CN116940568A - 呋喃稠环取代的戊二酰亚胺类化合物 - Google Patents

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CN116940568A CN202280018997.6A CN202280018997A CN116940568A CN 116940568 A CN116940568 A CN 116940568A CN 202280018997 A CN202280018997 A CN 202280018997A CN 116940568 A CN116940568 A CN 116940568A
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栗俊苗
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Abstract

本发明公开了一系列呋喃稠环取代的戊二酰亚胺类化合物，及其在制备治疗相关疾病药物中的应用，具体公开了式(II)所示化合物及其药学上可接受的盐。

Description

呋喃稠环取代的戊二酰亚胺类化合物
本申请主张如下优先权：
CN202110286500.6，申请日：2021-3-17；
CN202110712765.8，申请日：2021-6-25；
CN202111314330.4，申请日：2021-11-8；
CN202210187905.9，申请日：2022-2-28。
技术领域
本发明涉及一系列呋喃稠环取代的戊二酰亚胺类化合物，及其在制备治疗相关疾病药物中的应用，具体涉及式(II)所示合物及其药学上可接受的盐。
背景技术
已知雄激素受体信号传导在***癌的发病机制中起着至关重要的作用，并参与其他雄激素受体阳性癌症的发生,用拮抗雄激素受体的抗雄激素抑制雄激素受体信号传导已被用于或拟用于***癌的治疗。
AR基因编码雄激素受体蛋白，其配体主要为睾酮和二氢睾酮，该受体广泛分布于人体内的大部分器官和组织，介导雄激素的生物效应。雄激素受体在胞浆中能与热休克蛋白(Hsp)结合，当雄激素与雄激素受体结合后，该受体被激活，热休克蛋白解离，雄激素受体形成二聚体进入核中，并与DNA上雄激素应答元件(ARE)结合，启动该元件下游一系列基因的转录表达，其中包括***特异性抗原(PSA)、***酸性磷酸酶(PAP)和细胞周期素依赖激酶(CDK)抑制剂p21WAF1/CIPI等基因，最终导致细胞分化，促进组织器官的发育。雄激素具有维持***生长发育的功能，在无雄激素的环境中***细胞会自发凋亡，而在正常雄激素水平的环境中***细胞能持续生长分化。因此，有研究认为雄激素的过量分泌以及雄激素受体反应性过强都会造成***细胞生长不受抑制，是***癌发生发展的危险因素。
***癌(PCa)是美国男性中最常诊断的非皮肤癌之一，是癌症死亡的第二大常见原因，在美国每年有超过200,000例新发病例和超过30,000例死亡。雄激素剥夺治疗(ADT)是晚期PCa的标准治疗。晚期PCa患者接受ADT，通过促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂、LHRH拮抗剂或双侧睾丸切除术。尽管最初对ADT有反应，但疾病进展不可避免，癌症出现去势抵抗性***癌(CRPC)。高达30％接受放疗或手术初级治疗的***癌患者将在初级治疗后10年内发生转移性疾病。每年约有50,000例患者将发生转移性疾病，称为转移性CRPC(mCRPC)。
蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera,PROTAC)是一种应用泛素–蛋白酶体***靶向特定蛋白质并诱导其在细胞内降解的技术。泛素-蛋白酶体***是细胞内蛋白质降解的主要途径，其正常生理功能主要负责清除细胞内变性、突变或有害蛋白质，细胞内80％以上蛋白质的降解都依赖于泛素–蛋白酶体***。PROTAC利用细胞自身的蛋白质破坏机制，清除细胞中的特异性靶向蛋白。
本公开描述了化合物，包括组成相同的组合物，其功能是招募内源性蛋白到E3泛素连接酶，例如，cereblon(CRBN)E3泛素连接酶，用于泛素化和随后的降解，以及使用相同的方法。特别地，本公开提供了双功能或蛋白水解靶向嵌合(PROTAC)化合物，发现其可作为靶向泛素化和雄激素受体(AR)降解的调节剂。
发明内容
本发明提供式(II)所示化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
PTM选自靶向结合于AR蛋白的药物或其衍生物；
L 1选自-(CH 2) n-，所述各CH 2任选被R 1置换；
R 1选自C 3-7环烷基、6元杂环烷基、-NR a-、-CR bR c-、-CH 2CH 2O-和-NHC(＝O)-；
R a选自H和C 1-3烷基；
R b、R c选自H、D和F；
E 1选自单键和O；
环A不存在；
或者环A选自苯基和5元杂芳基；
n选自1、2、3、4、5和6；
所述6元杂环烷基和5元杂芳基分别包含1、2或3个独立选自-NH-、-O-、-S-和N的杂原子或杂原子团；
条件是，所述化合物不选自：
在本发明的一些方案中，上述PTM选自 其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述R a选自H和CH 3，其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述R 1选自环丙基、环己基、哌嗪基、哌啶基、-NR a-、-CH 2CH 2O-、-NHC(＝O)-和-C(＝O)NH-，其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述R 1选自 -NH-、-N(CH 3)-、-CH 2CH 2O-、-NHC(＝O)-和-C(＝O)NH-，其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述R 1选自 -N(CH 3)-、-CH 2CH 2O-和-NHC(＝O)-，其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述L 1选自 其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述结构单元-E 1-L 1-选自 其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述结构单元 选自 其他变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述化合物选自式(I-1)、(I-2)、(II-1)、(II-2)、(III-1)和(IV-1)所示的结构：
其中，
L 1如本发明所定义。
本发明提供式(Ι)所示化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
E 1选自单键、O和NH；
E 2选自单键和C 1-3烷基；
E 3选自C 1-3烷基和环丙基；
E 4选自单键和-C(＝O)NH-；
环A不存在；
或者环A选自苯基；
ABM选自结合于AR靶向蛋白的药物或其衍生物。
在本发明的一些方案中，上述结构单元-E 1-E 2-选自单键和-OCH 2CH 2-，其它变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述结构单元-E 3-E 4-选自C 1-3烷基、 其它变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述结构单元 选自 其它变量如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述ABM选自式(ABM-1)的结构：
其中，
R 1和R 2选自甲基；
或者，R 1与R 2与共同相连的碳原子成C 4-6环烷基；
Y 1和Y 2分别独立地选自O和S；
环B选自苯基和吡啶基，所述苯基和吡啶基任选被1、2或3个R a取代；
环C选自单键或苯基，所述苯基任选被1、2或3个R b取代；
R a选自F、Cl、Br、I、CN、CH 3、CF 3和NO 2；
R b选自F和Cl。
在本发明的一些方案中，上述ABM选自式(ABM-1a)和(ABM-1b)的结构：
其中，
T 1选自CH和N；
R b1选自H和F；
n选自1、2和3；
Y 1、Y 2、R a、R 1和R 2如本发明所定义。
在本发明的一些方案中，上述ABM选自
在本发明的一些方案中，上述化合物选自式(I-1a)和(I-2a)所示的结构：
其中，
T 1、R 1、R 2、R a、R b1、n、E 1、E 2、E 3和E 4如本发明任意一项所定义。
本发明还有一些方案是由上述各变量任意组合而来。
本发明还提供下述化合物或其药学上可接受的盐：
本发明还提供下述化合物或其药学上可接受的盐：
本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗制备治疗***癌的药物中的应用。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸 加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
术语“药物或其衍生物”包括已开发可结合于靶向蛋白的药物或其衍生物。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
除非另有说明，术语“对映异构体”或者“旋光异构体”是指互为镜像关系的立体异构体。
除非另有说明，术语“非对映异构体”是指分子具有两个或多个手性中心，并且分子间为非镜像的关系的立体异构体。
除非另有说明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。
除非另有说明，用楔形实线键 和楔形虚线键 表示一个立体中心的绝对构型；在结构中没有立体中心的情况下，楔形实线键 和楔形虚线键 同时出现表示相对构型，例如，用 表示反-1,4-二甲基环己烷。
除非另有规定，当某一基团具有一个或多个可连接位点时，该基团的任意一个或多个位点可以通过化学键与其他基团相连。所述位点与其他基团连接的化学键可以用直形实线键 直形虚线键 或波浪线 表示。例如-OCH3中的直形实线键表示通过该基团中的氧原子与其他基团相连； 中的直形虚线键表示通过该基团中的氮原子的两端与其他基团相连； 中的波浪线表示通过该苯基集团中的1和2位的碳原子与其他基团相连。
本发明的化合物可以存在特定的。除非另有说明，术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指在室温 下，不同官能团异构体处于动态平衡，并能很快的相互转化。若互变异构体是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(proton tautomer)(也称质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键异构体(valence tautomer)包括一些成键电子的重组来进行的相互转化。其中酮-烯醇互变异构化的具体实例是戊烷-2,4-二酮与4-羟基戊-3-烯-2-酮两个互变异构体之间的互变。
除非另有说明，术语“富含一种异构体”、“异构体富集”、“富含一种对映体”或者“对映体富集”指其中一种异构体或对映体的含量小于100％，并且，该异构体或对映体的含量大于等于60％，或者大于等于70％，或者大于等于80％，或者大于等于90％，或者大于等于95％，或者大于等于96％，或者大于等于97％，或者大于等于98％，或者大于等于99％，或者大于等于99.5％，或者大于等于99.6％，或者大于等于99.7％，或者大于等于99.8％，或者大于等于99.9％。
除非另有说明，术语“异构体过量”或“对映体过量”指两种异构体或两种对映体相对百分数之间的差值。例如，其中一种异构体或对映体的含量为90％，另一种异构体或对映体的含量为10％，则异构体或对映体过量(ee值)为80％。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3H)，碘-125(125I)或C-14(14C)。又例如，可用重氢取代氢形成氘代药物，氘与碳构成的键比普通氢与碳构成的键更坚固，相比于未氘化药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
术语“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。氧取代不会发生在芳香基上。术语“任选被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。
术语“被置换”指特定的原子或基团可以被替换为指定的其他原子或基团。如CH3CH2CH3中的CH2可被O、S、NH置换得到CH3OCH3、CH3SCH3和CH3NHCH3。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
当一个连接基团的数量为0时，比如-(CRR)0-，表示该连接基团为单键。
当一个取代基为空缺时，表示该取代基是不存在的，比如A-X中X为空缺时表示该结构实际上是A。当所列举的取代基中没有指明其通过哪一个原子连接到被取代的基团上时，这种取代基可以通过其任何原子相键合，例如，吡啶基作为取代基可以通过吡啶环上任意一个碳原子连接到被取代的基团上。
除非另有规定，术语“C1-3烷基”用于表示直链或支链的由1至3个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C1-3烷基包括C1-2和C2-3烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C1-3烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(包括n-丙基和异丙基)等。
除非另有规定，环上原子的数目通常被定义为环的元数，例如，“5-7元环”是指环绕排列5-7个原子的“环”。
除非另有规定，“C3-7环烷基”表示由3至7个碳原子组成的饱和环状碳氢基团，其包括单环和双环体系，其中双环体系包括螺环、并环和桥环。所述C3-7环烷基包括C3-6、C3-5、C3-4、C4-7、C4-6、C4-5、C5-7或C5-6环烷基等；其可以是一价、二价或者多价。C3-7环烷基的实例包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。
除非另有规定，术语“6元杂环烷基”本身或者与其他术语联合分别表示由6个环原子组成的饱和环状基团，其1、2、3或4个环原子为独立选自O、S和N的杂原子，其余为碳原子，其中氮原子任选地被季铵化，氮和硫杂原子可任选被氧化(即NO和S(O)p，p是1或2)。其包括单环和双环体系，其中双环体系包括螺环、并环和桥环。6元杂环烷基的实例包括但不限于四氢吡喃基、哌啶基(包括1-哌啶基、2-哌啶基和3-哌啶基等)、哌嗪基(包括1-哌嗪基和2-哌嗪基等)或吗啉基(包括3-吗啉基和4-吗啉基等)等。
除非另有规定，本发明术语“5元杂芳环”和“5元杂芳基”可以互换使用，术语“5元杂芳基”表示由个环原子组成的具有共轭π电子体系的单环基团，其1、2或3个环原子为独立选自O、S和N的杂原子，其余为碳原子。其中氮原子任选地被季铵化，氮和硫杂原子可任选被氧化(即NO和S(O)p，p是1或2)。5元杂芳基可通过杂原子或碳原子连接到分子的其余部分。所述5元杂芳基的实例包括但不限于吡咯基(包括N-吡咯基、2-吡咯基和3-吡咯基等)、吡唑基(包括2-吡唑基和3-吡唑基等)、咪唑基(包括N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基和5-咪唑基等)、噁唑基(包括2-噁唑基、4-噁唑基和5-噁唑基等)、***基(1H-1,2,3-***基、2H-1,2,3-***基、1H-1,2,4-***基和4H-1,2,4-***基等)、四唑基、异噁唑基(3-异噁唑基、4-异 噁唑基和5-异噁唑基等)、噻唑基(包括2-噻唑基、4-噻唑基和5-噻唑基等)、呋喃基(包括2-呋喃基和3-呋喃基等)、噻吩基(包括2-噻吩基和3-噻吩基等)。
除非另有规定，Cn-n+m或Cn-Cn+m包括n至n+m个碳的任何一种具体情况，例如C1-12包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、和C12，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如C1-12包括C1-3、C1-6、C1-9、C3-6、C3-9、C3-12、C6-9、C6-12、和C9-12等；同理，n元至n+m元表示环上原子数为n至n+m个，例如3-12元环包括3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环、11元环、和12元环，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如3-12元环包括3-6元环、3-9元环、5-6元环、5-7元环、6-7元环、6-8元环、和6-10元环等。
除非另有规定，当某一基团具有一个或多个可连接位点时，该基团的任意一个或多个位点可以通过化学键与其他基团相连。当该化学键的连接方式是不定位的，且可连接位点存在H原子时，则连接化学键时，该位点的H原子的个数会随所连接化学键的个数而对应减少变成相应价数的基团。所述位点与其他基团连接的化学键可以用直形实线键 直形虚线键 或波浪线 表示。例如-OCH3中的直形实线键表示通过该基团中的氧原子与其他基团相连； 中的直形虚线键表示通过该基团中的氮原子的两端与其他基团相连； 中的波浪线表示通过该苯基基团中的1和2位碳原子与其他基团相连； 表示萘环上的任意可连接位点可以通过1个化学键与其他基团相连，至少包括 这6种连接方式。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法来确认结构，如果本发明涉及化合物的绝对构型，则该绝对构型可以通过本领域常规技术手段予以确证。例如单晶X射线衍射法(SXRD)，把培养出的单晶用Bruker D8 venture衍射仪收集衍射强度数据，光源为CuKα辐射，扫描方式： 扫描，收集相关数据后，进一步采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，便可以确证绝对构型。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明采用下述缩略词：aq代表水；eq代表当量、等量；CDI代 表羰基二咪唑；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；DMSO代表二甲亚砜；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；Boc代表叔丁氧羰基是一种胺保护基团；r.t.代表室温；O/N代表过夜；THF代表四氢呋喃；Boc2O代表二-叔丁基二碳酸酯；M代表mol/L；HPLC代表高效液相色谱。
化合物依据本领域常规命名原则或者使用 软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。技术效果
本发明化合物具有优异的AR蛋白降解作用、细胞增殖抑制作用和显著的抑瘤作用。
附图说明
图1：恩杂鲁胺和WX001在细胞系LNCaP AR蛋白降解活性。
图2：WX002在细胞系LNCaP AR蛋白降解活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
参考例1
合成路线：
步骤1：中间体BB-1-2的合成
将化合物BB-1-1(1g,3.53mmol)和氨基甲酸叔丁酯(2.07g,17.66mmol)加到甲苯(15mL)和水(1.5mL)中，将三(二亚苄基丙酮)二钯(226.41mg,247.25μmol)，2-二叔丁基膦-2′,4′,6′-三异丙基联苯(209.98mg,494.49μmol)，磷酸钾(3.00g,14.13mmol)依次慢慢的加到反应中，混合物用氮气置换3次后升温到100℃搅拌12小时。反应液冷却到室温，减压旋掉大部分的有机溶剂。用乙酸乙酯稀释(30mL)，有机相经水洗涤2次(30mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。所得残留物经柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0-3/2,体积比)，得到中间体BB-1-2。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:7.83-7.73(m,1H),7.57(s,1H),7.47- 7.40(m,1H),7.14-7.05(m,1H),6.81(br d,J＝1.0Hz,1H),4.19(q,J＝7.0Hz,2H),3.67(d,J＝1.3Hz,2H),1.49-1.42(m,9H),1.32-1.23(m,3H)。
步骤2：中间体BB-1-3的合成
0℃下，将化合物BB-1-2(300mg,939.40μmol)和丙烯酰胺(73.45mg,1.03mmol,71.31μL)加到四氢呋喃(5mL)中，将叔丁醇钾(158.12mg,1.41mmol)慢慢加到反应中，混合物氮气置换3次后在0℃搅拌1小时。反应液慢慢加到饱和氯化铵水溶液中(20mL)中，用乙酸乙酯萃取2次(20mL×2)，有机相用饱和食盐水洗涤1次(20mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。所得残留物经柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0-3/1,体积比)，得到中间体BB-1-3。
步骤3：中间体BB-1的盐酸盐的合成
将化合物BB-1-3(40mg,116.16μmol)加到乙酸乙酯(2mL)中，将盐酸/二氧六环(4M,1mL)慢慢滴加到反应中。混合物氮气置换3次后在25℃搅拌12小时。反应液直接旋干得到中间体BB-1的盐酸盐。
参考例2
合成路线：
步骤1：中间体BB-2-2的合成
室温和氮气保护下，将中间体BB-2-1(4g,14.13mmol)和氨基甲酸叔丁酯(4.97g,42.39mmol)加入到甲苯(70mL)和水(10mL)的混合液中，随后依次加入磷酸钾(12.00g,56.51mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(905.63mg,988.99μmol)和2-二叔丁基膦-2′,4′,6′-三异丙基联苯(839.93mg,1.98mmol)，反应混合物在110℃和氮气保护下搅拌反应12小时。反应完毕后，冷却至室温，经硅藻土过滤，滤液中加入水(100mL)，用乙酸乙酯(500mL×2)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(300mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，所得残余物经过柱分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝0/1-10/1，体积比)，得到中间体BB-2-2。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:7.71(br s,1H),7.63(s,1H),7.37(d,J＝8.8Hz,1H),7.14(dd,J＝2.0,8.8Hz,1H),6.59(br s,1H),4.20(q,J＝7.2Hz,2H),3.67(d,J＝0.8Hz,2H),1.53(s,9H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤2：中间体BB-2-3的的合成
将化合物BB-2-2(0.75g,1.69mmol)和叔丁醇钾(284.42mg,2.53mmol)加到四氢呋喃(8mL)中，将丙烯酰胺(312.60mg,2.03mmol)慢慢的加到反应液中，混合物用氮气置换3次后在0-5℃搅拌2小时。反应完毕，将反应液慢慢加到饱和氯化铵水溶液中(20mL)，乙酸乙酯萃取2次(20mL×2)，合并有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干，所得残余物经过柱分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0-1/1，体积比)，得到中间体BB-2-3。MS-ESI m/z:245.0[M+H] +. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.13(br s,1H),7.65(br s,1H),7.46(s,1H),7.32(d,J＝8.8Hz,1H),7.04(dd,J＝2.1,8.8Hz,1H),6.57(br s,1H),3.91(t,J＝7.6Hz,1H),2.80-2.53(m,2H),2.35-2.20(m,2H),1.45(s,9H)。
步骤3：中间体BB-2的盐酸盐的合成
室温下，将中间体BB-2-3(300mg,871.18μmol)溶于盐酸/乙酸乙酯溶液(4M,5mL)，反应混合物在室温下搅拌反应2小时。反应完毕后，反应液减压浓缩除去溶剂得到中间体BB-2的盐酸盐。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.97(s,1H),10.34(br s,2H),8.05(s,1H),7.72(d,J＝8.8Hz,1H),7.58(d,J＝2.0Hz,1H),7.35(dd,J＝2.1,8.7Hz,1H),4.20(dd,J＝4.8,12.3Hz,1H),2.88-2.73(m,1H),2.68-2.58(m,1H),2.30(dq,J＝4.4,12.6Hz,1H),2.20-2.10(m,1H)。
参考例3
合成路线：
步骤1：中间体BB-3-2的合成
室温和氮气保护下，将浓硫酸(220.80g,2.21mol,120mL,纯度:98％)滴加到冰水(40mL)中，随后加入化合物BB-3-1(10g,44.83mmol)，冷却至5～10℃，缓慢滴加4-氯乙酰乙酸乙酯(7.38g,44.83mmol)，反应 混合物升温至室温并搅拌反应16小时，再升温至50℃并继续搅拌反应16小时。反应完毕后，冷却至室温，倒入冰水(1L)中，有大量固体析出，过滤，收集滤饼。所得固体加入甲苯(400mL)，减压除去溶剂，再加入甲苯(400mL)，再减压除去溶剂，得到中间体BB-3-2。
步骤2：中间体BB-3-3的合成
室温和氮气保护下，将中间体BB-3-2(14.5g,44.81mmol)溶于氢氧化钠(8.70g,217.52mmol)的水(150mL)溶液中，反应混合物加热至80℃并搅拌反应5小时。反应完毕后，冷却至室温，加入二氯甲烷(150mL)稀释，分液后收集有机相，水相用二氯甲烷(150mL×3)萃取。水相用2M稀盐酸调节pH值至4，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂，得到中间体BB-3-3。
步骤3：中间体BB-3-4的合成
室温和氮气保护下，将中间体BB-3-3(11.3g,37.03mmol)溶于乙醇(300mL)中，随后加入浓硫酸(2.08g,20.78mmol,1.13mL,纯度:98％)，反应混合物加热至80℃搅拌反应12小时。反应结束后，冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，加入水(150mL)，用乙酸乙酯(150mL×1,100mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂。所得残余物经过柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0-97/3，体积比)，得到中间体BB-3-4。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.35(d,J＝2.0Hz,1H),8.09(t,J＝4.4Hz,2H),7.86(s,2H),7.73(dd,J＝2.0,8.8Hz,1H),4.18-4.09(m,4H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤4：中间体BB-3-5的合成
室温下，在搅拌条件下将中间体BB-3-4(2.00g，6.00mmol)溶于甲苯(60mL)和水(6mL)中，之后依次加入叔丁基氨基甲酸酯(3.52g，30.01mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(384.78mg,420.20μmol)，2-二叔丁基膦-2′,4′,6′-三异丙基联苯(356.87mg，840.40μmol)，磷酸钾(5.10g，20.01mmol)。反应混合物体系经氮气置换三次，缓慢升温至105℃，氮气保护条件下，反应12小时。反应完毕后，冷却至室温，向所得反应液中加入水(50mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并有机相，依次用饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经柱层析分离纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1-5/1，体积比)，得到中间体BB-3-5。
步骤5：中间体BB-3-6的合成
0℃和氮气保护下，将BB-3-5(4.00g,10.83mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(60mL)溶剂中，向其中分别加入叔丁醇钾(1.22g,10.83mmol)和丙烯酰胺(1.67g,10.83mmol)，反应混合物在0℃下搅拌反应3小时。反应完毕后，向反应液中加入水(50mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经柱层析分离纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1-1/1，体积比)，得到中间体BB-3-6。MS-ESI m/z:338.4[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.95(s,1H),9.55(s,1H),8.25(s,1H),7.96(d,J＝4.0Hz,2H),7.72(s,2H),2.89(s,3H),2.74(s,2H),1.52(s, 9H)。
步骤6：中间体BB-3的盐酸盐的合成
0℃下，将BB-3-6(1.0g,2.54mmol)溶解于乙酸乙酯(20mL)中，向其中缓慢加入盐酸乙酸乙酯(2.54mL)，氮气氛围下，反应混合液搅拌4小时。反应结束后，减压浓缩得BB-3的盐酸盐。MS-ESI m/z:294.31[M+H] +.
参考例4
合成路线：
步骤1：中间体BB-4-2的合成
在0-5℃和氮气保护下，将化合物BB-4-1(10g,78.67mmol)溶于二氯甲烷(120mL)和丙酮(60mL)，依次慢慢滴加氰基三甲基硅烷(12.45g,125.50mmol,15.70mL)，三甲基硅基三氟甲磺酸酯(820.00mg,3.69mmol,666.67μL)，反应混合物在25℃搅拌2小时，反应完毕后，冷却至0-5℃，加入水(200mL)稀释，乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并的有机相经饱和食盐水(100mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂。所得残余物经过柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1-5/1，体积比)分离，得到化合物BB-4-2。H NMR(400MHz,CDCl3)δ：6.83(t,J＝9.0Hz,1H),6.74(dd,J＝2.7,12.1Hz,1H),6.66-6.59(m,1H),1.65(s, 6H)。
步骤2：化合物BB-4-3的合成
在室温下和氮气保护下，将化合物BB-4-2(8g,45.40mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺(150mL)，4-硫代异氰酸酯-2-(三氟甲基)苯腈(10.36g,45.40mmol)分批加入反应液中，反应混合物在25℃搅拌12小时，加入甲醇(60mL),稀盐酸(2M,60mL),反应混合物在70℃搅拌3小时，反应完毕后，冷却至室温，加入水(500mL)稀释，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(100mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂。所得残余物经过柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1-1/1，体积比)，得到化合物BB-4-3。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ：8.03-7.94(m,1H),8.02-7.94(m,1H),8.05-7.92(m,1H),8.04-7.92(m,1H),8.15-7.89(m,1H),7.86(d,J＝1.5Hz,1H),7.82-7.79(m,1H),7.19-7.10(m,2H),6.99-6.90(m,2H),6.06(br s,1H),1.58(s,6H)。
步骤3：化合物BB-4-4的合成
在室温下和氮气保护下,将化合物BB-4-3(2g,4.72mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(50mL),依此加入叔丁基4-(2-溴乙基)哌嗪-1-甲酸酯(1.66g,5.67mmol),碳酸钾(1.31g,9.45mmol),碘化钾(784.17mg,4.72mmol)，反应混合物加热至80℃搅拌反应12小时。反应完毕后，冷却至室温，加入水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(100mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂。所得残余物经过柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1-1/1，体积比)，得到化合物BB-4-4。MS-ESI m/z:636.3[M+H] +.
步骤4：化合物BB-4-5的盐酸盐的合成
在室温下和氮气保护下,将化合物BB-4-4(2.0g,3.15mmol)溶于乙酸乙酯(50mL),盐酸乙酸乙酯(4M,3.93mL)慢慢滴加到反应混合物中，反应混合物在25℃搅拌12小时，反应完毕后，反应混合物减压浓缩得到化合物BB-4-5的盐酸盐。 1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ:8.23-8.13(m,2H),8.00(dd,J＝1.8,8.3Hz,1H),7.40(t,J＝8.9Hz,1H),7.32(dd,J＝2.4,11.4Hz,1H),7.24(br d,J＝8.8Hz,1H),4.69-4.60(m,2H),3.88-3.79(m,6H),3.75-3.65(m,4H),1.58(s,6H)。
步骤5：化合物BB-4-6的合成
在室温下和氮气保护下,将化合物BB-4-5(1.5g,2.62mmol,盐酸盐)溶于乙腈(50mL)，依次加入溴乙酸乙酯(875.85mg,5.24mmol,580.04μL)，碳酸钾(724.86mg,5.24mmol)，反应混合物加热至80℃搅拌反应5小时,反应完毕后，冷却至室温，加入水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(100mL×2)洗涤,无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂。所得残余物经过柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1-1/1，体积比)，得到化合物BB-4-6。MS-ESI m/z:622.2[M+H] +.
步骤6：化合物BB-4的合成
在室温下和氮气保护下,化合物BB-4-6(1.5g,2.42mmol)溶于乙醇(50mL)，氢氧化锂(1M,7.25mL)慢 慢滴加到反应混合物中，反应混合物在25℃搅拌12小时。反应完毕，反应混合物用2M盐酸调节到pH＝2-3,反应混合物减压浓缩得化合物BB-4。MS-ESI m/z:594.1[M+H] +.
参考例5
合成路线：
将化合物BB-1-1(3g,10.60mmol)和烯丙醇(1.34g,23.07mmol,1.57mL)加到二氧六环(30mL)中，将N-环己基-N-甲基-环己胺(2.48g,12.72mmol,2.70mL)，三叔丁基膦(4.29g,2.12mmol,4.97mL,含量10％)和三(二亚苄基丙酮)二钯(970.32mg,1.06mmol)缓慢加到反应中。混合物用氮气置换3次后在30℃搅拌12小时。反应液慢慢加到水(50mL)中，用乙酸乙酯萃取3次(50mL×3)，合并有机相的用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。所得残余物经过柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝0/1-3/1，体积比)，得到化合物BB-5。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:9.84(s,1H),7.60(s,1H),7.50(d,J＝8.0Hz,1H),7.33(s,1H),7.12(dd,J＝1.0,8.0Hz,1H),4.24-4.16(m,2H),3.69(d,J＝0.8Hz,2H),3.14-3.03(m,2H),2.90-2.78(m,2H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H)。
参考例6
合成路线：
步骤1：中间体BB-6-2的合成
25℃下将化合物1-氨基环丙烷-1-甲酸乙酯盐酸盐(1.0g,6.04mmol)加入到乙醇(10mL)中，开启搅拌，依次加入化合物N-苯甲基-2-氯-N-(2-氯乙基)乙胺盐酸(1.78g,6.64mmol)，N,N-二异丙基乙胺(7.88g,60.98mmol,10.62mL)。氮气保护下，加热至80℃，氮气保护下，继续搅拌12小时。反应完毕后，反应液冷却至室温，然后直接旋干，粗品加入水(20mL)，乙酸乙酯(20mL×2)萃取。合并有机相加入半饱和食盐水(10mL×2)洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，所得残余物经过柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1–1/1，体积比)分离得到中间体BB-6-2。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ：7.40-7.27(m,5H),4.18(q,J＝7.20Hz,2H),3.55(s,2H),3.02(s,4H),2.40(s,4H),1.28-1.34(m,5H),0.94(q,J＝3.6Hz,2H)。
步骤2：中间体BB-6-3的合成
25℃下将中间体BB-6-2(0.3g,1.04mmol)加入到乙醇(20mL)，开启搅拌，依次加入化合物氢氧化钾(583.66mg,10.40mmol)，加热至120℃，继续搅拌12小时。反应完毕后，反应液冷却至室温，旋干。然后加入水(40mL)，乙酸乙酯(40mL×2)萃取。水相加入4M稀盐酸调节pH至3，然后加入乙酸乙酯(40mL)萃取，产物在水相里，收集水相冻干。得到化合物BB-6-3。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.70(s,1H),7.59(s,2H),7.45(s,3H),4.26(s,2H)，3.46(t,J＝12.4Hz,2H)，3.21(d,J＝11.6Hz,2H)，2.94(d,J＝12.8Hz,2H)，2.83(s,2H)，1.16(s,2H)，0.94(s,2H)。
步骤3：化合物BB-6-4的合成
25℃下，将中间体BB-6-3加入到N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，开启搅拌，依次加入化合物BB-2(938.21mg,3.84mmol)，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(2.19g,5.76mmol)，三乙胺(1.55g,15.37mmol,2.14mL)。氮气保护下，继续搅拌12小时。反应完毕后，反应液加入水(50mL)，乙酸乙酯(50mL×2)萃取，合并有机相，加入半饱和食盐水(50mL)洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，所得残余物经过柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1–0/1，体积比)分离得到中间体BB-6-4。MS-ESI m/z::487.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：10.91(s,1H),9.92(s,1H),7.95(s,1H),7.88(s,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,1H),7.41(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),7.35-7.28(m,4H),7.27-7.22(m,1H),4.12(dd,J＝12.0,4.8Hz,1H),3.50(s,2H),3.40-3.30(m,2H),2.89(s,2H),2.83-2.74(m,1H),2.73(s,2H),2.61-2.60 (m,1H),2.56-2.55(m,2H),2.34-2.20(m,1H),2.14-2.10(m,1H),1.08-1.06(m,4H)。
步骤4：化合物BB-6的合成
25℃下将化合物BB-6-4(50mg,97.91μmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，氩气保护下加入湿钯碳(5mg,10.28μL)，氢气置换3次，保持压力在40Psi，反应液加热至30℃，氢气氛围中，搅拌12小时。反应完毕后，反应液冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂得到化合物BB-6。MS-ESI m/z:397.1[M+H] +.
参考例7
合成路线：
步骤1：化合物BB-7-2的合成
25℃下将化合物亚磷酸三苯酯(48.42g,156.06mmol,41.04mL)溶于二氯甲烷(250mL)中，在氮气氛围下，降温至-70℃，滴加液溴(27.21g,170.25mmol,8.78mL)，加完后依次滴加三乙胺(18.66g,184.44mmol,25.67mL)和化合物BB-7-1(25.00g,141.88mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液，加完后缓慢升温至25℃，搅拌12小时。反应完毕，向反应液中缓慢倒入饱和的亚硫酸钠水溶液(400mL)中，搅拌10分钟，用二氯甲烷萃取(200mL×3)，有机相用饱和食盐水洗涤(100mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂为纯石油醚)纯化。得到化合物BB-7-2。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:7.48(d,J＝8.78Hz,1H),6.75(dd,J＝8.53,2.51Hz,1H),6.68(d,J＝2.76Hz,1H),6.30(t,J＝4.77Hz,1H),3.82(s,3H),2.82(t,J＝8.03Hz,2H),2.35(td,J＝8.03,5.02Hz,2H)。
步骤2：化合物BB-7-3的合成
25℃下将化合物BB-7-2(10.00g,41.82mmol)溶于甲苯(100mL)中，氮气保护下降温至0℃，分批 加入二氯二氰基苯醌(10.44g,46.00mmol)，加完后25℃下反应15小时。向反应液中滴加饱和亚硫酸钠水溶液(200mL)淬灭反应，搅拌10分钟后加1N的氢氧化钠水溶液(100mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤(100mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。所得粗品经石油醚(50mL)打浆10分钟，过滤，滤饼用石油醚(25mL×2)淋洗，滤液旋干，粗品经柱层析(洗脱剂为纯石油醚)纯化。得到化合物BB-7-3。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.13(d,J＝9.29Hz,1H),7.67(d,J＝8.28Hz,1H),7.61(d,J＝7.28Hz,1H),7.21–7.26(m,2H),7.11(d,J＝2.51Hz,1H),3.92(s,3H)。
步骤3：化合物BB-7-4的合成
25℃下将化合物BB-7-3(4.90g,20.67mmol)溶于二氯甲烷(50mL)，降温至0℃，缓慢滴加三溴化硼(6.21g,24.80mmol,2.39mL)，加完后25℃下搅拌3小时。将反应液倒入冰水(250mL)淬灭反应，用二氯甲烷(100mL)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤(100mL×1)，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。得到化合物BB-7-4。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.19(d,J＝9.03Hz,1H),7.63–7.73(m,2H),7.26–7.32(m,1H),7.23(dd,J＝9.03,2.51Hz,1H),7.19(d,J＝2.51Hz,1H)。
步骤4：化合物BB-7-5的合成
20℃下将化合物BB-7-4(2.50g,11.21mmol)溶于甲烷磺酸(25mL)，滴加4-氯乙酰乙酸乙酯(2.77g,16.81mmol,2.27mL)，20℃下搅拌15小时。将反应液倒入冰水中(200mL)淬灭，搅拌10分钟，过滤，滤饼用水淋洗(30mL×3)后旋干。得到化合物BB-7-5。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.56(d,J＝8.78Hz,1H),8.46(d,J＝9.29Hz,1H),7.71(d,J＝9.29Hz,1H),7.63(dd,J＝8.66,7.65Hz,1H),6.92(s,1H),5.39(s,2H)。
步骤5：化合物BB-7-6的合成
25℃下将化合物BB-7-5(0.10g,309.05μmol)加入到氢氧化钠(2M,1.03mL)的水溶液中，80℃搅拌3小时。反应液降温至25℃，用水(10mL)稀释，用稀盐酸(2M,水溶液)调节pH＝3，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤(10mL×1)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干。得到化合物BB-7-6。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.59(br s,1H),8.24(d,J＝8.38Hz,1H),7.96(d,J＝9.26Hz,1H),7.90(d,J＝7.50Hz,1H),7.54(dd,J＝2.8Hz,1H),7.53(s,1H),7.41(s,1H),4.08(s,2H)。
步骤6：化合物BB-7的合成
25℃下将化合物BB-7-6(1.40g,4.59mmol)溶于无水乙醇(14mL)，缓慢滴加硫酸(413.28mg,4.13mmol,224.61μL,98％浓度)后升温至80℃，搅拌12小时。将反应液减压浓缩除去溶剂，加乙酸乙酯(60mL)稀释，加饱和碳酸氢钠水溶液(60mL)，乙酸乙酯(60mL×2)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤(60mL×1)，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。加石油醚(5mL)室温打浆，搅拌10分钟后过滤，滤饼用石油醚(5mL×2)淋洗，收集滤饼并旋干。得到化合物BB-7。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.22(t,J＝8.41Hz,2H),7.78–7.85(m,2H),7.75(d,J＝9.29Hz,1H),7.41(t,J＝7.91Hz,1H),4.23(q,J＝7.03Hz,2H),4.06(s,2H),1.26(t,J＝7.15Hz,3H)。
参考例8
合成路线：
步骤1：化合物8-1的合成
将化合物BB-7(5g,15.01mmol)溶于甲苯(50mL)和水(10mL)的混合溶剂中，加入氨基甲酸叔丁酯(2.64g,22.51mmol)，磷酸钾(12.74g,60.03mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(961.96mg,1.05mmol)和2-二叔丁基膦-2,4,6-三异丙基联苯(892.16mg,2.10mmol)，氮气置换3次，升温至100℃搅拌15小时。将反应液降至室温，过滤，滤饼用乙酸乙酯(30mL×3)淋洗，滤液用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。向粗品中加入甲基叔丁基醚(50mL)，搅拌10分钟，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚(10mL×2)淋洗，收集滤饼得到化合物BB-8-1。
步骤2：化合物BB-8-2的合成
将化合物BB-8-1(4.2g,11.37mmol)和丙烯酰胺(888.93mg,12.51mmol,863.04μL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(40mL)中，氮气保护下降至0℃，滴加叔丁醇钾(2.55g,22.74mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液，升温到20℃搅拌2小时。将反应液倒入0.2N稀盐酸(200mL)中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。向粗品中加入二氯甲烷(20mL)，搅拌10分钟，过滤，滤饼用二氯甲烷(10mL)淋洗，收集滤饼得到化合物BB-8-2。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.94(s,1H),9.28(s,1H),8.04-7.96(m,3H),7.79(d,J＝9.6Hz,1H),7.55-7.51(m,2H),4.67(dd,J＝4.4Hz,12.0Hz,1H),2.93-2.84(m,1H),2.66-2.60(m,1H),2.45-2.36(m,1H),2.33-2.26(m,1H),1.49(s,9H)。
步骤3：化合物BB-8的盐酸盐的合成
将化合物BB-8-2(1g,2.54mmol)溶于乙酸乙酯(10mL)中，滴加盐酸/乙酸乙酯(4M,50.00mL)
20℃搅拌15小时。将反应液减压浓缩得到化合物BB-8的盐酸盐。
参考例9
合成路线：
步骤1：化合物BB-9-1的合成
将化合物BB-4-3(13g,30.71mmol)，碳酸钾(8.49g,61.41mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(300mL)中，加入1,2-二溴乙烷(28.84g,153.53mmol,11.58mL)，升温至80℃搅拌12小时。将反应液降至室温，加入水(1L)，用乙酸乙酯(300mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(300mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝4/1)分离得到化合物BB-9-1。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.00-7.96(m,2H),7.85-7.83(m,1H),7.14-7.04(m,3H),4.44(t,J＝6.0Hz,2H),3.71(t,J＝6.4Hz,2H),1.60(s,6H)。
步骤2：化合物BB-9的合成
将化合物BB-9-1(3g,5.66mmol)和甲胺盐酸盐(1.91g,28.28mmol)置于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入碳酸钾(11.73g,84.85mmol)，升温至50℃搅拌12小时。反应液降至室温，加入水(70mL)，用乙酸乙酯(50mL×4)萃取，有机相用饱和食盐水(70mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝50/1～10/1)分离得到化合物BB-9。
参考例10：片段BB–10
合成路线：
步骤1：化合物BB-10-2的合成
在0℃和氮气保护下，将化合物BB-10-1(5g,18.03mmol)溶于二氯甲烷(50mL)和丙酮(25mL)，依次慢慢滴加氰基三甲基硅烷(2.68g,27.04mmol,3.38mL)，三甲基硅基三氟甲磺酸酯(400.67mg,1.80mmol,325.74μL)，反应混合物在20℃搅拌2小时。反应完毕后，反应液减压除去溶剂。所得残余物经过柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0–4/1，体积比)分离，得到化合物BB-10-2。
步骤2：化合物BB-10的合成
在室温下和氮气保护下，将化合物BB-10-2(10g,29.03mmol)溶于N,N–二甲基乙酰胺(100mL)，4-硫代异氰酸酯-2-(三氟甲基)苯腈(6.62g,29.03mmol)分批加入反应液中，反应混合物在20℃搅拌3小时，加入甲醇(100mL)，稀盐酸(2M,56.32mL)，反应混合物在70℃搅拌2小时，反应完毕后，冷却至室温，加入水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂。所得残余物经过柱层析分离(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1–10/1，体积比)，得到化合物BB-10。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:7.99(d,J＝8.8Hz,1H),7.96(d,J＝1.6Hz,1H),7.84(dd,J＝2.0,8.4Hz,1H),7.22(d,J＝9.2Hz,2H),7.04(d,J＝8.8Hz,2H),3.64–3.57(m,4H),3.45–3.38(m,4H),1.58(s,6H)。
参考例11：片段BB–11
合成路线：
步骤1：化合物BB-11-2的合成
0℃和氮气保护下，将化合物BB-11-1(0.87g,5.57mmol)和化合物[(1R,4R)-4-羟基环己基]氨基甲酸叔丁酯(1.00g,4.64mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，随后加入钠氢(278.68mg,6.97mmol,60％)并在0℃下搅拌反应2小时。反应完毕后，向反应液中加入水(50mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并有机相，依次用水(50mL×3)和饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0–6/1，体积比)分离得到化合物BB-11-2。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.00(s,1H),7.56-7.47(m,1H),6.97-6.92(m,1H),6.84-6.72(m,1H),4.29-4.17(m,1H),4.13-4.08(m,1H),2.14-2.03(m,4H),1.47-1.38(m,9H),1.26-1.20(m,4H)。
步骤2：化合物BB-11-3的盐酸盐的合成
室温下，将化合物BB-11-2(2.70g,7.70mmol)溶于甲醇(5mL)中，随后加入4M氯化氢甲醇溶液(25mL)，反应混合物在室温下搅拌反应12小时。反应完毕后，减压浓缩除去溶剂得到化合物BB-11-3的盐酸盐，直接用于下一步反应。
步骤3：化合物BB-11-6的合成
室温下，将化合物BB-11-5(10.00g,57.95mmol)和4-哌啶甲醇(6.67g,57.95mmol)溶于二甲基亚砜(100mL)中，随后加入三乙胺(11.73g,115.90mmol,16.13mL)，反应混合物加热至90℃并搅拌反应12小时。反应完毕后冷却至室温，向反应液中加入水(200mL)，用二氯甲烷萃取(100mL×4)。合并有机相，依次用水(100mL×2)和饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经柱层析分离(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝1/0–20/1，体积比)，得到化合物BB-11-6。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.79(d,J＝9.2Hz,1H),7.27(d,J＝9.6Hz,1H),4.57-4.53(m,1H),4.53-4.48(m,2H),3.86(s,3H),3.30-3.24(m,2H),2.99(td,J＝1.9,12.7Hz,2H),1.81-1.66(m,3H),1.21-1.06(m,2H)。
步骤4：化合物BB-11-7的合成
室温下，将BB-11-6(2.00g,7.96mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中，随后加入2M氢氧化钠水溶液(15mL)，反应混合物在室温下搅拌反应12小时。反应完毕后，用4M盐酸调节pH值至4-5，减压浓缩除去溶剂，得到化合物BB-11-7的粗品，直接用于下一步反应。
步骤5：化合物BB-11-4的合成
室温和氮气保护下，将化合物BB-11-3的盐酸盐(7.65mmol)和化合物BB-11-7(7.65mmol,粗品)溶于N,N-二甲基甲酰胺(46mL)中，随后加入二异丙基乙基胺(1.03g,7.96mmol,1.39mL)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(3.03g,7.96mmol)并在室温下搅拌反应12小时。反应完毕后，向反应液中加入水(100mL)，用乙酸乙酯(70mL×3)萃取。合并有机相，依次用水(100mL×2)和饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经柱层析分离(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝1/0–20/1，体积比)，得到化合物BB-11-4。MS–ESI m/z:470.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.58(d,J＝8.4Hz,1H),7.85(d,J＝8.4Hz,1H),7.79(d,J＝9.6Hz,1H),7.38(d,J＝2.4Hz,1H),7.33(d,J＝9.6Hz,1H),7.13(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),4.60-4.44(m,4H),3.92-3.79(m,1H),3.32-3.27(m,2H),3.07-2.95(m,2H),2.18-2.05(m,2H),1.95-1.84(m,2H),1.81-1.68(m,3H),1.68-1.51(m,2H),1.51-1.48(m,2H),1.20-1.06(m,2H)。
步骤6：化合物BB-11的合成
室温下，将化合物BB-11-4(100.02mg,205.06μmol)溶于二氯甲烷(6mL)中，随后加入戴斯-马丁氧化剂(130.46mg,307.59μmol)并在室温下搅拌反应1小时。反应完毕后，向反应液中加入水(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0–0/1，体积比)，得到化合物BB-11。MS–ESI m/z:468.2[M+H] +。
参考例12：片段BB–12
合成路线：
步骤1：化合物BB-12-1的合成
25℃下将化合物BB-3-4(10.00g,30.01mmol)和1-叔丁氧羰基哌嗪(8.39g,45.02mmol)加到甲苯(150mL)和水(20mL)中，将三(二亚苄基丙酮)二钯(1.92g,2.10mmol)，磷酸钾(19.11g，90.04mmol)，2-二 叔丁基膦-2',4',6'-三异丙基联苯(1.78g,4.20mmol)慢慢的加到反应中，混合物用氮气置换3次后升温到100℃搅拌12小时。反应液冷却到25℃，经硅藻土过滤，滤饼用20mL乙酸乙酯洗涤。滤液加到300mL乙酸乙酯和300mL水中，水相用乙酸乙酯萃取(200mL×2)，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。粗品经经柱层析(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝50/1～5/1)分离得到化合物BB-12-1。
MS–ESI m/z:439.0[M+H] +. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.15(d,J＝9.0Hz,1H),7.74(s,1H),7.60(s,2H),7.36(dd,J＝2.5,9.0Hz,1H),7.31(d,J＝2.5Hz,1H),4.23(q,J＝7.1Hz,2H),4.04(s,2H),3.71-3.62(m,4H),3.29-3.20(m,4H),1.53(s,9H),1.28(dt,J＝7.2Hz,3H)。
步骤2：化合物BB-12-2的合成
0℃下将化合物BB-12-1(8.6g,15.86mmol)和丙烯酰胺(1.13g,15.86mmol,1.09mL)加到N,N二甲基甲酰胺(80mL)中，开启搅拌，将叔丁醇钾(2.67g,23.80mmol)分批加入到反应中，反应液用氮气置换3次后在0℃搅拌1小时。反应完毕，将反应液慢慢滴加到饱和氯化铵水溶液中(480mL)，有大量固体析出，过滤，滤饼用水洗涤2次(20mL×2)，收集滤饼减压旋干。所得粗品加到甲醇(10mL)中搅拌30分钟，过滤，滤饼用甲醇洗涤(5mL)，收集滤饼减压旋干得到化合物BB-12-2。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.96(br dd,J＝2.9,6.1Hz,1H),8.02(br d,J＝8.8Hz,1H),7.97-7.91(m,1H),7.72-7.65(m,2H),7.44-7.37(m,2H),4.62(br dd,J＝4.3,11.8Hz,1H),3.53(br s,4H),3.22-3.20(m,4H),2.93-2.83(m,1H),2.68-2.57(m,1H),2.39(dq,J＝4.3,12.5Hz,1H),2.26(br dd,J＝3.9,8.7Hz,1H),1.44(s,9H)。
步骤3：化合物BB-12的盐酸盐的合成
将化合物BB-12-2(3.4g,7.34mmol)加到乙酸乙酯(20mL)中，开启搅拌，慢慢加入盐酸乙酸乙酯溶液(4M,30mL)，反应液用氮气置换3次后在25℃搅拌12小时。反应完毕，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤(5mL×2)，收集滤饼减压旋干得到化合物BB-12的盐酸盐。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.96(s,1H),9.65(br s,2H),8.07(br d,J＝9.3Hz,1H),7.96(s,1H),7.75-7.69(m,2H),7.53(d,J＝2.3Hz,2H),7.45(dd,J＝2.4,9.2Hz,1H),4.64(br dd,J＝4.4,11.9Hz,1H),3.54(br d,J＝5.0Hz,4H),3.28(br s,4H),2.94-2.82(m,1H),2.67-2.58(m,1H),2.39(br dd,J＝4.0,12.5Hz,1H),2.30-2.17(m,1H)。
参考例13：片段BB–13
合成路线：
步骤1：化合物BB-13-1的合成
25℃下将化合物BB-7(1.4g,4.20mmol)和1-叔丁氧羰基哌嗪(1.17g,6.30mmol)加到二氧六环(20mL)和水(4mL)中，将三(二亚苄基丙酮)二钯(269.35mg,294.14μmol)，磷酸钾(2.68g,12.61mmol)，2-二叔丁基膦-2',4',6'-三异丙基联苯(249.81mg,588.28μmol)慢慢的加到反应中，混合物用氮气置换3次后升温到100℃搅拌12小时。反应液冷却到25℃，经硅藻土过滤，滤饼用20mL乙酸乙酯洗涤。滤液加到乙酸乙(100mL)和水(100mL)中，水相用乙酸乙酯萃取(100mL×2)，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝50/1～10/1)分离得到化合物BB-13-1。MS:ESI m/z:439.0[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.17(d,J＝9.3Hz,1H),8.04(s,1H),7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.77(d,J＝9.3Hz,1H),7.53(t,J＝8.0Hz,1H),7.19(d,J＝7.3Hz,1H),4.20-4.09(m,4H),3.36-2.59(m,8H),1.45(s,9H),1.20(t,J＝7.0Hz,3H)。
步骤2：化合物BB-13-2的合成
0℃下将化合物BB-13-1(1.5g,3.26mmol)和丙烯酰胺(231.68mg,3.26mmol,224.93μL)加到N,N二甲基甲酰胺(20mL)中，开启搅拌，将叔丁醇钾(438.91mg,3.91mmol)慢慢分批加入到反应中，反应液用氮气置换3次后在0℃搅拌1小时。混合物慢慢滴加到饱和氯化铵水溶液中(75mL)，有固体析出，过滤。滤饼用水洗涤(5mL×2)，收集固体减压旋干。粗品加到5mL甲醇中搅拌15分钟，过滤，过滤用甲醇洗涤(3mL×2)，收集固体减压旋干。得到化合物BB-13-2。MS–ESI m/z:464.0[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：8.19(d,J＝9.3Hz,1H),7.97(d,J＝16.8Hz,2H),7.78(d,J＝9.0Hz,1H),7.51(br t,J＝8.0Hz,1H), 7.18(br d,J＝7.5Hz,1H),4.66(br d,J＝7.8Hz,1H),3.34(m,4H),3.17(m,4H),2.89-2.81(m,1H),2.68-2.55(m,1H),2.40(dq,J＝3.8,12.4Hz,1H),2.26(br s,1H),1.44(s,9H)。
步骤3：化合物BB-13的盐酸盐的合成
将化合物BB-13-2(0.6g,1.16mmol)加到乙酸乙酯(6mL)中，开启搅拌，将盐酸乙酸乙酯(4M,10mL)慢慢加入到反应中，反应用氮气置换3次后在25℃搅拌12小时。混合物减压旋干得到化合物BB-13的盐酸盐。MS–ESI m/z:364.0[M+H] +。
实施例1
合成路线：
在室温和氮气保护下，化合物BB-4(0.3g,505.40μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL),加入BB-2(123.44mg,505.40μmol，盐酸盐)，三乙胺(255.70mg,2.53mmol,351.72μL),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(288.25mg,758.10μmol)，反应混合物在20℃搅拌2小时，反应完毕后，加入水(50mL),用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(50mL×2)洗涤,无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂.所得残余物经过制备HPLC分离(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％盐酸)，冻干，得到目标化合物WX001。MS-ESI m/z:820.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.94(s,1H),10.61(s,1H),8.40(d,J＝8.0Hz,1H),8.29(d,J＝1.6Hz,1H),8.08(m,1H),7.93-7.92(m,2H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.49-7.43(m,3H),7.40(d,J＝2.4Hz,1H),4.59(s,2H),4.15-4.11(m,1H),3.62-3.54(m,6H),2.90-2.51(m,8H),2.25-2.15(m,2H),1.52(s,6H).
实施例2
合成路线：
将化合物BB-4(100mg,168.47μmol)和中间体BB-1(47.29mg,168.47μmol)的盐酸盐加到N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，将2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(96.08mg,252.70μmol)和三乙胺(34.09mg,336.93μmol,46.90μL)慢慢的加到反应中，混合物用氮气置换3次后在25℃搅拌12小时。反应液倒入20mL水和30mL乙酸乙酯中，分出有机相用水洗涤2次(20mL×2)，收集有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干，所得残余物经制备HPLC分离(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％盐酸))得到化合物WX002。MS-ESI m/z:820.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.90(s,1H),10.47(br s,1H),8.40(d,J＝8.3Hz,1H),8.28(d,J＝1.5Hz,1H),8.13-7.97(m,2H),7.87(s,1H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),7.47-7.29(m,3H),7.26-7.13(m,1H),4.54(br s,2H),4.12(dd,J＝4.8,11.8Hz,1H),3.67-3.45(m,2H),2.83-2.67(m,2H),2.63-2.43(m,10H),2.39-2.25(m,1H),2.19-2.03(m,1H),1.52(s,6H)。
实施例3
合成路线：
室温和氮气保护条件下，将BB-3的盐酸盐(378mg,1.08mmol)和BB-4(767.86mg,1.29mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)溶剂中，分别向其中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(614.82mg,1.62mmol)和三乙胺(272.70mg,2.69mmol)反应混合物在25℃下搅拌3小时。反应完毕后，向反应液 中加入水(50mL)，用乙酸乙酯(100mL×2)萃取。合并有机相，依次用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经制备HPLC分离(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％盐酸)，得到目标化合物WX003。MS-ESI m/z:870.1[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.96(s,1H),10.73(s,1H),8.41-8.40(m,2H),8.39(d,J＝1.6Hz,1H),8.08(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(dd,J＝1.6,8.4Hz,1H),8.01(s,1H),7.78(s,3H),7.75(d,J＝2.0Hz,1H),7.46-7.37(m,2H),7.23(d,J＝8.8Hz,1H),4.68(dd,J＝4.0,11.2Hz,1H),4.58(s,2H),3.98(m,1H),3.47(s,9H),2.95-2.58(m,3H),2.49-2.21(m,3H),1.52(s,6H)。
实施例4
合成路线：
步骤1：WX004-1的合成
将化合物BB-5(102.38mg,393.35μmol)和BB-4-5(150mg,262.23μmol,145.82μL,盐酸盐)加到二氯甲烷(10mL)中，将三乙胺(53.07mg,524.46μmol,73.00μL)慢慢加到反应中，混合物在25℃搅拌0.5小时，将醋酸硼氢化钠(138.94mg,655.58μmol)慢慢加入到反应中，混合物氮气置换3次后在25℃搅拌11.5小时。反应慢慢加入50mL水中，用二氯甲烷萃取3次(50mL×3)，合并有机相减压旋干。所得残余物经过柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝1/0-5.7/1，体积比)纯化得到化合物WX004-1。MS-ESI m/z:780.1[M+H] +.
步骤2：WX004的合成
0℃将化合物WX004-1(280mg,309.14μmol)和丙烯酰胺(26.37mg,370.97μmol,25.60μL)加到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，将叔丁醇钾(173.45mg,1.55mmol)慢慢分批加到反应中，混合物氮气置换3次后在0℃搅拌1小时。反应慢慢加入到饱和氯化铵的溶液中，用乙酸乙酯萃取2次(20mL×2)，合并有机相用饱和食盐水洗涤2次(20mL×2)，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。所得残余物经制备HPLC分离(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)，得到目标化合物WX004。MS-ESI m/z:805.4[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：10.89(s,1H),8.40(d,J＝8.3Hz,1H),8.28(d,J＝1.0Hz,1H),8.07(dd,J＝1.4,8.2Hz,1H),7.85(d,J＝6.8Hz,1H),7.53(dd,J＝4.0,7.8Hz,1H),7.49-7.32(m,3H),7.21(br d,J＝8.8Hz,1H),7.15(dd,J＝5.5,7.3Hz,1H),4.53(br d,J＝1.0Hz,2H),4.12(dd,J＝4.9,11.9Hz,1H),3.83-3.62(m,5H),3.27-3.06(m,2H),2.84-2.65(m,3H),2.57(br dd,J＝4.1,17.2Hz,4H),2.49-2.42(m,2H),2.40-2.26(m,1H),2.19-2.01(m,3H),1.52(s,6H)。
实施例5
合成路线：
步骤1：中间体WX005-1的合成
室温下，将BB-4-3(1.00g,2.36mmol)和溴乙醛缩二乙醇(512.01mg,2.60mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，向其中加入碳酸钾(391.73mg,2.83mmol)，反应混合物在80℃氮气保护下搅拌反应12小时。反应完毕后，冷却至室温，向混合物加入水(50mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并有机相，依次用饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经过柱层析 分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0–3/1，体积比)，得到中间体WX005-1。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.01-7.94(m,2H),7.84(dd,J＝2.0,8.4Hz,1H),7.16-7.10(m,1H),7.09-7.00(m,2H),4.88(t,J＝5.2Hz,1H),4.13(d,J＝5.2Hz,2H),3.86-3.76(m,2H),3.72-3.62(m,2H),1.59(s,6H),1.27(t,J＝7.0Hz,6H).
步骤2：中间体WX005-2的合成
室温下，将WX005-1(500.00mg,926.71μmol)溶于乙醇(20mL)中，向其中加入乙酸(5.25g,87.42mmol)和盐酸(1M,2.5mL)，反应混合物在80℃氮气保护下搅拌反应12小时。反应完毕后，冷却至室温，减压浓缩除去溶剂(乙醇)，向混合物加入水(30mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机相，依次用饱和食盐水(30mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。所得残余物经过柱层析分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0–1/1，体积比)，得到中间体WX005-2。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:9.92(s,1H),8.02-7.92(m,2H),7.84(dd,J＝2.0,8.0Hz,1H),7.19-7.10(m,1H),7.10-7.01(m,2H),4.74(s,2H),1.60(s,6H).
步骤3：化合物WX005的合成
25℃下将化合物WX005-2(40mg,85.94μmol)加入到二氯甲烷(10mL)中，开启搅拌，然后加入化合物BB-6(36.80mg,77.35μmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(54.65mg,257.83μmol)。氮气保护下，继续搅拌12小时。反应完毕后，反应液加入水(50mL)，乙酸乙酯(50mL×2)萃取，合并有机相加入半饱和食盐水(50mL×2)洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥后过滤，旋干。所得残余物经制备HPLC分离(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)，得到目标化合物WX005。ESI m/z:846.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：10.89(s,2H)，9.77(s,1H)，8.39(d,J＝8.4Hz,1H)，8.27(d,J＝1.25Hz,1H)，8.07(d,J＝8.4Hz,1H)，7.96(d,J＝1.2Hz,1H)，7.88(s,1H)，7.51-7.56(m,1H)，7.44-7.50(m,1H)，7.35-7.44(m,2H)，7.21-7.23(m,1H)，4.61(s,2H)，4.11(dd,J＝12.0,4.8Hz,1H)，3.5-3.60(m,4H)，3.50-3.51(m,2H)，2.93-3.02(m,2H)，2.80-2.90(m,2H)，2.70-2.79(m,1H)，2.55-2.68(m,1H)，2.22-2.35(m,1H)，2.06-2.19(m,1H)，1.51(s,6H)，1.14-1.21(m,2H)，1.08-1.10(m,2H)。
实施例6
合成路线：
步骤1：化合物WX006-1的合成
将化合物BB-9(71.00mg,499.50μmol,66.36μL)和化合物2-甲酰基-1-环丙羧酸乙酯(0.2g,416.25μmol)溶于二氯甲烷(4mL)和冰乙酸(0.1mL)的混合溶剂中，20℃加入三乙酰氧基硼氢化钠(132.33mg,624.38μmol)，20℃搅拌15小时。向反应液中加入水(2mL)，搅拌10分钟，加入饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)，用二氯甲烷(5mL×4)萃取，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。经板层析分离纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物WX006-1。
步骤2：化合物WX006-2的合成
将化合物WX006-1(0.11g,181.33μmol)溶于四氢呋喃(2mL)和水(0.4mL)的混合溶剂中，加入一水合氢氧化锂(38.05mg,906.65μmol)，20℃搅拌15小时。向反应液中加入乙酸乙酯(5mL)，用1N的氢氧化锂水溶液(2mL×5)洗涤，水相用1N稀盐酸调节pH＝4-5，用二氯甲烷(5mL×3)萃取，有机相直接用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到化合物WX006-2。
步骤3：化合物WX006的合成
将化合物WX006-2(90mg,155.55μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(88.72mg,233.33μmol)和N,N-二异丙基乙胺(100.52mg,777.77μmol,135.47μL)，搅拌10分钟后加入化合物BB-8的盐酸盐(54.94mg,186.66μmol)，20℃搅拌60小时。反应液经制备HPLC(流动相：乙腈/水；中性体系)分离纯化后得到化合物WX006。 1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ:8.15-8.13(m,2H),8.06-8.05(m,1H),7.98(t,J＝10Hz,2H),7.84(s,1H),7.69(d,J＝9.2Hz,1H),7.58-7.55(m,2H),7.29-7.19(m,2H),7.10-7.08(m,1H),4.65-4.61(m,1H),4.33(t,J＝5.2Hz,2H),3.07(t,J＝4.8Hz,2H),2.92-2.84(m,1H),2.77-2.70(m,2H),2.61-2.58(t,1H),2.55(s,3H)2.46-2.42(m,2H),1.94-1.91(m,1H),1.67-1.65(m,1H),1.52(s,6H),1.35-1.31(m,1H),0.95-0.90(m,1H)。
实施例7
合成路线：
步骤1：化合物WX007-1的合成
将化合物WX007-2(0.5g,3.47mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，反应液降至0℃，向反应液中分批加入戴斯-马丁氧化剂(2.94g,6.94mmol,2.15mL)，缓慢升温至20℃搅拌2小时。将反应液倒入0-10℃的饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)和10％的硫代硫酸钠的水溶液(30mL)中，用二氯甲烷(10mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤得到化合物WX007-3的溶液。将化合物WX007-3的溶液和化合物BB-9(1.4g,2.91mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和冰乙酸(0.1mL)中，20℃加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.24g,5.83mmol)并搅拌12小时。向反应液中加入水(50mL)，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1～0/1)纯化得到化合物WX007-1。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.00-7.96(m,2H),7.85(dd,J＝1.6Hz,8.4Hz,1H),7.14-7.02(m,3H),4.21-4.18(m,2H),4.13(q,J＝7.2Hz,2H),2.98-2.90(m,2H),2.78(s,2H),2.41(s,3H),1.59(s,6H),1.29-1.23(m,5H),0.88-0.85(m,2H)。
步骤2：化合物WX007-4的合成
将化合物WX007-1(0.53g,873.68μmol)溶于四氢呋喃(5mL)和水(1mL)中，加入一水合氢氧化锂(183.30mg,4.37mmol)，20℃搅拌24小时。升温至40℃搅拌24小时。将反应液用1N盐酸调节pH＝6～7，旋出大部分四氢呋喃，加入甲基叔丁基醚(30mL)和10％的碳酸钾水溶液(20mL×3)，分液，水相用1N 盐酸调节pH＝5～6，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干得到化合物WX007-4。
步骤3：化合物WX007的合成
将化合物WX007-4(50mg,86.42μmol)和N,N-二异丙基乙胺(44.68mg,345.68μmol,60.21μL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，20℃加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(39.43mg,103.70μmol)并搅拌5分钟，加入化合物BB-8的盐酸盐(34.30mg,103.70μmol)，20℃搅拌12小时。反应液减压浓缩除去溶剂得到粗品，粗品经制备HPLC(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)分离纯化后，得到化合物WX007。 1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ:8.17-8.15(m,3H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.87-7.84(m,2H),7.74(d,J＝9.6Hz,1H),7.62(t,J＝7.6Hz,1H),7.45(d,J＝7.2Hz,1H),7.28-7.25(m,2H),7.12(d,J＝8.8Hz,1H),4.65(dd,J＝5.6Hz,11.2Hz,1H),4.52(t,J＝4.4Hz,2H),3.90(dd,J＝4.0Hz,13.2Hz,1H),3.83-3.79(m,1H),3.65-3.61(m,1H),3.32-3.29(m,1H),3.08(s,3H),2.94-2.85(m,1H),2.77-2.72(m,1H),2.53-2.43(m,2H),1.92-1.84(m,2H),1.53(s,6H),1.48-1.45(m,1H),1.39-1.35(m,1H)。
实施例8
合成路线：
步骤1：化合物WX008-2的合成
将化合物WX008-1(100g,460.70mmol)和乙酰氯(54.25g,691.05mmol,49.31mL)溶于二氯甲烷(1000mL)中，氮气置换并保护，20℃下分批加入三氯化铝(92.15g,691.05mmol,37.76mL)，反应液搅拌2小时。将反应液倒入冰的6N盐酸(400mL)中，用二氯甲烷(700mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(700mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到的粗品经甲醇(500mL)打浆搅拌15分钟，过滤，用甲醇(100mL×2)淋洗滤饼，收集滤饼得到化合物WX008-2。
步骤2：化合物WX008-3的合成
将WX008-2(20g,77.19mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中，降温至-70℃，滴加三溴化硼(17.40g,69.47mmol,6.69mL)，慢慢升温至20℃搅拌1小时。将反应液倒入4N盐酸(100mL)中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥过滤，旋干，所得残留物经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝7/1)分离得到化合物WX008-3。
步骤3：化合物WX008-4的合成
将化合物WX008-3(13.84g,56.47mmol)溶于氯仿(70mL)和乙酸乙酯(70mL)中，加入溴化铜(25.23g,112.95mmol,5.29mL)，升温至90℃搅拌16小时。将反应液降至室温，过滤，用二氯甲烷(110mL)淋洗滤饼，得到化合物WX008-4的二氯甲烷溶液。
步骤4：化合物WX008-5的合成
在0℃，将三乙胺(11.43g,112.97mmol,15.72mL)缓慢滴加至化合物WX008-4的二氯甲烷溶液中，滴加完毕，升温至20℃，搅拌2小时。用饱和氯化铵水溶液(100mL×3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，得到化合物WX008-5的二氯甲烷溶液。
步骤5：化合物WX008-6的合成
在WX008-5的二氯甲烷溶液中加入甲苯(150mL)和乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦(23.62g,67.79mmol)，升温至130℃，用分水器分离低沸点溶剂，搅拌12小时。降至室温，直接减压浓缩得到粗品。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)分离得到化合物WX008-6。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.70(s,1H),7.60(s,1H),7.05(s,1H),4.20(q,J＝7.2Hz,2H),3.95(s,3H),3.67(s,2H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤6：化合物WX008-7的合成
将化合物WX008-6(4g,12.77mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，降温至-70℃，滴加三溴化硼(3.36g,13.41mmol,1.29mL)，保温搅拌0.5小时，慢慢升温至0℃搅拌1小时。降至-70℃，补加三溴化硼(3.36g)，慢慢升温至0℃搅拌1小时。将反应液倒入1N盐酸(50mL)中，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)分离得到化合物WX008-7。
步骤7：化合物WX008-8的合成
将化合物WX008-7(1.8g,6.02mmol)和碳酸钾(1.83g,13.24mmol)置于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入2-溴-1,1-二甲氧基乙烷(1.22g,7.22mmol,847.58μL)，升温至100℃搅拌12小时。将反应液降至室温，加入水(50mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)分离得到化合物WX008-8。
步骤8：化合物WX008-9的合成
将化合物WX008-8(1.84g,4.75mmol)置于甲苯(20mL)中，加入多聚磷酸(1.84g,8.74mmol)，升温至100℃搅拌12小时。将反应液降至室温，加入水(30mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)分离得到化合物WX008-9。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:7.81(d,J＝2.4Hz,1H),7.71(m,1H),7.66(s,1H),7.13(d,J＝2.0Hz,1H),4.20(q,J＝7.2Hz,2H),3.85(d,J＝0.8Hz,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤9：化合物WX008-10的合成
将化合物WX008-9(700mg,2.17mmol)，2-二叔丁基膦-2',4',6'-三异丙基联苯(128.78mg,303.28μmol)，氨基甲酸叔丁酯(304.53mg,2.60mmol)，磷酸钾(1.84g,8.67mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(138.86mg,151.64μmol)置于甲苯(10mL)和水(2mL)中，氮气置换并保护，升温至100℃搅拌6小时。将反应液降至室温，加入水(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。向粗品中加入正庚烷(10mL)并搅拌15分钟，过滤，用正庚烷(3mL×3)淋洗滤饼，收集滤饼得到化合物WX008-10。
步骤10：化合物WX008-11的合成
将化合物WX008-10(760mg,2.11mmol)和丙烯酰胺(165.35mg,2.33mmol,160.53μL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，20℃加入叔丁醇钾(498.34mg,4.44mmol)，20℃搅拌1小时。将反应液倒入0-10℃的1N盐酸(20mL)中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)分离得到化合物WX008-11。
步骤11：化合物WX008-12的盐酸盐的合成
将化合物WX008-11(240mg,624.38μmol)置于乙酸乙酯(1mL)中，加入盐酸/乙酸乙酯(4M,10mL)，20℃搅拌3小时。将反应液直接减压浓缩得到化合物WX008-12的盐酸盐。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.94(s,1H),8.16(d,J＝2.0Hz,1H),7.87(s,1H),7.26(s,1H),7.09(d,J＝2.0Hz,1H),4.29(dd,J＝4.8Hz,12.0Hz,1H),2.86-2.77(m,1H),2.68-2.58(m,1H),2.34-2.22(m,1H),2.19-2.14(m,1H)。
步骤12：化合物WX008的合成
将化合物BB-4(125.29mg,211.07μmol)和N,N-二异丙基乙胺(90.93mg,703.57μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，20℃加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(86.94mg,228.66μmol)并搅拌5分钟。20℃加入化合物WX008-12的盐酸盐(50mg,175.89μmol)并搅拌12小时。将反应液直接减压浓缩。粗品经制备HPLC(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)分离纯化后，得到化合物WX008。 1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ:8.19(s,1H),8.17-8.15(m,2H),7.98(dd,J＝1.6Hz,8.0Hz,1H),7.91(d,J＝2.0Hz,1H),7.81(s,1H),7.40-7.35(m,1H),7.32(dd,J＝2.4Hz,11.6Hz,1H),7.25-7.22(m,1H),7.02(d,J＝2.0Hz,1H),4.60-4.58(m,2H),4.29(dd,J＝5.2Hz,11.6Hz,1H),3.92(s,2H),3.77-3.69(m,6H),3.42(m,4H),2.92-2.83(m,1H),2.79-2.73(m,1H),2.44-2.30(m,2H),1.57(s,6H)。
实施例9
合成路线：
化合物WX009的合成
将化合物BB-4(200mg,336.93μmol)和BB-8的盐酸盐(133.73mg,404.32μmol)加到N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，将2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(256.22mg,673.86μmol)和N,N-二异丙基乙胺(130.64mg,1.01mmol)慢慢的加到反应中，混合物用氮气置换3次后在20℃搅拌12小时。反应液倒入10mL水和10mL乙酸乙酯中，分出有机相用水洗涤3次(10mL×3)，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。粗品经制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)得到化合物WX009。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.95(s,1H),10.69-10.37(m,1H),8.39(d,J＝8.0Hz,1H),8.27(d,J＝1.5Hz,1H),8.17-7.97(m,4H),7.86(d,J＝9.3Hz,1H),7.68-7.54(m,2H),7.49-7.33(m,2H),7.22(br d,J＝8.0Hz,1H),4.70(br dd,J＝4.3,11.8Hz,1H),4.66-4.46(m,2H),4.28-3.98(m,2H),3.81-3.61(m,10H),3.00-2.81(m,1H),2.72-2.60(m,1H),2.47-2.37(m,1H),2.35-2.21(m,1H),1.51(s,6H)。
实施例10
合成路线：
步骤1：化合物WX010-1的合成
室温下将化合物BB-3-4(2g,6.00mmol)加入到二氧六环(20mL)的溶剂中，开启搅拌，加入化合物联硼酸频那醇酯(2.29g,9.00mmol)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(439.23mg,600.28μmol)和醋酸钾(1.18g,12.01mmol)，反应液升温至100℃，氮气保护下，搅拌12小时。反应完毕后，反应液冷却至室温，加入水(30mL)，乙酸乙酯(30mL×2)萃取。合并有机相加入半饱和食盐水(30mL×2)洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥后过滤，旋干，所得粗品经过柱层析分离(洗脱剂，石油醚：乙酸乙酯＝1/0～4/1)纯化得到化合物WX010-1。MS–ESI m/z:380.9[M+H] +. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.47(s,1H),8.19(d,J＝8.5Hz,1H),7.94(d,J＝8.3Hz,1H),7.83-7.75(m,2H),7.65(d,J＝9.0Hz,1H),4.23(q,J＝7.1Hz,2H),4.09-4.09(m,1H),4.08(s,1H),1.41(s,12H),1.30-1.25(m,3H)。
步骤2：化合物WX010-2的合成
室温下将化合物WX010-1(2.3g,6.05mmol)加入到四氢呋喃(40mL)和水(20mL)的混合溶剂中，开启搅拌，加入化合物碳酸氢钠(1.02g,12.10mmol,470.52μL)，反应液降温至0℃，将双氧水(5.49g,48.39mmol,4.65mL,30％浓度)缓慢滴加至反应液中，氮气保护下，继续搅拌2小时。反应液在冰浴下缓慢滴加饱和亚硫酸钠水溶液(50mL)滴加完毕后，继续搅拌10分钟。在加入乙酸乙酯(100mL×2)萃取。有机相加入无水硫酸钠干燥后，过滤，旋干。粗品经过柱层析(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝8/1～4/1)分离纯化得到化合物WX010-2。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ：8.13(d,J＝8.9Hz,1H),7.74(s,1H),7.64-7.51(m,2H),7.29(d,J＝2.6Hz,1H),7.18(dd,J＝2.6,8.9Hz,1H),4.23(q,J＝7.1Hz,2H),4.05(d,J＝0.9Hz,2H),1.31-1.22(m,3H)。
步骤3：化合物WX010-3的合成
将化合物WX010-2(400mg,1.33mmol)和1,5-二溴戊烷(1.53g,6.64mmol,897.79μL)加到N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，开启搅拌，将碳酸钾(550.41mg,3.98mmol)和碘化钠(198.99mg,1.33mmol)慢慢加入到反应中，混合物用氮气置换3次后在80℃搅拌10小时。反应液冷却到25℃，往里面加入乙酸乙 酯(30mL)和水(30mL)，分出有机相用饱和食盐水洗涤2次(30mL×2)。收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干，所得粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝50/1～10/1)分离纯化得到化合物WX010-3。MS–ESI m/z:418.9[M+H] +. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ:8.06(d,J＝9.0Hz,1H),7.66(s,1H),7.53(s,2H),7.25-7.10(m,3H),4.17-4.08(m,3H),4.03(t,J＝6.3Hz,2H),3.96(s,2H),3.39(t,J＝6.8Hz,2H),1.97-1.86(m,2H),1.85-1.77(m,2H),1.69-1.57(m,3H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤4：化合物WX010-4的合成
将化合物BB-10(200mg,422.37μmol)和WX010-3(177.11mg,422.37μmol,72.61μL)加到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，开启搅拌，将碳酸钾(175.12mg,1.27mmol)和碘化钾(70.12mg,422.37μmol)慢慢加入到反应中，反应液用氮气置换3次后在80℃搅拌12小时。反应液冷却到室温，用乙酸乙酯(30mL)稀释，有机相用水洗涤2次(20mL×2)，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。所得粗品经柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝50/1～10/1)分离纯化得到化合物WX010-4。
MS–ESI m/z:812.3[M+H] +.
步骤5：化合物WX010的合成
0℃将化合物WX010-4(300mg,369.50μmol)和丙烯酰胺(26.26mg,369.50μmol,25.50μL)加到N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，将叔丁醇钾(82.92mg,739.00μmol)慢慢分批加到反应中，混合物氮气置换3次后在0℃搅拌1小时。反应慢慢加入到饱和氯化铵(50mL)中，用乙酸乙酯萃取2次(50mL×2)，合并有机相用饱和食盐水洗涤3次(30mL×3)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。粗品经制备HPLC(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)分离得到化合物WX010。MS–ESI m/z:837.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.23(br s,1H),10.95(s,1H),8.39(d,J＝8.3Hz,1H),8.30(d,J＝1.3Hz,1H),8.15-8.04(m,2H),7.98(d,J＝6.8Hz,1H),7.82-7.68(m,2H),7.53(d,J＝2.3Hz,1H),7.34-7.20(m,3H),7.14(br d,J＝9.0Hz,2H),4.65(br dd,J＝4.1,11.9Hz,1H),4.18-4.09(m,2H),4.03(s,1H),3.93(br s,2H),3.60(br d,J＝11.3Hz,2H),3.38-3.23(m,2H),3.22-3.04(m,4H),2.98-2.79(m,1H),2.71-2.53(m,1H),2.41(br dd,J＝3.9,12.7Hz,1H),2.31-2.17(m,1H),1.95-1.76(m,4H),1.64-1.43(m,8H)。
实施例11
合成路线：
步骤1：化合物WX011-1的合成
将化合物BB-4-3(1g,2.36mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入碳酸钾(652.86mg,4.72mmol)和2,2’-二溴二***(2.74g,11.81mmol,1.48mL)，升温到80℃搅拌30小时。向反应液中加入水(150mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化得到化合物WX011-1。
步骤2：化合物WX011-2的合成
将1-胺基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐(346.01mg,2.09mmol)和碳酸钾(577.48mg,4.18mmol,)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入化合物WX011-1(0.6g,1.04mmol)，升温至75℃搅拌15小时。向反应液中加入水(50mL)，用乙酸乙酯(15mL×2)萃取，有机相用饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化得到化合物WX011-2。
步骤3：化合物WX011-3的合成
将化合物WX011-2(0.2g,321.22μmol)溶于四氢呋喃(4mL)和水(1mL)的混合溶剂中，20℃加入一水合氢氧化锂(67.40mg,1.61mmol)，搅拌30小时。向反应液中加入水(5mL)，用1N稀盐酸调节至pH＝5，用乙酸乙酯(10mL×4)萃取，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到化合物WX011-3。
步骤4：化合物WX011的合成
将化合物WX011-3(80mg,134.55μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(76.74mg,201.82μmol)和N,N-二异丙基乙胺(69.56mg,538.20μmol,93.74μL)，搅拌10分钟，加入化合物BB-1的盐酸盐(49.10mg,174.91μmol)，20℃搅拌15小时。反应液经制备HPLC(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)分离纯化得到化合物WX011。 1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ:8.16-8.14(m,2H),7.95(dd,J＝1.6Hz,8.4Hz,1H),7.91(d,J＝1.6Hz,1H),7.71(s,1H),7.50(d,J＝8.8Hz,1H),7.30-7.22(m,3H),7.16-7.14(m,1H),4.35(t,J＝4.0Hz,2H),4.10(dd,J＝4.2Hz,11.6Hz,1H),3.99-3.97(m,2H),3.89(t,J＝2.8Hz,2H),3.47(s,2H),2.83-2.66(m,2H),2.42-2.32(m,1H),2.29-2.22(m,1H),1.81-1.78(m,2H),1.65-1.63(m,2H),1.54(s,9H).
实施例12
合成路线：
步骤1：化合物WX012-1的合成
将化合物BB-10和5-溴戊酸乙酯(662.33mg,3.17mmol,505.59μL)加到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，开启搅拌，将碳酸钾(262.69mg,1.90mmol)和碘化钠(94.97mg,633.56μmol)慢慢加入到反应中，反应液用氮气置换3次后在80℃搅拌12小时。反应完毕，冷却到25℃，用乙酸乙酯(20mL)稀释，有机相用水洗涤2次(20mL×2)，用饱和食盐水洗涤1次(20mL)，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝50/1～10/1)分离纯化得到化合物WX012-1。MS–ESI m/z:602.1[M+H] +.
步骤2：化合物WX012-2的合成
将化合物WX012-1(170mg,282.54μmol)加到无水乙醇(2.5mL)和水(0.5mL)中，开启搅拌，将一水合氢氧化锂(29.64mg,706.35μmol)慢慢加入到反应中，反应液用氮气置换3次后在25℃搅拌12小时。反应完毕，反应液加入水(10mL)，减压旋掉大部分的有机溶剂，水相用2N盐酸调至pH＝3，水相直接冻干。得到化合物WX012-2。MS–ESI m/z:574.0[M+H] +.
步骤3：化合物WX012的盐酸盐的合成
将化合物BB-3的盐酸盐(54.30mg,139.46μmol)加到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，将2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(165.71mg,435.82μmol)和三乙胺(52.92mg,522.99μmol,72.79μL)慢慢加到反应中，混合物氮气置换3次后在25℃搅拌3小时。反应用乙酸乙酯(30mL)稀释， 有机相用水洗涤2次(20mL×2)，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干的粗品经制备HPLC(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)分离得到化合物WX012的盐酸盐。MS–ESI m/z:850.4[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.95(s,1H),10.54(br d,J＝4.5Hz,1H),10.29(s,1H),8.48-8.35(m,2H),8.29(d,J＝1.3Hz,1H),8.18-8.04(m,2H),7.99(s,1H),7.79-7.69(m,3H),7.28-7.21(m,2H),7.14(d,J＝9.0Hz,2H),4.65(br dd,J＝4.4,12.2Hz,1H),3.94(br d,J＝11.3Hz,2H),3.62(br d,J＝10.8Hz,2H),3.28-3.07(m,6H),2.95-2.80(m,1H),2.69-2.59(m,1H),2.49-2.36(m,3H),2.33-2.22(m,1H),1.92-1.77(m,2H),1.76-1.65(m,2H),1.49(s,6H)。
实施例13
合成路线：
步骤1：化合物WX013-1的合成
将化合物BB-10(0.15g,284.79μmol)和溴代丙酸乙酯(103.11mg,569.57μmol,72.61μL)加到乙腈(5mL)中，开启搅拌，将碳酸钾(78.72mg,569.57μmol)和碘化钾(47.28mg,284.79μmol)慢慢加入到反应中，反应液用氮气置换3次后在80℃搅拌2小时。反应液冷却到室温，往里面加入乙酸乙酯(50mL)和水(50mL)，分出有机相用饱和食盐水洗涤2次(30mL×2)。收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干。粗品经柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝50/1–10/1，体积比)纯化得到化合物WX013-1。MS–ESI m/z:574.0[M+H] +.
步骤2：化合物WX013-2的合成
将化合物WX013-1(0.2g,348.66μmol)加到无水乙醇(4mL)和水(1mL)中，开启搅拌，将一水合 氢氧化锂(43.89mg,1.05mmol)慢慢加入到反应中，反应液用氮气置换3次后在25℃搅拌12小时。反应减压旋掉大部分的乙醇，往里面加入20mL水。水相用2N的盐酸调至pH＝3-4，水相直接冻干。得到化合物WX013-2。MS–ESI m/z:546.0[M+H] +.
步骤3：化合物WX013的盐酸盐的合成
将化合物WX013-2(60mg,109.98μmol)和BB-3的盐酸盐加到N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，将2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(83.63mg,219.95μmol)和N,N-二异丙基乙胺(42.64mg,329.93μmol,57.47μL)慢慢的加到反应中，混合物用氮气置换3次后在20℃下搅拌12小时。反应完毕，将反应液倒入水和乙酸乙酯(10mL:10mL)的混合溶剂中，分出有机相用水洗涤3次(10mL×3)，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干的粗品经制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)得到化合物WX013的盐酸盐。MS–ESI m/z:822.3[M+H] +.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.95(s,1H),10.54(br s,1H),10.46(br s,1H),8.47-8.35(m,2H),8.29(br s,1H),8.16(br s,1H),8.08(br d,J＝8.5Hz,1H),8.00(s,1H),7.80-7.67(m,3H),7.34-7.20(m,2H),7.16(br d,J＝8.8Hz,2H),4.68(br s,1H),3.98(m,2H),3.64(m,2H),3.55(m,4H),3.23(m,2H),3.05(br s,2H),2.86(m,1H),2.67(m,1H),2.63-2.62(m,1H),2.41-2.33(m,1H),1.49(br s,6H)。
实施例14
合成路线：
化合物WX014的盐酸盐的合成
将化合物BB-11(400mg,854.80μmol)和化合物BB-12的盐酸盐(403.83mg,1.11mmol)溶于二氯甲烷(30mL)，加入醋酸硼氢化钠(543.50mg,2.56mmol)，反应混合物在氮气保护下，室温搅拌12小时。 反应完毕，加入二氯甲烷(100mL)和水(100mL)稀释反应液，有机相分离，用无水硫酸钠干燥，过滤减压浓缩有机相，所得粗品经过制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)得到化合物WX014的盐酸盐。MS–ESI m/z:815.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.97(s,1H),10.83(br s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.05(br d,J＝8.5Hz,1H),7.96(s,1H),7.91-7.84(m,2H),7.73(s,2H),7.54-7.43(m,3H),7.41-7.38(m,1H),7.16-7.11(m,1H),4.63(br dd,J＝4.0,12.0Hz,1H),4.58-4.46(m,3H),3.98-3.81(m,3H),3.66(br d,J＝11.0Hz,2H),3.43(br t,J＝12.2Hz,2H),3.28-3.05(m,6H),2.96-2.83(m,1H),2.76-2.58(m,2H),2.56-2.53(m,1H),2.46-2.37(m,1H),2.31-2.21(m,2H),2.11(br d,J＝9.0Hz,2H),2.02(br d,J＝12.0Hz,2H),1.90(br d,J＝10.5Hz,2H),1.72-1.58(m,2H),1.58-1.45(m,2H)。
实施例15
合成路线：
化合物WX015的盐酸盐的合成
将化合物BB-11(400mg,854.80μmol)和化合物BB-13的盐酸盐(403.83mg,1.11mmol)溶于二氯甲烷(30mL)，加入醋酸硼氢化钠(181.17mg,854.80μmol)，反应混合物在氮气保护下，室温搅拌12小时。反应完毕，加入二氯甲烷(100mL)和水(100mL)稀释反应液，有机相分离，用无水硫酸钠干燥，过滤减压浓缩有机相，所得粗品经制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水；酸性体系：0.05％HCl)得到化合物WX015的盐酸盐。MS–ESI m/z:815.2[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.96(s,1H),10.82(br s,1H),8.63(d,J＝8.3Hz,1H),8.17(d,J＝9.3Hz,1H),8.03(s,1H),7.96(br d,J＝5.8Hz,1H),7.86(dt,J＝9.4,15.6Hz,3H),7.60-7.51(m,2H),7.39(d,J＝2.5Hz,1H),7.27-7.22(m,1H),7.14(dd,J＝2.3,8.8Hz,1H),4.68(br dd,J＝3.9,11.9Hz,1H),4.58-4.47(m,3H),3.92-3.81(m,1H),3.69(br s,3H),3.50-3.38(m,3H),3.23-3.06(m,4H),2.98-2.81(m,1H),2.70-2.58(m,1H),2.45-2.20(m,4H),2.16-1.99(m,5H),1.91(br d,J＝10.3Hz,2H),1.71-1.58(m,2H),1.57-1.42(m,2H),1.40-1.27(m,2H)。
实施例16和实施例17
合成路线：
化合物16和化合物17的合成
将化合物BB-11(7g,14.96mmol)和化合物BB-13的盐酸盐(7.18g,17.95mmol)溶于二氯甲烷(500mL)中，室温搅拌12小时，加入醋酸硼氢化钠(4.76g,22.44mmol)，反应混合物在氮气保护下，室温搅拌12小时。反应完毕，加入水(200mL)稀释反应液，有机相分离，饱和食盐水(100mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤减压浓缩有机相，所得粗品经柱层析分离(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝10/1)得到化合物WX015，化合物WX015经过手性HPLC拆分(柱型：DAICEL CHIRALPAK IE(250mm*30mm,10μm)；流动相：A(IPA)，B(ACN)，B％：50％～100％；流速：80mL/min)得到化合物WX016和WX017。
分析方法：色谱柱：Chiralpak IA 100*4.6mm，3μm；流动相：A：正己烷(0.1％二乙胺)；B：异丙醇：乙腈＝2:1，A:B＝40:60；柱温：35℃；波长：220nm。
WX016:保留时间为4.679min，ee％:98.77％；MS–ESI m/z:815.4[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.97(s,1H),8.60(d,J＝8.3Hz,1H),8.16(d,J＝9.3Hz,1H),7.99(s,1H),7.91-7.74(m,4H),7.51(t,J＝7.9Hz,1H),7.41-7.31(m,2H),7.21-7.10(m,2H),4.66(br dd,J＝4.1,11.7Hz,1H),4.58-4.45(m,3H),3.94-3.79(m,1H),3.223.00(m,7H),2.89(ddd,J＝5.3,12.2,17.4Hz,2H),2.69-2.56(m,2H),2.47-2.33(m,2H),2.29(br d,J＝7.0Hz,3H),2.11(br d,J＝9.3Hz,2H),2.00-1.81(m,5H),1.72-1.58(m,2H),1.58-1.44(m,2H),1.26-1.09(m,2H).
WX017:保留时间为5.797min，ee％:99.86％；MS–ESI m/z:815.4[M+H] +. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝11.00(br s,1H),8.60(br d,J＝8.3Hz,1H),8.22-8.13(m,1H),8.04-7.95(m,1H),7.94-7.71(m,4H),7.57-7.47(m,1H),7.41-7.31(m,2H),7.16(br dd,J＝8.0,19.1Hz,2H),4.66(br d,J＝7.3Hz,1H),4.58-4.40(m,3H),3.87(br d,J＝7.8Hz,1H),3.28-2.97(m,7H),2.88(br t,J＝12.3Hz,2H),2.69-2.56(m,2H),2.49-2.35(m,2H),2.28(br d,J＝6.0Hz,3H),2.17-2.00(m,2H),2.00-1.79(m,5H),1.71-1.58(m,2H),1.51(q,J＝10.6Hz,2H),1.26-1.01(m,2H).
生物数据
测试例1：人***癌LNCaP细胞的AR蛋白水平及下游效应***特异性抗原(PSA)蛋白的调控的体外测试
实验目的：用WB(Western Blot，蛋白质印迹法)的方法，研究化合物在不同浓度条件下对人***癌LNCaP细胞的AR蛋白水平及下游效应***特异性抗原(PSA)蛋白的调控。
实验方案：
1)将LNCaP细胞解冻并传代至少2次；
2)将LNCaP细胞以每孔3×105个细胞接种在6孔板中，隔夜贴壁后用一定浓度的受试化合物处理；
3)处理24小时后，将培养的细胞样品上清弃去，用DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)洗涤2次，然后用一定量100℃预热的2％SDS裂解液(SDS Lysis Buffer)裂解细胞，收集后以100℃变性15分钟；
4)上述裂解液变性冷却后进行蛋白定量测试(Pierce BCA蛋白测定试剂盒，Thermo)，然后以5倍上样缓冲液(含二硫苏糖醇(DDT)，碧云天)按相同蛋白浓度定容，再以100℃还原变性10分钟；
5)通过SDS–PAGE分离上述样品(10～20μg蛋白)，并转移到PVDF膜(Biorad)上；
6)根据目的蛋白分子量裁剪条带，以封闭液(3％牛血清白蛋白TBS–T溶液，其中TBS–T溶液为含0.2％Tween–20的Tris–HCl缓冲液)封闭1小时，再用一抗(anti–AR(#5153,CST)、anti–PSA/KLK3(#5365,CST)和anti–β-actin(#4970,CST)，以封闭液分别按1:1000、1:1000和1:2000稀释配制)4℃孵育过夜；
7)最后用HRP连接的二抗(anti–rabbit IgG(#7074,CST)，以封闭液按1:2000稀释配制)室温孵育1小时，然后用化学发光底物(Clarity ECL，Biorad)检测膜上的条带。
实验结果：
测试结果如图1，图2所示。
结论：本发明化合物对AR蛋白展现出良好的降解活性，其降解能力呈现良好的浓度依赖性，本发明化合物可显著影响对应下游PSA效应变化，其影响程度呈现良好的浓度依赖性。
测试例2：在人***癌LNCaP细胞中的抗增殖作用评估
实验目的
本实验通过检测受试化合物在人***癌LNCaP细胞中对细胞增殖的抑制作用。
实验材料：
1.细胞系及培养方法
表1.细胞系及培养方法
细胞系 肿瘤类型 生长特点 培养方法
LNCaP 人***癌 贴壁 无酚红1640+10％FBS
2.培养基及试剂
表2.培养基及试剂
培养基及试剂 生产商 货号
无酚红RPMI 1640 GIBCO 11835030
Dulbecco's PBS CORNING 21-031-CVC
FBS ExCell Bio FSP500
Penicillin-Streptomycin Solution HyClone SV30010
0.25％Trypsin GIBCO 25200072
3.多孔板
Greiner 96-孔板，平底黑板(带盖及透明底),#655090。
4.细胞活性实验所用试剂及仪器
(1)Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)。
(2)2104 读板器，PerkinElmer。
实验方案
1.细胞培养
将肿瘤细胞系按上述培养条件在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。
2.细胞铺板
(1).用台盼兰进行细胞染色并计数活细胞；
(2).将细胞浓度调整至合适浓度；
表3.细胞铺板数
Cell line Density(per 96-well)
LNCaP 4500
(3).按上表所示在培养板中每孔加入90μL细胞悬液，在空白对照空中加入不含细胞的培养液；
(4).将培养板在37℃,5％CO2，及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。
3.化合物存储板制备
制备化合物起始浓度400倍浓度的母液存储板：将化合物用DMSO从最高浓度梯度稀释至最低浓度。每次现用现配。
化合物起始浓度10倍浓度的工作液的配制及化合物处理细胞
(1).在V形底的96孔板中加入78μL细胞培养液，从化合物起始浓度400倍浓度的母液存储板中吸取2
μL化合物加入96孔板的细胞培养液中。在溶媒对照和空白对照中加入2μLDMSO。加入化合物或DMSO
后用排枪吹打混匀。
(2).加药：取10μL的化合物起始浓度10倍浓度的工作液加入到细胞培养板中。在溶媒对照和空白
对照中加入10μL DMSO–细胞培养液混合液。
(3).将96孔细胞板放回培养箱中培养6天。
5.CellTiter–Glo发光法细胞活性检测
以下步骤按照Promega CellTiter–Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega–G7573)的说明书来进行。
(1).将CellTiter–Glo缓冲液融化并放置至室温；
(2).将CellTiter–Glo底物放置至室温；
(3).在一瓶CellTiter-Glo底物中加入100mL CellTiter–Glo缓冲液以溶解底物，从而配制CellTiter–Glo工作液；
(4).缓慢涡旋震荡使充分溶解；
(5).取出细胞培养板放置30分钟使其平衡至室温；
(6).在每孔中加入50μL(等于每孔中细胞培养液一半体积)的CellTiter–Glo工作液。用铝箔纸包裹细胞板以避光；
(7).将培养板在轨道摇床上振摇2分钟以诱导细胞裂解；
(8).培养板在室温放置10分钟以稳定发光信号；
(9).在2104EnVision读板器上检测发光信号。
6.数据分析
用下列公式来计算检测化合物的抑制率(Inhibition rate，IR)：IR(％)＝(RLU溶媒对照–RLU化合物)/(RLU溶媒对照–RLU空白对照)*100％.在Excel中计算不同浓度化合物的抑制率，然后用GraphPad Prism软件作抑制曲线图和计算相关参数，包括最小抑制率，最大抑制率及IC50。
实验结果：
测试结果见表4。
表4本发明化合物在LNCaP细胞系中的细胞增殖抑制作用
化合物 LNCaP IC50(nM)
WX001 332.6
WX002 46
WX003 230
WX004 25
WX005 190
WX015的盐酸盐 45
WX016 31
WX017 44
结论：本发明化合物在人***癌细胞LNCaP中展现出优异细胞增殖的抑制作用。
测试例3：人***癌LNCaP细胞皮下异种移植肿瘤CB-17 SCID模型的体内药效学研究
细胞培养
人***癌LNcap细胞(ECACC-89110211)体外单层培养，培养条件为RPMI-1640培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃5％CO2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种。
实验动物
CB-17 SCID小鼠，6-8周龄，雄性，体重18-22克。
实验方案
将0.2mL(1×107个)LNcap细胞(加基质胶，体积比为1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到约80mm3时对小鼠进行去势手术，166mm3时开始分组给药。实验动物分组及给药方案见表5。
表5.实验动物分组及给药方案
注：
1.N:每组小鼠数目
2.给药体积：根据小鼠体重10μL/g。如果体重下降超过15％，给药方案应做出相应调整。
3.BID时间间隔为8hr
肿瘤测量和实验指标
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
实验结果
测试结果见表6。
表6.化合物对LNCaP异种移植瘤模型的抑瘤效果
结论：本发明化合物在人***癌LNCaP异种移植瘤模型上展示了的显著的抑瘤作用。
测试例4：人***癌LNCaP细胞的AR蛋白水平的调控的体外测试
实验目的：用ICW方法测试化合物在LNCap细胞中对雄激素受体AR的降解作用
实验方法:
第一天
1.将细胞培养基、0.025％胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液于37℃水浴锅中预热。
2.胰蛋白酶消化的细胞用1000转离心5分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬细胞。
3.将细胞按4k/36μL/孔的密度接种于COL-Coated CellCarrier-384板中。
4.接种细胞的384细胞板放在超净台中静置10分钟。
5.将细胞板放置二氧化碳细胞培养箱中培养过夜。
第二天
1.将10mM浓度的化合物在进行倍比稀释前稀释到3mM(3μL+7μL二甲基亚砜)。
2.用Bravo仪器将化合物在Echo板中进行3倍系列稀释(4μL+8μL)。
3.设置ZPE和HPE对照孔，ZPE对照孔为二甲基亚砜。
4.将Echo板用1000转离心1分钟后，用Echo将稀释好的化合物从Echo板转移至中间板中，200nL/孔。
5.用Multidrop combi将细胞培养基加入中间板中，20μL/孔。
6.将中间板放置于水平震荡器上震荡1分钟，使化合物与培养基充分混合。
7.用Bravo将中间稀释板中的化合物转移至细胞板中，4μL/孔。
8.将细胞板放置于水平震荡器上震荡1分钟，800转离心30秒。
9.将细胞板放回二氧化碳培养箱中继续培养24小时。
第三天
1.冰箱中取出4％的多聚甲醛放至室温。
2.将细胞板从培养箱中取出。
3.细胞板中直接加入4％多聚甲醛，40μL/孔。
4.室温孵育20分钟
5.手动甩去细胞板中的培养基，倒置于离心机中，800转离心7秒，充分去除残留的培养基。
6.细胞板加入4％的多聚甲醛，25μL/孔。
7.室温孵育30分钟。
8.手动甩去细胞板中的多聚甲醛溶液，倒置于离心机中，800转离心7秒。
9.加入0.1％Trition，25μL/孔。
10.室温孵育10分钟。
11.手动甩去细胞板中0.1％的Trition溶液，倒置于离心机中，800转离心7秒。
12.加入 (PBS)Blocking Buffer，25μL/孔。
13.室温孵育1小时。
14.手动甩去细胞板中的 (PBS)Blocking Buffer溶液，倒置于离心机中，800转离心7秒。
15.加入一抗溶液，20μL/孔。细胞板置于离心机中，800转离心7秒。
16.将细胞板封膜后放置4℃孵育过夜。
第四天
1.手动甩去细胞板中的一抗溶液，倒置于离心机中，800转离心7秒。
2. 110μL PBS洗3次。
3.细胞板倒置于离心机中，800转离心7秒。
4.加入二抗和DAPI溶液，20μL/孔。细胞板置于离心机中，800转离心7秒。
5.室温孵育1小时。
6.手动甩去细胞板中的二抗和DAPI溶液，倒置于离心机中，800转离心7秒。
7.用110μL PBS洗3次后，细胞板中残留30μL PBS。
8.细胞板置于离心机中，800转离心7秒。
9.Operetta仪器扫描细胞板。
实验结果
测试结果见表4。
表7.化合物在LNCap细胞中对雄激素受体AR的降解作用
# 化合物编号 DC50(nM) Dmax
1 WX002 8.9 72.01
2 WX009 10.1 64.66
3 WX014的盐酸盐 22.4 76.22
4 WX015的盐酸盐 13.7 102.09
5 WX016 14.0 95.66
6 WX017 15.1 100.32
结论：本发明化合物对AR展现出良好的降解活性。
测试例5：In cell western分析293T AR F876L细胞中AR蛋白的表达水平
实验目的：本实验通过In Cell Western实验检测化合物WX015、WX016和WX017对细胞系293T AR F876L中点突变的AR蛋白表达水平的影响，评估化合物对AR F876L点突变蛋白的降解作用。
实验材料：
1.细胞系及培养方法
表8.细胞系及培养方法
细胞系 细胞类型 生长特点 培养方法
293T AR F876L Embryo kidney cell 贴壁生长 DMEM+10％FBS+1％AA
2.培养基及试剂
表9.培养基及试剂
培养基及试剂 生产商 货号
DMEM GIBCO 11995-065
PBS Cytiva SH30256.01
FBS Hyclone SH30084.03
Antibiotic-antimycotic GIBCO 15240-062
0.25％Trypsin GIBCO 25200072
DMSO SIGMA D2650
3.仪器
表10.仪器
仪器 供应商 Catalog#
Odyssey Gel Imaging System LI-COR CLx
二氧化碳培养箱 Thermo Scientific Heracell 2401
自动细胞计数仪 Countstar IC-1000
倒置显微镜 Nikon ECLIPSE Ts2
生物安全柜 苏净安泰 BSC-1600 A3
脱色摇床 Hm-Kylin TS-1
4.抗体
表11.抗体
实验方法:
1.细胞培养:
将细胞系在培养条件在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。
2.细胞铺板：
1)用台盼兰进行细胞染色并计数活细胞。
2)将细胞浓度调整至合适浓度，密度为20000/孔。
3)在96孔培养板中每孔加入90μL细胞悬液，在空白对照空中加入不含细胞的培养液。
4)将培养板在37℃,5％CO2,及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。
3.化合物存储板制备和In cell western检测：
1)制备400倍化合物存储板：将化合物用DMSO从最高浓度梯度稀释至最低浓度。
2)10倍化合物工作液的配制：在V形底的96孔板中加入78μL细胞培养液，从400X化合物存储板中吸取2μL化合物加入96孔板的细胞培养液中。在溶媒对照和空白对照中加入2μL DMSO。加入化合物或DMSO后用排枪吹打混匀。
3)加药：取10μL的10倍化合物工作液加入到细胞培养板中。在溶媒对照和空白对照中加入10μL DMSO-细胞培养液混合液。DMSO终浓度为0.25％。
4)将96孔细胞板放回培养箱中培养48h。
5)去除培养基，并加PBS清洗一遍；
6)加入8％***溶液(PBS稀释)，4℃孵育过夜。
7)去除8％***溶液，每孔加入150μL Licor Blocking buffer，室温放于摇床封闭1.5h；
8)倒去封闭液，每孔加入50μL用Licor Blocking buffer稀释的一抗(DMSO孔不加入一抗)，4℃过夜孵育后用PBST(含0.1％Triton-X)清洗5次，每次5min；
9)每孔加入50μL用Licor Blocking buffer稀释的二抗，室温孵育1h后用PBST(含0.1％Triton-X)清洗3次，ddH2O清洗2次，每孔再加入100μL PBS准备检测；
10)检测：倒去孔板中的PBS，Li-COR odyssey双色近红外激光成像仪检测每孔700nm的荧光信号。
4.数据分析
运用Image Studio Ver 5.2软件对免疫印迹化学发光谱带的密度强度进行相对定量。
实验结果
测试结果见表12。
表12.化合物在293T AR F876L细胞中对雄激素受体AR的降解作用
# 化合物编号 DC50(nM) Dmax
1 WX015盐酸盐 43 85
2 WX016 18 86
3 WX017 97 95
结论：本发明化合物具有较强的降解F876L点突变AR蛋白的能力。
测试例6：化合物的小鼠药代动力学评价
实验目的：
本研究受试化合物选用CB-17 SCID雄性小鼠，应用LCMS/MS法定量测定小鼠静脉注射或口服给予测试化合物和参比化合物不同时间点的血浆中的药物浓度，以评价受试药物在小鼠的药代动力学特征。实验材料：
CB-17 SCID小鼠(雄性，20-30g,7-10周龄，北京维通利华或上海斯莱克)。
实验操作：
将测试化合物的澄清溶液或混悬溶液经尾静脉注射到小鼠体内(不禁食)，或灌胃给予到小鼠(不禁食)。静脉注射给药于0h(给药前)和给药后0.083，0.25，0.5，1，2，4，8，24h从颈静脉穿刺采血， 置于添加了EDTA-K2的抗凝管中，在4℃，将混合物充分涡旋混合并在13000rpm下离心10分钟；口服灌胃给药于0h(给药前)和给药后0.5，1，2，4，6，8，24h从颈静脉穿刺采血，置于添加了EDTA-K2的抗凝管中，将混合物充分涡旋混合并在13000rpm下离心10分钟。采用LC-MS/MS法测定血药浓度，使用WinNonlinTMVersion 6.3(Pharsight,Mountain View,CA)药代学软件，以非房室型线性对数梯形法计算相关药代动力学参数。
实验结果：测试结果见表13
表13.本发明化合物在小鼠中的药代动力学参数
结论：本发明化合物在小鼠体内展示良好的成药性。
测试例7：化合物的大鼠药代动力学评价
实验目的：
本研究受试化合物选用SD雄性大鼠，应用LCMS/MS法定量测定大鼠静脉注射或口服给予测试化合物和参比化合物不同时间点的血浆中的药物浓度，以评价受试药物在大鼠的药代动力学特征。
实验材料：
SD大鼠(雄性，北京维通利华)。
实验操作：
将测试化合物的澄清溶液或混悬溶液经尾静脉注射到大鼠体内(不禁食)，或灌胃给予到大鼠(不禁食)。静脉注射给药于0h(给药前)和给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h，48h从颈静脉穿刺采血，置于添加了肝素钠的抗凝管中，血液样本采集后置于冰上，并于1小时之内离心分离血浆(离心条件：6000g，3分钟，2-8℃)；口服灌胃给药于0h(给药前)和给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h，48h从颈静脉穿刺采血，置于添加了肝素钠的抗凝管中，血液样本采集后置于冰上，并于1小时之内离心分离血浆(离心条件：6000g，3分钟，2-8℃)。采用LC-MS/MS法测定血药浓度，使用WinNonlinTMVersion 8.2.0(Pharsight,Mountain View,CA)药代学软件，以非房室型线性对数梯形法计算相关药代动力学参数。
实验结果：测试结果见表14
表14.本发明化合物在大鼠中的药代动力学参数
结论：本发明化合物在大鼠体内展示良好的成药性。
测试例8：化合物的比格犬药代动力学评价
实验目的：
本研究受试化合物选用比格犬，应用LCMS/MS法定量比格犬静脉注射或口服给予测试化合物和参比化合物不同时间点的血浆中的药物浓度，以评价受试药物在比格犬的药代动力学特征。
实验材料：
比格犬(雄性，江苏亚东实验动物研究院有限公司)。
实验操作：
将测试化合物的澄清溶液或混悬溶液经尾静脉注射到比格犬体内(正常给食)，或灌胃给予到比格犬(正常给食)。静脉注射给药于0h(给药前)和给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h，48h从前肢静脉穿刺采血，置于添加了EDTA-2K的抗凝管中，血液样本采集后置于冰上，并于1小时之内离心分离血浆(离心条件：6000g，3分钟，2-8℃)；口服灌胃给药于0h(给药前)和给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h，48h从前肢静脉穿刺采血，置于添加了EDTA-2K的抗凝管中，血液样本采集后置于冰上，并于1小时之内离心分离血浆(离心条件：6000g，3分钟，2-8℃)。采用LC-MS/MS法测定血药浓度，使用WinNonlinTMVersion 8.2.0(Pharsight,Mountain View,CA)药代学软件，以非房室型线性对数梯形法计算相关药代动力学参数。
实验结果：测试结果见表15
表15.本发明化合物在比格犬中的药代动力学参数
结论：本发明化合物在比格犬体内展示良好的成药性。

Claims (11)

  1. 式(ⅠI)所示化合物或其药学上可接受的盐，
    其中，
    PTM选自靶向结合于AR蛋白的药物或其衍生物；
    L 1选自-(CH 2) n-，所述各CH 2任选被R 1置换；
    R 1选自C 3-7环烷基、6元杂环烷基、-NR a-、-CR bR c-、-CH 2CH 2O-和-NHC(＝O)-；
    R a选自H和C 1-3烷基；
    R b、R c各自独立地选自H、D和F；
    E 1选自单键和O；
    环A不存在；
    或者环A选自苯基和5元杂芳基；
    n选自1、2、3、4、5和6；
    所述6元杂环烷基和5元杂芳基分别包含1、2或3个独立选自-NH-、-O-、-S-和N的杂原子或杂原子团；条件是，所述化合物不选自：
  2. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，PTM选自
  3. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R a选自H和CH 3。
  4. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R 1选自 -NH-、-N(CH 3)-、-CH 2CH 2O-、-NHC(＝O)-和-C(＝O)NH-。
  5. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，L 1选自
  6. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，结构单元-E 1-L 1-选自
  7. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，结构单元 选自
  8. 根据权利要求1-6任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐，其化合物选自式(I-1)、(I-2)、(II-1)、(II- 2)、(III-1)和(IV-1)所示的结构：
    其中，L 1如权利要求1-6任意一项所定义。
  9. 下式所示化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
  10. 根据权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
  11. 根据权利要求1-10任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗***癌的药物中的应用。
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