CN117018217B - Gnai2作为细胞外囊泡支架蛋白的应用、细胞外囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents
Gnai2作为细胞外囊泡支架蛋白的应用、细胞外囊泡及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种GNAI2作为细胞外囊泡支架蛋白的应用、细胞外囊泡及其制备方法和应用,涉及生物技术领域。本发明提供的GNAI2或其片段应用于细胞外囊泡的支架蛋白,过表达后不会对细胞的生长造成影响,并且在细胞外囊泡中的富集程度高于现有用于治疗的支架蛋白。本发明提供的细胞外囊泡包括支架蛋白和与所述支架蛋白结合的生物活性结构域,其中支架蛋白为GNAI2或其片段。本发明提供了新的支架蛋白,为细胞外囊泡的载药或标记用途提供了新的丰度更高的连接基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种GNAI2作为细胞外囊泡支架蛋白的应用、细胞外囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)因其极低的免疫原性,被认为是目前最安全、最有前景的药物递送载体。但其载量较小(小于4.7k),限制了其在基因治疗领域的部分应用。外泌体属于纳米级颗粒,免疫原性低,适合作为一种药物载体。且外泌体体积显著大于AAV,已有文献报道,外泌体可以容纳6k的核酸,相比于AAV,具有一定的优势。在天然外泌体中,某些蛋白会显著富集,这些蛋白可作为支架蛋白,而将某种特殊的蛋白与支架蛋白融合表达后,这种特殊的蛋白也会富集,进而实现蛋白、核酸在外泌体上的装载。通过将外泌体递送给受体细胞,使装载的蛋白或核酸发挥作用,达到治疗的作用。
现有技术中常使用的一些支架蛋白,比如CD63、CD81等,在外泌体中分布不均,只有部分外泌体中含有这种蛋白。在药物递送中,上述支架蛋白存在的缺陷会影响外泌体递送效率,进而限制工程化外泌体潜在的临床应用价值。因此需要寻找新的支架蛋白以改善目前外泌体支架蛋白的现状。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题,本发明提供了GNAI2或其片段作为细胞外囊泡支架蛋白的应用,GNAI2或其片段作为一种细胞外囊泡的支架蛋白,过表达后不会对细胞的生长造成影响,并且在细胞外囊泡中的富集程度高于现有用于治疗的支架蛋白,同时筛选出的支架蛋白在细胞外囊泡的分布至少与常用的支架蛋白(如CD63)分布相当。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
根据本发明的一个方面,提供了一种GNAI2或其片段作为细胞外囊泡支架蛋白的应用。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2至少具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 6具有至少85%序列同一性的氨基酸序列;
或,所述GNAI2具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡和纳米囊泡中的一种或多种;
和/或,所述细胞外囊泡是定位于肝细胞的细胞外囊泡;
和/或,所述GNAI2或其片段定位于细胞外囊泡。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2或其片段在产生所述细胞外囊泡的细胞中过表达。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种细胞外囊泡,所述细胞外囊泡包含支架蛋白和活性结构域;所述支架蛋白包含GNAI2或其片段。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2至少具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 6具有至少85%序列同一性的氨基酸序列;
或,所述GNAI2具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,所述活性结构域包括多肽、多核苷酸、化合物或它们的任何组合。
在一些可选的实施方式中,所述支架蛋白直接与所述活性结构域连接或通过连接子与所述活性结构域连接。
在一些可选的实施方式中,所述活性结构域包括如下(ⅰ)~(ⅵ)中任意一种或几种的组合:
(ⅰ)反义寡核苷酸、mRNA、siRNA、miRNA、shRNA、LncRNA、circRNA或它们的任何组合;
(ⅱ)抗体或其抗原结合片段,包括全长抗体、scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双功能抗体、抗体相关多肽或它们的任何片段或它们的任何组合;
(ⅲ)核苷酸结合蛋白或其片段;
(ⅳ)核苷酸结合蛋白或其片段,且所述核苷酸结合蛋白或其片段结合多核苷酸;
(ⅴ)荧光标记蛋白和/或标签蛋白;
(ⅵ)靶向肽、重组肽和治疗肽中的一种或多种的组合。
在一些可选的实施方式中,所述核苷酸结合蛋白选自Ku蛋白、Sm7蛋白、MS2外壳蛋白、PP7外壳蛋白、Com RNA结合蛋白或适体配体,或它们的任何组合、功能性变体、片段或结构域。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种表达***,所述表达***包括:
第一表达元件,其编码支架蛋白,其中所述支架蛋白为GNAI2或其片段;
和第二表达元件,其编码活性结构域。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种细胞,该细胞包含上述的表达***。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种细胞外囊泡的制备方法,包括在细胞中过表达含有GNAI2或其片段的多肽,然后从细胞或含有细胞的培养体系中分离或制造细胞外囊泡。
根据本发明的另一个方面,还提供了上述细胞外囊泡,或上述表达***,或上述细胞,或上述细胞外囊泡的制备方法在制备用于预防或治疗疾病中的药物中的用途;所述疾病包括癌症、炎症性病症、神经变性病症、中枢神经疾病或代谢疾病。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含上述细胞外囊泡或上述细胞外囊泡的制备方法制备得到的细胞外囊泡;和药学上可接受的载体。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的GNAI2或其片段作为细胞外囊泡支架蛋白的应用,为细胞外囊泡的载药或标记用途提供了新的丰度更高的连接基础。GNAI2或其片段作为支架蛋白在细胞外囊泡的分布至少可达到常用的支架蛋白(如CD63)水平。GNAI2或其片段能够富集在外泌体上,可以作为外泌体支架蛋白来运载外源的蛋白或者核酸,以实现预期的效果。本发明提供的细胞外囊泡包含GNAI2或其片段,通过GNAI2作为蛋白支架装载其他活性结构域,例如多肽和多核苷酸等,丰富了外泌体的功能,可作为药物载体以及具有示踪和靶向功能,进而可用于制备药物,以提高药物的治疗效果和靶向能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中过表达不同支架蛋白的外泌体的TEM结果;
图2为实施例2中过表达不同支架蛋白的外泌体的标志物免疫印记检测结果,其中泳道1为293细胞裂解物,泳道2为293Evs,泳道3为GNAI2-293Evs,泳道4为CD63-293Evs,泳道5为MFGE8-293Evs,泳道6为PTGFRN-293Evs,泳道7为Basp-1-293Evs;
图3为实施例2中不同外泌体纯化后的HPLC纯度表征结果,其中a为293Evs、b为GNAI2-Evs、c为CD63-293Evs;
图4为实施例2中不同外泌体纯化后的HPLC纯度表征结果,其中a为MFGE8-Evs、b为PTGFRN-Evs、c为Basp-1-293Evs;
图5为实施例3中不同外泌体的支架分布比例表征结果;
图6为实施例3中不同外泌体的支架丰度表征结果;
图7为实施例4中过表达truncated-GNAI2支架蛋白的外泌体的纯度(a)、形态(b)、粒径(c)及负载EGFP蛋白(d)表征结果;
图8为实施例5制备的外泌体GNAI2-MCP-MS2-FIX-Fc 293Evs的纯度(a)、粒径(b)及形态(c)表征结果;
图9为实施例5制备的外泌体GNAI2-L7Ae-C/D box-FIX-Fc 293Evs的纯度(a)、粒径(b)及形态(c)表征结果;
图10为实施例5制备的外泌体GNAI2-FIX-Fc 293Evs的纯度(a)、粒径(b)及形态(c)表征结果;
图11为实施例5制备的外泌体GNAI2-293Evs的纯度(a)、粒径(b)及形态(c)表征结果;
图12为实施例5中GNAI2融合不同RNA结合蛋白的mRNA装载量表征结果;
图13为实施例6制备的外泌体CD19scfv-GNAI2-EGFP 293Evs的纯度(a)、粒径(b)、抗体阳性率(c)及形态(d)表征结果;
图14为实施例6制备的外泌体GNAI2-EGFP 293Evs的纯度(a)、粒径(b)、抗体阳性率(c)及形态(d)表征结果;
图15为实施例6制备的未过表达GNAI2支架的expi 293F细胞外泌体的纯度(a)、粒径(b)、抗体阳性率(c)及形态(d)表征结果;
图16为实施例6中外泌体表面CD19scfv与CD19抗原结合Elisa检测柱状结果;
图17为实施例6制备的外泌体gp17-GNAI2-EGFP-Flag 293Evs的外泌体纯度(a)、粒径(b)、靶向肽阳性比例(c)及形态(d)表征结果;
图18为实施例6制备的外泌体GNAI2-EGFP-Flag 293Evs的外泌体纯度(a)、粒径(b)、靶向肽阳性比例(c)及形态(d)表征结果;
图19为实施例6制备的未过表达GNAI2支架的expi 293F细胞外泌体293 Evs纯度(a)、粒径(b)、靶向肽阳性比例(c)及形态(d)表征结果;
图20为实施例6中GNAI2靶向肽外泌体在肝类器官中的吞噬分布结果,纵坐标表示外泌体携带Flag标签和肝细胞表面标签DPPIV共染色时,二者重叠面积;
图21为实施例7中GNAI2靶向肽的外泌体对外泌体小鼠体内分布影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明,并不用于构成对本发明的任何限制。此外,在以下说明中,省略了对公知结构和技术的描述,以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
术语解释:
除非另有定义,否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的,将应用以下定义,并且在适当时,以单数形式使用的术语也将包括复数形式,反之亦然。
除非上下文另有明确说明,否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如,提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些可选的实施方式中,术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些可选的实施方式中,术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。
本文所用的术语氨基酸的“替换”或“取代”可以指保守氨基酸的取代,其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族,包括碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,如果多肽中的一个氨基酸被来自同一侧链家族的另一种氨基酸替代,这种取代被认为是保守的。在另一个方面,一串氨基酸可以被保守地替代为结构相似的串,所述结构相似的串在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。
两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即,空位)的情况下,比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸,所以靶序列中存在的空位不计在内。同样,由于计入靶序列核苷酸或氨基酸,而不计来自参考序列的核苷酸或氨基酸,所以不计参考序列中存在的空位。
可以通过以下过程来计算序列同一性百分比:确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数,以得到匹配位置数,将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数,并将结果乘以100,得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得,用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq,其为可从国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列,而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是,例如,Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分,并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。
本文所用的术语“细胞外囊泡”、“外囊泡”或“EV”是指包含包封内部空间的膜的细胞源性囊泡。细胞外囊泡包括所有与膜结合的囊泡(例如,外泌体、微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡、纳米囊泡等),其直径小于其所源自的细胞的直径。在一些方面,细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm的范围内,并且可包含在内部空间(即,腔)内、展示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨膜的各种大分子有效载荷。在一些方面,所述有效载荷可包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。在某些方面,细胞外媒介物包含支架部分。作为示例而非限制,细胞外囊泡包括凋亡小体,细胞碎片,通过直接或间接操作(例如,通过连续挤压或用碱性溶液处理)获得的细胞源性囊泡,成泡的细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如,通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可源自活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些方面,细胞外囊泡由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
本文所用的术语“外泌体”是指直径在20~300nm之间(例如,在40~200nm之间)的细胞外囊泡。外泌体包含包封内部空间的膜,并且在一些方面,可通过直接质膜出芽或通过晚期内体或多囊体与质膜的融合由细胞产生。在某些方面,外泌体包含支架部分。如下文所述,外泌体可来源于生产者细胞,并根据其大小、密度、生化参数或其组合从生产者细胞中分离出来。在一些方面,本公开的EV(例如,外泌体)由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
本文所用的术语“纳米囊泡”是指直径介于20~250nm之间(例如,介于30~150nm之间)的细胞外囊泡,并且通过直接或间接操纵由细胞(例如,生产细胞)产生,以使得在无操纵的情况下所述细胞将不产生纳米囊泡。为了产生纳米囊泡而对细胞进行的适当操纵包括但不限于连续挤出、用碱性溶液进行的处理、超声处理或它们的组合。在一些方面中,本文所述的纳米囊泡群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式而来源于细胞的囊泡。在某些方面中,纳米囊泡包含支架部分,例如支架X和/或支架Y。纳米囊泡,一旦来源于生产细胞,就可基于其大小、密度、生物化学参数或它们的组合从生产细胞中分离。
本文所用的术语“活性结构域”或“生物活性结构域”可互换使用,是指可通过锚定部分与支架蛋白连接的任何分子,其中所述分子可在有需要的受试者中具有治疗或防治作用,或者可用于诊断目的。因此,举例来说,术语生物活性结构域包括蛋白质(例如,抗体、蛋白质、多肽以及其衍生物、片段和变体)、核苷酸结合蛋白、多核苷酸或化学化合物。
本文所用的术语“抗体”涵盖免疫球蛋白(无论是天然产生的还是部分或完全合成产生的)及其片段。所述术语还覆盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括多肽,所述多肽包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的框架区。术语抗体的使用意在包括完全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、它们的片段,并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合单克隆抗体、小鼠-人单克隆抗体、小鼠-灵长类动物单克隆抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段(诸如,例如scFv、(scFv)2、Fab、Fab '和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段)、双功能抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体,只要它们表现出所需的生物活性或功能即可。
本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合物,包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。此术语是指分子的一级结构。因此,所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”),以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括修饰(例如通过烷基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。更特别地,术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖);聚核糖核苷酸(含有D-核糖) ,包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA,无论是剪接的还是未剪接的;为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸;以及含有正核苷酸主链的其它聚合物,例如聚酰胺(例如,肽核酸“PNA”)和聚吗啉代聚合物;以及其它合成的序列特异性核酸聚合物,条件是所述聚合物含有呈允许碱基配对和碱基堆积,如在DNA和RNA中发现的构型的核碱基。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物包括基因产物、天然存在的聚合物、合成的聚合物、同源物、直向同源物、横向同源物、前述的片段和其它等效物、变体和类似物。所述聚合物可包含经修饰的氨基酸。所述术语还涵盖已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰,诸如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括,例如非天然氨基酸,诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其它修饰的多肽。聚合物可以是单个分子或者可以是多分子复合物,如二聚物、三聚物或四聚物。它们还可包含单链或多链多肽。最常见地,二硫键存在于多链多肽中。术语多肽还可应用于氨基酸聚合物,其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面中,“肽”可小于或等于50个氨基酸长,例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
本文所用的术语“融合蛋白”是指,使用编码蛋白的多核苷酸的遗传表达或蛋白合成方法,将两个或多个蛋白或其片段通过各自的肽骨架共线性连接。
如本文所用,术语“连接子”是指肽或多肽序列(例如,合成肽或多肽序列)或非多肽,例如烷基链。连接子将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合,所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。
本文中任一实施方式中的连接子可选地按照如下实施方式中任意一种实施:
在一些可选的实施方式中,所述连接子是多肽连接子和/或非多肽连接子。
在一些可选的实施方式中,所述连接子可以是(化学)共价连接。
在一些可选的实施方式中,多肽连接子可以包含至少约两个、至少约三个、至少约四个、至少约五个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个或至少约100个氨基酸。在一些可选的实施方式中,连接子包含一个或多个氨基酸。在一些可选的实施方式中,连接子包括Gly-Ser(GS)连接子。在一些可选的实施方式中,GS连接子包括(G4S)n,其中n是介于1与10之间的整数。在一些可选的实施方式中,GS连接子包括(G3S)n,其中n是介于1与10之间的整数。
在一些可选的实施方式中,多肽连接子是合成的,即非天然存在的,其是天然存在的多肽的修饰形式(例如,包含突变诸如添加、取代或缺失)。
在一些可选的实施方式中,连接子可能容易被切割(“可切割的连接子”),从而促进外源性生物活性部分的释放。在一些可选的实施方式中,连接子是“还原敏感型连接子”。在一些可选的实施方式中,还原敏感型连接子含有二硫键。在一些可选的实施方式中,连接子是“酸不稳定型连接子”。在一些可选的实施方式中,酸不稳定型连接子含有腙。合适的酸不稳定型连接子还包括,例如,顺式乌头酸连接子、酰肼连接子、硫代氨甲酰基连接子或其任何组合。在一些可选的实施方式中,ASO借助于连接子与EV(例如外泌体)缔合。在一些可选的实施方式中,连接子包括丙烯酸亚磷酰胺(例如,ACRYDITETM)、腺苷酸化、叠氮化物(NHS Ester)、地高辛(NHS Ester)、胆固醇-TEG、I-LINKERTM、氨基修饰剂(例如氨基修饰剂C6、氨基修饰剂C12、氨基修饰剂C6 dT或Uni-LinkTM氨基修饰剂)、炔烃、5'己炔基、5-辛二炔基dU、生物素化(例如,生物素、生物素(叠氮化物)、生物素dT、生物素-TEG、双重生物素、PC生物素或脱硫生物素)、硫醇修饰(硫醇修饰剂C3 S-S、二硫醇或硫醇修饰剂C6 S-S)、或其任何组合。
在一些可选的实施方式中,连接子包括萜烯,诸如橙花叔醇、法尼醇、柠檬烯、芳樟醇、香叶醇、香芹酮、小茴香酮或薄荷醇;脂质,诸如棕榈酸或肉豆蔻酸;胆固醇;油基;视黄基;胆固醇残基;胆酸;金刚烷乙酸;1-芘丁酸;双氢睾酮;1,3-双-O(十六烷基)甘油;香叶氧基己基;十六烷基甘油;冰片;1,3-丙二醇;十七烷基;O3-(油酰基)石胆酸;O3-(油酰基)胆酸;二甲氧三苯甲基;吩恶嗪,马来酰亚胺部分,葡萄糖醛酸苷酶型,CL2A-SN38型,叶酸;碳水化合物;维生素A;维生素E;维生素K,或其任何组合。在某些方面,ASO包含胆固醇标签,并且胆固醇标签与EV(例如外泌体)的膜缔合。在一些可选的实施方式中,连接子包括不可切割的连接子。在一些可选的实施方式中,连接子包括四乙二醇(TEG)、六乙二醇(HEG)、聚乙二醇(PEG)、琥珀酰亚胺或其任何组合。在一些可选的实施方式中,连接子包括将生物活性分子连接至连接子的间隔基单元。在一些可选的实施方式中,一个或多个连接子包括连接在一起的较小单元(例如,HEG、TEG、甘油、C2至C12烷基等)。在一个方面,键联是酯键联(例如,磷酸二酯或硫代磷酸酯)或其他键联。在一些可选的实施方式中,连接子包括聚乙二醇(PEG),其特征在于式R3-(O-CH2-CH2)n-或R3-(0-CH2-CH2)n-O-,其中R3是氢、甲基或乙基,且n的值为2至200。在一些可选的实施方式中,连接子包括间隔基,其中间隔基是PEG。在一些可选的实施方式中,PEG连接子是低聚乙二醇,例如二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇(TEG)、五乙二醇或六乙二醇(HEG)连接子。
在一些实施方式中,所述连接子可以包括跨膜肽。在一些实施方式中,所述支架蛋白通过包括跨膜肽的连接子与所述活性结构域结合,从而将所述活性结构域展示在外囊泡的腔内。在一些实施方式中,所述支架蛋白通过跨膜肽与核苷酸结合蛋白或其片段结合,形成融合蛋白。所述核苷酸结合蛋白或其片段进一步与多核苷酸序列结合。在一些实施方式中,所述跨膜肽可以具有例如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列,或与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或***的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,可将两个或更多个连接子串联连接。当存在多个连接子时,每个连接子可以相同或不同。一般来说,连接子提供了柔性或防止/改善了空间位阻。连接子通常不被切割;然而在某些方面,此类切割可以是需要的。因此,在一些可选的实施方式中,连接子可包含一个或多个蛋白酶可切割位点,这些位点可以位于连接子序列内或连接子序列任一端的连接子侧翼。
本文所用的术语“预防”是指部分或完全延迟疾病、病症和/或疾患的发作;部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或临床表现的发作;部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或表现的发作;部分或完全延迟从特定疾病、病症和/或疾患的进展;和/或降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。
本文所用的术语“治疗”是指例如疾病或疾患的严重程度的降低;病程持续时间的缩短;与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除;向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用,但不一定治愈所述疾病或疾患。所述术语还包括疾病或疾患或其症状的防治或预防。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒性的成分。
下面结合实施例进一步说明本发明技术方案。
G蛋白亚基αi2(GNAI2)鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)在多种跨膜信号***中起着调节或转导作用。G(i)蛋白参与腺苷酸环化酶的激素调节:它们在β-肾上腺素刺激下能抑制环化酶。可能在细胞***中起作用。发明人出乎意料地发现GNAI2能够富集在外泌体上,可以作为外泌体支架蛋白来运载外源的蛋白或者核酸,以实现预期的效果。
因此,根据上述发现,本发明提供了G蛋白亚基αi2(GNAI2)或其片段作为细胞外囊泡支架蛋白的应用。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2或其片段定位于细胞外囊泡。在一些可选的实施方式中,所述GNAI2或其片段定位于细胞外囊泡的膜上、膜内或膜外。在一些可选的实施方式中,所述GNAI2或其片段定位于细胞外囊泡的腔内。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2的氨基酸序列来源于人。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡和纳米囊泡中的一种或多种。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡是定位于肝细胞的细胞外囊泡。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2或其片段在产生所述细胞外囊泡的细胞中过表达,以使细胞外囊泡获得GNAI2或其片段作为支架蛋白。
在一些可选的实施方式中,还可对作为支架蛋白的GNAI2或其片段进行改造,如进行截短、突变、***外源序列或修饰。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2至少具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列来源于人。
在一些可选的实施方式中,所述与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列来源于人。
在一些可选的实施方式中,所述与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有相同的功能,所述相同的功能包括定位于细胞外囊泡和将所述活性结构域展示在外囊泡的外表面上或者外囊泡的腔内。
在一些可选的实施方式中,作为支架蛋白的GNAI2或其片段还直接或通过连接子与其他结构域融合,其他结构域融合于GNAI2或其片段N端和/或碳端,其他结构域例如可以但不限于本文中任意一实施方式中的活性结构域。
在一些可选的实施方式中,所述支架蛋白N端融合短肽链,短肽链能够表达靶向肽、重组肽、治疗肽或连接子。
在另一些可选的实施方式中,所述支架蛋白C端融合短肽链,短肽链能够表达治疗肽、重组肽或连接子。
在一些可选的实施方式中,所述支架蛋白C端融合RNA结合蛋白,RNA结合蛋白能够结合含有特殊结构域的RNA,含有特殊结构域的RNA含有具有药用作用的功能区和用于连接RNA结合蛋白的连接区;用于治疗的RNA可以是mRNA、miRNA、LncRNA、circRNA或siRNA。
根据本发明的另一个方面,提供了一种细胞外囊泡,所述细胞外囊泡包含支架蛋白和活性结构域;所述支架蛋白包含GNAI2或其片段。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2的氨基酸序列来源于人。
在一些可选的实施方式中,通过本公开的支架蛋白GNAI2或其片段,可以将所述活性结构域展示在外囊泡的外表面上或者外囊泡的腔内。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2至少具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,所述与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列来源于人。
在一些可选的实施方式中,所述与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有相同的功能,所述相同的功能包括定位于细胞外囊泡和将所述活性结构域展示在外囊泡的外表面上或者外囊泡的腔内。
在一些可选的实施方式中,所述活性结构域包括多肽、多核苷酸、化合物或它们的任何组合。
在一些可选的实施方式中,所述多肽包括但不限于抗体或其抗原结合片段、核苷酸结合蛋白或其片段、荧光标记蛋白、标签蛋白、具有治疗和/或靶向作用的多肽中的一种或多种。
在一些可选的实施方式中,所述支架蛋白直接或通过连接子与所述活性结构域结。
在一些可选的实施方式中,所述活性结构域包括如下(ⅰ)~(ⅵ)中一种或几种的组合:
(ⅰ)多核苷酸中的一种或几种的组合,所述多核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、siRNA、miRNA、shRNA、LncRNA、circRNA或它们的任何组合;
(ⅱ)抗体或其抗原结合片段或它们的任何组合,所述抗体或其抗原结合片段包括全长抗体、scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双功能抗体、抗体相关多肽或它们的任何片段或它们的任何片段的组合;
(ⅲ)核苷酸结合蛋白或其片段;
(ⅳ)核苷酸结合蛋白或其片段,且所述核苷酸结合蛋白或其片段结合多核苷酸;
(ⅴ)荧光标记蛋白和/或标签蛋白;
(ⅵ)靶向肽、重组肽和治疗肽中的一种或多种的组合。
在一些可选的实施方式中,(ⅲ)或(ⅳ)中的核苷酸结合蛋白选自Ku蛋白、Sm7蛋白、MS2外壳蛋白、PP7外壳蛋白、Com RNA结合蛋白或适体配体,或它们的任何组合、功能性变体、片段或结构域。
在一些可选的实施方式中,(ⅲ)或(ⅳ)支架蛋白与核苷酸结合蛋白或其片段形成融合蛋白。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡为外泌体,所述GNAI2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述活性结构域为核苷酸结合蛋白,所述核苷酸结合蛋白为古细菌的L7Ae,其氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡为外泌体,所述GNAI2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述活性结构域为核苷酸结合蛋白,所述核苷酸结合蛋白为MS2噬菌体的RNA结合蛋白MCP蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡为外泌体,所述GNAI2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述活性结构域为scFv(单链抗体)。在一些可选的实施方式中,所述scFv来源于抗CD19抗体。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡为外泌体,所述GNAI2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述活性结构域为来源于噬菌体P17蛋白的短肽,其靶向肝细胞。
在一些可选的实施方式中,所述活性结构域中还含有荧光蛋白,例如EGFP。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种表达***,所述表达***包括:第一表达元件,其编码支架蛋白,其中所述支架蛋白为GNAI2或其片段;和第二表达元件,其编码活性结构域。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2至少具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,所述GNAI2具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些可选的实施方式中,所述与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列来源于人。
在一些可选的实施方式中,所述与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 6具有相同的功能,所述相同的功能包括定位于细胞外囊泡和将所述活性结构域展示在外囊泡的外表面上或者外囊泡的腔内。
在一些可选的实施方式中,所述活性结构域包括多肽、多核苷酸、化合物或它们的任何组合。
在一些可选的实施方式中,所述多肽包括但不限于抗体或其抗原结合片段、核苷酸结合蛋白或其片段、荧光标记蛋白、标签蛋白、具有治疗和/或靶向作用的多肽中的一种或多种。
在一些可选的实施方式中,所述支架蛋白直接或通过连接子与所述活性结构域结。
在一些可选的实施方式中,所述活性结构域包括如下(ⅰ)~(ⅵ)中一种或几种的组合:
(ⅰ)多核苷酸中的一种或几种的组合,所述多核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、siRNA、miRNA、shRNA、LncRNA、circRNA或它们的任何组合;
(ⅱ)抗体或其抗原结合片段或它们的任何组合,所述抗体或其抗原结合片段包括全长抗体、scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双功能抗体、抗体相关多肽或它们的任何片段或它们的任何片段的组合;
(ⅲ)核苷酸结合蛋白或其片段;
(ⅳ)核苷酸结合蛋白或其片段,且所述核苷酸结合蛋白或其片段结合多核苷酸;
(ⅴ)荧光标记蛋白和/或标签蛋白;
(ⅵ)靶向肽、重组肽和治疗肽中的一种或多种的组合。
在一些可选的实施方式中,(ⅲ)或(ⅳ)中的核苷酸结合蛋白选自Ku蛋白、Sm7蛋白、MS2外壳蛋白、PP7外壳蛋白、Com RNA结合蛋白或适体配体,或它们的任何组合、功能性变体、片段或结构域。
在一些可选的实施方式中,(ⅲ)或(ⅳ)支架蛋白与核苷酸结合蛋白或其片段形成融合蛋白。
在一些可选的实施方式中,所述表达***可以选自原核表达***、真核表达***或病毒表达***。在一些可选的实施方式中,所述表达***可以包括原核载体、真核载体或病毒载体等。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种细胞,所述细胞含有上述表达***。
在一些可选的实施方式中,所述细胞为原核细胞或真核细胞。在一些可选的实施方式中,所述原核细胞可以选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等,例如大肠杆菌BL21、T7E、C41或Arctic等。在一些可选的实施方式中,所述真核细胞可以选自酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞等,例如酵母细胞、CHO细胞、293细胞、Vero细胞或NSO细胞等。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种细胞外囊泡的制备方法,该制备方法包括在细胞中过表达含有GNAI2或其片段的多肽,然后从细胞或含有细胞的培养体系中分离或制造细胞外囊泡。本领域技术人员可根据所要获得的细胞外囊泡的生物学特征选择本领域任选的、常规的分离或制造方法,如本文中记载的离心分离、连续挤出、用碱性溶液进行的处理和超声处理中的一种或多种的组合。本领域技术人员根据本领域一般知识能够从细胞或细胞培养体系中分离或制造目标细胞外囊泡,本发明对具体的分离方法不做限制。
在一些可选的实施方式中,过表达GNAI2或其片段的细胞是前述实施方式中含有第一表达元件和第二表达元件的表达***的细胞。
在一些可选的实施方式中,所述制备方法是外泌体的制备方法。
在一些可选的实施方式中,外泌体的制备方法包括从细胞培养体系中分离外泌体。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种前述实施方式中的细胞外囊泡,或前述实施方式中的表达***,或前述实施方式中的细胞,或前述实施方式中的细胞外囊泡的制备方法在制备用于预防或治疗疾病中的药物中的用途;所述疾病包括癌症、炎症性病症、神经变性病症、中枢神经疾病或代谢疾病。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡经由静脉内、腹膜内、经鼻、经口、肌内、皮下、胃肠外或肿瘤内施用。
在一些可选的实施方式中,所述细胞外囊泡可用于药物装载和/或标记物装载。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含前述实施方式中的细胞外囊泡或前述实施方式中的细胞外囊泡的制备方法制备得到的细胞外囊泡;和药学上可接受的载体。
在一些可选的实施方式中,所述药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂中的一种或几种的组合。
在一些可选的实施方式中,所述药物组合物为片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、混悬液、粉剂、乳剂、气雾剂、凝胶剂、滴眼剂、缓释剂或缓释植入体的形式。在一些可选的实施方式中,所述药物组合物可以配制成可注射的配制品。在一些可选的实施方式中,所述配制品适合于玻璃体内注射、皮下、皮内、肌内、静脉、鞘内或椎管内给药。
在一些可选的实施方式中,前述用于制备预防或治疗疾病的药物中的细胞外囊泡或前述药物组合物中的细胞外囊泡为外泌体。外泌体富含RNA(miRNA、lncRNA、circRNA等)、DNA、蛋白及脂质,参与细胞间分子传递。外泌体是一种高度异质性的群体,包括尺寸异质性,内容物的异质性,功能的异质性,以及来源的异质性。因此不同的细胞产生的外泌体富含的分子种类和数量不同,不同的外泌体纯化方式分离得到的外泌体所富含的分子种类和数量也有差异。外泌体富含各种分子,在被细胞摄取时,会对受体细胞造成不同程度的影响,来源于不同细胞的天然外泌体会具有源头细胞的一些功能,通过对细胞改造,进而影响外泌体的功能,用于治疗或者药物递送。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1. 表达载体构建
将GNAI2蛋白(SEQ ID NO: 1)和对照支架蛋白BASP-1(SEQ ID NO: 2)、PTGFRN(SEQ ID NO: 3)、CD63(SEQ ID NO: 4)、MFGE8(SEQ ID NO: 5),分别构建表达质粒pcDNA3.1(+)-支架蛋白-EGFP-Nanoluc。
实施例2. 外泌体的制备和验证
分别制备表达EGFP-Nanoluc与支架GNAI2、BASP-1、PTGFRN、CD63和MFGE8融合表达蛋白的外泌体以及天然Expi 293F外泌体(命名GNAI2-293Evs、BASP-1-293Evs、PTGFRN-293Evs、CD63-293Evs、MFGE8-293Evs及293Evs)。
2.1 293s细胞传代
Expi 293F细胞复苏密度3~10×105个细胞/ml,传代期间控制细胞密度为0.5~5×106个细胞/ml。
2.2 细胞转染
转染前将步骤2.1中传代细胞调整为1~3×106个细胞/ml,质粒浓度为1~1.5μg/ml,聚乙烯亚胺(PEI)与质粒的浓度比控制为(1:1)~(4:1)。将实施例1获得的5个质粒按照上述条件转染293s细胞,使蛋白GNAI2、BASP-1、PTGFRN、CD63和MFGE8在细胞中过表达。37℃5%CO2培养48~72h,收集细胞培养上清,用于下游纯化。
2.3外泌体纯化
使用步骤2.2中收集的细胞培养上清,通过300KD膜包超滤,100000g×2h超速离心,30-80nm孔径分子筛过滤,之后100000g×2h超速离心浓缩样本,最后获得可用于纳米流式分析的外泌体样品。
2.4外泌体质检
对纯化出的外泌体进行表征,形态(TEM)表征结果如图1所示,获得纯化产物为典型的外泌体碟状窦膜层结构。
另外,通过蛋白免疫印迹(Western Blot)检测了经各组细胞来源的外泌体标志物CD81、TSG101,以及高尔基体标志物GM130和内质网标志物Calexin的表达,结果如图2所示。纯度(HPLC)表征结果如图3~图4所示。从图2至图4可以看出,获得的各组细胞来源的外泌体均高表达CD81、TSG101,同时没有检测到GM130和Calexin的表达,进一步表明获得的为外泌体,且具有较高纯度。
实施例3. 经新支架蛋白工程化改造的外泌体在外泌体上的分布和丰度表征
3.1外泌体支架分布表征比较
使用Nano-flow分别检测不同支架蛋白及阴性对照组的20 μL外泌体中,EGFP阳性颗粒的比例,如图5所示。图5显示,GNAI2阳性的外泌体亚群在整个外泌体分布中的占比为50%以上,且高于目前公开的外泌体通用支架CD63。
3.2外泌体支架丰度表征比较
使用Nano-glo®luciferase试剂分别检测不同支架蛋白及阴性对照组的同等颗粒数外泌体中Nanoluc酶活进而表征同等颗粒数外泌体中融合表达支架的丰度含量,如图6所示。图6显示,GNAI2支架的丰度大于CD63支架丰度。
实施例4:实现外泌体定位并装载外来物质的新支架蛋白截短蛋白
为了确定GNAI2实现外源物质装载的最短序列,本实施例根据GNAI2的蛋白结构划分,最终确定了一个结构域,为SEQ ID NO:1所示序列的第1-45位氨基酸,命名截短GNAI2结构域(truncated-GNAI2,SEQ ID NO: 6),作为实现外泌体定位装载的最短序列。
以下为其在外泌体中分布和丰度验证。
4.1 表达载体构建及制备
(1.1)载体构建
将truncated-GNAI2的C端与EGFP-Nanoluc融合表达,构建验证表达载体pcDNA3.1-truncated-GNAI2 -EGFP-Nanoluc。
(1.2)质粒制备
质粒制备同实施例1。
(1.3)外泌体制备
将(1.2)中制备的质粒转染Expi 293细胞,其制备、纯化及质控过程同实施例2。将其命名为truncated-GNAI2 -293Evs。
4.2 truncated-GNAI2-293Evs将EGFP载入外泌体验证
将上一步骤中(1.3)中制备高纯度外泌体进行表征,图7显示,外泌体纯度接近100%,形态为外泌体碟状窦膜层结构,粒径分布范围为外泌体正常范围。外泌体EGFP阳性率为24.6%左右,说明truncated-GNAI2可以将EGFP载入外泌体,保留了外泌体定位及负载功能。
实施例5:GNAI2作为支架蛋白与RNA结合蛋白融合用于装载mRNA
本实施例中所选RNA结合蛋白为MS2噬菌体的RNA结合蛋白MCP蛋白(SEQ ID NO:7)和古细菌的L7Ae(SEQ ID NO: 8),其识别序列分别为MS2(SEQ ID NO: 9)和C/D box序列(SEQ ID NO: 10),所选mRNA为蛋白凝血因子9与Fc融合蛋白编码 mRNA。
5.1 表达载体构建及制备
(1.1)载体构建
1)支架表达质粒:将RNA结合蛋白MCP、L7Ae分别融合于GNAI2(SEQ ID NO.1)的C端,使用GGGSlinker连接分别构建支架表达质粒pcDNA3.1(+)-GNAI2-MCP/L7Ae(RNA结合蛋白),将GNAI2与RNA结合蛋白融合表达,使GNAI2成为能够装载mRNA的支架,pcDNA3.1(+)-GNAI2为对照。
2)mRNA转录质粒:将RNA结合蛋白识别序列(MCP识别MS2,L7Ae识别C/D box)定位于所装载mRNA的3’端,终止密码子之后,polyA之前,构建mRNA转录质粒pcDNA3.1-FIX-Fc-MS2/C/Dbox(结合蛋白识别序列),pcDNA3.1-FIX-Fc为与对照对应质粒。
(1.2)质粒制备
质粒制备同实施例1。
5.2 外泌体制备
将5.1中构建制备的支架表达质粒(pcDNA3.1(+)-支架蛋白-MCP/L7Ae)与mRNA转录质粒(pcDNA3.1-FIX-Fc-MS2/C/Dbox)共转染,制备装载mRNA的外泌体。制备步骤同实施例2,共制4组外泌体,分别为:
GNAI2-MCP-MS2-FICX-Fc 293Evs:共转染pcDNA3.1(+)-GNAI2-MCP和pcDNA3.1-FIX-Fc-MS2制备得到的外泌体。
GNAI2-L7Ae-C/D box-FIX-Fc 293Evs:共转染pcDNA3.1(+)-GNAI2-L7Ae和pcDNA3.1-FIX-Fc- C/Dbox制备得到的外泌体。
GNAI2-FIX-Fc 293Evs:共转染pcDNA3.1(+)-GNAI2和pcDNA3.1-FIX-Fc制备得到的外泌体。
GNAI2-293Evs:转染pcDNA3.1(+)-GNAI2制备得到的外泌体。
对上述4组外泌体形态、粒径和纯度进行分析结果如图8~图11所示。图8~图11显示,外泌体纯度接近100%,形态为外泌体碟状窦膜层结构,粒径分布范围为外泌体正常范围。
5.3 外泌体装载包裹目标(FIX 9)mRNA表征
外泌体样本FIX 9 mRNA 计算:
1)取200 μl外泌体提取总RNA。
2)对RNA进行RT-qPCR,检测RNA中FIX mRNA的拷贝数。
3)检测个样本对应外泌体颗粒数浓度。
4)计算平均单个外泌体中mRNA的装载拷贝数。
如图12所示,融合表达RNA结合蛋白支架的外泌体GNAI2-MCP-MS2-FICX-Fc293Evs和GNAI2-L7Ae-C/D box-FIX-Fc 293Evs较GNAI2-FIX-Fc 293Evs外泌体均可提升mRNA装载量,可见支架蛋白与RNA结合蛋白融合后,可以将更多的mRNA包裹进外泌体,实现支架蛋白mRNA装载赋能。
实施例6:外泌体靶向功能
6.1 外泌体表面靶向抗体展示
(1.1)支架融合表达抗体质粒构建
以GNAI2为抗体展示支架,构建表达载体,使嵌合支架分布的外泌体表面展示抗体,实现此外泌体靶向功能,展示抗体为人CD19对应克隆号为FMC63抗体。质粒名称为pcDNA3.1-CD19scfv-GNAI2-EGFP。将来源于FMC63抗体的单链抗体(scFv)融合于GNAI2(SEQID NO.1)的N端,使用跨膜段(SEQ ID NO.12)和GGGSlinker连接。
(1.2)外泌体制备
分别制备融合表达CD19scfv的外泌体(命名CD19scfv-GNAI2-EGFP 293Evs)和只过表达支架蛋白的外泌体(命名GNAI2-EGFP 293Evs)及293F细胞外泌体(命名293 Evs)。
293s细胞传代、细胞转染及外泌体纯化过程同实施例1。
(1.3)外泌体质检
将本实施例步骤(1.2)获得的样本的形态、粒径和纯度进行分析检测,如下图13~图15所示,CD19scfv-GNAI2-EGFP 293Evs在制备样本中的分布比例为21%左右,颗粒大小间于40nm~200nm之间,纯度大于90%,电镜观察外泌体形态为外泌体碟状窦膜层结构。
(1.4)CD19scfv-GNAI2-EGFP 293Evs靶向CD19抗原功能验证
1)CD19抗原包被于固相载体Elisa板,4℃过夜包被;
2)经PBST缓冲液洗板后,2% BSA室温封闭2h;
3)洗板后孵育等量被测外泌体样本,室温1h;
4)洗涤后孵育后续外泌体表面标志物CD9抗体、后为HRP标记二抗;
5)底物显色后,终止反应,OD450检测样本吸光值。评价检测外泌体样本是否为CD19抗原结合外泌体。
图16的结果显示,外泌体表面CD19scfv可以与CD19抗原特异性结合,从而实现外泌体抗原靶向功能。
6.2 外泌体表面靶向肽展示
(2.1)支架融合表达靶向肽质粒的构建
以外泌体分布蛋白GNAI2为靶向肽展示支架,展示靶向肽为靶向肝细胞且来源于噬菌体P17蛋白的短肽(SEQ ID NO.11),实现外泌体靶向肝细胞。质粒命名为pcDNA3.1-gp17-GNAI2-EGFP。来源于噬菌体P17蛋白的短肽融合于GNAI2(SEQ ID NO.1)的N端,使用跨膜段(SEQ ID NO.12)和GGGSlinker连接。
(2.2)外泌体的制备
分别制备融合表达gp17靶向肽外泌体(命名gp17-GNAI2-EGFP-Flag 293Evs)、不包含靶向肽的外泌体(命名GNAI2-EGFP-Flag 293Evs)和293原始外泌体(命名293 Evs)
293s细胞传代、细胞转染及外泌体纯化过程同实施例1。
(2.3)外泌体的质检
将步骤6.2中步骤(2.2)获得的外泌体的粒径、分布比例、纯度及形态分析检测数据如图17~图19所示,gp17-GNAI2-EGFP-Flag 293Evs在外泌体样本中的分布比例大约为18%,颗粒大小间于40nm~200nm之间,纯度大于90%,电镜观察外泌体形态为外泌体碟状窦膜层碟状窦膜层结构。
(2.4)gp17-GNAI2-EGFP-Flag 293Evs靶向功能验证
将gp17-GNAI2-EGFP-Flag 293Evs和GNAI2-EGFP-Flag 293Evs分别孵育成熟的肝类器官细胞。通过检测支架融合表达的flag标签,成像外泌体与肝类器官的表面结合效果。结果表明,靶向肽外泌体gp17-GNAI2-EGFP-Flag 293Evs紧密吸附于肝类器官表面,形成严实吸附膜。而无靶向肽外泌体扩散于类器官细胞内,在肝细胞表面并不聚集,通过统计类器官对不同外泌体摄取,肝类器官对含靶向肽的外泌体的摄取量明显高于不含靶向肽的外泌体(如图20所示)。
实施例7:靶向肽外泌体提高外泌体靶向器官的体内摄取
以实施例6制备的靶向肽外泌体gp17-GNAI2-EGFP-Flag 293Evs为实验组,GNAI2-EGFP-Flag 293Evs为对照组,动物模型为野生型Balb/c小鼠,尾静脉注射给药外泌体。
动物实验设计:
观察单次静脉注射外泌体-Nluc后,供试品在Balb/c鼠体内组织分布情况,分组如下表1所示。
表1
具体操作步骤如下:
1)体重:分别于动物接收和给药前对动物进行称重
2)组织取材:
给药后1h,取动物组织,心、肝、脾、肺、脑和血清。G1组为背景组,G2为实验组,G3为对照组。所取组织称量总重量,后每种组织均匀取材20mg左右,并记录准确取材重量,研磨珠破碎匀浆,破碎完全后后离心,取上清备用。
3)组织匀浆液化学发光强度检测:
4)采用Nano-Glo ® Luciferase Assay System试剂盒,检测匀浆液中Nanoluc酶活,具体操作见试剂盒说明书。
5)计算各组织中Nanoluc酶活总量,表征各组织摄入外泌体的总量。
计算结果如下图21所示,与对照组相对,靶向肽外泌体提高了外泌体在肝脏中的分布。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1. GNAI2或其片段在制备细胞外囊泡支架蛋白中的应用,所述制备包括在细胞中过表达含有GNAI2或其片段的多肽,然后从细胞或含有细胞的培养体系中分离或制造细胞外囊泡;
所述GNAI2或其片段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小泡中的一种或多种;
和/或,所述细胞外囊泡是定位于肝细胞的细胞外囊泡;
和/或,所述GNAI2或其片段定位于细胞外囊泡。
3.一种细胞外囊泡的制备方法,其特征在于,包括在细胞中过表达含有GNAI2或其片段的多肽,然后从细胞或含有细胞的培养体系中分离或制造细胞外囊泡;
所述GNAI2或其片段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6所示。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述细胞包括表达***,所述表达***包括:
第一表达元件,其编码支架蛋白,其中所述支架蛋白为GNAI2或其片段;
和第二表达元件,其编码活性结构域;所述活性结构域选自RNA结合蛋白、scFv或靶向肽。
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