CN116953142A - 茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法 - Google Patents

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CN116953142A CN202310909051.5A CN202310909051A CN116953142A CN 116953142 A CN116953142 A CN 116953142A CN 202310909051 A CN202310909051 A CN 202310909051A CN 116953142 A CN116953142 A CN 116953142A
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Abstract

本发明提供了茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，属于质量检测技术领域。所述方法包括：***标准工作液的配制：称取6种花青素的标准品溶解后，逐级稀释得到系列标准工作液；样品溶液的配制：取待测茶叶样品，经提取、离心后，将上清液过水相滤膜，过滤后的提取液分成两组，一组进行稀释，另一组不稀释，两组提取液均为待测样品溶液；HPLC‑MS/MS检测：将所述系列标准工作液和所述待测样品溶液在相同条件下分别注入液相色谱质谱联用仪中进行分析，从而确定样品中各花青素的含量；所述6种花青素为：天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草色素、牵牛花色素、锦葵色素。使用该方法可以准确地检测出食品中常见的6种花青素单体含量。

Description

茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法
技术领域
本发明属于质量检测技术领域，具体涉及茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法。
背景技术
花青素是一类常见的天然植物水溶性色素，属于类黄酮化合物，在酸性环境中表现为红色或者紫色，在碱性环境中则表现为蓝色，它能使水果、蔬菜、花卉等植物呈现五彩缤纷的颜色，其颜色深浅和花青素的含量成正比。作为一种天然食用色素，花青素含量丰富、无毒安全，并且具有很高的营养价值和药理作用，可以用来预防和治疗部分疾病。由于茶叶花青素具有苦味，且使用富含花青素的紫色芽叶制得的茶品质较差，以往的研究多偏向于减少花青素的积累。但随着市场需求的变化，高花青素含量的茶叶凭借其独特品质特点和性状特征得到重视，富含花青素的茶产品的开发成为当下热点。
随着科学研究的新进展，目前报导了多种用于花青素进行定量分析的方法，其中应用最广泛的方法包括分光光度法、HPLC法和HPLC-MS/MS法。分光光度法可用于检测花青素的总量，HPLC法适用于样品中不同花青素的分析，HPLC-MS/MS不仅可以对花青素进行定量检测，还可以识别花青素的类型。但是花青素含量检测研究多集中在蓝莓、紫薯、黑枸杞等众人熟知的花青素含量较多的植物中。花青素也是茶叶中十分重要的一类物质，80％的茶叶中都含有花青素，特别是近几年研究较多的紫芽叶，其花青素含量占干物质的0.5％～1.0％。因此，建立一种HPLC-MS/MS的方法对茶叶中花青素含量进行检测同样具有十分重要的意义。
发明内容
鉴于此，本发明提供了茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，使用本发明的方法可以准确地检测出天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草色素、牵牛花色素、锦葵色素6种花青素单体含量，且具有操作简单、快速、准确的特点。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，所述方法包括：
S1、***标准工作液的配制：称取6种花青素的标准品溶解后，逐级稀释得到系列标准工作液；
S2、样品溶液的配制：取待测茶叶样品，经提取、离心后，将上清液过水相滤膜，过滤后的提取液分成两组，一组进行稀释，另一组不稀释，两组提取液均为待测样品溶液；
S3、HPLC-MS/MS检测：将步骤S1的系列标准工作液依次注入液相色谱质谱联用仪中，以花青素的多反应监测模式离子峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，在相同条件下，将步骤S2的待测样品溶液注入液相色谱质谱联用仪中，得到各花青素的多反应监测模式离子峰面积，代入标准工作曲线，即可求得样品中6种花青素的含量；
所述6种花青素为：天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草色素、牵牛花色素、锦葵色素。
稀释的待测样品溶液用于测定飞燕草色素、矢车菊素、天竺葵素3种花青素的含量，不稀释的待测样品溶液用于测定芍药素、牵牛花色素、锦葵色素3种花青素的含量。
在一个具体实施方式中，步骤S1中，溶解过程用10％的盐酸甲醇；步骤S1和步骤S2中，稀释过程用甲醇。
花青素易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水或者其混合溶剂中，为了防止提取过程中非酰基化的花青素降解,通常在提取溶剂中加入一定浓度的盐酸或者甲酸。
系列标准溶液的配制，优选的，称取6种花青素的标准品，用10％的盐酸甲醇溶液溶解，配制成6种花青素的单一标准品储备溶液，然后吸取6种花青素的单一标准品储备溶液配制成混合标准溶液，然后再用甲醇逐级稀释得到系列标准工作液。
在一个具体实施方式中，步骤S1中，系列标准工作液的6种花青素的浓度为25μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、1000μg/L、2500μg/L。
1.在一个具体实施方式中，步骤S2中，茶叶样品提取的具体步骤如下：在茶叶样品中加入酸化乙醇溶液，超声50min，再于100℃下水浴75min；所述酸化乙醇溶液中乙醇、盐酸、水的体积比为2:1:1；步骤S2中，水相滤膜的型号为0.22μm水相滤膜。
上述茶叶提取的具体步骤中，加入酸化乙醇溶液后、超声后以及水浴后还要混匀；优选为涡旋混匀。
在一个具体实施方式中，茶叶样品与酸化乙醇溶液的料液比为1:100(g:mL)。
在一个具体实施方式中，步骤S2中，所述离心是以7500r/min离心3min。
在一个具体实施方式中，步骤S2中，提取液稀释的倍数为100倍。
提取液稀释的倍数可以根据样品中花青素的含量作适当调整。
在一个具体实施方式中，步骤S3中，所述色谱的条件为：
色谱柱型号为：Agilent Poroshell 120SB-C18，2.1mm×100mm，2.7μm；
色谱柱温度：40℃；
流速：0.35mL/min；
进样量：2μL；
流动相：流动相A为1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；
流动相梯度洗脱程序表：
在一个具体实施方式中，步骤S3中，所述质谱的条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描模式：正离子扫描模式；
检测方式：多反应监测模式(MRM)；
干燥气：氮气；
雾化气：氮气；
雾化气压力：50psi；
离子喷雾电压：2000V；
干燥气温度：350℃；
干燥气流速：11L/min；
质谱采集参数见表：
在一个具体实施方式中，所述方法的平均加标回收率的范围为91.95％～106.99％，RSD均小于10％，检出限为0.02～17mg/kg，定量限为0.07～55mg/kg。
本发明中所述检出限是指方法能测出该物质时的最低浓度。本发明中所述定量限是指方法能准确定量出该物质时的最低浓度。
与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
1.与现有高效液相色谱法只能通过保留时间进行定性定量检测相比，本发明采用液相色谱质谱联用方法可以同时更准确检测出待测样品中天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草色素、牵牛花色素、锦葵色素6种花青素单体的含量。
2.该方法在浓度范围为25～2500μg/L内线性关系良好，平均加标回收率的范围为91.95％～106.99％，RSD均小于10％，检出限为0.02～17mg/kg，定量限为0.07～55mg/kg，稳定性、精密度均满足相关标准的要求。
3.该方法操作简单、灵敏度好、准确度高，能适用于相关的分析检测工作，可以为国内外对茶叶中花青素含量检测标准方法的建立提供参考，还可为紫芽茶树选育工作提供一定技术支撑。
附图说明
图1为待测样品与提取溶剂酸化乙醇溶液的比值对响应值的影响；
图2为在待测样品提取过程中提取溶剂种类对响应值的影响；
图3为待测样品的提取溶剂酸化乙醇溶液中盐酸浓度对响应值的影响；
图4为待测样品提取过程中超声时间对响应值的影响；
图5为待测样品提取过程中水浴时间对响应值的影响；
图6为不同类型色谱柱分离花青素类物质标准溶液的TIC图；
图7为不同流动相体系下花青素类物质分离情况的TIC图；
图8不同色谱柱温度下花青素类物质标准溶液分离情况的TIC图；
图9不同洗脱程序的TIC图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
通用的材料与方法
(1)仪器与设备
(2)材料与试剂
6种花青素标准品：天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草色素、牵牛花色素和锦葵色素(纯度均≥98％)购自成都德锐可生物科技有限公司。
试剂：色谱纯甲酸、优级纯盐酸、优级纯无水乙醇、优级纯甲酸铵，均购自成都市科隆化学品有限公司
样品：实验所用茶叶样品均购买于四川及外省各茶企业。
实验用水为超存水。
(3)标准工作液的配制
精确称取天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草色素、牵牛花色素、锦葵色素标准品各10.00mg，分别用10％盐酸甲醇溶解后定容至10mL，混匀，即得浓度为1000mg/L的不同的单一标准品储备溶液，于-20℃下避光保存备用，有效期为1个月。
分别准确吸取上述6种花青素类物质单一标准品储备溶液各100μL，配制成6种花青素类物质浓度均为10mg/L的混合标准溶液，然后用甲醇逐级稀释，配制成6种花青素类物质浓度均为25μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、1000μg/L、2500μg/L的系列混合标准工作溶液，现配现用。
(4)样品前处理
称取茶叶粉末0.1000g于15mL离心管中，加入10mL酸化乙醇溶液(乙醇:盐酸:水＝2:1:1)，先涡旋混匀，然后超声50min，取出，再涡旋混匀，然后于100℃下水浴75min，取出，再涡旋混匀，然后以7500r/min离心3min，将上清液倒入10mL容量瓶，定容至10mL，过0.22μm水相滤膜，过滤后的提取液分成两组，一组用甲醇稀释100倍，另一组不稀释，两组提取液都为待测样品。
由于本方法具有较低的检出限，在对茶叶中含量较高的三种花青素类物质(飞燕草色素、矢车菊素、天竺葵素)进行检测时需要对样品进行稀释100倍，而测定另外三种花青素不需要进行样品稀释。提取液稀释的倍数可以根据样品中花青素的含量作适当调整。
(5)仪器方法
液相色谱条件为：
色谱柱型号为：Agilent Poroshell 120SB-C18，2.1mm×100mm，2.7μm；
色谱柱温度：40℃；
流速：0.35mL/min；
进样量：2μL；
流动相：流动相A为1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；
流动相梯度洗脱程序见表1：
表1流动相梯度洗脱步骤
时间(min) 1％甲酸水(％) 甲醇(％)
0 70 30
5 70 30
10 65 35
20 60 40
20.1 5 95
25 5 95
25.1 70 30
33 70 30
质谱条件为:
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描模式：正离子扫描模式；
检测方式：多反应监测模式(MRM)；
干燥气：氮气；
雾化气：氮气；
雾化气压力：50psi；
离子喷雾电压：2000V；
干燥气温度：350℃；
干燥气流速：11L/min；
质谱采集参数见表2所示。
表2质谱采集参数
测定：
将上述配制好的系列混合标准工作液注入HPLC-MS/MS，以6种花青素的MRM离子峰面积与其对应的浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，见下表3。在相同条件下，将待测样品溶液注入HPLC-MS/MS，得到各花青素的MRM离子峰面积，代入标准工作曲线，即可求得待测样品中各花青素的含量。
表3 6种花青素的线性方程、相关系数、线性范围、稀释倍数
实施例1样品前处理条件的优化
1.料液比的优化
为考察料液比对提取率的影响，分别以茶叶与酸化乙醇溶液(乙醇:盐酸:水＝2:1:1)的比例(g:mL)为1:25、1:50、1:75、1:100、1:125对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各料液比条件下待测液中花青素的响应值(峰面积)情况见图1。由图1可知，随着提取溶液比例的增加，提取效率逐渐提高，在料液比1:100条件下提取率最高，再提高溶液比例提取效率也未有明显提升，因此料液比选择为1:100。
2.提取溶剂种类的优化
为考察提取溶剂种类对提取率的影响，分别以酸化乙醇溶液(乙醇:盐酸:水＝2:1:1)、酸化甲醇溶液(甲醇:盐酸:水＝2:1:1)、酸化乙腈溶液(乙腈:盐酸:水＝2:1:1)、酸化水溶液(盐酸:水＝1:3)作为提取溶剂对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各提取溶剂下待测液中花青素的响应值(峰面积)情况见图2。由图2可知，酸化乙醇溶液(乙醇:盐酸:水＝2:1:1)作为提取溶剂时提取效率最高，因此提取溶剂选择为酸化乙醇溶液(乙醇:盐酸:水＝2:1:1)。
3.盐酸浓度的优化
为考察提取溶剂中的盐酸浓度对提取率的影响，分别以盐酸浓度为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、8.0％、10.0％、20.0％、25.0％、30.0％的乙醇水溶液(乙醇:水＝2:1)作为提取溶剂对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各盐酸浓度下待测液中花青素的响应值(峰面积)情况见图3。由图3可知，随着盐酸浓度的增加，提取效率有不同程度地提高，盐酸浓度为25％和30％时，各待测物的提取效率较高。考虑到酸浓度过高对质谱仪器存在伤害，因此不再提高盐酸浓度。在6种待测物中，芍药素和锦葵色素的含量相对较低，应优先考虑芍药素和锦葵色素提取率高的盐酸浓度，在盐酸浓度为25％时，芍药素和锦葵色素提取率相对高，因此盐酸浓度选择为25％。
4.超声时间的优化
为考察超声时间对提取率的影响，分别以超声时间为0、10、20、30、40、50、60min对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各超声时间条件下待测液中花青素的响应值(峰面积)情况见图4。由图4可知，超声时间为50min时提取效率最高，因此超声时间选择为50min。
5.水浴时间的优化
为考察水浴时间对提取率的影响，分别以水浴时间为30、45、60、75、90min对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各水浴时间条件下待测液中花青素的响应值(峰面积)情况见图5。由图5可知，水浴时间为75和90min时各待测物的提取效率较高。在6种待测物中，芍药素和锦葵色素的含量相对较低，应优先考虑芍药素和锦葵色素提取率高的水浴时间，在水浴时间为75min时，芍药素和锦葵色素提取率相对高。因此水浴时间选择为75min。
实施例2液相色谱条件的优化
1.色谱柱的选择
因为花青素在pH小于3的条件下才稳定，为保证色谱柱柱效稳定应选择耐低pH的色谱柱，针对现有色谱柱以及花青素类物质结构特征，共考察了2种规格色谱柱对花青素类物质的分离效果，色谱柱的型号及规格如表4所示。不同类型色谱柱分离花青素类物质标准溶液的总离子流图(TIC图)如图6所示，图中，1：飞燕草色素；2：矢车菊色素；3：牵牛花色素；4：天竺葵素；5：芍药素；6：锦葵色素。由图6可知：Agilent Poroshell 120EC-C18型色谱柱的分离效果和峰形明显优于XSELECTTM HSS T3型色谱柱，综合考虑后选择AgilentPoroshell 120EC-C18(2.1mm×100mm，2.7μm)型色谱柱作为本方法检测色谱柱。
表4用于分离花青素类物质的色谱柱的型号、规格及其对应的TIC图
2.流动相种类的优化
选定色谱柱后，用混合标准工作溶液考察了8种不同流动相体系对花青素类物质响应及分离的影响，如表5和图7所示。由图7可知，乙腈体系下花青素类物质出峰时间早、分离情况差；水相酸度越高，峰分离情况、峰形更好，考虑到色谱柱的耐酸性，甲酸水的最高浓度定为1％；在水相中加入盐后，与没加盐对比，出峰情况、峰形等差别不大，因此水相直接选用1％甲酸水。总体而言，1％甲酸水-甲醇体系下各待测物的分离情况、峰形、响应优于其他流动相体系，因此选择1％甲酸水-甲醇体系作为本方法流动相种类。
表5 8种不同的流动相种类
注：因所使用的仪器在同时采集正负离子模式时，正离子模式下离子响应低，因此对8种流动相体系分别进行正、负离子模式扫描。
3.色谱柱温度的优化
色谱柱温度对待测物的分离度和响应都存在不同程度的影响，分别考察了色谱柱在35℃、40℃、45℃以及50℃温度下花青素类物质分离以及响应的影响，见图8所示，图中，1：飞燕草色素；2：矢车菊色素；3：牵牛花色素；4：天竺葵素；5：芍药素；6：锦葵色素；A、B、C、D分别为柱温35℃、40℃、45℃、50℃。由图8可知，随着色谱柱温度的增加，待测物出峰时间变快，但不影响待测物间的分离情况；色谱柱对待测物响应的影响不是特别大。为了尽量提高分析效率、降低色谱柱柱压，延长色谱柱寿命，综合考虑后选择色谱柱温度为40℃。
4.流动相梯度的优化
为保证花青素类物质具有良好的分离和响应，考察了不同初始流动相比例，见表6所示，对花青素类物质保留时间、分离效果以及响应的影响，结果见图9。由表6和图9可知，在低比例有机相等度洗脱条件下，待测物出峰时间晚、峰宽较宽；在高比例有机相等度洗脱条件下，待测物出峰快，峰分离情况差；梯度洗脱下，改变有机相初始比例和有机相比例增加速率能有效改变各待测物的出峰时间和分离情况；综合考虑后选择编号4为流动相梯度洗脱程序。
表6梯度洗脱程序
实施例3质谱条件的优化
用10％盐酸甲醇溶液配制6种花青素的单一标准工作溶液，浓度为500μg/L，分别在ESI正离子和负离子模式对其进行一级质谱扫描，得到待测物的母离子。发现花青素类物质在正离子模式下响应较好。然后优化得到每种花青素类物质的一级质谱最佳破碎电压，再对每种花青素类物质的分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，最后优化得到每种花青素类物质的二级质谱最佳碰撞电压。优化后的花青素类物质的MRM信息如表2所示。
同时在仪器参数推荐设置范围内，考察了干燥气温度、干燥气流速、雾化气压力、离子喷雾电压对花青素类物质响应(峰面积)的影响，结果见表7～表10。由表可知，在所有实验条件下，所有待测物的干燥气温度、雾化气压力、离子喷雾电压最佳响应条件分别集中在350℃、50psi、2000V下，只有干燥气流速参数的各个目标物的最佳响应条件在10L/min和11L/min两个条件中分布均匀，由于飞燕草色素和锦葵色素的响应值相对偏低，因此优先选择飞燕草色素和锦葵色素响应值较高的离子源参数。综合比较各参数的响应值后最终质谱离子源条件确定为干燥气温度350℃、干燥气流速11L/min、雾化气压力50psi、离子喷雾电压为2000V。
表7不同干燥气温度对花青素类物质响应值的影响
表8不同干燥气流速对花青素类物质响应值的影响
表9不同雾化气压力对花青素类物质响应值的影响
表10不同离子喷雾电压对花青素类物质响应值的影响
实施例4HPLC-MS/MS检测方法性能评价
1.方法的线性和灵敏度
“通用的材料与方法”中所得的标准工作曲线可知，各目标物在25～2500μg/L范围内线性关系均良好，相关系数R均＞0.99。为了考察本方法的灵敏度，以信噪比S/N≥3的浓度为检出限浓度、信噪比S/N≥10的浓度为定量限浓度，具体结果见表11，由表11可知，本方法测定花青素类物质具有良好的灵敏度，能够很好满足茶叶中6种花青素类物质测定的需要。
表11方法的线性和灵敏度实验结果
2.方法的准确度和精密度
准确称取绿茶、红茶样品各12份，其中3份完全按“通用的材料与方法”所述的样品前处理方法制备待测液，另9份分别加入适量“通用的材料与方法”所述的混合标准工作液使最终测试液浓度构成低浓度、中浓度、高浓度三个不同浓度水平加标样品，再按照“通用的材料与方法”的样品前处理方法制备待测液，按照“通用的材料与方法”所述的检测条件进行，考察本方法的加标回收率和精密度情况，具体结果见表12～表14。由表可知，本方法测定茶叶中的花青素类物质的平均回收率在91.95％～106.99％之间，且RSD均小于10％，满足相关标准对方法回收率和精密度的要求，说明本方法能够准确检测茶叶中的花青素类物质的含量。
由于本方法具有较低的检出限，根据样品中的含量和花青素在仪器上的线性范围综合考虑，在对茶叶中含量较高的三种花青素类物质进行样品检测时需要对样品进行稀释100倍，同时可以通过稀释的方法降低基质效应，由加标回收结果可知，基质效应确实已经被克服，因此没有必要针对样品的基质效应再专门进行优化。
表12绿茶样品加标回收率实验结果(n＝3)
表13红茶样品加标回收率实验结果(n＝3)
表14方法精密度测试结果
3.溶液稳定性验证
分别吸取2μL红茶和绿茶样品溶液以及对应的茶叶低、中、高浓度加标溶液，按照“通用的材料与方法”所述的检测条件，在红茶和绿茶样品溶液放置0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h时，分别注入液相色谱串联质谱仪进行分析；在各单一标准工作溶液于-20℃避光环境下放置7、15、30、45、60d时，按照“通用的材料与方法”所述的检测条件，分别吸取2μL浓度均为1000μg/L的混合标准工作溶液(用单一标准工作溶液现配)注入液相色谱串联质谱仪，分析考察标准工作溶液稳定性，具体结果见表15～表17。由表可知，样品待测溶液在24小时内未明显变化，单一标准工作溶液在60天内未明显变化，说明本方法制备的待测液在24h内稳定性良好，于-20℃避光环境下保存的单一标准工作溶液在60d内稳定性均良好。
表15绿茶溶液稳定性测试结果
表16红茶溶液稳定性测试结果
表17单一标准工作溶液稳定性测试结果
物质名称 单一标准工作溶液RSD(％)
飞燕草色素 6.40
矢车菊素 4.07
天竺葵素 6.92
牵牛花色素 8.30
芍药素 6.15
锦葵色素 8.80
实施例5
本实施例采用“通用的材料与方法”所述方法测定五种茶叶样品中6种花青素的含量。
5种茶叶样品分别为：云南大叶种功夫红茶(样品1)、西湖龙井绿茶(样品2)、蒙顶甘露绿茶(样品3)、筠连红茶(样品4)和叙府龙芽绿茶(样品5)，五个茶叶样品全部按照“通用的材料与方法”所述的样品前处理步骤进行处理，得到五个茶叶样品的待测样品溶液。
在“通用的材料与方法”所述的HPLC-MS/MS工作条件下，将五个茶叶样品的待测样品溶液注入HPLC-MS/MS，得到各花青素的MRM离子峰面积，然后代入标准工作曲线，即可求得样品中各花青素的含量。含量测定结果见表18所示。
表18本实施例待测样品的检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、***标准工作液的配制：称取6种花青素的标准品溶解后，逐级稀释得到系列标准工作液；
S2、样品溶液的配制：取待测茶叶样品，经提取、离心后，将上清液过水相滤膜，过滤后的提取液分成两组，一组进行稀释，另一组不稀释，两组提取液均为待测样品溶液；
S3、HPLC-MS/MS检测：将步骤S1的系列标准工作液依次注入液相色谱质谱联用仪中，以花青素的多反应监测模式离子峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，在相同条件下，将步骤S2的待测样品溶液注入液相色谱质谱联用仪中，得到各花青素的多反应监测模式离子峰面积，代入标准工作曲线，即可求得样品中6种花青素的含量；
所述6种花青素为：天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草色素、牵牛花色素、锦葵色素。
2.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S1中，溶解过程用10％的盐酸甲醇；步骤S1和步骤S2中，稀释过程用甲醇。
3.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S1中，系列标准工作液的6种花青素的浓度为25μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、1000μg/L、2500μg/L。
4.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S2中，茶叶样品提取的具体步骤如下：在茶叶样品中加入酸化乙醇溶液，超声50min，再于100℃下水浴75min；所述酸化乙醇溶液中乙醇、盐酸、水的体积比为2:1:1；步骤S2中，水相滤膜的型号为0.22μm水相滤膜。
5.根据权利要求4所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，茶叶样品与酸化乙醇溶液的料液比为1:100(g:mL)。
6.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述离心是以7500r/min离心3min。
7.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S2中，提取液稀释的倍数为100倍。
8.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述色谱的条件为：
色谱柱型号为：Agilent Poroshell 120SB-C18，2.1mm×100mm，2.7μm；
色谱柱温度：40℃；
流速：0.35mL/min；
进样量：2μL；
流动相：流动相A为1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；
流动相梯度洗脱程序表：
9.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，所述质谱的条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描模式：正离子扫描模式；
检测方式：多反应监测模式；
干燥气：氮气；
雾化气：氮气；
雾化气压力：50psi；
离子喷雾电压：2000V；
干燥气温度：350℃；
干燥气流速：11L/min；
质谱采集参数见表：
10.根据权利要求1所述的茶叶中花青素的液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，所述方法的平均加标回收率的范围为91.95％～106.99％，RSD均小于10％，检出限为0.02～17mg/kg，定量限为0.07～55mg/kg。
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CN117607066A (zh) * 2023-12-27 2024-02-27 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 基于高光谱成像的茄子皮中花青素浓度确定方法

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