CN116970289A - 一种基于氧气控制的酶反应水溶性荧光染料、制备方法及应用 - Google Patents
一种基于氧气控制的酶反应水溶性荧光染料、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于氧气控制的酶反应水溶性荧光染料、制备方法及应用,所述的水溶性荧光染料产物,通过调节酶促反应的氧浓度条件,稳定高效制备而成。本发明的荧光染料具有良好的光稳定性、热稳定性、高荧光量子产率和波长涵盖整个可见光谱区域。与传统的有机化学的合成方法相比,其制备工艺简单、绿色,在生物、化工、医学、电化学等领域具有广泛的应用,包括生物成像、荧光标记、传感器、蛋白质定位、药物开发等。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有酪氨酸基团的生物分子为底物,通过氧气调控的酶催化反应,获得水溶性荧光染料产物、其制备方法及应用。更具体地,本发明涉及调控反应体系,使其在低氧条件下,稳定高效制备水溶性荧光染料组合物和制备工艺,属于生物材料领域。
背景技术
荧光染料在医学、生物学和环境科学等多个学科领域具有广泛应用。在不同领域的应用中,对荧光染料的性质提出了相应要求。尤其在生物、医学领域,要求荧光染料具有:(1)生物相容性,高的生物相容性是进行生物体系活体检测的必要条件,尤其需要荧光染料具有良好的水溶性;(2)荧光量子产率高,高的荧光量子产率有利于荧光信号的采集和识别,提高分析检测的灵敏度;(3) 高稳定性,包括化学结构的稳定以及环境稳定性。包括光、热和pH稳定性等; (4)固有荧光发射可以调整到可见光,甚至是近红外区,一方面荧光团波长范围涵盖广,利于进行多荧光通道的监测,另一方面红色和近红外荧光,便于生物医学中的高信噪比观测;(5)易于合成,适宜广泛应用需求。现有的水溶性荧光染料难以满足上述条件。
大自然通过酪氨酸基色素的各种修饰产生丰富多彩的毛皮、羽毛、头发和眼睛等。专利CN 110325204 A提供了一种自组装肽,其被酶促氧化可形成聚合物颜料。通过自组装和复杂的聚合途径调控,包括催化、模板化、组装和受限氧化等,获得不同的黑色素样颜料,初步实现了光吸收的调节。
最近,受到自然界中荧光蛋白发色团化学的启发,不断有研究探索发现的肽基荧光染料,为此领域的突破指明了方向。文章报道中指出:含Y的三肽可以在氧化和自/共组装的帮助下在可见光区域发出荧光(ChemBioChem 2019,20, 2324-2330;ACS MacroLett.2021,10,7,825–830;);有研究报道了一种杂交策略,将一些天然含环结构的生物分子与短肽结合,控制其混合平衡,获得荧光红移的荧光染料(510nm)(Chem.Commun.2020,56(46),6301-6304;)。最近发现,富含Y的短肽(KYF)可以在紫外光照射下共价组装成荧光纳米凝胶,但荧光不能在410nm以上红移(Angew.Chem.,Int.Ed.2021,60(14),7564–7569);上述的研究从分层组装的策略上,一定程度上拓展了含酪氨酸的肽基荧光性质。然而上述体系中,荧光的调谐依赖于纳米结构,限制了它分子生物学和细胞生物领域的应用。而且,仅通过氨基酸及其序列调节量子产率和红移的效果是有限的,最长获得510nm(青色)的荧光。如何获得全可见光区的荧光染料,特别是红色和近红外的荧光染料是有一定挑战的。
发明内容
针对上述现有技术的不足和缺点,本发明提供了一种含有酪氨酸基团的生物分子为底物,通过控制反应体系的氧含量,调控氧化酶的催化反应路径,获得水溶性荧光染料产物。该水溶性荧光染料具有良好的光稳定性、热稳定性、高荧光量子产率和波长涵盖整个可见光谱区域,特别是其荧光发射可达红光到近红光范围。
作为地球环境中的重要组成物质,氧气自出现以来就在生命演化的历程中扮演着关键的角色。在多肽以及氨基酸的分子层次上,关于氧气对于这些肽、蛋白类分子化学进化的调控也十分重要。最近即有文章报道关注到:氧气在酪氨酸分子化学进化中具有调控作用。通过改变含酪氨酸分子在反应体系中氧气的含量,可获得具有光热和光致发光现象的生物材料。在富氧条件下,酪氨酸基团向黑色素类似物转变的路径占有优势,得到的产物具有明显的光热效应;而在乏氧的环境中,酪氨酸基团将优先向联二酪氨酸转化,得到具有pH响应的发光材料(Angew. Chem.Int.Ed.,2019,58,5872–5876)。
此外,传统理解的氧化酶反应催化反应是需氧的,而本发明意外地发现低氧至无氧条件下,氧化酶仍可催化反应,并高效地获得荧光材料。
在本发明中,创造性地综合了肽序列设计、氧气含量调控和酶反应调控相结合,获得了具有优良性质的水溶性分子态荧光染料。
有鉴于此,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明首先涉及式(1)或式(2)或式(3)的肽或其盐或其衍生物,经过低氧条件下的酶促氧化反应所得的产物。
所述的式(1)为NH2-X1-Tyr-COOH;
所述的式(2)为NH2-(A)n-X1-Tyr-X2-COOH;
所述的式(3)为NH2-X1-Tyr-X2-(A)n-COOH;
其中,优选的,X1为氨基酸;优选地,X1为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸中的任何一种氨基酸;
优选的,X2为氨基酸;优选地,X2为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸中的任何一种氨基酸;
(A)n表示连接键、氨基酸或肽,n为大于等于0的整数;当n=0时,(A)n表示化学连接键;当n=1时,(A)n选自任何一种氨基酸;
当n大于1时,(A)n为长度为n的任意的肽-,所述的肽为n个氨基酸通过肽键缩合而成的分子,其中n≥2,优选地,2≤n≤10;
A为氨基酸;优选地,A为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸中的任何一种氨基酸或者多种氨基酸的组合。
在本发明的一个优选实施方式中,其特征在于式(1)或式(2)或式(3) 的肽具有下列序列之一:
构成本发明的肽并以术语AA指示的氨基酸可以是L-和D-同分异构构型。优选地,氨基酸是L型的。
术语“肽”或“肽化合物”指彼此通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的肽链或通过修饰的肽链连接在一起的肽序列。
“肽”或“肽化合物”或“肽底物”还指如上述本发明的天然或合成肽,或者至少它的片段之一,无论它是通过蛋白质水解或合成获得的,或者任何天然或合成的肽,其序列完全或部分由上述肽的序列组成。
其中,所述式(1)或式(2)或式(3)的肽的盐,其盐的形式的选自醋酸盐、氯化盐、磷酸盐和三氟乙酸盐中的一种;
为了提高对降解的耐受性,使用保护形式的本发明的肽底物是可选的,即形成所述式(1)或式(2)或式(3)肽的衍生物,可包含NH2端的保护基Trt、Boc、 Fmoc、Cbz/Z、Allyl;或COOH端的保护基OFm、Otbu、OBzl、OAll、OMe、 OEt;或NH2端和COOH端同时被保护的肽衍生物;
本发明的肽可以是天然或合成来源的,优选地,根据本发明,肽是合成来源的,通过化学合成获得。可以通过典型化学合成(以固相或液体均相)或通过从组成氨基酸的酶促合成获得本发明的式(1)或式(2)式(3)的肽底物。
所述的酶促氧化反应中使用氧化酶;优选地,氧化酶选自辣根过氧化氢酶、过氧化物酶、双孢菌酪氨酸酶(AbTYR)、人酪氨酸酶(hTYR)、色氨酸双加氧酶、漆酶、细胞色素P450氧化酶复合体中的一种或几种的混合物。
本发明结果显示,式(1)或式(2)或式(3)的肽或其盐或其衍生物,X1为含有羟基、氨基、胍基以及硫甲基等富含电子的基团时,所得到的水溶性荧光染料发射波长红移;特别地,X2为甘氨酸、丙氨酸和赖氨酸时,水溶性荧光染料的量子产率更高;而(A)n以及端基保护基团对发光性质影响较小。
在特别的实施例中,本发明还发现,当Tyr位于N端时,发光波长蓝移,且量子产率偏低。
第二方面,提供了如第一方面描述的任意之一肽基的水溶性荧光染料的制备方法,包括如下制备步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。
(2)对步骤(1)所得溶液体系进行除氧处理;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入适量氧化酶;
(4)上述步骤(3)的溶液,在5-50℃下反应一定时间,进行酶催化反应,即得到水溶性荧光染料。
步骤(1)中,所述磷酸盐缓冲溶液为pH为7.0-10.0的磷酸缓冲溶液,其中,磷酸根的浓度0.01M-1M;
步骤(2)中,所述的除氧处理包括但不限于通入高纯惰性气体、冷冻-脱气循环、加热和超声处理的方式;优选地,通过向体系通入高纯的惰性气体和冷冻 -脱气循环;
步骤(2)中,除氧处理后的体系溶解氧浓度低于5mg/L,优选地,除氧处理后的体系溶解氧浓度低于2.5mg/L;更优地,除氧处理后的体系溶解氧浓度低于2mg/L;
步骤(3)中,氧化酶的浓度范围为:1-5000UI/mg;优化地,氧化酶的浓度范围为:2-1000UI/mg;
步骤(4)中,所述的反应时间为12-240h;优选地,反应时间为12-120h;更优选地,反应时间为24-72h;
所述的单位UI/mg表示每mg底物肽所对应氧化酶的效价量;
第三方面,本发明提供如第一方面和第二方面任意之一所述的水溶性荧光染料的应用。包括但限于在生物、化工、医学、电化学等领域的应用,包括但不限制于生物成像、荧光标记、传感器、蛋白质定位、药物开发等。
本发明提供的水溶性荧光染料,综合光学性能优异,应用前景佳。至少具有如下有益效果中的一种、多种或者全部:
1)本发明的水溶性荧光染料与目前的商品化的生物荧光染料相比,具有良好的光稳定性;
2)本发明的水溶性荧光染料与目前的商品化的生物荧光染料相比,具有良好的热稳定性;
3)本发明的水溶性荧光染料与现有肽基荧光染料相比,吸收和发射波长红移,荧光量子产率提高;
4)本发明的水溶性荧光染料与目前的商品化的生物荧光染料相比,制备工艺简单、绿色且可规模化制备;
5)本发明的水溶性荧光染料可以兼容不同的生物正交基团的同时,不影响其荧光性质,可兼容多肽、蛋白质和核酸等的标记。
附图说明
图1为实施例1-3和对比例1-3所制备的水溶性荧光染料溶液的荧光发射谱图。
图2为实施例4所制备的水溶性荧光染料溶液的激发发射荧光谱图。
图3为实施例5-8所制备的水溶性荧光染料溶液的荧光发射谱图。
图4为实施例9所制备的水溶性荧光染料溶液在绿色激光笔下的红色荧光发射实物图。
图5:(a)为实施例10所制备的所制备的水溶性荧光染料溶液在紫色波段光激发下发射蓝光的实物图;(b)为实施例11所制备的所制备的水溶性荧光染料溶液在紫色波段光激发下发射青色光的实物图;(c)为实施例12所制备的所制备的水溶性荧光染料溶液在紫色波段光激发下发射黄绿色光的实物图;(d) 为实施例12所制备的所制备的水溶性荧光染料溶液在绿色波段光激发下发射红光的实物图。
图6为实施例13所制备的水溶性荧光染料溶液的紫外吸收谱图。
图7为实施例13所制备的水溶性荧光染料溶液在600nm激发下荧光发射图。
图8:(a)为实施例14所制备的水溶性荧光染料溶液的实物图;(b)为实施例14所制备的水溶性荧光染料溶液在绿色激光笔激发下发射红光的实物图。
图9:(a)为实施例15所制备的水溶性荧光染料溶液在绿色激光笔激发下发射橙红光的实物图;(b)为实施例16所制备的水溶性荧光染料溶液在绿色激光笔激发下发射红光的实物图。
图10为实施例17所制备的水溶性荧光染料溶液的激发发射荧光谱图。
图11为实施例18所制备的水溶性荧光染料溶液的起始以及室温下放置180 天后的荧光光谱图。
图12实施例20所制备的水溶性荧光染料标记的天然蛋白质在365nm激发下的荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下表述中“肽”“肽化合物”“肽序列”“肽底物”均指代本发明中的肽化合物。
实施例1
一种基于低氧状态下酶催化反应Gly-Tyr(SEQ ID No1)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的二肽Gly-Tyr粉末置于5ml 锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为0.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应24小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图1示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于573nm处。
实施例2
一种基于低氧状态下酶催化反应Met-Tyr-Gly(SEQ ID No12)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取2mg的Met-Tyr-Gly粉末置于5ml 锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=9.0,0.05M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氮气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.0mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入辣根过氧化氢酶,最终浓度控制为5000UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应24小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图1示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于564nm处。
实施例3
一种基于低氧状态下酶催化反应Gly-Tyr-Lys-OMe(SEQ ID No22)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取4mg的Gly-Tyr-Lys-OMe(SEQ ID No22)粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为2.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应24小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图1示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于570nm处。
实施例4
一种基于低氧状态下酶催化反应Sec-Tyr-Gly(SEQ ID No6)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的Sec-Tyr-Gly(SEQ ID No6) 粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
反应后的溶液呈绿色,采用波长是365nm的激光笔照射该产物的水溶液,可以观察到明显的红色荧光。结果如图1所示;
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在不同激发波长下的在450-800nm范围的荧光光谱,得到的激发发射荧光光谱结果如图2示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于668nm处。
实施例5
一种基于低氧状态下酶催化反应Trp-Tyr-Gly(SEQ ID No9)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的Trp-Tyr-Gly(SEQ ID No9) 粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图3示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于576nm处。
实施例6
一种基于低氧状态下酶催化反应Phe-Tyr-Gly(SEQ ID No10)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的Phe-Tyr-Gly(SEQ ID No10)粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图3示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于578nm处。
实施例7
一种基于低氧状态下酶催化反应His-Tyr-Gly(SEQ ID No11)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的His-Tyr-Gly(SEQ ID No11) 粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图3示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于574nm处。
实施例8
一种基于低氧状态下酶催化反应Phe-Phe-His-Try-Gly(SEQ ID No19)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的Phe-Phe-His-Try-Gly(SEQ IDNo19)粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入色氨酸双加氧酶,最终浓度控制为500UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图3示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于574nm处。
实施例9
一种基于低氧状态下酶催化反应Pro-Tyr-Gly(SEQ ID No14)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的Pro-Tyr-Gly(SEQ ID No14) 粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
反应后的溶液呈浅黄色,采用波长是450nm的激光笔照射该产物的水溶液,可以观察到明显的红色荧光。结果如图4所示;
实施例10
一种基于低氧状态下酶催化反应Tyr-Ser-Gly得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的Tyr-Ser-Gly粉末置于5ml 锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱和365nm激光激发下的荧光光谱,结果列入表1中;用365nm波长的光激发产物,可见蓝色荧光,结果如图5中(a)所示。
实施例11
一种基于低氧状态下酶催化反应Tyr-Tyr-Ser-Leu(SEQ ID No18)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg的Tyr-Tyr-Ser-Leu(SEQ ID No18)粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入双孢菌酪氨酸酶(AbTYR),最终浓度控制为5UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱和365nm激光激发下的荧光光谱,结果列入表1中;用365nm波长的光激发产物,可见蓝绿色荧光,结果如图5中(b)所示。
实施例12
一种基于低氧状态下酶催化反应Ser-Tyr-Ala(SEQ ID No13)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg Ser-Tyr-Ala(SEQ ID No13) 的粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入漆酶,最终浓度控制为1UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱和365nm激光激发下的荧光光谱,结果列入表1中;用365nm波长的光激发产物,可见黄绿色荧光,结果如图5中(c)所示;用550nm波长的光激发产物,可见红色荧光,结果如图5中(d)所示。
实施例13
一种基于低氧状态下酶催化反应Gln-Tyr-Gly(SEQ ID No16)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg Gln-Tyr-Gly(SEQ ID No16) 的粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入漆酶,最终浓度控制为1UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱,结果如图6所示;测定其300-800nm范围内的荧光发射光谱,结果如图7所示,相应的最大紫外吸收和荧光发射值列于表1。结果显示,该溶液的最大吸收峰位于600nm处,且具有极大的红移荧光发射,分别位于650nm和 688nm处,其荧光发射呈红色,接近近红外区。显示出本发明的荧光性能显著提升效果。
实施例14
一种基于低氧状态下酶催化反应Gln-Tyr-His(SEQ ID No15)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg Gln-Tyr-His(SEQ ID No15) 的粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入漆酶,最终浓度控制为1UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱和400nm激光激发下的荧光光谱,结果列入表1中;反应后溶液呈蓝色,结果如图8中(a)所示;用550nm波长的光激发产物,可见橙红色荧光,结果如图8中(b)所示。
实施例15
一种基于低氧状态下酶催化反应Asp-Tyr-Gly(SEQ ID No8)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg Asp-Tyr-Gly(SEQ ID No8) 的粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入漆酶,最终浓度控制为1UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱和400nm激光激发下的荧光光谱,结果列入表1中;反应后溶液用 550nm波长的光激发产物,可见橙红色荧光,结果如图9中(a)所示。
实施例16
一种基于低氧状态下酶催化反应Z-Gln-Tyr-Gly-Gly(SEQ ID No21)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg Z-Gln-Tyr-Gly-Gly(SEQ ID No21)的粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入漆酶,最终浓度控制为1UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱和400nm激光激发下的荧光光谱,结果列入表1中;反应后溶液用 550nm波长的光激发产物,可见红色荧光,结果如图9中(b)所示。表明取代基和非邻位氨基酸对发光性质影响较小。
实施例17
一种基于低氧状态下酶催化反应Hyp-Tyr-Gly(SEQ ID No7)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg Hyp-Tyr-Gly(SEQ ID No7) 的粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入漆酶,最终浓度控制为1UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在不同激发波长下的在450-800nm范围的荧光光谱,得到的激发发射荧光光谱结果如图10所示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于605nm处。
实施例18
一种基于低氧状态下酶催化反应Gly-Tyr-Lys(SEQ ID No17)得到水溶性荧光染料的制备方法包括如下步骤:
(1)配置底物肽的磷酸盐缓冲溶液。称取20mg Gly-Tyr-Lys(SEQ ID No17) 的粉末置于5ml锥形瓶后,加入4ml磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5,0.1M),搅拌使其充分溶解;
(2)以持续向体系对溶液体系中通入高纯氩气进行溶液除氧处理,用溶解氧测试仪检测,测定最终体系溶解氧浓度为1.5mg/L;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的手套箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入漆酶,最终浓度控制为1UI/mg;
(4)上述步骤(3)的溶液,在37℃下,进行酶催化反应,反应48小时后即得到水溶性荧光染料。
将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在300-800nm范围内的紫外吸收光谱以及在激发波长为400nm时,其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图11所示,相应的最大吸收波长和最大发射波长列于表1,可见其荧光发射峰位于570nm处。
实施例19荧光染料的稳定性测试
将实施例18中得到的产物溶液,加热到80℃灭活后,在室温条件下,放置 180天后,再次测定其在激发波长为400nm时,在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图11所示,结果显示该样品放置180天后,其荧光光谱谱图几乎没有发生变化,显示出良好的稳定性。
实施例20荧光染料的蛋白标记
本发明提供的水溶性荧光染料的反应底物为常规可编码的氨基酸序列,且形成荧光发射的反应条件温和,因此可用于含相应序列的蛋白等的荧光标记。例如从蛋白质数据库(PDB;http://www.rcsb.org/pdb/)可查询到酪蛋白序列中含GY 的特征序列,因此按照实施例1的条件,将所述的肽底物换为等质量的酪蛋白;反应后的溶液,采用波长是365nm的激光灯照射该产物的水溶液,可以观察到明显的荧光。结果如图12所示;显著出本发明提供的水溶性荧光染料制备方法适用于蛋白标记,是一种温和高效的荧光标记策略。
对比例1
将实施例1中,仅将除氧步骤略去,其余步骤不变,相同投料配比条件下,反应得到的溶液视为对比例1;
同样将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图1示,可见其荧光发射强度显著降低,且发射峰位于511nm处。
对比例2
将实施例2中,仅将除氧步骤略去,其余步骤不变,相同投料配比条件下,反应得到的溶液视为对比例2;
同样将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图1示,可见其荧光发射强度显著降低,几乎完全没有荧光发射。
对比例3
将实施例3中,仅将除氧步骤略去,其余步骤不变,相同投料配比条件下,反应得到的溶液视为对比例3;
同样将反应后的产物溶液放于石英比色皿中测定在其在450-750nm范围的荧光光谱,荧光光谱结果如图1示,可见其荧光发射强度显著降低,且发射峰位于508nm处。
由上述对比例1-3结果可见,本发明提出的除氧工艺步骤,是获得高量子产率和长波长荧光发射的水溶性荧光染料的关键步骤之一。
表1本发明中所得产物的光学特征(最大紫外吸收和荧光发射峰)
/>
其中,除有明确的条件说明外,其它(SEQ ID No2)、(SEQ ID No3)、 (SEQ IDNo4)、(SEQ ID No5)和(SEQ ID No19)均按照实施例1的条件,获得数据。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 一种基于氧气控制的酶反应水溶性荧光染料、制备方法及应用
<130> CP2022059
<141> 2022-04-21
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Gly Tyr
1
<210> 2
<211> 2
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Phe Tyr
1
<210> 3
<211> 2
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
His Tyr
1
<210> 4
<211> 1
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Tyr
1
<210> 5
<211> 1
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
Tyr
1
<210> 6
<211> 2
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
Tyr Gly
1
<210> 7
<211> 2
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
Tyr Gly
1
<210> 8
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
Asp Tyr Gly
1
<210> 9
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
Trp Tyr Gly
1
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
Phe Tyr Gly
1
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
His Tyr Gly
1
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
Met Tyr Gly
1
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
Ser Tyr Ala
1
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 14
Pro Tyr Gly
1
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
Gln Tyr His
1
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
Gln Tyr Gly
1
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 17
Gly Tyr Lys
1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 18
Tyr Tyr Ser Leu
1
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 19
Pro Phe Gln Gly
1
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 20
Phe Phe His Gly
1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 21
Gln Tyr Gly Gly
1
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 22
Gly Tyr Lys
1
Claims (10)
1.一类肽基的水溶性荧光染料,其特征在于,由式(1)或式(2)或式(3)的肽或其盐或其衍生物中的至少一种或多种的组合经过低氧条件下的酶促氧化反应所得的产物,所述低氧条件是指反应体系中溶解氧的浓度为0.1mg/L~5mg/L之间;
所述的式(1)为NH2-X1-Tyr-COOH;
所述的式(2)为NH2-(A)n-X1-Tyr-X2-COOH;
所述的式(3)为NH2-X1-Tyr-X2-(A)n-COOH;
其中,X1为氨基酸;X2为氨基酸;A为氨基酸;
n为大于等于0的整数,当n=0时,(A)n表示化学连接键,当n=1时,(A)n选自任何一种氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一类肽基的水溶性荧光染料,其特征在于,X1为甘氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸、硒半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸和吡咯赖氨酸中的任何一种氨基酸;
优选地,X2为甘氨酸、羟脯氨酸、硒半胱氨酸、谷氨酰胺、吡咯赖氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的任何一种氨基酸。
3.根据权利要求1-2所述的一类肽基的水溶性荧光染料,其特征在于,所述式(1)或式(2)或式(3)的肽的盐,其盐的形式的选自醋酸盐、盐酸盐、磷酸盐和三氟乙酸盐中的一种;
所述式(1)或式(2)或式(3)的肽的衍生物,可包含NH2端的保护基Trt、Boc、Fmoc、Cbz/Z、Allyl;或COOH端的保护基OFm、Otbu、OBzl、OAll、OMe、OEt;或NH2端和COOH端同时被保护的肽衍生物。
4.根据权利要求1-3所述的肽基的水溶性荧光染料,其特征在于,式(1)或式(2)或式(3)的肽为下列序列之一:
所述的酶促氧化反应中使用氧化酶;优选地,氧化酶选自辣根过氧化氢酶、过氧化物酶、双孢菌酪氨酸酶(AbTYR)、人酪氨酸酶(hTYR)、色氨酸双加氧酶、漆酶、细胞色素P450氧化酶复合体中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的肽基的水溶性荧光染料,所述水溶性荧光染料的荧光发射峰在530nm以上,优选在550nm以上,进一步优选在560nm以上。
6.权利要求1-4任意之一所述的肽基的水溶性荧光染料的制备方法,包括如下制备步骤:
(1)配置底物肽的缓冲溶液;
(2)对步骤(1)所得溶液体系进行除氧处理;
(3)将步骤(2)的样品转移至密封除氧的箱中,并向步骤(2)的样品溶液中加入适量氧化酶;
(4)上述步骤(3)的溶液,在5-50℃下反应,即得到水溶性荧光染料;
优选地,反应时间为12-240h;进一步优选地,反应时间为12-120h;更优选地,反应时间为24-72h。
7.根据权利要求6所述的一类肽基的水溶性荧光染料的制备方法,其特征在于,所述缓冲溶液为pH为7.0-10.0的磷酸缓冲溶液;肽的浓度为0.1-20mg/mL;优选地,肽的浓度为1-10mg/mL;
步骤(3)中,以肽的用量为基准,氧化酶的浓度范围为:1-5000UI/mg;优选地,氧化酶的浓度范围为:2-1000UI/mg。
8.根据权利要求6或7所述的一类肽基的水溶性荧光染料的制备方法,其特征在于,除氧处理包括通入高纯惰性气体、冷冻-脱气循环、加热和超声处理的方式;优选地,通过向体系通入高纯的惰性气体和冷冻-脱气循环。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的一类肽基的水溶性荧光染料的制备方法,其特征在于,除氧处理后的体系溶解氧浓度低于5mg/L,优选地,除氧处理后的体系溶解氧浓度低于2.5mg/L;更优地,除氧处理后的体系溶解氧浓度低于2mg/L。
10.权利要求1-5任意之一所述的水溶性荧光染料的应用,所述水溶性荧光染料用于生物成像、荧光标记、传感器、蛋白质定位、药物开发。
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2022
- 2022-04-21 CN CN202210426890.7A patent/CN116970289A/zh active Pending
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