CN117025548B - 鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株、抗体、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了鼠抗SARS‑CoV‑2 Spike蛋白杂交瘤细胞株、抗体、试剂盒及应用。所述鼠抗SARS‑CoV‑2 Spike蛋白杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC NO 45629，保藏日期为2023年07月13日，保藏分类命名为鼠抗SARS‑CoV‑2 Spike蛋白杂交瘤细胞株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。同时，本申请提供了一种SARS‑CoV‑2 Spike蛋白活性的检测方法。本申请优点在于，该检测方法具有高灵敏度和高检测精确度，能够实现对SARS‑CoV‑2 Spike蛋白结合活性的检测。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体涉及一种抗SARS-CoV-2 Spike蛋白的抗体、应用、试剂盒及检测方法。
背景技术
SARS-CoV-2具有很强的传染性，即使在潜伏期也能传播，因此对其进行研究和活性检测的重要性愈发突显。
SARS-CoV-2主要由四种结构蛋白组成，它们分别是刺突蛋白（Spike蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和包膜蛋白（E蛋白）。其中，Spike蛋白由S1和S2两个亚基组成。S1亚基中的受体结合位点（RBD）主要负责与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合，以实现与宿主细胞的融合。因此，Spike蛋白成为研发疫苗、治疗性抗体和临床诊断的潜在靶点。
目前，存在许多检测SARS-CoV-2 Spike蛋白的方法。常用的方法之一是双抗夹心法，使用ELISA技术。该方法将SARS-CoV-2 Spike蛋白抗体固定在酶联板上，然后使用标记有辣根过氧化物酶（HRP）的另一种SARS-CoV-2 Spike蛋白抗体。在加入待测物后，免疫复合物形成，并通过对HRP标记物的检测来判断待测物中是否含有SARS-CoV-2 Spike蛋白。虽然双抗夹心法能够定量检测待测物中的SARS-CoV-2 Spike蛋白含量，但无法评估该病毒与细胞的结合能力，也无法反映其活性水平。
另外，一些研究者利用SARS-CoV-2 Spike蛋白与细胞表面ACE2结合的特性，开发了一种新的检测方法。这种方法使用生物素酯标记的ACE2重组蛋白包被磁性微粒，并使用碱性磷酸酶（ALP）标记的ACE2重组蛋白和发光底物AMPPD。通过这种方法制备的SARS-CoV-2Spike蛋白检测试剂既省去了抗体制备和筛选步骤，又利用成熟的标记材料，但该方法无法检测RBD单体，并且由于化学发光仪器成本较高，很多实验室无法采用该方法进行Spike蛋白检测。
发明内容
为了解决上述至少一种技术问题，本申请开发一种低成本、简便操作、灵敏准确且能够快速检测SARS-CoV-2 Spike蛋白含量的检测方法，本申请提供一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体、应用、试剂盒及检测方法。
第一方面，本申请提供一种鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株，所述细胞株保藏号为CGMCC NO 45629，保藏日期为2023年07月13日，保藏分类命名为鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
通过采用上述技术方案，本申请提供的鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株能够为研究SARS-CoV-2作出贡献，同时，为SARS-CoV-2的研究提供了一个可靠的实验材料。
第二方面，本申请提供一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，所述抗体由本申请提供的 鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株通过腹水制备后经纯化制备获得。
通过采用上述技术方案，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，能够针对SARS-CoV-2的野生株和多种突变株进行有效的识别和结合。同时，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体具有以下效果：第一方面，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体可以用于开发或改进SARS-CoV-2的检测方法，例如ELISA、免疫荧光分析等。这些方法可以帮助提高病毒的早期检测和诊断准确性。第二方面，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体可能具有中和病毒的能力，可以用于研发疫苗或治疗方法。中和抗体可以阻止病毒进入宿主细胞，从而预防感染或减轻疾病症状。第三方面，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体可以用于开发治疗性抗体药物，作为治疗SARS-CoV-2感染的一种选择。这些抗体可以针对病毒的关键部位，阻断病毒复制和扩散，有助于减轻疾病的严重程度和缩短康复时间。总之，通过提供一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，并结合相应的技术方案，可以为SARS-CoV-2的检测、预防和治疗提供重要的工具和策略。这对于保护公共卫生具有重要意义。
第三方面，本申请提供一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体在生物检测领域中的应用。
第四方面，本申请提供一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，所述试剂盒包括酶标抗体、ACE2、显色液以及终止液；
其中，所述酶标抗体中所述抗体为本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体。
通过采用上述技术方案，本申请提供的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒提供一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的工具，通过使用种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体和辣根过氧化物酶实现对Spike蛋白的检测，并通过TMB显色液反应生成的产物进行定量分析。硫酸溶液用于停止反应。总之，本申请提供的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒在研究和诊断中有实际应用的潜力。
可选的，所述酶标抗体的稀释浓度为1*10-4~1mg/mL。
可选的，所述酶标抗体的稀释过程中，使用的稀释液包括含1%牛血清白蛋白的浓度为10mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
可选的，所述酶标抗体的稀释浓度为1*10-3~2*10-3mg/mL。
可选的，所述酶标抗体中，所述酶包括辣根过氧化物酶。
可选的，所述显色液包括TMB显色液；所述终止液包括浓度为2mol/L的硫酸溶液。
可选的，所述ACE2的稀释浓度为2*10-3mg/mL。
进一步可选的，在ACE2稀释过程中，所使用的稀释液包括浓度为50mmol/L，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液。
第五方面，本申请提供一种SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法，检测方法包括如下步骤：
S1、将ACE2用缓冲液稀释至2*10-3mg/mL，并以100μL/孔的量将稀释后的ACE2包被于酶联板上，充分孵育，使ACE2与酶联板表面的固定试剂结合，制得包被的ACE2；
S2、使用HRP标记本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，制得酶标抗体；
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至1*10-4~1mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物；
S4、洗涤去除步骤S3中所述复合物中未结合的物质，拍干，加入显色液，在37℃避光条件下反应不小于5min，并加入体积为50μL，浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，并使用酶标仪在450nm波长处测量酶联板中颜色反应的光密度，根据光密度值判断Spike蛋白与ACE2之间的结合活性。
通过采用上述技术方案，本申请提供的一种SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法成功开发了一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的方法。与现有技术相比，该方法具有以下优势：第一方面，传统的双抗夹心法只能检测Spike蛋白的含量，无法评估与细胞的结合能力和活性水平。而本申请提供的检测方法通过测量光密度值，可以直接反映Spike蛋白与ACE2之间的结合活性。第二方面，本申请提供的检测方法能够检测RBD（受体结合结构域）单体，这是SARS-CoV-2 Spike蛋白与宿主细胞结合的关键区域，对于研究和诊断具有重要意义。第三方面，与一些现有方法比较，本申请提供的检测方法成本较低，可以降低检测费用，提高检测的可行性和实施性。第四方面，本申请提供的检测方法采用了高质量的抗体和酶标技术，能够提供高灵敏度和高特异性的检测结果。第五方面，通过测量光密度值，可以获得准确的结果，提高了检测的精度和可靠性。因此，本申请SARS-CoV-2 Spike蛋白活性检测方法具有在研究和诊断领域中应用的潜力，可以为病情监测、病毒筛查和临床诊断提供重要的技术支持。
可选的，步骤S1所述孵育条件为如下：配置含2%牛血清白蛋白和5%蔗糖的磷酸盐缓冲液（10mmol/L，pH7.4），并以200μL/孔的量加入到步骤S1所述酶联板上，37℃孵育2h，制得包被ACE2的酶联板。
可选的，步骤S3为如下：
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至1*10-3~1mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物。
优选的，步骤S3为如下：
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至1*10-3~4*10-3mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物。
优选的，步骤S3为如下：
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至1*10-3~2*10-3mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物。
进一步优选的，步骤S3为如下：
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至2*10-3mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物。
通过采用上述技术方案，本申请提供的浓度为2*10-3mg/mL的由HRP标记的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株Spike蛋白的抗体进一步提高检测的精确度。在步骤S3中，使用的酶标抗体浓度为2*10-3mg/mL，在这个浓度下，酶标抗体与不同的SARS-CoV-2 Spike蛋白都能够有效地发生反应，并呈现出良好的显色效果。这表明在2*10-3mg/mL的浓度下，酶标抗体与Spike蛋白之间的结合是最为有效的。这一浓度的酶标抗体能够充分和特异地与目标蛋白发生反应，提供准确的检测结果。因此，通过在酶标抗体的浓度为2*10-3mg/mL的条件下进行实验，能够提高检测的精确度，确保与SARS-CoV-2 Spike蛋白的结合反应能够有效地进行。这将为后续的研究和诊断工作提供可靠的技术支持。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
本申请提供的一种鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株能够为研究SARS-CoV-2作出贡献，同时，为SARS-CoV-2的研究提供了一个可靠的实验材料。
本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，能够针对SARS-CoV-2的野生株和多种突变株进行有效的识别和结合。同时，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体具有以下效果：第一方面，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体可以用于开发或改进SARS-CoV-2的检测方法，例如ELISA、免疫荧光分析等。这些方法可以帮助提高病毒的早期检测和诊断准确性。第二方面，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体可能具有中和病毒的能力，可以用于研发疫苗或治疗方法。中和抗体可以阻止病毒进入宿主细胞，从而预防感染或减轻疾病症状。第三方面，本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体可以用于开发治疗性抗体药物，作为治疗SARS-CoV-2感染的一种选择。这些抗体可以针对病毒的关键部位，阻断病毒复制和扩散，有助于减轻疾病的严重程度和缩短康复时间。总之，通过提供一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，并结合相应的技术方案，可以为SARS-CoV-2的检测、预防和治疗提供重要的工具和策略。这对于保护公共卫生具有重要意义。
本申请提供的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒在研究和诊断中有实际应用的潜力。
本申请提供的一种SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法成功开发了一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的方法。与现有技术相比，该方法具有以下优势：第一方面，传统的双抗夹心法只能检测Spike蛋白的含量，无法评估与细胞的结合能力和活性水平。而本申请提供的检测方法通过测量光密度值，可以直接反映Spike蛋白与ACE2之间的结合活性。第二方面，本申请提供的检测方法能够检测RBD（受体结合结构域）单体，这是冠状病毒Spike蛋白与宿主细胞结合的关键区域，对于研究和诊断具有重要意义。第三方面，与一些现有方法比较，本申请提供的检测方法成本较低，可以降低检测费用，提高检测的可行性和实施性。第四方面，本申请提供的检测方法采用了高质量的抗体和酶标技术，能够提供高灵敏度和高特异性的检测结果。第五方面，通过测量光密度值，可以获得准确的结果，提高了检测的精度和可靠性。因此，本申请SARS-CoV-2 Spike蛋白活性检测方法具有在研究和诊断领域中应用的潜力，可以为病情监测、病毒筛查和临床诊断提供重要的技术支持。
本申请提供的浓度为2*10-3mg/mL的由HRP标记的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株Spike蛋白的抗体进一步提高检测的精确度。在步骤S3中，使用的酶标抗体浓度为2*10- 3mg/mL，在这个浓度下，酶标抗体与不同的SARS-CoV-2 Spike蛋白都能够有效地发生反应，并呈现出良好的显色效果。这表明在2*10-3mg/mL的浓度下，酶标抗体与Spike蛋白之间的结合是最为有效的。这一浓度的酶标抗体能够充分和特异地与目标蛋白发生反应，提供准确的检测结果。因此，通过在酶标抗体的浓度为2*10-3mg/mL的条件下进行实验，能够提高检测的精确度，确保与SARS-CoV-2 Spike蛋白的结合反应能够有效地进行。这将为后续的研究和诊断工作提供可靠的技术支持。
附图说明
图1为实施例9中不同抗原的Spike蛋白活性测试结果图。
图2为实施例10中不同样本的Spike蛋白活性测试结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
第一方面，本申请设计了一种鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株，所述细胞株保藏号为CGMCC NO 45629，保藏日期为2023年07月13日，保藏分类命名为鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
第二方面，本申请设计一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，所述抗体由本申请提供的鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株通过腹水制备后经纯化制备获得。
第三方面，本申请设计了一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体在生物检测领域中的应用。
第四方面，本申请设计了一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，所述试剂盒包括酶标抗体、ACE2、显色液以及终止液；
其中，所述酶标抗体中所述抗体为本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体。
第五方面，本申请设计了一种SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法，检测方法包括如下步骤：
S1、将ACE2用缓冲液稀释至2*10-3mg/mL，并以100μL/孔的量将稀释后的ACE2包被于酶联板上，充分孵育，使ACE2与酶联板表面的固定试剂结合，制得包被的ACE2；
S2、使用HRP标记本申请提供的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，制得酶标抗体；
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至1*10-4~1mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物；
S4、洗涤去除步骤S3中所述复合物中未结合的物质，拍干，加入显色液，在37℃避光条件下反应不小于5min，并加入体积为50μL，浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，并使用酶标仪在450nm波长处测量酶联板中颜色反应的光密度，根据光密度值判断Spike蛋白与ACE2之间的结合活性。
优选的，步骤S3所述酶标抗体的浓度为2*10-3mg/mL。
在对SARS-CoV-2 Spike蛋白进行研究时，申请人发现目前存在多种检测该蛋白的方法。其中一种常用的方法是双抗夹心法，利用ELISA技术进行。该方法将SARS-CoV-2Spike蛋白抗体固定在酶联板上，然后使用标记有辣根过氧化物酶（HRP）的另一种SARS-CoV-2 Spike蛋白抗体。加入待测物后，免疫复合物形成，通过对HRP标记物的检测来判断待测物中是否含有SARS-CoV-2 Spike蛋白的方法。虽然双抗夹心法能够定量检测待测物中的SARS-CoV-2 Spike蛋白含量，但无法评估该病毒与细胞的结合能力，也无法反映其活性水平。另一种方法是基于SARS-CoV-2 Spike蛋白与细胞表面ACE2的结合特性开发的。该方法通过将生物素酯标记的ACE2重组蛋白包被在磁性微粒上，并使用碱性磷酸酶（ALP）标记的ACE2重组蛋白和发光底物AMPPD进行检测。这种方法省去了抗体制备和筛选步骤，利用已经成熟的标记材料。然而，该方法无法检测RBD单体，并且由于化学发光仪器成本较高，很多实验室无法采用该方法进行Spike蛋白检测。综上所述，尽管存在多种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白的方法，每种方法都有其局限性。
因此，申请人在为了开发出更准确、灵敏和经济实用的方法来评估SARS-CoV-2Spike蛋白与细胞的结合能力和活性水平的目标下，在本申请中首先提供了一种鼠抗SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株，所述细胞株保藏号为CGMCC NO 45629，保藏日期为2023年07月13日，保藏分类命名为鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在设计一种鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株基础上，通过腹水制备后经纯化制得了一种特异性及灵敏性较强的一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体。这种抗体能够识别和结合SARS-CoV-2的Spike蛋白，用于检测和研究该蛋白的功能和特性。通过研究，本申请开发的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体，对于野生型和多种突变株的Spike蛋白都能够进行有效的识别和结合。在SARS-CoV-2的进化过程中，Spike蛋白可能发生了变异，因此对于不同株系的检测和研究，能够使用具有广泛识别能力的抗体是非常重要的。这种抗体的应用能够为SARS-CoV-2相关研究、疫苗开发和药物筛选等领域提供有力的支持。通过对Spike蛋白结合能力和活性水平的评估，我们能够更好地了解病毒的传播机制和感染特性，为病情防控和治疗提供科学依据和战略指导。在本申请中提供的抗体具有一定的优势，可望为研究人员提供一种可靠、方便和高效的工具，加速SARS-CoV-2 Spike蛋白相关研究的进展，并推动相关疫苗和治疗策略的开发。
以下为本申请具体实施例
制备例
本制备例提供一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，所述试剂盒包括酶标抗体、ACE2、显色液以及终止液；
试剂盒中，酶标抗体中的抗体为一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体。
酶标抗体中，一种抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体的制备方法为如下：
将鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株通过腹水制备后经纯化，制得抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体。
所述鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株具体信息为如下：一种鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株，所述细胞株保藏号为CGMCC NO 45629，保藏日期为2023年07月13日，保藏分类命名为鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址为《北京市朝阳区北辰西路1号院3号》。
其中，显色液为TMB显色液。
其中，终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液。
其中，ACE2的稀释浓度为2*10-3mg/mL。
实施例1~4、酶标抗体浓度的优化
实施例1
本实施例使用由制备例提供的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒对不同的抗原进行有关抗原Spike蛋白与ACE2之间的结合活性（OD值）检测。检测方法包括如下步骤：
S1、包被：用碳酸盐缓冲液（50mmol/L，pH9.6）将ACE2稀释至2*10-3mg/mL，并将稀释后的ACE2以100μL/孔的量包被于酶联板上，4℃过夜；
S2、封闭：配置含2%牛血清白蛋白和5%蔗糖的磷酸盐缓冲液（10mmol/L，pH7.4），并以200μL/孔的量加入到步骤S1中的酶联板上，37℃孵育2h，制得包被的ACE2的酶联板；
S3、往包被ACE2的酶联板中加入浓度均为2*10-3mg/mL的不同的抗原，在37℃反应1h，使抗原中的Spike蛋白与包被在酶联板上的ACE2结合，并用洗涤液去除未结合的抗原，制得Spike蛋白和ACE2结合物；
S4、采用高碘酸钠氧化法对抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株Spike蛋白的抗体进行HRP标记，制得酶标抗体，并将酶标抗体稀释至1mg/mL；步骤S4所使用的稀释液为含1%牛血清白蛋白的浓度为10mM， pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
S5、往Spike蛋白和ACE2结合物中加入浓度为1mg/mL的酶标抗体，37℃反应1h，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物；
S6、洗涤去除酶联板上未结合的物质，加入TMB显色液，在37℃避光条件下反应10min，并加入50μL，浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，并使用酶标仪在450nm波长处测量试剂盘中颜色反应的光密度，根据光密度值可以判断Spike蛋白与ACE2之间的结合活性，ACE2和Spike蛋白的结合活性与Elisa显色成正相关。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中酶标抗体的浓度为1*10-2mg/mL，其余部分与实施例1保持一致。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中酶标抗体的浓度1*10-3mg/mL，其余部分与实施例1保持一致。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中酶标抗体的浓度为1*10-4mg/mL，其余部分与实施例1保持一致。
实施例1~4中不同的抗原Spike蛋白与ACE2之间的结合活性（OD值）检测结果参见表1。
表1 实施例1~4中不同的抗原Spike蛋白与ACE2之间的结合活性（OD值）检测汇总表
实施例1~4中使用的抗原的信息参见表2。
表2 实施例1~4中使用的抗原的信息参见表
结果分析：
实施例2~4与实施例1的区别在于，使用的酶标抗体的浓度不同。申请人根据实施例1~4的检测结果得出，当由酶标记的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体的浓度为1*10-3mg/mL时，与不同的抗原的显色结果均较好。
申请人为了确定酶标抗体和SARS-CoV-2 Spike蛋白反应达到饱和时的浓度，在实施例5~8中，对浓度为1mg/mL的酶标抗体的浓度进行进一步稀释。
以下为本申请实施例5~8
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于，本实施例中酶标抗体的浓度为4*10-3mg/mL，抗原的选择也不同。
实施例6
本实施例与实施例3的区别在于，本实施例中酶标抗体的浓度为2*10-3mg/mL，抗原的选择也不同。
实施例7
本实施例与实施例3的区别在于，本实施例中酶标抗体的浓度为1*10-3mg/mL，抗原的选择也不同。
实施例8
本实施例与实施例3的区别在于，本实施例中酶标抗体的浓度为5*10-4mg/mL，抗原的选择也不同。
实施例4~8中不同的抗原Spike蛋白与ACE2之间的结合活性（OD值）检测结果参见表3~4。
表3 实施例5~8野生株（43047P）的（OD值）检测结果汇总表
表4 实施例5~8突变株delta（43052P）的（OD值）检测结果汇总表
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参见表3~4，申请人得出，当由酶标记的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体的浓度为2*10-3mg/mL时，与不同浓度的抗原的显色结果均较好，当酶标抗体浓度为2*10-3mg/mL时，酶标抗体与不同的SARS-CoV-2 Spike蛋白都能够有效地发生反应，并呈现出良好的显色效果。这表明在2*10-3mg/mL的浓度下，酶标抗体与Spike蛋白之间的结合是最为有效的。这一浓度的酶标抗体能够充分和特异地与目标蛋白发生反应，提供准确的检测结果。因此，通过在酶标抗体的浓度为2*10-3mg/mL的条件下进行实验，能够提高检测的精确度，确保与SARS-CoV-2 Spike蛋白的结合反应能够有效地进行。通过检测OD值，可以评估SARS-CoV-2 Spike蛋白与其他物质（如抗体）的相互作用和结合能力。OD值代表了检测样品中反应的强度，从而可以间接反映Spike蛋白的活性水平。本申请检测Spike蛋白的活性水平的主要目的包括如下几个方面的内容：第一方面，Spike蛋白是新冠病毒进入人体细胞的关键结构，疫苗开发需要评估疫苗候选者的Spike蛋白活性水平。通过检测Spike蛋白与抗体的结合能力，可以评估疫苗候选者诱导的免疫反应，包括抗体产生的强度和效力。第二方面，Spike蛋白的活性水平检测可以用于筛选和评估潜在的抗病毒药物。某些药物可以干扰Spike蛋白与受体结合，从而阻断病毒进入细胞。检测Spike蛋白的活性水平可以评估这些药物的抑制效果，进而指导药物研发和治疗的选择。第三方面，通过监测Spike蛋白的活性水平，可以了解不同群体中新冠病毒的感染情况。根据Spike蛋白的活性水平，可以评估不同地区或人群中的感染程度，进而为病情监测和流行病学调查提供重要依据。从而为后续的研究和诊断工作提供可靠的技术支持。因此，申请人得出酶标记的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体的最优稀释浓度为2*10-3mg/mL。
实施例9、灵敏度检测
本实施例与实施例6的区别在于，本实施例对不同浓度的抗原进行Spike蛋白活性测试。抗原信息参见表5。
本实施例中不同抗原的Spike蛋白活性测试结果参见图1。
表5 实施例9中不同抗原的信息汇总表
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参见图1可知，图1显示了S1/RBD浓度与OD值之间的关系，可以看出随着S1/RBD浓度的增加，OD值也在增加。根据这个结果，可以得出本申请提供的SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法具有检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的优势。通过检测OD值，可以评估SARS-CoV-2 Spike蛋白与其他物质（如抗体）的相互作用和结合能力。OD值代表了检测样品中反应的强度，从而可以间接反映Spike蛋白的活性水平。同时，本申请提供的SARS-CoV-2Spike蛋白活性的检测方法具有能够快速、准确地检测Spike蛋白的活性的优势。通过测量OD值，研究人员可以了解Spike蛋白的功能和特性，进一步了解感染机制和抗体-抗原相互作用。这对于抗病毒药物研发、疫苗评估和病毒学研究非常重要。因此，本申请提供的SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法可以提供有关SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的信息，这对于相关研究和应用具有重要意义。
实施例10、特异性实验
本实施例与实施例6的区别在于，本实施例分别对7种不同的待测样本进行有关SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测，7种不同的待测样本分别为重组SARS-CoV-2 SpikeS1、重组SARS-CoV Spike S1、重组MERS-CoV Spike S1、重组HCoV-229E Spike S1、重组HCoV-NL63 Spike S1、重组HCoV-OC43 Spike S1和重组HCoV-HKU1 Spike S1蛋白。本实施例测试结果显示，本申请提供的由酶标记的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体与SARS-CoV-2 Spike S1蛋白能够有效地发生反应，且未能与另外6种病毒的Spike S1蛋白进行结合反应，这表明本申请提供的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体特异性强。
本实施例中不同样本的Spike蛋白活性测试结果参见图2。
根据实施例1~10显示的测试结果不难得出，本申请提供的一种SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法成功开发了一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的方法。与现有技术相比，该方法具有以下优势：第一方面，传统的双抗夹心法只能检测Spike蛋白的含量，无法评估与细胞的结合能力和活性水平。而本申请提供的检测方法通过比较测量得到的光密度值，可以评估Spike蛋白与ACE2之间的结合活性。光密度值越高，表示Spike蛋白与ACE2结合越紧密，结合活性越强。
第二方面，本申请提供的检测方法能够检测RBD（受体结合结构域）单体，这是冠状病毒Spike蛋白与宿主细胞结合的关键区域，对于研究和诊断具有重要意义。
第三方面，与一些现有方法比较，本申请提供的检测方法成本较低，可以降低检测费用，提高检测的可行性和实施性。
第四方面，本申请提供的检测方法采用了高质量的抗体和酶标技术，能够提供高灵敏度和高特异性的检测结果。
第五方面，通过测量光密度值，可以获得准确的结果，提高了检测的精度和可靠性。
因此，本申请SARS-CoV-2 Spike蛋白活性检测方法具有在研究和诊断领域中应用的潜力，可以为病情监测、病毒筛查和临床诊断提供重要的技术支持。
综上所述，本申请提供的抗SARS-CoV-2野生株和多种突变株的Spike蛋白的抗体具有特异性强、灵敏性高，检测精确度高等优势。同时，本申请提供的一种SARS-CoV-2Spike蛋白活性的检测方法具有快速简便、低成本、高精确度、高灵敏度、高特异性的特点。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鼠抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株，其特征在于，所述细胞株保藏号为CGMCC NO 45629，保藏日期为2023年07月13日，保藏分类命名为鼠抗SARS-CoV-2 Spike蛋白杂交瘤细胞株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种抗SARS-CoV-2野生株和德尔塔毒株、奥密克戎毒株、贝塔毒株、伽马毒株的Spike蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体由权利要求1所述的鼠抗SARS-CoV-2 Spike 蛋白杂交瘤细胞株通过腹水制备后经纯化制备获得。
3.一种权利要求2所述的抗SARS-CoV-2野生株和德尔塔毒株、奥密克戎毒株、贝塔毒株、伽马毒株的Spike蛋白的抗体在生物检测领域中的应用。
4.一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标抗体、ACE2、显色液以及终止液；其中，所述酶标抗体中所述抗体为权利要求2所述的一种抗SARS-CoV-2野生株和德尔塔毒株、奥密克戎毒株、贝塔毒株、伽马毒株的Spike蛋白的抗体。
5.根据权利要求4所述的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的稀释浓度为1*10-4 ~ 1mg/mL。
6.根据权利要求5所述的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的稀释浓度为1*10-3 ~ 2*10-3 mg/mL。
7.根据权利要求4所述的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体中，所述酶包括辣根过氧化物酶。
8.根据权利要求4所述的一种检测SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的试剂盒，其特征在于，所述显色液包括TMB显色液；所述终止液包括浓度为2mol/L的硫酸溶液。
9.一种SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法，其特征在于，检测方法包括如下步骤：
S1、将ACE2用缓冲液稀释至2*10-3 mg/mL，并以100μL/孔的量将稀释后的ACE2包被于酶联板上，充分孵育，使ACE2与酶联板表面的固定试剂结合，制得包被的ACE2；
S2、使用HRP标记权利要求2所述的一种抗SARS-CoV-2 野生株和德尔塔毒株、奥密克戎毒株、贝塔毒株、伽马毒株的Spike蛋白的抗体制得酶标抗体；
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至1*10-4 ~ 1mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物；
S4、洗涤去除步骤S3中所述复合物中未结合的物质，拍干，加入显色液，在37℃避光条件下反应不小于5min，并加入体积为50μL，浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，并使用酶标仪在450nm波长处测量酶联板中颜色反应的光密度，根据光密度值判断Spike蛋白与ACE2之间的结合活性。
10.根据权利要求9所述的一种SARS-CoV-2 Spike蛋白活性的检测方法，其特征在于，步骤S3如下：
S3、将待测物加入到步骤S1所述酶联板中，使待测物中的Spike蛋白与包被的ACE2结合，洗涤去除未结合的待测样本，拍干，制得Spike蛋白与ACE2结合的结合物，将酶标抗体用稀释液稀释至1*10-3 ~ 1mg/mL，并以100μL/孔的量加入到Spike蛋白与ACE2结合的结合物中，在37℃下进行反应，使ACE2、Spike蛋白和酶标抗体形成免疫复合物。
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