CN116949099B - 一种靶向cd38和cs1抗原的并联嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向cd38和cs1抗原的并联嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用合成出能同时识别CD38抗原和CS1抗原的并联抗CD38‑CS1的胞外域，连带其他CAR共有的铰链区、共刺激区域等得到靶向CD38和CS1的CAR嵌合受体，制成慢病毒载体质粒，并将其感染T细胞，形成能同时识别CD38和CS1两种抗原的CAR‑T细胞(并联抗CD38‑CS1 CAR‑T细胞和并联抗CS1‑CD38 CAR‑T细胞)，有效避免了由于抗原逃逸导致的肿瘤复发；并且与单特异性CAR‑T相比，明显提高了肿瘤的杀伤效率。本发明的同时靶向CD38和CS1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，在制备过程中经过对CAR序列不断改良，精简其长度，并经过效果验证，得到了靶向CD38和CS1的并联双CAR的序列。

Description

一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体T细胞及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体说是一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
CAR-T即嵌合抗原受体T细胞，包括胞外域、跨膜域和胞内域三部分，胞外域主要为抗原识别区，是由单链抗体构成能识别肿瘤表面相应的抗原，跨膜域主要是铰链区，胞内域主要为共刺激分子区，用于传递T细胞激活信号。CAR-T可以有效识别肿瘤表面抗原，发挥杀伤肿瘤的作用。CS1是一种细胞表面糖蛋白，CD38是一种单链II型跨膜糖蛋白，CS1和CD38在多发性骨髓瘤患者细胞中高表达，因此CS1和CD38均可以作为CAR-T免疫疗法的抗原。
多发性骨髓瘤是比较常见且难治的血液***肿瘤。之前有研究证明BCMA、CD38、CS1都在骨髓瘤表面有较高的表达且抗BCMACAR-T、抗CD38 CAR-T以及抗CS1CAR-T都具有非常好的抗肿瘤疗效。但是仍然存在患者易形成耐药性或者由于抗原逃逸而导致肿瘤复发的情况，因此研究靶向两种抗原的CAR-T细胞，防止抗原逃逸成为现在亟需解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合受体的慢病毒载体质粒，分为CD38-CS1-DualCAR质粒(简称38CS-Dual CAR质粒)和CS1-CD38-Dual CAR质粒(简称CS38-Dual CAR质粒)两种，其中CD38-CS1-Dual CAR质粒的基因编码序列为SEQ ID NO.1，CS1-CD38-Dual CAR质粒的基因编码序列为SEQ ID NO.2。
靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合受体的CAR-T细胞，包含CD38-CS1-Dual CAR质粒(简称38CS-Dual CAR质粒)或CS1-CD38-Dual CAR质粒(简称CS38-Dual CAR质粒)中的一种。
一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合受体的慢病毒载体质粒的制备方法，包括以下步骤：
以下步骤中的P1、P2、P4、PW等原料均为质粒小提试剂盒中提供，购买自TIANGEN。使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的标签。
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400xg)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(请使用当天处理过的柱子)
(2)取1-5ml过夜培养的大肠杆菌菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12.000rpm(～13,400xg)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低；
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充***解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断；此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏；如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量；
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm(～13,400xg)离心10min；
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀；如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清；
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12.000rpm(～13,400xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
(7)可选步骤:向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(-13400xg)离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；
如果宿主菌是endA宿主菌(TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等)，这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步；
如果宿主菌是endA宿主菌(DH5a，TOP10等)，这步可省略；
(8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13,400xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤8；
(10)将吸附柱CP3放入收集管中,12000rpm(～1340xg)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13400xg)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm(～13,400xg)离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
本发明还包括质粒酶切验证过程，步骤如下：
(1)酶切鉴定
酶切体系：
pLenti-PGK-GFP-Puro(生产厂家addgene型号19070)：2ug
Buffer：1ul
BamHI酶：1ul
XbaI酶：1ul
水：补足至10ul
37℃酶切20min。
(2)琼脂糖凝胶电泳
①配置1％琼脂糖凝胶，称取0.25g琼脂糖置于锥形瓶中，加入25毫升1×TAE，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，加入2.5ul EB替代物，摇匀，倒入胶板中；
②加样，凝胶完全凝固后，垂直拔下梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE至没过胶板。将酶切产物加入上样孔，100V跑胶30min；
③电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察有无条带。
一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合受体的CAR-T细胞，内含CD38-CS1-Dual CAR质粒，其制备方法包括以下步骤：
(1)对靶向CD38和CS1的并联双CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒进行质粒大提，然后与293ft细胞进行质粒包装，转染，72h后收集病毒上清液进行超速离心，得到并联抗CD38-CS1 CAR沉淀，然后将沉淀重悬；
(2)采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)，磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗3遍，重悬细胞；
(3)按照说明书比例向步骤(2)的重选细胞中加入CD3+T细胞阳性分选磁珠，混匀后常温孵育20分钟；
(4)将分选柱置于分选架上，1ml磷酸盐缓冲液过柱平衡2遍；
(5)将步骤(3)中的PBMC悬液加入分选柱中，1ml磷酸盐缓冲液洗2遍，将分选柱从分选架上取下，加入1ml磷酸盐缓冲液冲洗出CD3+T细胞；培养后加入重悬的并联抗CD38-CS1 CAR病毒，培养，转染，得到并联抗CD38-CS1 CAR-T细胞。
并联抗CS1-CD38 CAR-T细胞制备方法与上述方法一致。
本发明还包括K562-CD38、K562-CS1以及K562-CD38-CS1制备方法，步骤如下：
(1)取一个24孔板，加入K562细胞系1×105个/孔，加入含有luciferase的慢病毒进行转染，三天后加嘌呤霉素进行筛选，用裂解液裂解细胞加入luciferase底物(以下简称Luc)，酶标仪检测数值在30万以上从而获得含有Luc的K562细胞系。
(2)向培养后的K562细胞系分成三部分，分别加入重悬的CD38抗原、CS1抗原以及加入CD38抗原和CS1抗原，培养，转染，筛选，得到K562-CD38、K562-CS1以及K562-CD38-CS1细胞(后面实验所用的K562-CD38、K562-CS1、K562-CD38-CS1细胞系都是带有Luc)。
本发明还包括并联抗CD38-CS1 CAR-T在研究多发性骨髓瘤中的应用，通过在K562-CD38、K562-CS1以及K562-CD38-CS1细胞的应用，验证上述细胞对CD38阳性、CS1阳性以及CD38和CS1双阳性肿瘤细胞的杀伤能力。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明设计合成出能同时识别CD38抗原和CS1抗原的并联抗CD38-CS1的胞外域，连带其他CAR共有的铰链区、共刺激区域等得到靶向CD38和CS1的CAR嵌合受体，制成慢病毒载体质粒，并将其感染T细胞，形成能同时识别CD38和CS1两种抗原的CAR-T细胞(并联抗CD38-CS1 CAR-T细胞和并联抗CS1-CD38 CAR-T细胞)，有效避免了由于抗原逃逸导致的肿瘤复发；并且与单特异性CAR-T相比，明显提高了肿瘤的杀伤效率。
本发明的同时靶向CD38和CS1的CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，在制备过程中经过对CAR序列不断改良，精简其长度，并经过效果验证，得到了靶向CD38和CS1的并联双CAR的序列。
本发明对细胞表面几乎没有CD38和CS1表达的K562细胞系进行改造，得到了能够单表达CD38抗原的K562-CD38细胞系、单表达CS1抗原的K562-CS1细胞系和能够表达CD38抗原和CS1抗原双抗原的K562-CD38-CS1细胞系，用CAR-T细胞进行杀伤效果的验证，从而为研究多发性骨髓瘤细胞提供依据。
附图说明
图1为CD38 CAR质粒、CS1CAR质粒、CD38-CS1-Dual CAR质粒和CS1-CD38-Dual CAR质粒的结构连接方式示意图；
图2为质粒酶切验证示意图；
图3为不同酶切位点进行酶切获得的质粒进行病毒包装后病毒滴度比较图；
图4为双CAR不同连接点转染率比较结果示意图；
图5为K562-CD38细胞对CD38的表达量检测结果图；
图6为K562-CS1细胞对CS1的表达量检测结果图；
图7为K562-CD38-CS1细胞对CD38的表达量检测结果图；
图8为K562-CD38-CS1细胞对CS1的表达量检测结果图；
图9为Con-T细胞(空白T细胞)、抗CD38 CAR-T细胞、抗CS1 CAR-T细胞、抗CD38-CS1CAR-T细胞的杀伤作用示意图；
图10为Con-T细胞(空白T细胞)、抗CD38 CAR-T细胞、抗CS1 CAR-T细胞、抗CS1-CD38 CAR-T细胞的杀伤作用示意图；
图11为Con-T细胞(空白T细胞)、抗CD38 CAR-T细胞、抗CS1 CAR-T细胞、抗CD38-CS1 CAR-T细胞在靶效比为5：1时的细胞因子检测结果示意图；
图12为Con-T细胞(空白T细胞)、抗CD38 CAR-T细胞、抗CS1 CAR-T细胞、抗CS1-CD38 CAR-T细胞在靶效比为5：1时的细胞因子检测结果示意图；
图13为对T细胞以及三种CAR-T细胞绘制增殖曲线(CD38-CS1 CAR-T细胞和CS1-CD38 CAR-T细胞增殖曲线基本一致)
具体实施方式
本发明的目的是提供一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用，通过以下技术方案实现：
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
本发明所用pMD2.G质粒购买于Addgenne#12259；psPAX2质粒购买于Addgene#12260；
实施例中带荧光流式抗体都为biolegend；
APC-human-Anti-CD38 antibody，Biolegend；#356606
APC-human-Anti-CD319 antibody(APC-human-Anti-CS1 antibody)，Biolegend；#331810
PE-human-Anti-CD4 antibody(antiCD4-APC抗体)，Biolegend；#980804
APC-human-Anti-CD8 antibody(antiCD8-APC抗体)，Biolegend；#344722
APC-human-Anti-TIM-3antibody(antiTIM-3-APC抗体)，Biolegend；#364804
APC-human-Anti-LAG-3antibody(antiLAG-3-APC抗体)，Biolegend；#369212
T CellActivation/Expansion Kit,mouse/T细胞激活/扩增试剂盒，MiltenyiBiotec；#130-093-627CD3
MicroBeads,human/人CD3磁珠，Miltenyi Biotec#130-050-101
Pack2原名pMD2.G，Addgenne#12259
Pack8原名psPAX2，Addgene#12260
pLenti-PGK-GFP-Puro(生产厂家addgene型号19070)
细胞裂解液：Reporter lysis 5X Buffer；Vazyme；DD1206-01
底物：Bright-Lite luciferase assay system；Vazyme；DD1204-02
实施例1
一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合受体的慢病毒载体质粒，分为CD38-CS1-DualCAR质粒(或简称38CS-Dual CAR质粒)和CS1-CD38-Dual CAR质粒(或简称CS38-Dual CAR质粒)两种，其中CD38-CS1-Dual CAR质粒的基因编码序列为SEQ ID NO.1，CS1-CD38-DualCAR质粒的基因编码序列为SEQ ID NO.2。
其中靶向CD38抗原的嵌合受体的慢病毒载体质粒为CD38 CAR质粒，基因编码序列为SEQ ID NO.3；靶向CS1抗原的嵌合受体的慢病毒载体质粒为CS1 CAR质粒，基因编码序列为SEQ ID NO.4；CD38 CAR质粒、CS1CAR质粒、CD38-CS1-Dual CAR质粒和CS1-CD38-DualCAR质粒的结构连接方式如图1所示。
靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合受体的CAR-T细胞，包含CD38-CS1-Dual CAR质粒和CS1-CD38-Dual CAR质粒中的一种。
一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合受体的慢病毒载体质粒的制备方法，包括以下步骤：
以下步骤中的P1、P2、P4、PW等原料均为质粒小提试剂盒中提供，购买自TIANGEN。使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的标签。
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400xg)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(请使用当天处理过的柱子)
(2)取1-5ml过夜培养的大肠杆菌菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12.000rpm(～13,400xg)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低；
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充***解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断；此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏；如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量；
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm(～13,400xg)离心10min；
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀；如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清；
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12.000rpm(～13,400xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
(7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(-13400xg)离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；
如果宿主菌是endA+宿主菌(TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等)，这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步；
如果宿主菌是endA+宿主菌(DH5a，TOP10等)，这步可省略；
(8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13,400xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤8；
(10)将吸附柱CP3放入收集管中,12000rpm(～1340xg)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13400xg)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm(～13,400xg)离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
低拷贝或大质粒(>10kb)提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5-10ml过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液EB应在65-70℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。
对CD38CAR质粒、CS1 CAR质粒以及双CAR质粒进行酶切验证，结果如图2所示，证明CD38 CAR质粒、CS1 CAR质粒以及双CAR质粒(CD38-CS1 CAR质粒或CS1-CD38 CAR质粒)被成功合成出。
实施例2
载体质粒的选择
分别用BamHI/SaLH酶对plenti PGK GFP Puro(u509-5)质粒进行酶切、用EcoRI/BamHI对PLvx-EFIA-IRES-mCherry质粒进行酶切、BamHI酶和XbaI酶对PGK-Lenti质粒进行酶切，包装病毒，超速离心，获得病毒；
由图3可以看出，plenti PGK GFPPuro(u509-5)质粒和PLvx-EFIA-IRES-mCherry质粒病毒滴度较低，而BamHI酶和XbaI酶对PGK-Lenti质粒进行酶切获得的质粒，经过病毒包装，超速离心，获得的病毒滴度明显提高，因此选择PGK-Lenti质粒作为载体质粒。
实施例3
对anti-CD38 CAR和anti-CS1 CAR连接结构的选择
分别选用(G4S)4和T2A对anti-CD38 CAR和anti-CS1 CAR进行连接，经过病毒包装，转染T细胞，得到双特异性CAR-T细胞，经过流式细胞术检测转染率，结果如图4所示，用(G4S)4连接的双CAR-T转染效率低，选用T2A连接双特异性CAR-T细胞转染率明显升高。T2A的的基因编码序列为SEQ ID NO.5。
实施例4
质粒酶切验证过程，步骤如下：
(1)酶切鉴定
酶切体系：
pLenti-PGK-GFP-Puro：2ug
Buffer：1ul
BamHI酶：1ul
XbaI酶：1ul
水：补足至10ul
37℃酶切20min。
(2)琼脂糖凝胶电泳
①配置1％琼脂糖凝胶，称取0.25g琼脂糖置于锥形瓶中，加入25毫升1×TAE，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，加入2.5ul EB替代物，摇匀，倒入胶板中；
②加样，凝胶完全凝固后，垂直拔下梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE至没过胶板。将酶切产物加入上样孔，100V跑胶30min；
③电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察有无条带。结果如图2所示
PGK-Lenti质粒经BamHI/XbaI酶切后序列为SEQ ID NO.6。
实施例5
包含靶向CD38和CS1 CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，制备方法包括以下步骤：
①将培养状态良好的293ft细胞系，传代至10cm培养皿中，待细胞长至70-80％时，进行病毒包装；
②吸弃原有培养基，加入新的预热培养基8毫升，放置于培养箱中待转染；原有培养基以及新的预热培养基都是DMEM完全培养基；
③向两个已灭菌15毫升离心管中，各加入3毫升的Opti-MEM培养基，其中一管加30微升转染试剂lipo3000，另外一管加入30微升p3000与适量的目的质粒和病毒包装质粒，将2个离心管液体吹打混匀，室温静置20分钟；目的质粒是并联抗CD38-CS1-CAR质粒；病毒包装质粒是psPAX2与pMD2.G(质粒质量比为PDL1-CAR质粒：psPAX2质粒：pMD2.G质粒＝4：3：1)；
④20分钟后，取出培养箱中的293ft细胞，将混合液用1毫升的小枪头轻轻滴入培养皿中，为避免细胞在转染过程中漂起来，然后轻轻十字混匀，放置于培养箱中培养48-72h。293ft细胞是贴壁细胞，病毒包装时，293ft在培养皿中融合度在70％～80％左右，转染的目的质粒含有GFP，在倒置荧光显微镜下观测到绿色荧光即说明目的质粒已转入293ft细胞中，并成功表达，可进行病毒包装。观测绿色荧光覆盖率在60％及以上说明包装效果良好，可收集包装病毒上清；
⑤72h后收集病毒上清液在4℃、110000RCF进行超速离心，得到含有CD38和CS1抗原的慢病毒沉淀，然后将沉淀重悬，得到包含靶向CD38和CS1 CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒。
实施例6
人血T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)，磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗3遍，重悬细胞；
(2)按照说明书比例向步骤(1)的重选细胞中加入CD3+T细胞阳性分选磁珠，混匀后常温孵育20分钟；
(3)将分选柱置于分选架上，1ml磷酸盐缓冲液过柱平衡2遍；
(4)将步骤(2)中的PBMC悬液加入分选柱中，1ml磷酸盐缓冲液洗2遍，将分选柱从分选架上取下，加入1ml磷酸盐缓冲液冲洗出T细胞。
实施例7
CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取12孔板，将实施例6中得到的T细胞进行细胞计数，按1.5×106个/孔加入T细胞；
(2)加入适量比例(每1.5×106个T细胞加入57ul)的CD3/CD28磁珠激活；
(3)24h后加入实施例5中的包含靶向CD38和CS1 CAR嵌合受体的慢病毒载体质粒，经过转染得到能同时靶向CD38和CS1的并联CAR-T细胞。
对上述CAR-T细胞的转染率进行检测，取Con-T，antiCD38 CAR-T细胞，antiCS1CAR-T细胞，并联双特异性CAR-T 3×105个细胞，加入1ml PBS,3000RPM离心5min；
弃上清，加入200ul PBS，吹匀，由于CAR带有GFP可直接进行流式细胞术检测。
实施例8
构建K562-38、K562-CS1、K562-CD38-CS1细胞系
(1)取一个24孔板，加入K562细胞1×105个/孔，加入含有luciferase的慢病毒进行转染，三天后加嘌呤霉素进行筛选，用裂解液裂解细胞加入luciferase底物，酶标仪检测数值在30万以上从而获得含有Luc的K562细胞(后面实验所用的K562-CD38、K562-CS1、K562-CD38-CS1细胞都是带有Luc)。
(2)取三个24孔板，加入带有Luc的K562细胞，分别加入CD38抗原病毒、CS1抗原病毒以及CD38抗原病毒和CS1抗原病毒，分别标记为K562-CD38、K562-CS1、K562-CD38-CS1，然后分别加入潮霉素和嘌呤霉素、G418和嘌呤霉素、潮霉素和G418和嘌呤霉素进行筛选，每隔一天检测细胞活率，每周用anti-CD38-APC和anti-CS1-APC进行染色，流式细胞仪检测CD38和CS1在细胞表面的表达，最后得到K562-CD38、K562-CS1、K562-CD38-CS1细胞。
野生的K562细胞表面无CD38和CS1的表达，经过对K562细胞进行改造，使其表面分别表达CD38、CS1以及CD38和CS1，流式细胞仪检测CD38和CS1在细胞表面的表达量，结果如图5-图8所示；其中K562-CD38细胞对CD38的表达量为99.85％，K562-CS1细胞对CS1的表达量为99.37％，K562-CD38-CS1细胞对CD38的表达量为99.89％，对CS1的表达量为99.76％，可以看出CD38、CS1、CD38-CS1抗原均能在细胞表面高表达。
实施例9
用Control-T、抗CD38-CAR-T、抗CS1-CAR-T、antiCD38-CS1-CAR-T、antiCS1-CD38CAR-T细胞按照不同比例分别对K562-CD38、K562-CS1、K562-38-CS1进行杀伤检测。过程如下：
①取四个96孔板，分别加入K562-CD38细胞、K562-CS1细胞、K562-CD38-CS1细胞、MM1.S细胞，1×105个/孔，按照1：1，2：1，5：1加入Control-T、抗CD38-CAR-T、抗CS1-CAR-T、antiCD38-CS1-CAR-T、antiCS1-CD38 CAR-T细胞；
②24h后检测细胞杀伤，将细胞从孔板里面吸出到ep管中，3000rpm离心10min，弃上清，加入细胞裂解液70ul，裂解30min，将ep管放入离心机瞬时离心1min，吸出50ul到不透光96孔板中；
③上机器，用luciferase底物检测荧光值，用公式检测OD值＝(1-T细胞杀伤值/纯肿瘤值)*100得到T细胞杀伤情况。
antiCD38-CS1CAR-T细胞和antiCS1-CD38 CAR-T细胞的杀伤结果分别如图9-图10所示，其中E/T Ratio(靶效比)为T细胞：肿瘤细胞；可以看出，每一种细胞随着T细胞比例的增加，lysis值(杀伤值)不断增加，即细胞的杀伤能力逐渐增加，并且CD38和CS1并联的CAR-T细胞的杀伤能力强于只嵌合CD38或CS1的CAR-T细胞。(注：由于图9和图10在实验过程中采用了不同批次的T细胞，细胞状态不一样，因此空白T细胞的结果会有差别)。
实施例10
检测CAR-T细胞的表型
(1)取Con-T，antiCD38CAR-T、antiCS1CAR-T和并联antiCD38-CS1CAR-T，每种细胞取4个ep管分别做空白组，antiCD3-APC抗体染色，antiCD4-PE/CD8-APC抗体染色，antiLAG-3-APC抗体，antiTIM-3-APC抗体，每个ep管3×105个细胞；
(2)加入1ml PBS，3000RPM离心5min；
(3)弃上清，加入100ul PBS，吹匀，然后分别加入抗体染料，避光染色20min；
(4)20min后加入1ml PBS，吹匀，3000rpm离心5min；
(5)弃上清，加入200ul PBS，重悬细胞，流式细胞术检测；
表1所示，CD3阳性率代表所测细胞为T细胞，CD4阳性率代表辅助T细胞的比例，CD8阳性率代表杀伤T细胞的比例，TIM-3阳性率代表T细胞的衰老比例和LAG-3阳性率代表T细胞的衰老比例。
表1各种T细胞的CD3、CD4、CD8、TIM-3和LAG-3的阳性率结果表
实施例11
在靶效比5：1时，对各种T细胞的IFN-γ数值进行测试
①取一个96孔板，分别加入K562-CD38细胞、K562-CS1细胞、K562-CD38-CS1细胞、MM1.S细胞，1×105个/孔，按照5:1比例加入Control-T、抗CD38-CAR-T、抗CS1-CAR-T、并联抗CD38-CS1-CAR-T；取另一个96孔板，分别加入K562-CD38细胞、K562-CS1细胞、K562-CD38-CS1细胞、MM1.S细胞，1×105个/孔，按照5：1比例加入Control-T、抗CD38-CAR-T、抗CS1-CAR-T、并联抗CS1-CD38 CAR-T
②24h后,将细胞从孔板里面吸出到ep管中，3000rpm离心10min，留上清，用ELISA试剂盒检测上清中IFN-γ的含量；
如图11和图12显示，并联抗CD38-CS1-CAR-T和并联抗CS1-CD38 CAR-T与单CAR-T相比能够产生更多的干扰素。
实施例12
研究转入antiCD38CAR、antiCS1CAR和并联antiCD38-CS1CAR是否会对CAR-T细胞生长的影响
①取24孔板，取四个孔，1×105个/孔，其中一个不加病毒，另外三个分别加入转入含antiCD38CAR、antiCS1CAR和并联antiCD38-CS1CAR的病毒，病毒转入时记录为Day1；
②Day3将细胞收集入培养瓶中，每两天计数一次，对T细胞以及三种CAR-T细胞绘制增值曲线；
结果如图13所示，CAR的嵌入对T细胞的前期增殖产生了一定的影响，但是双CAR对T细胞前期增殖影响效果最小，由细胞增殖趋势图可以看出在7-9天T细胞以及CAR-T增长迅速，在后面四者可以达到平衡。

Claims (3)

1.一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体的慢病毒载体质粒，其特征在于：能同时靶向CD38和CS1两种抗原，根据CD38和CS1在质粒中连接的前后顺序分为CD38-CS1-DualCAR质粒和CS1-CD38-Dual CAR质粒两种，其中CD38-CS1-Dual CAR质粒的基因编码序列为SEQ ID NO.1，CS1-CD38-Dual CAR质粒的基因编码序列为SEQ ID NO.2。
2.一种靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体的CAR-T细胞，其特征在于：包含权利要求1所述的CD38-CS1-Dual CAR质粒或CS1-CD38-Dual CAR质粒。
3.权利要求2所述靶向CD38和CS1抗原的并联嵌合抗原受体的CAR-T细胞在制备多发性骨髓瘤药物中的应用。
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