CN116987165A - 高粱株高SgSD1蛋白及其育种材料和应用 - Google Patents

高粱株高SgSD1蛋白及其育种材料和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高粱株高SgSD1蛋白及其育种材料和应用。所要解决的技术问题是调控高粱株高，尤其是降低高粱株高。具体公开了序列2所述蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：A1)调控植物株高中的应用；A2)制备调控植物株高产品中的应用，通过下调所述蛋白质的编码基因的表达能够明显降低高粱株高，可应用于高粱育种或低株高品种选育。

Description

高粱株高SgSD1蛋白及其育种材料和应用
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体涉及高粱株高SgSD1蛋白及其育种材料和应用。
背景技术
高粱是世界五大作物之一，具有耐旱、耐盐碱、耐瘠薄的特性，在干旱、半干旱、盐碱和贫瘠的地区发挥着显著的种植优势，在未来的农业发展中具有不可替代的作用，被认为是最具有开发潜力的粮饲作物。植株矮化是农作物育种中重要的研究焦点，ye是第一次绿色革命的主要特征，20世纪40年代，就是利用矮化植株来培育抗倒伏农作物新品种，从而大幅度提高了粮食产量。矮化株高能有效促进光合产物在籽粒中分配，提高籽粒产量，同时减少倒伏，适于密植。
目前水稻、小麦和玉米等主要农作物中，分别解析了60、27和30个矮杆相关的调控基因，如OsGA20ox2、Rht-B1b和ZmCCT等基因参与调控植株株高的形成。而在高粱中仅发现Dw1、Dw2、Dw3和Dw4等4个基因,仅前3个基因被克隆，分别通过编码细胞增殖新型蛋白、蛋白激酶和ABCB1生长素外排转运蛋白，调节节间细胞增殖活性降低株高，高粱株高研究远落后于其他作物。导致高粱遗传调控网络解析不清楚、遗传基础相对狭窄，阻碍了理想株型新品种选育。因此，迫切需要挖掘和鉴定更多调控高粱株高的优异基因，提高育种效率。
因此，如何提供一种与高粱株高相关的基因是本领域人员待解决的技术问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是调控植物株高，尤其是高粱，尤其是抑制或降低或下调高粱株高。
为了解决上述的问题，本发明提供了下述应用；
蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：
A1)调控植物株高中的应用；
A2)制备调控植物株高产品中的应用；
所述蛋白质为如下任一种：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白称作SgSD1蛋白。
上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由327个氨基酸残基组成。
序列2具体如下：
MVSQERQEPALPLPSNSSSAKRAAASMDASSPAPPLLLRAPTPSPSIDLPAAAGKAAAVFDLRREPKIPAPFLWPHEEARPTSAAELEVPVVDVGVLRNGDRAGLRRAAAQVASACATHGFFQVCGHGVDAALGRAALDGASDFFRLPLADKQRARRVPGTVSGYTSAHADRFASKLPWKETLSFGFHDGAASPVVVDYFTGTLGQDFEPMGRVYQRYCEKMKELSLTIMELLELSLGVERGYYREFFEDSRSIMRCNYYPPCPEPERTLGTGPHCDPTALTILLQDDVGGLEVLVDGEWRPVRPVPGAMVINIGDTFMSELNKAQM
上述蛋白称作SgSD1蛋白。
本申请中，所述调控可为敲除或抑制或降低或下调。所述调控也可为增强或提高或上调
上文中，所述敲除或抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量可实现抑制或降低或下调植物株高。
上文中，所述增强或提高或上调上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量可实现增强或提高或上调植物株高。
上述的用途中，所述蛋白来源于高粱。
上文中，所述高粱可为高粱P898012。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述的用途中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
D1)抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；
D2)表达D1)所述核酸分子的编码基因；
D3)含有D2)所述基因的表达盒；
D4)含有D2)所述基因的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D2)所述基因的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有D3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D7)含有D2)所述基因的转基因植物组织、或含有D3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D4)所述重组载体的转基因植物组织；
D8)含有D2)所述基因的转基因植物器官、或含有D3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D4)所述重组载体的转基因植物器官。
D1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的抑制或降低或下调和/或增强或提高或上调蛋白质SgSD1编码基因表达的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的抑制或降低或下调蛋白质SgSD1编码基因表达的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，且具有抑制或降低或下调蛋白质SgSD1编码基因表达的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述生物材料中，D3)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述D3)中，可用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway***载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用IbpPGM构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述D4)中，所述重组载体的骨架载体可为Pcas9载体。
上述D5)所述的微生物可为农杆菌。所述农杆菌为根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105。
上述的用途中，所述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)高粱属植物；
G4)高粱。
所述高粱可为高粱品种P898012。
为了解决上述问题，本发明还提供了一种降低植物株高的方法。
所述方法包括通过敲除或抑制或降低或下调植物中上述蛋白质的编码基因的表达，和/或，上述蛋白质的活性和/或含量来降低植物株高。
为了解决上述问题，本发明还提供了一种培育低株高植物的方法。
所述方法包括敲除或抑制或降低或下调目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量，得到低株高植物，所述低株高植物的株高低于所述目的植物。
本申请中，所述植物可为高粱。所述高粱可为高粱品种P898012。
上述的方法中，所述敲除或抑制或降低或下调植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入上述的核酸分子、表达盒或重组载体。
上文中，所述核酸分子可为序列1所述的核酸分子。
序列1具体如下：
CACTCGCACATCTCATGGTGTCCCAAGAACGGCAAGAGCCAGCACTGCCTCTGCCTAGCAACAGCAGCAGCGCCAAGCGAGCAGCCGCGTCCATGGACGCCAGCAGCCCGGCCCCGCCGCTCCTCCTCCGCGCCCCCACTCCCAGTCCCAGCATTGACCTCCCCGCTGCCGCTGGCAAGGCCGCGGCCGTGTTCGACCTGCGGCGGGAGCCCAAGATCCCGGCGCCATTCCTGTGGCCGCACGAGGAGGCGCGCCCGACCTCGGCCGCGGAGCTGGAGGTTCCGGTGGTGGACGTGGGCGTGCTGCGCAATGGCGACCGCGCGGGGCTGCGGCGCGCCGCGGCGCAGGTGGCCTCGGCGTGCGCGACGCACGGGTTCTTCCAGGTGTGCGGGCACGGCGTGGACGCGGCCCTGGGGCGCGCCGCGCTGGACGGCGCCAGCGACTTCTTCCGGCTGCCGCTGGCCGACAAGCAGCGCGCCCGGCGCGTCCCCGGCACCGTGTCCGGGTACACGAGCGCGCACGCCGACCGGTTCGCGTCCAAGCTCCCCTGGAAGGAGACCCTGTCCTTCGGCTTCCACGACGGCGCCGCGTCGCCCGTCGTCGTGGACTACTTCACCGGCACCCTCGGCCAAGATTTCGAGCCAATGGGGTAAGCGAAGCACCGATTTACATTTACCGCGCGTCGGCCCCTGAGGCCTGGGTCTTAGTCTTAGCACTGCATATACGGTCGGTAGCTCTGGATATGATACGTATATATGAAACCCCGTTCCAATCCCATGCACGGTGTACACAGGCGGGTGTACCAGAGGTACTGCGAGAAGATGAAGGAGCTGTCGCTGACGATCATGGAGCTGCTGGAGCTGAGCCTGGGCGTGGAGCGCGGCTACTACCGGGAGTTCTTCGAGGACAGCCGCTCCATCATGCGGTGCAACTACTACCCGCCGTGCCCGGAGCCGGAGCGCACGCTGGGCACGGGCCCGCACTGCGACCCTACGGCGCTGACCATCCTCCTGCAGGACGACGTCGGCGGGCTGGAGGTGCTGGTGGACGGCGAGTGGCGCCCCGTCCGGCCCGTCCCAGGCGCCATGGTCATCAACATCGGCGACACCTTCATGGTAACCCCTGCTCTGTTTTTTCTTGTCCTCCTCTTGTCCTGTGTGTGTGTATATTCACTTCTCTCTGTTTTTTTGCCCCGAATCCTAGTGGACCTAACTGGACGGATTACAGCACGCACACGTAGGCATGTCATGTAGCAGCAGTCTGCAGCACTGTAGTACTTAGCGATGCAATAGAGACATGCGTTCCAGTCGGTTCCATCTCGGTGGGCTACAGCTACAGTCCTACACGGACGCGGCTCGTAGTCGTAGGGACGGGCGCGTTCTCTGTATCCACACACGGCTGCGCCCAGGCCGAGGCTTCCGCCGCGGGAAAGTTGCGACAACAGAACGGGGTTTGTGCCGTTGGAGCGTTGCGGAGAGGCAGAGGCTTGGGGGGACGGGGGCGCGATACGCTGCGATGGGTGGGTGACCGAGGCGACGCTTTCGGCGGGGGCCCGGGCCTGCCCAGGTGCGCGCGGCCTCGTCGCCTTCCCCTGTTTTTTTGATGCCGCCGCTCGGTCCTCGGTGTTCTGGCTCCGCCCGCCCGCTCGCTGGGTGCCCATCCCATCTGATCCGATCCGCTCCGCTCCGCGGTGGCGGTCCTATGCGATGCCGCCGCACGAGCGCGGGGGGCCGCCCGTGGAGGAGTAGAAAGTGGTACAAGGTTGGTTGGAACTTGGAATTGTGGGGGGTTACTGCTGCTGGTGGCTGCTGCTTTGCAACTTGCCAGGCTGCTGCCTGTTGCCCCCCGCGTTTTCTAGCCGTTTCCGCTCGCGATCCGGCACGCGGCGCCCACACCGGGGCTCCAGCTCGGCCCCTTGGCCGTGTAGGTAGCAGGCACTTGCATCTGTCCGTTCGACACGATGATTCTTGTGCACTGTGTACGTATGTACTAACCCTTTCTGGTATGATGTACGCATGGCATGCAGGCGCTGTCGAACGGGCGGTACAAGAGCTGCCTGCACCGCGCGGTGGTGAACCAGCGGCAGGAGCGGCGGTCGCTGGCCTTCTTCCTGTGCCCGCGCGAGGACCGGGTGGTGCGGCCGCCGGCCAGCAGCGCCACGCCGCGGCAGTACCCGGACTTCACCTGGGCCGACCTCATGCGCTTCACGCAGCGCCACTACCGCGCCGACACCCGCACGCTGGACGCCTTCACCCGCTGGCTCTCCCACGGCCCAGTCCCAGCCCAGGAGGCGGCGGCTCCCTGCACCTAGCGAGCGAGCGAGCCGGGCCAAACAAACAAGGGGCAAAGGCCATCTCTTTCGCCGGGGCCCGCGCGCGGGGTTCGCCCACGTGCGCGCCCAGGTGGGCGCTGGCCGCGGGCAGGTGGCGGACATGTGGCCTGCGGGCCCCGCGCCGCCTTCCCATTTTTGGACGCTGCCGCGCATGCCGCATGCGTGCGTCGACGGCCCTACTACTTCTACTACTGCTACTGCGACTACTAGTGTACATACGCAAAAATACATATATACGTATTTTCTATATATATATATATAAGCAAGGCGGCCCCCCGGTGACCTTTTCTTTGTTTTTGTCGACAACTGTGTTTTGATCCCATTCTAGCTGTTCTATGGACCATGGATGGTTCGTTCAATGTTTGTACGTACTCCACGTAACCAAACTACTCTAGTGGACTAGTAGATCGGGCTCATGTGATGAAACTGGACCGACGCGGACGTCACGTGCGTCACCCGCGTCTGGTAGCGGTAGCGCACGAGCGCCGAATGTTTCCTGGGCCCGCAAGAGAATCGCTTCTCATCTCCTCTCACCATGAATGGGGAAAAATGCTGCGTCGAAAGTTCCAGACGTTTCCAAATTCCAAACGGTTTTGTGGCGTCCGATCCATGGGGCGCCCCAAACTTCCAAGACGTTTTCAGGTTCCAAATCTTCGTGCTCCACATCACCTTCTTCCCAGATTCATTTGCCTCGTCGCTTGCTCTCCTGTGTTATTCACGGGTCCCACTGTTGCCCCGTCTGCGAGAAAGAAATTTATTAGAGTTGAAGCATTCGACATTTCGACTGACTGATTGTTAGTATCACTAAATTTTGTGCACATGTTTCTTTGGTCATTCATCTCTGGATATTTTTTTTAGATAATGGATATAAATATCGGGCCTCTACATCTGAGGAAGTACACAGCCAATTATTTTCATCTCTGGACATGGGACGATGGAAGAGGCAGATAGATTTAGGAGACCCTTCAATTCAGAATTTCAGGTGCACAAGGCCTGCCTGGCTTGCCCGGATTCTTGTTTCGGACATGACCAACTAGGCCGCACTACTTGCACTGATAGCTGGAGAAAAAACAAAACTTTGCAAACAGCAGGATTATCTACAAGGGAAACTCCATCCACGTGAACCAGCATTTCAGGGAGAGATGCGACAAAAAAAAAGAGGCGGCAACAAAAAAATCTTACTGCAATTTTATCTCTGCATTGAACCTCTTCCAACCATGCCGCATCCTGTACTGTTTTGTATCTTTCCCGGTGGTCCGTTGCGTTCTCACGCAGTTGATAACATGCAGTCACGCACCACCGAATCCAGTGTACTAGGGGTAGTGACTTGTCACGCGGAACAACAGGTCGGTAGCACCAAGCAAGTCGCTGTAGACTTGGGCGTTTAACAACGACTTGCACAACAGTTCAAATATAGCATATGCAATTATGCACAAGATTGTTCGACTGCTATCCGACAAACTGAAGAAGCTGCCCAATTGAACAGAATGTACCAGTGATTTCCAGCACACTATCTTACAGCAGCGTTGAGAATGAAACAACAAATGGGGGAAAACAGATGTGTATTATTCTACAGTTACACCAAAGAGTTTGTCCTTTCAGCATCAACAAGAATCATATGCATATCTAGTGACAAAAATTCCTCTAATTTTACCCTACTTGGTAACAGTTCTCTTCAACACATATATTTCACGTGCTTGCATCGAGTTCCTTGGGCCGCCACATCGACTTCTCGACGCAAAGCAAGCCCTCGTTGCCCTTGGTGTAGGTCATTCGCACCTCCCACTGCAGGGACTTGGCCATGCTTTCCAGTTCGTTTATTGTGTCCGCAGTGTCCCTCACAATCAGTTTGCCTTGGGGCCTCAGTACACGATCAACCTCGGCAAAAACTGCCATCAATTTGCATCTGTAAACAAGCAACACAGATTTAGCATCTGTAAACACCACAGGTTTCATTGCAAGAAGCATAAAGCATGCAAACATGCTACTTGTACATGTCAAAGAAACATGTCAAACTCAAACACATGAAAATCATTATTATTGTTTTCTTGCTGAACTGATCACATTAGTTGGTTTCAATTTCTGAGTTCCACTAGTAATCTATACCAGAAGGATAGAATAATGTCAAGAACAAGAGATACAAACCTCTTTGTGAGCTTTGAGAATAGATGGTCCGCGTGCAGAAGGTCATAAGTTCTTGGGTAAGTGCTCAAAGACTCGCACCAGTCATGGTACATACCAAACAAACCACGCTCGTAAATGATGGGCAGTGTGTCTGGTGAATCAATCGGCACAATATTCATGACCCAGACCTTTTGGTCCCTCAGAGCTGCAGCAAAACTGCCATGCAACGATGTAAAGCATTAGTAAAAATATTGGGTTTTTTAAACCAAAACCAAGAAAGATAATTCCTCCAGCTTAACTGAAAGAAAGAAAGAAAAAAACTGCTTAATGACTTATGGTGGACAAGTTGCCTGTTATGTTTTATGATAGCTATGTGCCAGCTTGGCTAACTGGTAGTTATGTAGTGTGATCTGAATTACCAAAAAAGAGAAGAAAAAAAAATCATGCCCAAGAAACTGAGAAAGACACCCATTTACTTACCCTCCATACACAGCTCTCATGTCCATTACATTTCTCACTTTGGACCAGTCAATTCCCATGCCAT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GCCGCCTGATGCCTTTGCCTGCCACGCTCCACGAGTTGAGGCGCACCAAACTGTGCTGTGCTCCTGATTTGTGCTAATCGGCCGACGCGTACCATTCTTTCTTTCTTTCGTCTACGCGCAGAGAGGCCGGTTGACTGTTTCTTCGTTGGAGGGCCATGTTGACTCGTACTAATAATAAAAATAATAATACTAGGTTGACTTTTTCAATTCCAACGCAGCAGTGCAAAGCTGCCCACCTATGAGCACAGGTCCTTTTTTAACTCCGTTTTTGTACGTACACACGTACTGTCCAGCCTGTGTCTAATAATCTTACCAAAAACCTGTCATCTCACTATCAACCAATCAGGCTCTCCGCCTGTTCGTCGAGGAACAGCAGTTGTTTTCCCTACTCCAACATAGAGTACACTATGGACGCACATTACCATGCCAGCTTGAGCTTAGCATTGCCCACCGTTGGATAACTGCCATGCCATTCTCAGGCCCTGTTTAGTTCCCATCTAAAAATTTTTCATCCATTCCATCGAATCTTTGGACACATGCATGGAACATTAAATGTAGATAAAAAAATAAACTAATTACACAGTTTAGTTGAGAATCGCGAGACGAATCTTTTAAGTCTAGTTACTCCATAATTAGCCTTAAGTGCTACAGTAATCCACATATACTAATGACAGATTAATTATGCTTAATAAATTTGTCTTACAGTTTCCTGACGAGCTATGTAATTTGTTTTTTTATTAGTTTCTAAAAACCCCTCCCGACATCCTTCCGACATATCCGATGTGACAACCAAAAAATTTTCATCTTCAATCTAAACAGGCCCTCACTCTCATCATCTCATGCCGGGGCAGCAGGTCCGTCGTCAGGTCTGTCGTCCCGTCCCGTGCCGTCTGAAGCAACAGGCGAGAGAAACGCCGTTCCATCGGTTTGCCGAGCGTGCAGAGGATAGAGCTATACTCGATCCGGAGAGGATTGTGAAACGAAGCACGGTTAAGCAGTGCCGCGCACGTGCTGCTCTGCTCCTGGATCCGATCCAGATCGACTCGGGGCGTCTCGGCCTCAGCGGCGATGGCAATCATCGCGCGCGCTGCTGGAGCTGGACGTTTTCGTCTTGCATTGCAGGAGGCGGAACAGAACGGAGAAAGCCACGGCGCGCTTTGCCGACGCCACGCGCTGACACGAGGGACCCGTTCAGCGGCCAGCACGCAGCCTAATCATGCCTGTCGGGGGGAGCTCATCCGTTCCTGAATTTGGGTCATGCTCCAGTATCAGGTATTCAGGTACTAGTACTCCTGAGCCATGTGCTGCGACAAAAAAGCGAGGCTCCTGTAGTAGAGCCTTGTTTACTTACAAAATTTTTTACATTCTCAGTTATATTAAATCTTGTGACACATGCATAAAGCATTAAATATACATAAAAGAAATAATTATTTACACAGTTACTTATAATTTGCGAAACGAATCTTTTAAGACTGGTTAGTTTATGATTAGATAATATTTATTAAATACAAATGAAAGTAATATTATTTATATTTTGCAAAAAGTAAATAAGACCTAGGTAGCTAGGCCAACGTGAGCATGTCGGACCCGGACCGGTTCGTTCTACGGCGCGTCCCGCAAACCTGCAGCCAGGTAGTAGTAGTACACCGTGCACGGGAGAGGTGCGCCATGCATGCTCGGGCAAAAGATCATAGAGAAAGGTGCAGCGTTTCAGTTGCACACCTGACCGAGTGACGCCTCGCCTTGTTTGGCTTTGTTCCCAAAATTTTTTAAAATTCCTCATCACATTAAATCTTTGAACGAATATATGGAGCATTAAATATAAATAAAAGAAATAATTAATCATACAATTTGTCTGTAATTTGCGAGACGAATCTTTTGAGCCTAGTTAGTTTATAATTAAATAATATTTGTTAAATACAAACGAAAATGCTACGTTAGCCAAAACTAAAATTTTTCTCCAAACGTGACCCAGCACCTTCCGATCAATCATCACTCAGCGGGTCACGTCAGAAGATCAGATGGACCTTGCCGTCCGGGCCTGTCTCTCGGCCTCCTCCCCATCTGGAACGAACAGAGGTCCAGTCCTGTTTCGAGTCGAGCTGAGTCGATCAGATGGGCCTAAATAGGCCGAAGACGTAGGCAAAGGGCCCGCTGATTTATCTGATTCTTCTAGGACCGTGCATGCGCGGATGGGCCTAGGTGGAAACCCAACAGATGTGAGGCTTCAAAGAGGAAGAAGTCCGTTACACATGGAGAGTTAGTCTATAATGGGATAATATTTACCACAAACAAATAAAAATACTACAGTAGCGAAATCCAAAATTTTTCACATCTAAACAAGGCCCTAGATGTTTTGTCAGTGCCAGACCAGAGAAAATCTCGTCTTCTGCTGTCAATAGCTTTGATGATTCCTGGCGGCAGAGGTAAAGCTTGCCTGGGCCTTGTTTAGTTCCGAAAAGTGAAAAGTTTTCGGTACTGTAGCACTTTTGTTTGTTCGTGACAAATATCATCCAATTATGGACTAACTAGAATTAAAAGATTCGTCTCGTGATCTACAGCTAAACTGTGTAATTAGTTTTTGTTTTCGTCTATATTTAATGTTTCATGCATGTGCCACAAGATTCGATGTGACGGAGAATTTTGAAAATTTTTTGGTTTTCAGAGTGAACTAAACAAGGCCCAGATGTAATTGACCATGCCATCGAGCGCGAGTTGACTAGAGTGAGTCGGCCCTGATGGTTAAGTAGTGCAGACTGCCAAGTGGACAACCGTCTATCAACTTTGCAGAGTGGGGCGAATGCACTGAGGATGTTGGAGAGGGGCAAGCCAAGGTAAACTTGAGGAAAGATGCTTGTTGACACTGTAGTATGTGAACAATCCTGTTTAATTTTGTGTCCTCGACG。
所述导入可通过遗传转化实现。
上述的方法中，所述核酸分子的靶序列为SEQ ID NO.1的第248-267位核苷酸。
上文中，所述方法为将高粱基因组中序列1区域第248位-267位***/替换/缺失导致基因功能缺失。
上文中，导致基因功能缺失可导致显著降低高粱株高。
上述的用途、方法中，所述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)高粱属植物；
G4)高粱。
上述的蛋白质或所述物质。
有益效果
本申请，针对高粱资源材料植株内的SgSD1基因进行了基因编辑，通过Pcas9载体构建基因敲除载体Pcas9-SgSD1(又称重组质粒Pcas9-SgSD1)，将其导入高粱愈伤组织获得基因敲除植株DB03、DB06、DB08和DB09。基因敲除植株DB03、DB06、DB08和DB09的纯合植株与高粱P898012相比，基因组中SgSD1基因发生了突变，DB03、DB06、DB08和DB09种植在两同源染色体中的核苷酸序列分别发生变化如下：DB03的基因组中的SEQ ID No 1的第254-255位之间缺失14个并***6个碱基(TGCGGA)；DB06的基因组中的SEQ ID No 1的第264-265位之间***1个碱基(C)；DB08的基因组中的SEQ ID No 1的第266位之间缺失1个碱基(C)；DB09的基因组中的SEQ ID No 1的第264-265位之间***1个碱基(G)，以上4个位点该缺失和***突变引起了移码，导致翻译提前终止，造成SgSD1蛋白功能缺失，从而将SgSD1基因敲除。将DB03、DB06、DB08和DB09与高粱P898012进行大田和实验室种植发现，基因编辑植株株高降低约1/3的株高。
附图说明
图1高粱P898012和基因编辑DB03、DB06、DB08和DB09植株的株高；
图2高粱P898012和基因编辑植株的田间照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
实施例1基因敲除载体的构建
本申请的发明人发现了一种能够调控高粱株高的基因，其基因组序列如序列表中序列1所示，将其命名为SgSD1基因，该基因共包括3个外显子，分别位于SEQ ID NO.1序列的第1-649位、第794-1115位、第12666-12906位；其编码序列如序列表中序列3所示。其编码蛋白序列如序列表中序列2所示，序列2(SEQ ID No.2)由327个氨基酸残基组成，将此蛋白命名为SgSD1蛋白。
一、载体构建
表1.引物表
表1中的target-F和target-R中，带单下划线和波浪线的序列为与下述线性化载体发生同源重组的序列，带双下划线的序列为靶点序列。
1.引物设计：利用大肠杆菌穿梭载体pCas9(又称pCas9载体，可通过常规商业途径购买)作为骨架载体，利用网站对靶点进行预测选择，设计靶点引物。
2.SgSD1片段的克隆：在10ul体系中各加入1ul的引物(表1中的target-F和target-R)，94℃10min，0.1℃/s退火至15℃，15℃保持10min，完成退火，得到退火产物，所述退火产物为SgSD1片段。该退火产物靶向于高粱基因组中的SgSD1基因，靶点是SEQ IDNO.1的第248-267位。
3.Pcas9线性载体的获得：将Pcas9载体用AarI酶切，利用胶回收试剂盒(AxyPrepDNA)，回收大的载体片段(15kb左右)，得到Pcas9线性载体。
4.SgSD1片段与Pcas9线性载体的同源重组连接：取1ul上述获得的退火产物(SgSD1片段)与上述Pcas9线性载体(酶切后的Pcas9载体),利用同源重组酶(-UniSeamless Cloning and Assembly Kit)进行同源重组连接，获得同源重组酶反应液。
5.重组载体转化大肠杆菌：取10ul上述同源重组酶反应液加入100ul大肠杆菌Trans-T1(TransGen Biotech)感受态细胞中，冰上静置30min,42℃热激30s，之后快速取出冰浴2min，在超净工作台无菌环境下将其涂于含有50mg/ml壮大霉素(spec)的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养至阳性克隆。
6.阳性菌落的鉴定：挑上述阳性菌斑，转移至含有壮大霉素(spec)的LB液体培养基中，37℃200rpm过夜培养，离心收集菌体，使用质粒提取试剂盒(AxyPrep质粒DNA小提试剂盒)提取重组质粒，并检测确定***正确的片段。测序正确的质粒被命名为Pcas9-SgSD1同源重组载体又称重组质粒Pcas9-SgSD1。
重组质粒Pcas9-SgSD1是用DNA片段1(核苷酸序列是SEQ ID NO.1的第248-267位)替换Pcas9载体的5'-AGATGATCCGTGGCA-3'和5'- -3'之间的片段，保持Pcas9载体的其它核苷酸序列不变，得到表达靶向于高粱SgSD1基因的gRNA和cas9蛋白的重组表达载体，称其为Pcas9-SgSD1同源重组载体(重组质粒Pcas9-SgSD1)。
7.Pcas9-SgSD1表达载体的遗传转化：取5ul重组质粒Pcas9-SgSD1加入100ul根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞中,冰浴30min,放入液氮5min,然后立即转入37℃的水浴锅中水浴5min，取出离心管加入0.5ml的LB培养基，28℃、220rpm振荡3-5h,完成农杆菌的转化。取菌液于含50mg/ml的spec和50mg/ml的Rif抗生素的LB培养基，在28℃条件下倒置培养2-3d。
8.重组农杆菌鉴定：挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的液体培养基，28℃振荡培养过夜。利用质粒提取试剂盒重新提取农杆菌质粒，然后回转大肠杆菌验证农杆菌克隆的正确性，备用，将回转大肠杆菌验证正确的农杆菌称作重组农杆菌EHA105/Pcas9-SgSD1。所述重组农杆菌EHA105/Pcas9-SgSD1为含有重组质粒Pcas9-SgSD1的农杆菌EHA105(又称作农杆菌EHA105/Pcas9-SgSD1)。
9.敲除植物的获得与鉴定：利用农杆菌介导法(参考文献如下：Do P T,Lee H,Mookkan M,et al.Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation ofsorghum(Sorghum bicolor)employing standard binary vectors and bar gene as aselectable marker.Plant Cell Reports,2016,35(10):2065-2076.)转化高粱P898012(高粱P898012记载于下述文献中：Rapid and efficient Agrobacterium-mediatedtransformation of sorghum(Sorghum bicolor)employing standard binary vectorsand bar gene as a selectable marker.Plant Cell Reports,2016,35(10):2065-2076.，在该文献中的名称为P898012)材料的幼胚，获得T0代植株，共获得27株T0代植株,将其命名为DB01--DB27(基因编辑植株DB01--DB27)。将T0代植株移栽于育苗盆中培养，高粱叶片2-3cm，研磨后用DNA提取试剂盒(DP360)提取植物DNA，利用检测引物(Check-F1/Check-R1)进行PCR和测序，完成基因型的鉴定。结果表明，多种基因编辑植株中，高粱DB03、DB06、DB08和DB09的中SgSD1的基因发生了基因编辑的纯合突变，将其称作DB03 T0代基因缺失纯合型高粱植株、DB06 T0代基因缺失纯合型高粱植株、DB08 T0代基因缺失纯合型高粱植株、DB09 T0代基因缺失纯合型高粱植株。
测序结果表明：
DB03 T0代基因缺失纯合型高粱植株与高粱P898012相比，高基因组中SgSD1的基因发生了突变：两同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列1(SEQ ID No 1)的SgSD1的基因组基因均发生了如下变化：序列1的第254-255位之间缺失14个并***6个碱基(TGCGGA)；
DB06 T0代基因缺失纯合型高粱植株与高粱P898012相比，高基因组中SgSD1的基因发生了突变：两同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列1的SgSD1的基因组基因均发生了如下变化：序列1的的第264-265位之间***1个碱基(T)；
DB08 T0代基因缺失纯合型高粱植株与高粱P898012相比，高基因组中SgSD1的基因发生了突变：两同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的SgSD1的基因组基因均发生了如下变化：序列1的第266位缺失一个碱基(C)；
DB09 T0代基因缺失纯合型高粱植株与高粱P898012相比，高基因组中SgSD1的基因发生了突变：两同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的SgSD1的基因组基因均发生了如下变化：序列1的第264-265位之间***1个碱基(G)。
以上4个位点该缺失和***突变引起了移码，导致翻译提前终止，造成SgSD1蛋白功能缺失，从而将SgSD1基因敲除。
DB03 T0代基因缺失纯合型高粱植株、DB06 T0代基因缺失纯合型高粱植株、DB08T0代基因缺失纯合型高粱植株和DB09 T0代基因缺失纯合型高粱植株分别进行自交，分别获得高粱DB03、DB06、DB08和DB09 T1代基因缺失纯合型植株的种子(由高粱DB03、DB06、DB08和DB09 T0代基因缺失纯合型植株自交获得)，用于进行下一步检测。
实施例2基因敲除株系的表型观察
分别将上述高粱DB03、DB06、DB08和DB09 T1代基因缺失纯合型植株的种子(种子成长为DB03、DB06、DB08和DB09 T1代基因缺失纯合型植株)各10株，于2022年6月5日，播种于北京地点，以高粱P898012做为对照进行种植，待种植的植株成熟时，分别测定DB03、DB06、DB08和DB09 T1代基因缺失纯合型植株与高粱P898012的株高。
采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
结果表明：待植株成熟时，观察DB03、DB06、DB08和DB09 T1代基因缺失纯合型植株与高粱P898012进行大田和实验室种植发现，与高粱P898012相比，SgSD1基因缺失纯合型植株(DB03、DB06、DB08和DB09 T1代基因缺失纯合型植株)株高降低约1/3的株高(见图1和图2，图1中，control为高粱P898012，DB03、DB06、DB08和DB09分别为DB03、DB06、DB08和DB09T1代基因缺失纯合型植株，株高单位为厘米(cm)，图2中，control为高粱P898012，DB03为DB03 T1代基因缺失纯合型植株，DB06为DB06 T1代基因缺失纯合型植株，DB08为DB08 T1代基因缺失纯合型植株，DB09为DB09 T1代基因缺失纯合型植株)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：
A1)调控植物株高中的应用；
A2)制备调控植物株高产品中的应用；
所述蛋白质为如下任一种：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白来源于高粱。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
D1)抑制或降低或下调权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；
D2)表达D1)所述核酸分子的编码基因；
D3)含有D2)所述基因的表达盒；
D4)含有D2)所述基因的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D2)所述基因的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有D3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D7)含有D2)所述基因的转基因植物组织、或含有D3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D4)所述重组载体的转基因植物组织；
D8)含有D2)所述基因的转基因植物器官、或含有D3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D4)所述重组载体的转基因植物器官。
4.如权利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于，所述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)高粱属植物；
G4)高粱。
5.一种降低植物株高的方法，其特征在于，所述方法包括通过敲除或抑制或降低或下调植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达，和/或，所述权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量来降低植物株高。
6.一种培育低株高植物的方法，其特征在于，所述方法包括敲除或抑制或降低或下调目的植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量，得到低株高植物，所述低株高植物的株高低于所述目的植物。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述敲除或抑制或降低或下调植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入权利要求3中所述的核酸分子、表达盒或重组载体。
8.如权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述核酸分子的靶序列为SEQ IDNO.1的第248-267位核苷酸。
9.如权利要求1-4任一所述的用途、权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述植物为如下任一种：
G1)单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)高粱属植物；
G4)高粱。
10.权利要求1-4中任一所述的蛋白质或所述物质。
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