CN117003720A - 化合物芙蓉花素及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药、保健品领域，具体涉及一种新的化合物芙蓉花素及其制备方法和用途。本发明化合物是首次从木芙蓉花中提取分离得到，结构如式Ⅰ，化学式为C23H18O8，化学命名为1”‑甲氧基‑3,5,7,4',3”',4”'‑六羟基黄酮，并命名为芙蓉花素，英文名Mutabilfloin。本发明化合物具有抗炎等多用途应用前景。

Description

化合物芙蓉花素及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药、保健品领域，具体涉及一种新的化合物芙蓉花素及其制备方法和用途。
背景技术
木芙蓉Hibiscus mutabilis.L为锦葵科木槿属植物，其花、叶均可以入药。药用价值记载始于宋代的《本草图经》，“地芙蓉，生鼎州。味辛，平，无毒。花主恶疮，叶以敷贴肿痛，九月采”。木芙蓉又名桦木、拒霜、下排杯(壮语)、奔娘咋(苗名)，在四川、浙江、福建、云南、台湾等多地均有种植，海外种植资源多分布在韩国、日本、尼泊尔、老挝、泰国等多地。经过十多年的研究，成都市植物园成功研究培育出18个木芙蓉品种。木芙蓉叶收载于2020版《中国药典》，其花收载于2019版《广东省中药材标准第三册》。味辛，性平，具有解毒消肿，清热凉血排脓之功效，外用可治疗痈疽疔疮发背、烧烫伤、乳腺炎、跌打损伤等，内服用于治疗肺热咳嗽，月经、白带过多等。《本草纲目》记载：“木芙蓉花并叶，气平而不寒不热，味微辛而性滑涎粘，其治痈肿之功，殊有神效”。现代药理研究表明其不仅具有抗炎镇痛、抗氧化、抗过敏、降低血糖等作用，还被广泛应用于化妆品和食品的原料或添加品等方面。
木芙蓉在要药用价值方面，具有清热解毒，消肿排脓，凉血止血的功效。用于肺热咳嗽，月经过多，白带；外用治痈肿疮疖，乳腺炎，***炎，腮腺炎，烧烫伤，毒蛇咬伤，跌打损伤。用法用量：0.3～1两；外用适量，以鲜叶、花捣烂敷患处或干叶、花研末用油、凡士林、酒、醋或浓茶调敷。已报道经方验方有：1、治吐血、子宫出血、火眼、疮肿、肺痈：芙蓉花三钱至一两，煎服。(《上海常用中草药》)；2、治痈疽肿毒：木芙蓉花、叶，丹皮。煎水洗。(《湖南药物志》)；3、治蛇头疔、天蛇毒：.鲜木芙蓉花二两，冬蜜五钱。捣烂敷，日换二至三次。(福建《民间实用草药》)；4、治水烫伤：木芙蓉花晒干，研末，麻油调搽。(《湖南药物志》)；5、治灸疮不愈：芙蓉花研末敷。(《奇效良方》)；6、治虚痨咳嗽：芙蓉花二至四两，鹿衔草一两，黄糖二两，炖猪心肺服；无糖时加盐亦可。(《重庆草药》)；7、治经血不止：拒霜花、莲蓬壳等分。为末，每用米次下二钱。(《妇人良方》)。
木芙蓉中化学成分主要是黄酮类及其苷类、有机酸类以及挥发性成分等，其中黄酮类及其苷类成分为木芙蓉的特征性成分和有效成分，迄今为止已从木芙蓉中分离鉴定出73个黄酮类化合物，包括从木芙蓉叶中分离鉴定出的48个黄酮类成分和从木芙蓉花分离鉴别出的36个黄酮类成分，主要是以山奈酚、槲皮素、芹菜素等为母核的黄酮苷类化合物。在此应用背景下，本发明的发明人在对木芙蓉花的研究中，发现了一种新的化合物。
发明内容
本发明所解决的第一个技术问题提供一种新的化合物，结构如式Ⅰ，化学式为C23H18O8。
本发明式Ⅰ化合物的化学命名为1″-甲氧基-3,5,7,4',3″′,4″′-六羟基黄酮，并命名为芙蓉花素，英文名Mutabilfloin。本发明式Ⅰ化合物的核磁数据(600MHz，CD3OH，JinHz)见表1。
表1
a)测量频率为600MHz；b)测量频率为150MHz。
本发明式Ⅰ所述化合物的理化性质为：棕褐色粉末，易溶于甲醇。
本发明式Ⅰ所述化合物的波谱数据：(c＝0.05，MeOH)，IR(KBr)vmax 3458,1733,1682,1560；UVλmax 205nm；LC-MS：m/z423.16；1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.62(2H,d,J＝8.2Hz,H-2',6'),6.78(2H,d,J＝8.1Hz,H-3',5'),6.75(1H,d,J＝2.1Hz,H-2″′),6.70(1H,d,J＝8.3Hz,H-5″′),6.65(1H,dd,J＝8.4,2.2Hz,H-6″′),6.29(1H,s,H-6),4.81(1H,q,J＝7.2Hz,H-1″),1.66(3H,d,J＝7.2Hz,2″-CH3)；13C NMR(151MHz,MeOD)δ160.4(C-2),123.8(C-3),177.7(C-4),160.3(C-5),98.9(C-6),163.0(C-7),112.5(C-8),155.7(C-9),105.1(C-10),136.8(C-1'),131.1(C-2'),116.1(C-3'),148.6(C-4'),116.1(C-5'),131.1(C-6'),33.0(C-1″),18.5(2″-CH3),138.2(C-1″′),115.4(C-2″′),144.0(C-3″′),146.0(C-4″′),116.0(C-5″′),119.1(C-6″′)。
本发明式Ⅰ所述化合物的旋光度(c 0.05，甲醇)，从红外光谱中可以观察到3458cm-1、1733cm-1、1682cm-1、1560cm-1处有吸收，表明化合物中羟基、羰基以及苯环。紫外光谱显示该化合物在205nm、280nm处有较强吸收。LC-MS准分子离子峰在m/z423.16[M+H]+处出现(计算值为423.11)，不饱和度Ω＝15，确定分子式为C23H18O8。
本发明式Ⅰ所述化合物的1H NMR谱和1H-1HCOSY谱(见表1)显示δ7.62(2H,J＝8.2Hz,H-2',6')、δ6.87(2H,J＝8.1Hz,H-3',5')为4'-羟基黄酮醇的特征信号，且HSQC谱显示δH 7.62与δC131.1相连，δH 6.87与δC116.1相连。将化合物*24的13C数据与山奈酚的13C核磁共振数据进行比较，确定分子中的黄酮母核部分为山奈酚。通过1H NMR谱并结合耦合值推出δH6.75(1H,d,J＝2.1Hz)，6.70(1H,d,J＝8.3Hz)，6.65(1H,dd,J＝8.4,2.2Hz)为苯环上ABX***氢信号。通过HSQC谱和HMBC谱显示δC160.3(C-5)和δC163.0(C-7)质子上连接羟基、δC105.9(C-4)为叔碳质子、δC98.9(C-6)为单峰(s)，表明山奈酚母核部分C-8位被取代。1H NMR谱和1H-1HCOSY谱显示δH4.81处为亚甲基质子信号，有一个四重峰(q)，J＝7.2Hz，与三个质子耦合，δH1.66处为甲基质子信号，与两个质子耦合，故判断化合物*24中存在一个乙基。HMBC谱显示叔碳δC 33.0与δC 18.5,112.5,115.4,119.1,138.2相关，故可以确定ABX***苯环、乙基与山奈酚母核结构位置，且由不饱和度Ω＝15判断可知，山奈酚母核部分与苯基取代基部分之间不存在环状结构。综上所述，确定本发明式Ⅰ化合物的结构为1″-甲氧基-3,5,7,4',3″′,4″′-六羟基黄酮，即1″-methoxy-3,5,7,4',3″′,4″′-hexahydroxyflavone，并命名为芙蓉花素，英文名Mutabilfloin。
本发明所解决的第二个技术问题是提供该化合物的制备方法，本发明式Ⅰ化合物是通过提取方法制备而得，所采用的原料为干燥木芙蓉花，即开花期采摘初开放的花朵或待开放的花蕾，晒干或烘干即得。
本发明式Ⅰ化合物的制备方法包括如下步骤：
A、粉碎干燥木芙蓉花，用乙醇提取，收集滤液，除去乙醇，得到木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏；
B、步骤A所得木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏加水混悬，分别使用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)依次萃取3-5次，分别收集萃取液，除去萃取液，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，剩余为水相部位；
C、取乙酸乙酯部位经正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检视合并，依次得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG，收集Fr.YC备用；
D、取步骤C所得Fr.YC用MCI中压柱进行分离，以甲醇-水溶剂***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13，收集Fr.YC 6备用；
E、取步骤D所得Fr.YC 6，经半制备液相纯化，以体积分数62％甲醇溶液为流动相，得到本发明式Ⅰ化合物。
上述制备方法的技术方案中：
步骤A所述乙醇为体积分数70-100％乙醇；优选，体积分数90％乙醇。
步骤A所述提取方法为回流提取。
步骤A所述提取方法中回流提取的提取条件为1-3次，每次0.5-3小时；优选的，提取条件为2次，每次2小时.
步骤A所述除去乙醇的方法采用减压回收，以无醇味为终点。
步骤B中木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏加水量为8-12倍量；优选10倍量。
步骤B中所述水为超纯水。
步骤B依次采用等体积的石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)萃取。
步骤B依次采用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)萃取的次数为1-5次，优选采用萃取次数为3次。
步骤C石油醚-乙酸乙酯溶剂***为按照20:1,8:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:10，0:100梯度进行洗脱，收集。
步骤D甲醇-水溶剂洗脱***依次为50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0，收集馏分用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13。
如步骤C取乙酸乙酯部位80g经正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱***按照20:1,8:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:10，0:100梯度进行洗脱，收集，共接馏分127瓶。然后收集的127瓶馏分经TLC进行检视合并，得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG，其中，1-15为Fr.YA，26-37为Fr.YB，38-52为Fr.YC，53-68为Fr.YD，69-90为Fr.YE，91-109为Fr.YF，110-127为Fr.YG。收集Fr.YC备用；
步骤C所得Fr.YC对应为石油醚：乙酸乙酯＝2:1洗脱的部分。
步骤D按取乙酸乙酯部位80g计算，甲醇-水溶剂洗脱***依次为50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0，共接馏分90瓶。用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13，其中：1-4为Fr.YC 1，5-9为Fr.YC 2，10-13为Fr.YC 3，14-19为Fr.YC 4，20-24为Fr.YC 5，25-28为Fr.YC 6，29-33为Fr.YC 7，34-38为Fr.YC 8，39-44为Fr.YC 9，45-48为Fr.YC 10，49-62为Fr.YC 11，63-79为Fr.YC 12，80-90为Fr.YC 13。
步骤D所得Fr.YC 6对应为甲醇-水溶剂***＝60:40洗脱的部分，即60％甲醇。
步骤E经半制备液相纯化，以体积分数62％甲醇溶液为流动相，出峰时间33min。
最优选的，本发明式Ⅰ化合物的制备方法如下：
A、将干燥木芙蓉花粉碎成粗粉，用体积分数90％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过后合并滤液，减压回收至无醇味，得到木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏；
B、加入10倍量超纯水混悬提取物，分别使用等体积石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)依次萃取3次，合并各萃取液，减压回收，得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分，剩余为水相部位；
C、取乙酸乙酯部位经正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检视合并，依次得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG，收集Fr.YC备用；
D、取步骤C所得Fr.YC用MCI中压柱进行分离，以甲醇-水溶剂***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13，收集Fr.YC 6备用；
E、去步骤D所得Fr.YC 6，经半制备液相纯化，以体积分数62％甲醇溶液为流动相，出峰时间33min，得到本发明式Ⅰ化合物。
采用上述制备方法，以20kg干燥木芙蓉花投料为例，步骤A可以得到3.34kg木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏；步骤B可以得到93.6g石油醚部分，89.7g乙酸乙酯部分，389g正丁醇部分，剩余为水相部位；步骤C取乙酸乙酯部位80g，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱***按照20:1,8:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:10，0:100梯度进行洗脱，收集，共接馏分127瓶。然后收集的127瓶馏分经TLC进行检视合并，得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG，其中，1-15为Fr.YA，26-37为Fr.YB，38-52为Fr.YC，53-68为Fr.YD，69-90为Fr.YE，91-109为Fr.YF，110-127为Fr.YG。收集Fr.YC备用；收集得到馏分Fr.YC 14.97g；然后Fr.YC用MCI中压柱进行分离，经过甲醇-水溶剂***(50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0)洗脱，共接馏分90瓶。1-4为Fr.YC 1，5-9为Fr.YC 2，10-13为Fr.YC 3，14-19为Fr.YC 4，20-24为Fr.YC 5，25-28为Fr.YC 6，29-33为Fr.YC 7，34-38为Fr.YC 8，39-44为Fr.YC 9，45-48为Fr.YC 10，49-62为Fr.YC 11，63-79为Fr.YC 12，80-90为Fr.YC 13。收集的Fr.YC 6对应为甲醇-水溶剂***＝60:40洗脱的部分，即60％甲醇，经半制备液相纯化得到本发明式Ⅰ化合物。
本发明解决的第三个技术问题是提供式Ⅰ化合物的至少一种新用途。
通过药理试验证明，本发明式Ⅰ化合物还具有在制备抗炎的药物、保健品、化妆品中的新用途。
本发明解决的第四个技术问题是提供式Ⅰ化合物为原料制备的衍生产品。
以本发明式Ⅰ化合物为原料，加入药学上可接受的辅助性成分制备而得的药物。
以本发明式Ⅰ化合物为原料，加入保健品可接受的辅助性成分制备而得的保健品。
以本发明式Ⅰ化合物为原料，加入化妆品可接受的辅助性成分制备而得的化妆品。
以本发明式Ⅰ化合物为原料，加入兽药可接受的辅助性成分制备而得的兽药。
本发明的有益效果：本发明通过提取分离技术获得了一种全新的式Ⅰ化合物，并确认了其具有抗炎的医药用途，为公众提供了一种全新的化合物及其制备方法和多种应用前景。
附图说明
图1提取分离与纯化流程图。
图2本发明式Ⅰ化合物对RAW264.7细胞增殖的影响。
图3本发明式Ⅰ化合物对TNF-α释放量的影响。
注：与空白组比较##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01，****P<0.001
图4本发明式Ⅰ化合物对NO释放量的影响。
注：与空白组比较##P<0.01；与模型组比较**P<0.01，***P<0.001
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
本发明化合物，结构如式Ⅰ，化学式为C23H18O8。
本发明化合物的化学命名为1″-甲氧基-3,5,7,4',3″′,4″′-六羟基黄酮，并命名为芙蓉花素，英文名Mutabilfloin。
本发明式Ⅰ化合物是首次被发现，发明人通过从木芙蓉花的乙醇提取物进行化学成分分离纯化得到的单体化合物。
本发明中木芙蓉花样品于2019年10月中旬采集于四川省成都市三合镇木芙蓉花种植基地，自然阴干，经鉴定为木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的干燥花。
一、本发明式Ⅰ化合物的提取分离与纯化
1提取分离与纯化
1.1提取
将干燥木芙蓉花20kg粉碎成粗粉，用体积分数90％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过后合并滤液，减压回收至无醇味，得到木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏(3.34kg)。加入10倍量超纯水混悬提取物，分别使用等体积石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)依次萃取3次，合并各萃取液，减压回收，得到石油醚部分(93.6g)、乙酸乙酯部分(89.7g)、正丁醇部分(389.0g)，剩余为水相部位。
1.2分离与纯化
取乙酸乙酯部位浸膏80.0g经正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检视合并，得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG。Fr.YA(10.97g)、YC(14.97g)段分别用MCI中压柱进行分离，以甲醇-水溶剂***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检测合并，得到组分Fr.YA 1～11，Fr.YC1～13。其中，Fr.YC 6经半制备液相纯化，体积分数62％甲醇溶液为流动相，得到本发明式Ⅰ化合物。提取分离与纯化流程图如下图1所示。
通过提取纯化方法得到的本发明式Ⅰ化合物为棕褐色粉末，易溶于甲醇。旋光度(c 0.05，甲醇)，从红外光谱中可以观察到3458cm-1、1733cm-1、1682cm-1、1560cm-1处有吸收，表明化合物中羟基、羰基以及苯环。紫外光谱显示该化合物在205nm、280nm处有较强吸收。LC-MS准分子离子峰在m/z423.16[M+H]+处出现(计算值为423.11)，不饱和度Ω＝15，确定分子式为C23H18O8。1H NMR谱和1H-1HCOSY谱(见表1)显示δ7.62(2H,J＝8.2Hz,H-2',6')、δ6.87(2H,J＝8.1Hz,H-3',5')为4'-羟基黄酮醇的特征信号，且HSQC谱显示δH7.62与δC131.1相连，δH 6.87与δC116.1相连。将化合物*24的13C数据与山奈酚的13C核磁共振数据进行比较，确定分子中的黄酮母核部分为山奈酚。通过1H NMR谱并结合耦合值推出δH6.75(1H,d,J＝2.1Hz)，6.70(1H,d,J＝8.3Hz)，6.65(1H,dd,J＝8.4,2.2Hz)为苯环上ABX***氢信号。通过HSQC谱和HMBC谱显示δC160.3(C-5)和δC163.0(C-7)质子上连接羟基、δC105.9(C-4)为叔碳质子、δC98.9(C-6)为单峰(s)，表明山奈酚母核部分C-8位被取代。1HNMR谱和1H-1HCOSY谱显示δH4.81处为亚甲基质子信号，有一个四重峰(q)，J＝7.2Hz，与三个质子耦合，δH1.66处为甲基质子信号，与两个质子耦合，故判断化合物*24中存在一个乙基。HMBC谱显示叔碳δC 33.0与δC 18.5,112.5,115.4,119.1,138.2相关，故可以确定ABX***苯环、乙基与山奈酚母核结构位置，且由不饱和度Ω＝15判断可知，山奈酚母核部分与苯基取代基部分之间不存在环状结构。综上所述，确定本发明式Ⅰ化合物的结构为1″′甲氧基-3,5,7,4',3″,4″-六羟基黄酮，即1″′-methoxy-3,5,7,4',3″,4″-hexahydroxyflavone，并命名为芙蓉花素，英文名Mutabilfloin。
本发明式Ⅰ所述化合物的波谱数据：(c＝0.05，MeOH)，IR(KBr)vmax 3458,1733,1682,1560；UVλmax 205nm；LC-MS：m/z423.16；1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.62(2H,d,J＝8.2Hz,H-2',6'),6.78(2H,d,J＝8.1Hz,H-3',5'),6.75(1H,d,J＝2.1Hz,H-2″′),6.70(1H,d,J＝8.3Hz,H-5″′),6.65(1H,dd,J＝8.4,2.2Hz,H-6″′),6.29(1H,s,H-6),4.81(1H,q,J＝7.2Hz,H-1″),1.66(3H,d,J＝7.2Hz,2″-CH3)；13C NMR(151MHz,MeOD)δ160.4(C-2),123.8(C-3),177.7(C-4),160.3(C-5),98.9(C-6),163.0(C-7),112.5(C-8),155.7(C-9),105.1(C-10),136.8(C-1'),131.1(C-2'),116.1(C-3'),148.6(C-4'),116.1(C-5'),131.1(C-6'),33.0(C-1″),18.5(2″-CH3),138.2(C-1″′),115.4(C-2″′),144.0(C-3″′),146.0(C-4″′),116.0(C-5″′),119.1(C-6″′)。
二、本发明式Ⅰ化合物的用途
小鼠巨噬细胞株RAW264.7，置于含有抗生素(100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)和10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基中，在37℃、5％CO2的孵箱中培养。
实验例1：对RAW264.7细胞增殖作用
选取对数生长期的RAW264.7细胞，以3×105/mL的密度、每孔100μL接种于96孔板，至37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，除去上清液，空白组加入DEME溶液1mL，模型组和实验组加入含有LPS(1μg/mL)的DEME溶液1mL，实验组加入含有不同浓度(3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L)的本发明式Ⅰ化合物的DEME溶液，阳性对照组加入100ug/ml的***，于37℃、5％CO2培养箱中分别培养24h。弃去96孔板中原有培养液，在避光条件下加入100μL无血清培养液以及10μL CCK-8溶液，设置无细胞的复孔为空白组。将细胞孔板置于细胞培养箱中避光孵育3h，酶标仪于450nm处平行测定3次吸光度(A450)值，计算细胞相对存活率。如图2，研究发现本发明式Ⅰ化合物对在一定摩尔浓度范围内(25～50μmol/L)可以明显抑制RAW264.7巨噬细胞增殖(P<0.05)，且具有浓度依赖性，对RAW264.7细胞增殖有明显抑制作用。
实验例2：Elisa法检测RAW264.7细胞炎性因子TNF-α释放量
选取对数生长期的RAW264.7细胞，以3×105/mL的密度、每孔100μL接种于96孔板，至37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，除去上清液，空白组加入DEME溶液1mL，模型组和实验组加入含有LPS(1μg/mL)的DEME溶液1mL，0.5h后实验组分别加入含有化合物(25μmol/L)的DEME溶液1mL，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h，以Elisa试剂盒检测炎性因子TNF-α水平，并根据标准曲线计算其含量。由图3可知与空白组比较，LPS可以升高RAW264.7巨噬细胞TNF-α释放量，具有显著性差异(P<0.05)。加入本发明式Ⅰ化合物(25μmol/L)进行处理后，可以有效降低RAW264.7细胞分泌TNF-α炎性因子能力，表明本发明式Ⅰ化合物通过降低TNF-α释放量表现出抗炎活性。
实验例3：Griess法测定NO释放量
选取对数生长期的RAW264.7细胞，以3×105/mL的密度、每孔100μL接种于96孔板，至37℃、5％CO2的培养箱中培养，按照试剂盒说明书制备NO标准曲线。空白组加入DEME溶液1mL，模型组和实验组加入含有LPS(1μg/mL)的DEME溶液1mL，0.5h后实验组分别加入含有本发明式Ⅰ化合物(6.25、12.5μmol/L)的DEME溶液1mL，24h后，离心(1 000g，15min)，吸取50μL培养上清于96孔细胞培养板，各孔加入50μL Griess试剂A并混合，室温避光静置5min，各孔再加入50μL Griess试剂B并混合，室温避光静置10min，酶标仪540nm检测吸光度(A540)，并用校准曲线确定实验各组NO的浓度，每个组重复6个孔。评价对一氧化氮(NO)的抑制作用。其NO抑制率按如下公式计算：NO抑制率＝(A造模组-A药物组)/(A造模组-A空白组)×100％。
如图4所示，LPS可以增加巨噬细胞上清液中NO释放量，具有显著性差异(P<0.05)。加入本发明式Ⅰ化合物(6.25、12.5μmol/L)进行处理后，经本发明式Ⅰ化合物(6.25、12.5μmol/L)处理的RAW264.7巨噬细胞上清液中NO含量明显降低(P<0.05)，且具有浓度依赖性，表明本发明式Ⅰ化合物可以通过降低NO释放量表现出抗炎活性。
以LPS作为诱导剂，刺激RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，对分离得到的本发明式Ⅰ化合物进行体外抗炎活性评价研究。首先采用CCK-8法检测不同浓度下本发明式Ⅰ化合物的细胞毒性，发现本发明式Ⅰ化合物在一定浓度范围内(25～50μmol/L)可抑制炎症细胞增殖且成浓度依赖性。然后通过Elisa法检测TNF-α炎症因子释放量，发现25μmol/L的本发明式Ⅰ化合物相较于模型组均可以降低TNF-α的释放量；Griess法检测NO释放量，发现6.25、12.5μmol/L的本发明式Ⅰ化合物相较于模型组均可以降低RAW264.7巨噬细胞NO释放量，实验结果表明本发明式Ⅰ化合物的抗炎作用主要与抑制炎症因子TNF-α和NO释放量有关。
综上，本发明化合物，结构如式Ⅰ，化学式为C23H18O8，化学命名为化学命名为1″-甲氧基-3,5,7,4',3″′,4″′-六羟基黄酮，并命名为芙蓉花素，英文名Mutabilfloin。首次由木芙蓉花提取物中提取分离纯化而得，具有明确的抗炎作用。

Claims (10)

1.化合物，其特征在于：结构如式Ⅰ，化学式为C23H18O8：
2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、粉碎干燥木芙蓉花，用乙醇提取，收集滤液，除去乙醇，得到木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏；
B、步骤A所得木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏加水混悬，分别使用60～90℃的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取3-5次，分别收集萃取液，除去萃取液，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，剩余为水相部位；
C、取乙酸乙酯部位经正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检视合并，依次得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG，收集Fr.YC备用；
D、取步骤C所得Fr.YC用MCI中压柱进行分离，以甲醇-水溶剂***进行梯度洗脱，收集馏分用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13，收集Fr.YC 6备用；
E、取步骤D所得Fr.YC 6，经半制备液相纯化，以体积分数62％甲醇溶液为流动相，得到式Ⅰ化合物。
3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
所述干燥木芙蓉花，即开花期采摘初开放的花朵或待开放的花蕾，晒干或烘干即得；
步骤A所述乙醇为体积分数70-100％乙醇；
优选的，步骤A所述乙醇为体积分数90％乙醇；
步骤A所述提取方法为回流提取；
步骤A所述提取方法中回流提取的提取条件为1-3次，每次0.5-3小时；
优选的，步骤A所述提取方法中回流提取的提取条件为提取条件为2次，每次2小时；
步骤A所述除去乙醇的方法采用减压回收，以无醇味为终点；
步骤B中木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏加水量为8-12倍量；
优选的，步骤B中木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏加水量为10倍量；
步骤B中所述水为超纯水；
步骤B依次采用等体积的60～90℃的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取；
步骤B依次采用60～90℃的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取的次数为1-5次；
优选的，步骤B依次采用60～90℃的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取的次数为3次；
步骤C石油醚-乙酸乙酯溶剂***为按照20:1,8:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:10，0:100梯度进行洗脱，收集；
步骤C所得Fr.YC对应为石油醚：乙酸乙酯＝2:1洗脱的部分；
步骤D甲醇-水溶剂洗脱***依次为50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0，收集馏分用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13；
步骤D所得Fr.YC 6对应为甲醇-水溶剂***＝60:40洗脱的部分，即60％甲醇。
4.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
步骤C中，取乙酸乙酯部位80g，经正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱***按照20:1,8:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:10，0:100进行梯度洗脱，收集，共接馏分127瓶；然后收集的127瓶馏分经TLC进行检视合并，得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG，其中，1-15为Fr.YA，26-37为Fr.YB，38-52为Fr.YC，53-68为Fr.YD，69-90为Fr.YE，91-109为Fr.YF，110-127为Fr.YG；收集Fr.YC备用，所得Fr.YC对应为石油醚：乙酸乙酯＝2:1洗脱的部分；
步骤D中，按步骤C取乙酸乙酯部位80g计算，甲醇-水溶剂洗脱***依次为50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0，共接馏分90瓶；用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13，其中：1-4为Fr.YC 1，5-9为Fr.YC 2，10-13为Fr.YC 3，14-19为Fr.YC4，20-24为Fr.YC 5，25-28为Fr.YC 6，29-33为Fr.YC 7，34-38为Fr.YC 8，39-44为Fr.YC 9，45-48为Fr.YC 10，49-62为Fr.YC 11，63-79为Fr.YC 12，80-90为Fr.YC 13；所得Fr.YC 6对应为甲醇-水溶剂***＝60:40洗脱的部分，即60％甲醇；
步骤E经半制备液相纯化，以体积分数62％甲醇溶液为流动相，出峰时间33min。
5.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、将干燥木芙蓉花粉碎成粗粉，用体积分数90％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过后合并滤液，减压回收至无醇味，得到木芙蓉花乙醇提取物粗浸膏；
B、加入10倍量超纯水混悬提取物，分别使用等体积60～90℃石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取3次，合并各萃取液，减压回收，得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分，剩余为水相部位；
C、取乙酸乙酯部位经正相硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯＝20:1,8:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:10，0:100为洗脱***进行梯度洗脱，收集馏分，共接馏分127瓶，用TLC进行检视合并，依次得到7个组分，命名为Fr.YA～Fr.YG，其中，1-15为Fr.YA，26-37为Fr.YB，38-52为Fr.YC，53-68为Fr.YD，69-90为Fr.YE，91-109为Fr.YF，110-127为Fr.YG，收集Fr.YC备用；D、取步骤C所得Fr.YC用MCI中压柱进行分离，以甲醇-水＝50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0为溶剂***进行梯度洗脱，收集馏分，共接馏分90瓶，用TLC进行检测合并，依次得到以下组分，分别命名为Fr.YC1～13，其中：1-4为Fr.YC 1，5-9为Fr.YC 2，10-13为Fr.YC 3，14-19为Fr.YC 4，20-24为Fr.YC 5，25-28为Fr.YC 6，29-33为Fr.YC 7，34-38为Fr.YC 8，39-44为Fr.YC 9，45-48为Fr.YC 10，49-62为Fr.YC 11，63-79为Fr.YC 12，80-90为Fr.YC 13，收集Fr.YC 6备用；
E、取步骤D所得Fr.YC 6，经半制备液相纯化，以体积分数62％甲醇溶液为流动相，出峰时间33min，得到式Ⅰ化合物。
6.权利要求1所述化合物具有在制备抗炎的药物、保健品、化妆品、兽药中的用途。
7.权利要求1所述的化合物制备的药物，其特征在于：以所述式Ⅰ化合为原料，加入药学上可接受的辅助性成分制备而得的药物。
8.权利要求1所述的化合物制备的保健品，其特征在于：以所述式Ⅰ化合为原料，加入保健品可接受的辅助性成分制备而得的保健品。
9.权利要求1所述的化合物制备的化妆品，其特征在于：以所述式Ⅰ化合为原料，加入化妆品可接受的辅助性成分制备而得的化妆品。
10.权利要求1所述的化合物制备的化妆品，其特征在于：以所述式Ⅰ化合为原料，加入兽药可接受的辅助性成分制备而得的兽药。
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