ka、解离速率常数kd、平衡解离常数KD、最大结合信号Rmax。
3个重组纳米抗体与人、小鼠、猴白蛋白的结合速率(Ka)、解离速率(Kd)及结合亲和力(KD)如表5所示。其中,三个重组纳米抗体针对人、小鼠、猴血清白蛋白的亲和力均优于对照抗体aHSA-Fc(SEQ ID NO.57),如表5所示,三个重组纳米抗体与人、小鼠、猴血清白蛋白均有结合,与人血清白蛋白的亲和力在6.87E-09M以上,与猴血清白蛋白的亲和力在7.10E-09M以上,与小鼠血清白蛋白的亲和力在1.04E-08M以上。
表5.SPR(biacore)检测重组纳米抗体与人、猴、小鼠血清白蛋白的亲和力
实施例4 纳米抗体人源化
4.1羊驼纳米抗体的人源化设计
通过比对IMGT(http://imgt.cines.fr)数据库中人类抗体可变区种系基因数据库和MOE(Molecular Operating Environment,分子操作环境)软件,分别挑选与纳米抗体同源性高的重链可变区种系基因作为模板,将纳米抗体的基于Kabat命名方法的CDRs序列分别移植到相应的人源模板中,形成次序为“FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4”的可变区序列。sdAb-76羊驼纳米抗体的人源化模板为IGHV3-23*04和IGHJ2*01,sdAb-350和sdAb-220羊驼纳米抗体的人源化模板为IGHV3-23*04和IGHJ3*01。将羊驼抗体sdAb-76、sdAb-350和sdAb-220的CDRs分别移植到其人源模板中,其人源化模板的氨基酸序列及3个人源化抗体的氨基酸序列见表6。
表6.人源化模板及人源化抗体的氨基酸具体序列信息
4.2 hu-sdAb76的人源化抗体回复突变设计
将hu-sdAb76人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为羊驼抗体对应的氨基酸,以保证原有的亲和力,具体回复突变后的突变点详情(回复突变点以自然顺序编号)及具体氨基酸序列见表7-8。
表7.hu-sdAb76人源化抗体回复突变的突变点情况
抗体名称 | 序列编号 | 突变点 |
hu-sdAb76-H1 | SEQ ID NO.7 | Graft(IGHV3-23*04)+S30N,V37F,I70V,A97R,K98Q,W109R |
hu-sdAb76-H2 | SEQ ID NO.8 | Graft(IGHV3-23*04)+S30N,V37F,I70V,A97R,K98Q,W109R,E1Q |
hu-sdAb76-H3 | SEQ ID NO.9 | Graft(IGHV3-23*04)+S30N,V37F,I70V,A97R,K98Q,W109R,S75A |
hu-sdAb76-H4 | SEQ ID NO.10 | Graft(IGHV3-23*04)+S30N,V37F,I70V,A97R,K98Q,W109R,Q82E |
hu-sdAb76-H5 | SEQ ID NO.11 | Graft(IGHV3-23*04)+S30N,V37F,I70V,A97R,K98Q,W109R,S85N |
hu-sdAb76-H6 | SEQ ID NO.12 | Graft(IGHV3-23*04)+S30N,V37F,I70V,A97R,K98Q,W109R,L114Q |
注:Graft(IGHV3-23*04)代表将羊驼抗体CDR植入人种系FR区序列;A97R表示将Graft(IGHV3-23*04)的第97位A突变为R,其它依此类推。
表8.hu-sdAb76人源化抗体回复突变的氨基酸序列
注:加粗部分表示突变点
4.3 hu-sdAb220的人源化抗体回复突变设计
将hu-sdAb220人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为羊驼抗体对应的氨基酸,以保证原有的亲和力,具体回复突变后的突变点详情(回复突变点以自然顺序编号)及具体氨基酸序列见表9-10。
表9.hu-sdAb220人源化抗体回复突变的突变点情况
注:Graft(IGHV3-23*04)代表将羊驼抗体CDR植入人种系FR区序列;E1Q表示将Graft(IGHV3-23*04)的第1位E突变为Q,其它依此类推。
表10.hu-sdAb220人源化抗体回复突变的氨基酸序列
注:加粗部分表示突变点
4.4 hu-sdAb350的人源化抗体回复突变设计
将hu-sdAb350人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为羊驼抗体对应的氨基酸,以保证原有的亲和力,具体回复突变后的突变点详情(回复突变点以自然顺序编号)及具体氨基酸序列见表11-12。
表11.hu-sdAb350人源化抗体回复突变的突变点情况
抗体名称 | 序列编号 | 突变点 |
hu-sdAb350-H1 | SEQ ID NO.20 | Graft(IGHV3-23*04)+A97S,K98I |
hu-sdAb350-H2 | SEQ ID NO.21 | Graft(IGHV3-23*04)+A97S,K98I,W104S |
hu-sdAb350-H3 | SEQ ID NO.22 | Graft(IGHV3-23*04)+V2L,A97S,K98I,W104S |
hu-sdAb350-H4 | SEQ ID NO.23 | Graft(IGHV3-23*04)+T28A,A97S,K98I,W104S |
hu-sdAb350-H5 | SEQ ID NO.24 | Graft(IGHV3-23*04)+V2L,T28A,A97S,K98I,W104S |
hu-sdAb350-H6 | SEQ ID NO.25 | Graft(IGHV3-23*04)+R87K,A88P,A97S,K98I,W104S |
hu-sdAb350-H7 | SEQ ID NO.26 | Graft(IGHV3-23*04)+V2L,T28A,S75A,A97S,K98I,W104S |
hu-sdAb350-H8 | SEQ ID NO.27 | Graft(IGHV3-23*04)+V2L,T28A,R87K,A88P,A97S,K98I,W104S |
注:Graft(IGHV3-23*04)代表将羊驼抗体CDR植入人种系FR区序列;A97S表示将Graft(IGHV3-23*04)的第97位A突变为S,其它依此类推。
表12.hu-sdAb350人源化抗体回复突变的氨基酸序列
注:加粗部分表示突变点
实施例5 人源化纳米抗体的表达纯化及亲和力测定
5.1人源化纳米抗体的表达纯化
将人源化抗体可变区序列基因合成后(上海生工完成)克隆到带有人Fc铰链区和恒定区序列的pTT5载体(优宝生物,VT2202),与抗体恒定区融合表达,形成VHH-Fc表达顺序,并制备质粒。抗体质粒经PEI(Polysciences,24765-1)瞬时转染到Expi293F(Gibco,A14527)细胞,培养7天后收集上清,按实施例2.2方式纯化抗体。
5.2 hu-sdAb76人源化抗体的亲和力测定
将最终获得的多种hu-sdAb76人源化抗体表达纯化后,按照实施例3.2的方法分别测定人源化抗体与人、猴、小鼠血清白蛋白的亲和力,具体亲和力数值见表13。经过回复突变,其中人源化抗体hu-sdAb76-H4保持了与嵌合抗体的亲和力水平,基本与嵌合对照抗体相当。
表13.SPR(biacore)检测hu-sdAb76人源化抗体与人、猴、小鼠血清白蛋白的亲和力
抗体名称 | 抗原 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
ch-sdAb-76 | 人血清白蛋白 | 5.12E+05 | 1.86E-04 | 3.64E-10 |
ch-sdAb-76 | 猴血清白蛋白 | 5.27E+05 | 1.40E-03 | 2.65E-09 |
ch-sdAb-76 | 小鼠血清白蛋白 | 1.30E+05 | 5.78E-04 | 4.44E-09 |
hu-sdAb76-H1 | 人血清白蛋白 | 1.47E+05 | 2.53E-04 | 1.71E-09 |
hu-sdAb76-H1 | 猴血清白蛋白 | 3.25E+05 | 6.22E-03 | 1.92E-08 |
hu-sdAb76-H1 | 小鼠血清白蛋白 | No binding | No binding | No binding |
hu-sdAb76-H2 | 人血清白蛋白 | 1.37E+05 | 2.35E-04 | 1.72E-09 |
hu-sdAb76-H2 | 猴血清白蛋白 | 2.24E+05 | 4.02E-03 | 1.80E-08 |
hu-sdAb76-H2 | 小鼠血清白蛋白 | 4.00E+04 | 3.57E-04 | 8.92E-09 |
hu-sdAb76-H3 | 人血清白蛋白 | 1.48E+05 | 2.89E-04 | 1.95E-09 |
hu-sdAb76-H3 | 猴血清白蛋白 | 2.52E+05 | 5.23E-03 | 2.08E-08 |
hu-sdAb76-H3 | 小鼠血清白蛋白 | 3.30E+04 | 4.11E-04 | 1.25E-08 |
hu-sdAb76-H4 | 人血清白蛋白 | 4.74E+05 | 1.70E-04 | 3.60E-10 |
hu-sdAb76-H4 | 猴血清白蛋白 | 4.45E+05 | 1.59E-03 | 3.58E-09 |
hu-sdAb76-H4 | 小鼠血清白蛋白 | 7.50E+04 | 6.82E-04 | 9.09E-09 |
hu-sdAb76-H5 | 人血清白蛋白 | 1.48E+05 | 2.99E-04 | 2.02E-09 |
hu-sdAb76-H5 | 猴血清白蛋白 | 2.18E+05 | 5.01E-03 | 2.30E-08 |
hu-sdAb76-H5 | 小鼠血清白蛋白 | 2.26E+04 | 5.41E-04 | 2.39E-08 |
hu-sdAb76-H6 | 人血清白蛋白 | 1.49E+05 | 3.12E-04 | 2.10E-09 |
hu-sdAb76-H6 | 猴血清白蛋白 | 2.31E+05 | 5.43E-03 | 2.36E-08 |
hu-sdAb76-H6 | 小鼠血清白蛋白 | 2.68E+04 | 5.02E-04 | 1.87E-08 |
5.3 hu-sdAb220人源化抗体的亲和力测定
将最终获得的多种hu-sdAb220人源化抗体表达纯化后,按照实施例3.2的方法分别测定抗体与人、猴、小鼠、大鼠血清白蛋白的亲和力,具体亲和力数值见表14。结果显示:经过回复突变,与人血清白蛋白和猴血清白蛋白的结合,所有hu-sdAb220人源化抗体都保持了与嵌合对照抗体相当的水平。但hu-sdAb220人源化抗体与小鼠血清白蛋白的结合能力较弱,略低于嵌合抗体。推测这可能是由于hu-sdAb220纳米抗体与小鼠白蛋白的结合表位更偏离CDR区域,更多的FR区域参与了蛋白的结合。
表14.SPR(biacore)检测hu-sdAb220人源化抗体与人、猴、小鼠血清白蛋白的亲和力
抗体名称 | 抗原 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
ch-sdAb-220 | 人血清白蛋白 | 2.47E+05 | 9.98E-04 | 4.04E-09 |
ch-sdAb-220 | 猴血清白蛋白 | 2.80E+05 | 1.98E-03 | 7.10E-09 |
ch-sdAb-220 | 小鼠血清白蛋白 | 5.34E+04 | 2.20E-04 | 4.13E-09 |
hu-sdAb220-H1 | 人血清白蛋白 | 3.70E+05 | 1.26E-03 | 3.40E-09 |
hu-sdAb220-H1 | 猴血清白蛋白 | 3.61E+05 | 2.16E-03 | 5.98E-09 |
hu-sdAb220-H1 | 小鼠血清白蛋白 | 2.58E+04 | 4.39E-04 | 1.70E-08 |
hu-sdAb220-H2 | 人血清白蛋白 | 3.62E+05 | 1.34E-03 | 3.70E-09 |
hu-sdAb220-H2 | 猴血清白蛋白 | 3.54E+05 | 2.27E-03 | 6.41E-09 |
hu-sdAb220-H2 | 小鼠血清白蛋白 | 2.16E+04 | 3.86E-04 | 1.78E-08 |
hu-sdAb220-H3 | 人血清白蛋白 | 3.79E+05 | 1.34E-03 | 3.54E-09 |
hu-sdAb220-H3 | 猴血清白蛋白 | 3.65E+05 | 2.26E-03 | 6.19E-09 |
hu-sdAb220-H3 | 小鼠血清白蛋白 | 2.82E+04 | 5.35E-04 | 1.89E-08 |
hu-sdAb220-H4 | 人血清白蛋白 | 3.68E+05 | 1.31E-03 | 3.57E-09 |
hu-sdAb220-H4 | 猴血清白蛋白 | 3.65E+05 | 2.22E-03 | 6.08E-09 |
hu-sdAb220-H4 | 小鼠血清白蛋白 | 2.39E+04 | 3.08E-04 | 1.29E-08 |
hu-sdAb220-H5 | 人血清白蛋白 | 3.68E+05 | 1.11E-03 | 3.02E-09 |
hu-sdAb220-H5 | 猴血清白蛋白 | 3.57E+05 | 1.92E-03 | 5.38E-09 |
hu-sdAb220-H5 | 小鼠血清白蛋白 | 2.53E+04 | 3.01E-04 | 1.19E-08 |
hu-sdAb220-H6 | 人血清白蛋白 | 3.84E+05 | 1.17E-03 | 3.05E-09 |
hu-sdAb220-H6 | 猴血清白蛋白 | 3.72E+05 | 2.04E-03 | 5.49E-09 |
hu-sdAb220-H6 | 小鼠血清白蛋白 | 3.10E+04 | 4.36E-04 | 1.41E-08 |
hu-sdAb220-H7 | 人血清白蛋白 | 3.64E+05 | 1.30E-03 | 3.56E-09 |
hu-sdAb220-H7 | 猴血清白蛋白 | 3.53E+05 | 2.24E-03 | 6.35E-09 |
hu-sdAB220-H7 | 小鼠血清白蛋白 | 2.34E+04 | 3.64E-04 | 1.55E-08 |
考虑到小鼠和大鼠的同源关系较近,我们又进一步按照实施例3.2的方法测定了抗体与大鼠血清白蛋白的亲和力,具体亲和力数值见表15。结果显示:对照抗体aHSA-Fc与大鼠血清白蛋白的亲和力非常弱,仅5.00E-07M。hu-sdAb220经过回复突变,所有人源化抗体与大鼠的亲和力都保持了与嵌合抗体相当的水平。
表15.SPR(biacore)检测hu-sdAb220人源化抗体与大鼠血清白蛋白的亲和力
抗体名称 | 抗原 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
ch-sdAb-220 | 大鼠血清白蛋白 | 1.22E+06 | 3.31E-02 | 2.71E-08 |
hu-sdAb220-H1 | 大鼠血清白蛋白 | 1.05E+06 | 3.16E-02 | 3.01E-08 |
hu-sdAb220-H2 | 大鼠血清白蛋白 | 1.20E+06 | 3.40E-02 | 2.84E-08 |
hu-sdAb220-H3 | 大鼠血清白蛋白 | 1.12E+06 | 3.32E-02 | 2.95E-08 |
hu-sdAb220-H4 | 大鼠血清白蛋白 | 1.20E+06 | 2.94E-02 | 2.46E-08 |
hu-sdAb220-H5 | 大鼠血清白蛋白 | 1.20E+06 | 3.01E-02 | 2.51E-08 |
hu-sdAb220-H6 | 大鼠血清白蛋白 | 1.11E+06 | 3.30E-02 | 2.97E-08 |
hu-sdAb220-H7 | 大鼠血清白蛋白 | 8.35E+05 | 2.24E-02 | 2.68E-08 |
aHSA-Fc对照 | 大鼠血清白蛋白 | 6.84E+04 | 3.42E-02 | 5.00E-07 |
5.4 hu-sdAb350人源化抗体的亲和力测定
将最终获得的多种hu-sdAb350人源化抗体表达纯化后,按照实施例3.2的方法分别测定抗体与人、猴、小鼠血清白蛋白的亲和力,具体亲和力数值见表16。结果显示:经过回复突变,除hu-sdAb350-H1外,其余人源化抗体的亲和力都保持了与嵌合对照抗体相当的水平。
表16.SPR(biacore)检测hu-sdAb350人源化抗体与人、猴、小鼠血清白蛋白的亲和力
抗体名称 | 抗原 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
ch-sdAb-350 | 人血清白蛋白 | 1.53E+05 | 1.05E-03 | 6.87E-09 |
ch-sdAb-350 | 猴血清白蛋白 | 1.50E+05 | 8.80E-04 | 5.85E-09 |
ch-sdAb-350 | 小鼠血清白蛋白 | 8.19E+04 | 8.56E-04 | 1.04E-08 |
hu-sdAb350-H1 | 人血清白蛋白 | 1.16E+05 | 1.73E-02 | 1.50E-07 |
hu-sdAb350-H1 | 猴血清白蛋白 | 5.63E+05 | 1.45E-02 | 2.58E-08 |
hu-sdAb350-H1 | 小鼠血清白蛋白 | 4.74E+04 | 1.21E-03 | 2.55E-08 |
hu-sdAb350-H2 | 人血清白蛋白 | 1.34E+05 | 7.90E-04 | 5.88E-09 |
hu-sdAb350-H2 | 猴血清白蛋白 | 1.28E+05 | 6.62E-04 | 5.18E-09 |
hu-sdAb350-H2 | 小鼠血清白蛋白 | 7.69E+04 | 1.17E-03 | 1.53E-08 |
hu-sdAb350-H3 | 人血清白蛋白 | 1.40E+05 | 1.08E-03 | 7.70E-09 |
hu-sdAb350-H3 | 猴血清白蛋白 | 1.32E+05 | 9.29E-04 | 7.02E-09 |
hu-sdAb350-H3 | 小鼠血清白蛋白 | 7.65E+04 | 1.06E-03 | 1.39E-08 |
hu-sdAb350-H4 | 人血清白蛋白 | 1.33E+05 | 7.39E-04 | 5.54E-09 |
hu-sdAb350-H4 | 猴血清白蛋白 | 1.27E+05 | 6.31E-04 | 4.95E-09 |
hu-sdAb350-H4 | 小鼠血清白蛋白 | 7.56E+04 | 1.17E-03 | 1.55E-08 |
hu-sdAb350-H5 | 人血清白蛋白 | 1.42E+05 | 1.02E-03 | 7.14E-09 |
hu-sdAb350-H5 | 猴血清白蛋白 | 1.34E+05 | 8.89E-04 | 6.63E-09 |
hu-sdAb350-H5 | 小鼠血清白蛋白 | 7.65E+04 | 1.05E-03 | 1.37E-08 |
hu-sdAb350-H6 | 人血清白蛋白 | 1.34E+05 | 7.72E-04 | 5.78E-09 |
hu-sdAb350-H6 | 猴血清白蛋白 | 1.26E+05 | 6.50E-04 | 5.14E-09 |
hu-sdAb350-H6 | 小鼠血清白蛋白 | 7.77E+04 | 1.17E-03 | 1.51E-08 |
hu-sdAb350-H7 | 人血清白蛋白 | 1.37E+05 | 1.05E-03 | 7.68E-09 |
hu-sdAb350-H7 | 猴血清白蛋白 | 1.65E+05 | 9.82E-04 | 5.95E-09 |
hu-sdAb350-H7 | 小鼠血清白蛋白 | 7.66E+04 | 1.03E-03 | 1.34E-08 |
hu-sdAb350-H8 | 人血清白蛋白 | 1.43E+05 | 1.02E-03 | 7.13E-09 |
hu-sdAb350-H8 | 猴血清白蛋白 | 1.35E+05 | 8.96E-04 | 6.63E-09 |
hu-sdAb350-H8 | 小鼠血清白蛋白 | 7.82E+04 | 1.03E-03 | 1.32E-08 |
Claims (24)
- 一种结合人血清白蛋白(HSA)的分离的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区的CDRs组合,所述CDRs组合包含:HCDR1、HCDR2和HCDR3;所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的序列组合:各个HCDR1、HCDR2和HCDR3为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码;优选地,所述替换为保守氨基酸的替换。
- 权利要求1所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,(1)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.31、32、33所示序列;(2)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.34、35、36所示序列;(3)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.37、38、36所示序列;(4)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.39、40、41所示序列;(5)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.42、43、44所示序列;(6)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.45、46、44所示序列;(7)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.47、48、49所示序列;(8)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.50、51、52所示序列;(9)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.53、54、52所示序列;或,(10)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3为具有与上述(1)-(9)序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的序列组合;优选为替换,更优选为保守氨 基酸残基的替换。
- 根据权利要求1-2任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述纳米抗体或抗原结合片段的重链可变区的框架区来源于人种系重链,其中:(1)框架区序列来源于人种系重链IGHV3-23*04和IGHJ2*01的组合序列;其包含SEQ ID NO:28所示IGHV3-23*04的FR1、FR2、FR3区和SEQ ID NO:29所示IGHJ2*01的FR4区;(2)框架区序列来源于人种系重链IGHV3-23*04和IGHJ3*01的组合序列;其包含SEQ ID NO:28所示IGHV3-23*04的FR1、FR2、FR3区和SEQ ID NO:30所示IGHJ3*01的FR4区。
- 根据权利要求3所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,根据Kabat编号***编号,所述纳米抗体或抗原结合片段的重链可变区的框架区还包括选自下组的一种或多种突变:(1)E1Q、S30N、V37F、I70V、S75A、Q82E、S85N、A97R、K98Q、W109R或L114Q;优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q和W109R;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和E1Q;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和S75A;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和Q82E;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和S85N;或优选包括S30N、V37F、I70V、A97R、K98Q、W109R和L114Q;(2)E1Q、A23V、F27V、T28D、S30R、S75A、R87K、A88F、T91M、A97V、K98Q、W111P或M116Q;优选包括E1Q、F27V、T28D、S30R、S75A、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括F27V、T28D、S30R、S75A、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括F27V、T28D、S30R、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括F27V、T28D、S30R、R87K、A88F、T91M、A97V、K98Q、W111P和M116Q;优选包括E1Q、A23V、F27V、T28D、S30R、S75A、A97V、K98Q和W111P;优选包括A23V、F27V、T28D、S30R、S75A、A97V、K98Q和W111P;优选包括F27V、T28D、S30R、R87K、A88F、T91M、A97V、K98Q和W111P;(3)V2L、T28A、S75A、R87K、A88P、A97S、K98I或W104S;优选包括A97S和K98I;优选包括A97S、K98I和W104S;优选包括V2L、A97S、K98I和W104S;优选包括T28A、A97S、K98I和W104S;优选包括V2L、T28A、A97S、K98I和W104S;优先包括R87K、A88P、A97S、K98I和W104S;优先包括V2L、T28A、S75A、A97S、K98I 和W104S;优先包括V2L、T28A、R87K、A88P、A97S、K98I和W104S。
- 根据权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述的纳米抗体或抗原结合片段包含:(1)可变区具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27所示序列;(2)与上述(1)所示序列具有至少90%同一性的氨基酸序列,优选为至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性;或,(3)所述纳米抗体或抗原结合片段的框架区与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27所示氨基酸序列的框架区具有至少90%同一性,优选为至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性。
- 权利要求1-5任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,其与人血清白蛋白、猴血清白蛋白和/或大鼠血清白蛋白结合;可选地,所述抗体或抗原结合片段结合人血清白蛋白、猴血清白蛋白和/或大鼠血清白蛋白的解离常数(KD)小于1.00E-8M、2.00E-8M、3.00E-8M、1.00E-9M、2.00E-09M、3.00E-9M、4.00E-09M、5.00E-09M、6.00E-09M、7.00E-09M、8.00E-09M、9.00E-09M、1.00E-10M、2.00E-10M、3.00E-10M、4.00E-10M、5.00E-10M、6.00E-10M、7.00E-10M、8.00E-10M、9.00E-10M、1.00E-11M、2.00E-11M、3.00E-11M、4.00E-11M、5.00E-11M、6.00E-11M、7.00E-11M、8.00E-11M、9.00E-11M、1.00E-12M、2.00E-12M、3.00E-12M、4.00E-12M、5.00E-12M、6.00E-12M、7.00E-12M、8.00E-12M或9.00E-12M;可选地,所述纳米抗体或抗原结合片段与小鼠血清白蛋白结合或不结合。
- 权利要求1-6任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段包含抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定区的序列;优选包含抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
- 权利要求1-7任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段进一步包含不存在CH1片段的抗体恒定区序列。
- 权利要求1-8任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段进一步包含具有CH2和CH3片段的抗体恒定区序列,或,所述抗体或抗原结合片段进一步包含抗体Fc区;所述抗体恒定区或抗体Fc区通过或不通过连接肽连接所述抗体或抗原结合片段;可选地,所述抗体恒定区或抗体Fc区来自骆驼科、小鼠、大鼠、兔、羊或人;可选地,所述抗体恒定区或抗体Fc区来自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。
- 权利要求1-9任一项所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段为:(1)嵌合抗体或其片段;(2)人源化抗体或其片段;或,(3)全人抗体或其片段;优选的,所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、全长抗体、抗体片段、裸抗体、缀合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
- 根据权利要求1-10任一项所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段进一步还偶联有治疗剂或示踪剂;优选地,所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂,所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂或光敏剂。
- 一种多特异性抗原结合分子,其特征在于,所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块,所述第一抗原结合模块包含权利要求1-11任一项所述的抗体或抗原结合片段,所述第二抗原结合模块特异性结合HSA以外的其他抗原或结合与第一抗原结合模块不同的HSA抗原表位;优选地,所述其他抗原选自CD2,CD3,CD4,CD5,CD7,CD8,CD11a,CD11b,CD18,CD19,CD20,CD23,CD25,CD33,CD38,CD40,CD45,CDW52,CD69,CD70,CD134(OX40),ICOS,BCMP7,CD137,CD27L,CDCP1,DPCR1,DPCR1,dudulin2,FLJ20584,FLJ40787,HEK2,KIAA0634,KIAA0659,KIAA1246,KIAA1455,LTBP2,LTK,MAL2,MRP2,MSLN;优选地,所述多特异性抗原结合分子为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
- 一种嵌合抗原受体(CAR),其特征在于,所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域,所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1-11任一项所述HSA抗体或抗原结合片段。
- 一种免疫效应细胞,其特征在于,所述免疫效应细胞包含权利要求13所述嵌合抗原受体或包含编码权利要求13所述嵌合抗原受体的核酸片段;优选地,所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞;所述T细胞可选自炎性T细 胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)或辅助性T细胞;优选地,所述免疫效应细胞为同种异体免疫效应细胞或自体免疫细胞。
- 一种分离的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1-11任一项所述的纳米抗体、抗原结合片段、或其任意组合,权利要求12所述的多特异性抗原结合分子或权利要求13所述的嵌合抗原受体。
- 包含权利要求15所述分离的核酸分子的表达载体。
- 包含权利要求15所述的分离的核酸分子、或权利要求16所述的表达载体的分离的宿主细胞;优选地,所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞;更优选地,所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌;更优选地,所述宿主细胞选自Expi293F细胞。
- 一种制备权利要求1-11任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求12所述多特异性抗原结合分子的方法,其特征在于,在适当的条件下培养权利要求17所述的宿主细胞,并分离抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
- 一种制备权利要求14所述免疫效应细胞的方法,其特征在于,所述方法包括将编码权利要求13所述CAR的核酸片段导入免疫效应细胞,可选地,所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求13所述CAR。
- 一种药物组合物,其特征在于,所述组合物包含权利要求1-11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12所述的多特异性抗原结合分子、权利要求14所述的免疫效应细胞、权利要求15的分离的核酸分子、权利要求16的表达载体、权利要求17的细胞,或权利要求18或19所述方法制备的产品;优选地,所述组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂;优选地,所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
- 权利要求1-11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12所述的多特异性抗原结合分子、权利要求14所述的免疫效应细胞、权利要求15的分离的核酸分子、权利要求16的表达载体、权利要求17的细胞,或权利要求18或19所述方法制备的产品、或权利要求20所述的药物组合物在制备预防和/或***疾病或炎性疾病的药物中的用途;优选地,所述肿瘤疾病优选黑色素瘤、透明细胞肉瘤、头部和颈部癌症、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、***癌、涎腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、或脑癌;优选地,所述炎性疾病优选多发性硬化、银屑病、重症肌无力、葡萄膜炎、***性红斑狼疮、或类风湿性关节炎。
- 一种预防和/或***疾病或炎性疾病的方法,包含向有此需要的患者施用有效量的权利要求1-11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12所述的多特异性抗原结合分子、权利要求14所述的免疫效应细胞、权利要求15的分离的核酸分子、权利要求16的表达载体或权利要求18或19所述方法制备的产品、或权利要求20所述的药物组合物;优选地,所述肿瘤疾病优选黑色素瘤、透明细胞肉瘤、头部和颈部癌症、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、***癌、涎腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、或脑癌;优选地,所述炎性疾病优选多发性硬化、银屑病、重症肌无力、葡萄膜炎、***性红斑狼疮、或类风湿性关节炎。
- 权利要求1-11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12所述的多特异性抗原结合分子、利要求14所述的免疫效应细胞、权利要求15的分离的核酸分子、权利要求16的表达载体、权利要求17的细胞,或权利要求18或19所述方法制备的产品、或权利要求20所述的药物组合物,其特征在于,用于和/或***疾病或炎性疾病;优选地,所述肿瘤疾病优选黑色素瘤、透明细胞肉瘤、头部和颈部癌症、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、***癌、涎腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、或脑癌;优选地,所述炎性疾病优选多发性硬化、银屑病、重症肌无力、葡萄膜炎、***性红斑狼疮、或类风湿性关节炎。
- 一种试剂盒,其包含权利要求1-11任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求12所述的多特异性抗原结合分子、权利要求14所述的免疫效应细胞、权利要求15的分离的核酸分子、权利要求16的表达载体、权利要求17的细胞,或权利要求18或19所述方法制备的产品、或权利要求20所述的药物组合物;任选地,还包含使用说明。
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