CN116925236B - 嵌合转换受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可同时识别两种免疫受体的配体抗原的嵌合转换受体及其用途。所述嵌合转换受体，包括：胞外区，所述胞外区包括第一结合片段和第二结合片段；跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连；胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。本发明的嵌合转换受体可同时识别两种免疫受体的配体抗原，表达该嵌合转换受体的免疫细胞在识别两种免疫受体的配体抗原中任意一个后，即能被激活，从而实现免疫细胞对肿瘤抗原识别的“或门”逻辑门控效应，提高了CSR‑免疫细胞的疗效。

Description

嵌合转换受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种嵌合转换受体及其应用，具体地涉及一种CSR-免疫细胞及其在肿瘤治疗领域的应用，更具体地，本发明涉及一种可同时识别两种抗原配体的嵌合转换受体及对应核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其用途。
背景技术
嵌合转换受体(CSR，Chimeric Switch Receptor)是一种人工构建的重组受体，包含胞外的抗原识别结构域、跨膜区及胞内区的信号转导结构域。与嵌合抗原受体的胞外抗原识别结构域由单链抗体构成不同，嵌合转换受体的胞外抗原识别结构域主要由免疫细胞的抑制性表面受体构成。嵌合转换受体通过识别抑制性受体的配体，从而将原有的免疫抑制性信号转变为免疫活化性信号，激活免疫细胞，触发针对表达抑制性受体配体的靶细胞的免疫应答。基于嵌合转换受体的免疫细胞疗法是肿瘤治疗领域的新兴方向。
嵌合转换受体的免疫细胞疗法在肿瘤治疗中有较好的应用前景，但疗效仍有待进一步提高。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种可同时识别两种免疫受体的配体抗原的嵌合转换受体，本发明的嵌合转换受体可同时识别两种免疫受体的配体抗原，表达该嵌合转换受体的免疫细胞在识别两种免疫受体的配体抗原中任意一个后，即能被激活，从而实现免疫细胞对肿瘤抗原识别的“或门”逻辑门控效应，解决了肿瘤免疫逃逸和肿瘤抗原异质性的问题，更有效地逆转来自肿瘤微环境抑制性信号的抑制，避免免疫细胞比如NK细胞发生免疫耗竭，有效提高了基于嵌合转换受体的免疫细胞的治疗效果。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
肿瘤具有异质性，虽然抑制性受体TIGIT的配体及抑制性受体PD-1的配体在肿瘤细胞高表达，但即便是在同一种肿瘤细胞中，也经常不同时表达，比如只有一部分肿瘤细胞表达其中一种配体、另一部分肿瘤细胞表达另一种配体的情况时有发生；同时，肿瘤逃逸机制也会导致肿瘤细胞TIGIT或PD-1的配体丢失的情况发生。因此，传统的单一嵌合抗原受体或嵌合转换受体不能对其进行有效识别、疗效有限。
为了解决上述问题，发明人大胆地提出了如下设想：在一种免疫细胞(如NK细胞或T细胞)中同时表达两种嵌合转换受体，由此得到的免疫细胞预期对上述两种情况下的肿瘤细胞均能有效识别，进而触发抗肿瘤效应、提高疗效。进一步地，发明人选择了人类抑制性受体TIGIT和人类抑制性受体PD-1的胞外结构域作为嵌合转换受体的胞外抗原识别结构域。经过大量生物信息学模拟及筛选试验，得到了两条与PD-L1和CD155结合活性良好的TIGIT、PD-1胞外截短体。
为进一步提高免疫细胞治疗效果，发明人巧妙地将TIGIT和PD-1的胞外截短体连接起来，并作为胞外抗原识别结构域，得到了同时含有两种抗原识别结构域的嵌合转换受体。
进一步的试验结果表明，经含有上述TIGIT和PD-1抗原识别结构域的嵌合转换受体基因修饰的NK细胞，能同时识别TIGIT配体和PD-1配体，可以将来自TIGIT或PD-1识别相应配体所传递的任一抑制性信号逆转为活化信号，避免肿瘤微环境中的NK细胞丧失功能或发生耗竭。进一步的动物水平试验结果表明，上述基因修饰的NK细胞可有效识别部分表达TIGIT配体或部分表达PD-1配体的肿瘤细胞，也可有效识别丢失PD-1或TIGIT其中一种受体配体的肿瘤细胞。由此，解决了肿瘤免疫逃逸和肿瘤抗原异质性的问题，提高了基于嵌合转换受体的免疫细胞的治疗效果。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种嵌合转换受体。所述嵌合转换受体包括：胞外区，所述胞外区包括第一结合片段和第二结合片段，所述第一结合片段具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述第二结合片段具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连；胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。本发明的嵌合转换受体同时具有PD-L1和CD155结合活性，表达本发明的嵌合转换受体的免疫细胞，可有效识别部分表达TIGIT配体或部分表达PD-1配体的肿瘤细胞，也可有效识别丢失PD-1或TIGIT其中一种受体配体的肿瘤细胞。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的嵌合转换受体。携带有上述核酸分子可在免疫细胞中表达本发明第一方面的嵌合转换受体，该嵌合转换受体可以在识别TIGIT配体、PD-1配体中的任意一个后，能激活所述免疫细胞，实现免疫细胞对肿瘤抗原识别的“或门”逻辑门控效应。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带本发明第二方面的核酸分子。由此，利用构建得到的表达载体表达在细胞内可有效表达得到本发明第一方面的嵌合转换受体。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体携带具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。将本发明第四方面的慢病毒载体导入受体细胞后，该受体细胞可实现本发明第一方面的嵌合转换受体的表达。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种转基因免疫细胞，所述转基因免疫细胞表达本发明第一方面的嵌合转换受体，或携带本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体或本发明第四方面的慢病毒载体。由此，获得的转基因免疫细胞可进一步用于肿瘤治疗，并且具有显著提高的肿瘤杀伤活性和有效降低的免疫细胞耗竭状态。临床上，只需要施用本发明的免疫细胞，即可有效消除因免疫逃逸和/或肿瘤抗原异质性而产生的肿瘤患者对治疗性免疫细胞的耐药性。同时，相对于依次或同时施用多种治疗性免疫细胞来识别不同肿瘤细胞配体的治疗方案，本发明的免疫细胞临床应用更安全、便捷，有利于细胞疗法的临床应用。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面的嵌合转换受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体、本发明第四方面的慢病毒载体或本发明第五方面的转基因免疫细胞。由此，获得的药物组合物可进一步用于肿瘤疾病的预防或治疗。
在本发明的第七方面，本发明提出了本发明第一方面的嵌合转换受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体、本发明第四方面的慢病毒载体、本发明第五方面的转基因免疫细胞或本发明第六方面的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或***。利用本发明的嵌合转换受体及对应的核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞或药物组合物可进一步制备成药物，该药物在临床上可用于预防或治疗疾病。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合转换受体、核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1的双(或门)嵌合转换受体结构示意图；
图2为本发明实施例2的双(或门)嵌合转换受体NK细胞的体外细胞毒效应考察结果图；
图3为本发明实施例3的双(或门)嵌合转换受体NK细胞的体外脱颗粒水平考察结果图；
图4为本发明实施例3的双(或门)嵌合转换受体NK细胞的体外干扰素γ产生水平考察结果图；
图5为本发明实施例4的卵巢癌细胞系HEY表达PD-1及TIGIT的配体的考察结果图；
图6为本发明实施例4的双(或门)嵌合转换受体NK细胞对卵巢癌细胞HEY的杀伤效率考察结果图；
图7为本发明实施例4的双(或门)嵌合转换受体NK细胞对卵巢癌的体内抗肿瘤效应图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
术语及定义
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“逻辑门控”，等同于“Logic Gate”，是在嵌合抗原受体的基础上，通过设计两个或以上数量的抗原识别结构域，并应用逻辑门控的“与门(AND-Gate)”、“或门(OR-Gate)”等原理，实现免疫细胞对靶细胞的精准识别。
在本文中，术语“嵌合转换受体”，等同于“CSR”，等同于“Chimeric SwitchReceptor”，是一种人工构建的重组受体，包含胞外的抗原识别结构域、跨膜区及胞内区的信号转导结构域。与嵌合抗原受体的胞外抗原识别结构域由单链抗体构成不同，嵌合转换受体的胞外抗原识别结构域主要由免疫细胞的抑制性表面受体构成。
在本文中，术语“表达嵌合转换受体的免疫细胞”，等同于“CSR-免疫细胞”，是一种转基因免疫细胞，表达特定的嵌合转换受体，进一步用于疾病的预防或治疗。在一些具体的情况下，包括但不限于，可以是CSR-T细胞，也可以是CSR-NK细胞、CSR-NKT细胞、CSR-γδT细胞、CSR-巨噬细胞、CSR-外周血NK细胞、CSR-脐带血NK细胞或CSR-iPSC来源的上述任意一种免疫细胞的至少之一、和任意一种CSR-NK细胞系。在一些情况下，结合上下文，等同于“嵌合转换受体基因修饰的免疫细胞技术”，等同于“嵌合转换受体基因修饰的免疫细胞”。
在本文中，术语“双嵌合转换受体”等同于“或门嵌合转换受体”，在一些情况下，结合上下文，等同于“本发明所述的嵌合转换受体”，等同于“上述的嵌合转换受体”，等同于“本发明第一方面的嵌合转换受体”；术语“双嵌合转换受体免疫细胞”等同于“或门嵌合转换受体免疫细胞”，在一些情况下，结合上下文，等同于“本发明所述的转基因免疫细胞”，等同于“上述的转基因免疫细胞”，等同于“本发明第五方面的转基因免疫细胞”。在本文中，所述双(或门)嵌合转换受体是本发明提出的一种新型嵌合转换受体，可同时识别实体肿瘤或血液肿瘤细胞表面所表达的两种抑制性受体的配体，在识别任意其中之一配体的情况下即能激活免疫细胞。
在本文中，术语“Hinge结构域”，等同于“Spacer结构域”，存在于单链抗体或其衍生体的结构中，是一段小的多肽序列，其作用是把scFv结构域和免疫细胞(如T细胞)隔开。Spacer序列长短或是否采用，需依据包括不限于：特定受体结合配体后触发下游信号强弱等实际情况而定，并进一步通过试验确定功效，无法提前预知。
在本文中，术语“单链抗体”，等同于“single chain Fv”，等同于“scFv”，由免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过连接肽连接而成的小分子抗体，用于制备scFv的连接肽须具有足够柔韧性，以保证VH和VL可自由折叠，使抗体结合区域具有正确构型。
在本文中，术语“(G4S)n”等同于“(Gly4Ser)n”，表示4个甘氨酸和1个丝氨酸重复n次，是目前应用广泛的一类连接肽，可位于VHC端和VLN端之间，也可位于VLC端和VHN端之间。目前常用的是(G4S)3，其中甘氨酸是分子质量最小、侧链最短的氨基酸，可以增加侧链的柔性，丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可以增加连接肽的亲水性。因此，(G4S)3具有较好的稳定性和活力。可以设计不同长度和序列的连接肽，构建具有不同生物学功能的scFv。
在本文中，术语“载体”通常是指能够***在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将***的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的嵌合转换受体、核酸分子、表达载体、慢病毒载体或转基因免疫细胞不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的本发明的嵌合转换受体、核酸分子、表达载体、慢病毒载体或转基因免疫细胞或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用静脉注射方式被给药。
在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或转基因免疫细胞给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述含有嵌合转换受体的细胞的药物给予有需要的个体。
在本文中，“碳端”和“C端”同义；“氮端”和“N端”同义。
本发明提出了一种可同时识别两种免疫受体的配体抗原的嵌合转换受体及对应核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其用途，下面将分别对其进行详细描述。
嵌合转换受体
本发明提供一种嵌合转换受体。所述嵌合转换受体包括：胞外区，所述胞外区包括第一结合片段和第二结合片段，所述第一结合片段具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述第二结合片段具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连；胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。
根据本发明的实施例，具有特定氨基酸序列的TIGIT胞外截短体(具有如SEQ IDNO：10所示的氨基酸序列)、PD-1胞外截短体(具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列)对PD-L1和CD155结合活性良好，在本发明的嵌合转换受体中可同时发挥结合活性。表达本发明的嵌合转换受体的免疫细胞，可有效识别表达TIGIT配体或表达PD-1配体的肿瘤细胞，也可有效识别丢失PD-1或TIGIT其中一种受体配体的肿瘤细胞。
根据本发明的实施例，本发明选用的胞外抗原识别结构域TIGIT胞外截短体(识别CD155配体)、PD-1胞外截短体(识别PD-L1配体)在嵌合转换受体中展示了协同增效的结合活性，由此构建的免疫细胞表现出更强的肿瘤细胞杀伤活性。相比于只表达TIGIT或PD1嵌合转换受体的免疫细胞，表达本发明的嵌合转换受体的免疫细胞对同时表达TIGIT和PD1的配体的肿瘤细胞具有更强的杀伤效果，同时抗肿瘤效应分子IFN-γ的表达水平也显著提高。
超乎发明人预想，根据本发明的实施例，发明人还观察到，相比于只转导了TIGIT或PD1嵌合转换受体的免疫细胞，转导了本发明的嵌合转换受体的免疫细胞，其CD107a表达水平显著提高，表明NK细胞脱颗粒水平显著增高，辅证了此时NK细胞具有更强的杀伤肿瘤能力。
根据本发明的实施例，上述嵌合转换受体还可以进一步包括如下技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述第一结合片段的C端与第二结合片段的N端相连接，或者所述第一结合片段的N端与第二结合片段的C端相连接。
根据本发明的实施例，所述胞外区进一步包括连接肽。在具体的实施方式中，所述TIGIT胞外截短体、PD-1胞外截短体通过连接肽连接，由此更好地发挥CD155、PD-L1配体结合活性。
根据本发明的实施例，所述第一结合片段的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述第二结合片段的N端相连接；或所述第二结合片段的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述第一结合片段的N端相连接。
根据本发明的实施例，所述连接肽选自(G4S)n、ESGRS GGGGSGGGGS、EGKSSGSGSESKST、EGKSSGSGSESKSTQ、GSTSGSGKSSEGKG、KESGS VSSEQ LAQFR SLD、ESGSVSSEELAFRSLD的至少之一，n为不为零的整数。
根据本发明的实施例，所述连接肽选自(G4S)n，n为2～6之间的任意整数。
根据本发明的实施例，所述连接肽是(G4S)4。
根据本发明的实施例，所述胞外区不包括Hinge结构域。发明人进一步研究发现，与一般的嵌合转换受体不同，本发明的嵌合转换受体的胞外结构域与跨膜区之间不包含如CD8a铰链区等其他受体的铰链区，更利于嵌合转换受体与配体之间的结合、及发挥嵌合转换受体对免疫细胞的激活效应。
根据本发明的实施例，所述跨膜区包括CD8a分子跨膜段。
在本发明的一些可选实施例中，所述CD8a分子跨膜段具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
根据本发明的实施例，所述共刺激因子结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端相连。
根据本发明的实施例，所述共刺激因子结构域选自CD28、4-1BB、2B4、DAP10、DAP12、CD27、CD40、OX40、ICOS胞内结构域的至少之一。
根据本发明的实施例，所述共刺激结构域为4-1BB分子胞内段。
在本发明的一些可选实施例中，所述4-1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ分子胞内段。
在本发明的一些可选实施例中，所述CD3ζ分子胞内段具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述嵌合转换受体具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
核酸分子
本发明提供一种核酸分子。所述核酸分子编码上述的嵌合转换受体。携带上述核酸分子的免疫细胞可表达前述的嵌合转换受体，嵌合转换受体可以在识别TIGIT配体和PD-1配体的任意一个后，其能激活所述免疫细胞，实现免疫细胞对肿瘤抗原识别的“或门”逻辑门控效应。
需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本文中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本发明中的分子序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
表达载体
本发明提供一种表达载体。所述表达载体携带上述的核酸分子。由此，构建得到的表达载体可在受体细胞中表达本发明的嵌合转换受体。
在将上述核酸分子连接到表达载体上时，可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。根据本发明的实施例，所述表达载体是非致病性病毒载体。
在本文中，术语“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控***的介导下，有效实现前面所述的核酸分子的表达，进而实现所述核酸分子编码的蛋白质的体外大量获得。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒任选自反转录病毒、慢性毒和腺病毒相关病毒之一。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒是慢病毒。
慢病毒载体
本发明提供一种慢病毒载体。所述慢病毒载体携带具有如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：15所示的核苷酸序列。由此，将慢病毒载体导入受体细胞后，可实现本发明的嵌合转换受体在免疫细胞中的表达。
细胞
本发明提供一种转基因免疫细胞。所述转基因免疫细胞表达上述的嵌合转换受体；或者携带上述的核酸分子、上述的表达载体或上述的慢病毒载体。由此，获得的转基因免疫细胞的肿瘤细胞杀伤活性显著提高，其在肿瘤治疗过程中的流失率有效降低。
根据本发明的实施例，所述转基因免疫细胞任选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、γδT细胞、巨噬细胞、外周血NK细胞、脐带血NK细胞和iPSC来源的上述任意一种免疫细胞的至少之一。
在一些具体的实施方式中，所述转基因免疫细胞任选自NK细胞。
在一些更具体的实施方式中，所述转基因免疫细胞任选自任意一种NK细胞系。
本发明的上述嵌合转换受体可通过表达载体(慢病毒载体)对T、NK、NKT、γδT、巨噬细胞等免疫细胞转导从而表达在这些免疫细胞表面。
根据本发明的实施例，本发明的转基因免疫细胞在相当的剂量、相同的给药方式下，与依次或同时施用仅含有TIGIT或PD-1抗原识别结构域的嵌合转换受体基因修饰的免疫细胞相比，具有更好的临床疗效和安全性。
药物组合物
本发明提供一种药物组合物。所述药物组合物包括上述的嵌合转换受体、上述的核酸分子、上述的表达载体、上述的慢病毒载体或上述的转基因免疫细胞。由此，获得的药物组合物进一步用于肿瘤的治疗。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的辅料。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合转换受体、核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。
用途
本发明提供一种上述的嵌合转换受体、上述的核酸分子、上述的表达载体、上述的慢病毒载体、上述的转基因免疫细胞或上述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或***。
根据本发明的实施例，所述肿瘤是实体瘤或血液瘤。
根据本发明的实施例，所述实体瘤包括选自发生在脏器中的有形瘤，包括胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、***、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、***癌、黑色素瘤等的至少之一。
根据本发明的实施例，所述血液瘤包括选自血细胞和造血***内的急性髓系白血病、急性淋巴细胞系白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤等的至少之一。
预防或***的方法
本发明提供了一种治疗和/或预防免疫***疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向受试者施用药学上可接受量的上述转基因免疫细胞或上述药物组合物。
本发明所述的转基因免疫细胞和药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所涉及的序列说明详见表1。
表1：核苷酸/氨基酸序列说明表
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下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在下列实施例中，慢病毒的产生和人NK细胞的转导方法如下：
制备复制缺陷型慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人NK细胞的转导。下面简要介绍慢病毒载体的制备、收集及浓缩的实验过程：将293T细胞铺在底面积为150平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Lipofectamine 3000(购自Thermo Fisher，Waltham，USA)对293T细胞进行质粒转染。每盘细胞加入47.37微克的慢病毒转基因质粒、30.8微克的psPAX2质粒、16.58微克的pMD2.G质粒、189.48微升的P3000和118.43微升的Lipofectamine 3000。于24小时收集上清，经过250g5分钟离心(离心机为湖南可城L4-5K)去除沉淀后，将上清与1/4体积的PEG-IT(购自Systems Biosciences，Palo Alto，USA)混合，在4摄氏度的条件下过夜放置，翌日离心1500g 30分钟。最后用0.3ml的DMEM无血清培养基对病毒载体沉淀进行重悬。
从不记名健康志愿者供体的外周血通过人外周血淋巴细胞分离液(购自达科为，深圳，中国)密度梯度离心法分离得到外周血来源的淋巴细胞，并通过人NK细胞富集试剂盒(购自Miltenyi，BergischGladbach，Germany)的方法富集得到人原代人NK细胞。人NK细胞培养在RPMI-1640完全培养基中并使用终浓度为1000U/mL人IL-2及终浓度为20ng/mL人IL-21进行刺激激活，在人NK细胞激活48小时后，在24孔板中，每孔铺有0.5×106NK细胞，培养体积为0.3ml含有100U/mL的1640完全培养基。向每孔细胞中加入0.3ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8微克/ml)。12小时之后吸走0.45ml培养上清，加入0.85ml含有100U/mL的1640完全培养基。继续培养3天后可用来做功能分析及后续实验。
本发明的实施例中所用的流式细胞仪为Beckman Cytoflex(购自BeckmanCoulter)，流式细胞分析数据使用Cytexpert软件(Beckman Coulter)进行分析。
在下列实施例中，体外CFSE-7AAD细胞毒实验方法如下：
应用4小时CFSE-7AAD法分析评估或门嵌合转换受体NK细胞的细胞毒活性。具体步骤如下：目标测试细胞用含有终浓度5mM CFSE的PBS溶液在37摄氏度下标记15分钟。标记后，用含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基润洗细胞。润洗后，将细胞重悬在相同的培养基中，重悬细胞的浓度是1×105/ml。转导后NK细胞以不同效靶细胞比值(E:T)加入目标测试细胞悬浮液中，并将细胞接种到96孔圆底板，每孔总体积是200微升。将细胞在37摄氏度培养箱中培养4小时。4小时后，从每孔中吸出全部细胞悬液，每孔加入3微升7AAD溶液，避光放置1分钟后，通过流式细胞仪Beckman Cytoflex(购自Beckman Coulter)检测CFSE阳性细胞中7AAD阳性细胞的比例，即为靶细胞死亡的比例，以反应NK细胞的细胞毒水平。
在下列实施例中，NK细胞脱颗粒及干扰素γ产生水平的检测方法如下：
实施例中通过将NK细胞与肿瘤细胞共培养评估或门嵌合转换受体NK细胞脱颗粒及产生干扰素γ的能力。具体步骤如下：目标测试细胞与转导后的NK细胞以1：3的效靶细胞比值(E:T)接种到96孔圆底板，每孔总体积是200微升，并加入每孔2微升抗人CD107a的荧光抗体。将细胞在37摄氏度培养箱中培养3小时。3小时后，从每孔中吸出全部细胞悬液，标记抗人CD56的荧光抗体，避光孵育15分钟后，经过洗涤，用固定液、穿膜液(购自Biolegend，San Diego，USA)根据说明书对细胞依次进行固定、穿膜，并标记抗人干扰素γ的荧光抗体，经过洗涤后，通过流式细胞仪Beckman Cytoflex(购自Beckman Coulter)检测CD56阳性的NK细胞中CD107a及干扰素γ阳性细胞的比例，其中前者即代表NK细胞脱颗粒水平。
在下列实施例中，用于性能测试的靶细胞共有4种，分别为：(1)WT K562细胞，以下简称为“WT K562”；(2)过表达CD155的K562细胞，以下简称为“155tg K562”；(3)敲除CD112及CD155并过表达PDL1的K562细胞，以下简称为“112&155KO PDL1tg K562”；(4)同时过表达PDL1及CD155的K562细胞，以下简称为“155&PDL1tg K562”。
需要说明的是，以下实施中所述的“质粒”与“载体”具有相同的意义，可互换使用。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法构建表达双(或门)嵌合转换受体的载体：
将编码有人CD8α信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示、核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示)和嵌合转换受体的核苷酸序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)克隆到含有EF-1α启动子的慢病毒载体(lentiviral vector)上，通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，获得表达双(或门)嵌合转换受体的慢病毒载体。
其中，嵌合转换受体从N端到C端依次为人TIGIT胞外区的序列、人PD-1胞外区的序列、人CD8α跨膜区的序列、人4-1BB胞内区的序列和CD3ζ分子胞内段序列。
本实施例双(或门)嵌合转换受体结构示意图见图1，具体序列信息见参考表1。
实施例2
在该实施例中，按照下列方法，发明人进一步考察了表达实施例1的双(或门)嵌合转换受体的NK细胞对表达TIGIT和PD-1配体的肿瘤细胞的杀伤作用：
制备复制缺陷型慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人NK细胞的转导：将293T细胞铺在底面积为150平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Lipofectamine3000(购自Thermo Fisher，Waltham，USA)对293T细胞进行质粒转染。共分成4组，每组仅“慢病毒转基因质粒”不同：每盘细胞加入47.37微克的慢病毒转基因质粒(分别为Ctrl,TIGIT-NKR,PD1-NKR,TIGIT-PD1-NKR,PD1-TIGIT-NKR)、30.8微克的psPAX2质粒、16.58微克的pMD2.G质粒、189.48微升的P3000和118.43微升的Lipofectamine 3000。于24小时收集上清，经过250g 5分钟离心(离心机为湖南可城L4-5K)去除沉淀后，将上清与1/4体积的PEG-IT(购自Systems Biosciences，Palo Alto，USA)混合，在4摄氏度的条件下过夜放置，翌日离心1500g 30分钟。最后用0.3ml的DMEM无血清培养基对病毒载体沉淀进行重悬。从不记名健康志愿者供体的外周血通过人外周血淋巴细胞分离液(购自达科为，深圳，中国)密度梯度离心法分离得到外周血来源的淋巴细胞，并通过人NK细胞富集试剂盒(购自Miltenyi，BergischGladbach，Germany)的方法富集得到人原代人NK细胞。人NK细胞培养在RPMI-1640完全培养基中并使用终浓度为1000U/mL人IL-2及终浓度为20ng/mL人IL-21进行刺激激活，在人NK细胞激活48小时后，在24孔板中，每孔铺有0.5×106NK细胞，培养体积为0.3ml含有100U/mL的1640完全培养基。向每孔细胞中加入0.3ml的上述4种重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8微克/ml)。12小时之后吸走0.45ml培养上清，加入0.85ml含有100U/mL的1640完全培养基。在慢病毒载体转导后的3-7天，收获转导的NK细胞，用于体外CFSE-7AAD细胞毒实验。
将WT K562、155tg K562、112&155KO PDL1tg K562、155&PDL1tg K562等4种测试的靶细胞分别用含有终浓度5mM CFSE的PBS溶液在37摄氏度下标记15分钟。标记后，用含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基润洗细胞。润洗后，将细胞重悬在相同的培养基中，重悬细胞的浓度是1×105/ml。转导后NK细胞以1：1的效靶细胞比(E:T)加入目标测试细胞悬浮液中，并将细胞接种到96孔圆底板，每孔总体积是200微升。将细胞在37摄氏度培养箱中培养4小时。4小时后，从每孔中吸出全部细胞悬液，每孔加入3微升7AAD溶液，避光放置1分钟后，通过流式细胞仪Beckman Cytoflex(购自Beckman Coulter)检测CFSE阳性细胞中7AAD阳性细胞的比例，即为靶细胞死亡的比例，以反应NK细胞的细胞毒水平。
考察结果如图2所示：转导了TIGIT嵌合转换受体(“TIGIT”)的NK细胞杀伤TIGIT配体阳性的肿瘤细胞(“155tg K562”或“PDL1&155tg K562”)时杀伤率高于对照组NK细胞(“Ctrl”)，但杀伤TIGIT配体阴性的肿瘤细胞(“WT K562”或“112&155KO PDL1tg K562”)时杀伤率与对照组NK细胞没有显著差别；转导了PD1嵌合转换受体(“PD1”)的NK细胞杀伤PD1配体阳性的肿瘤细胞(“112&155KO PDL1tg K562”、“PDL1&155tg K562”)时杀伤率高于对照组NK细胞(“Ctrl”),但杀伤PD1配体阴性的肿瘤细胞(“WT K562”或“155tg K562”)时杀伤率与对照组NK细胞没有显著差别；而转导了双嵌合转换受体(或门嵌合转换受体)的NK细胞(“TIGIT-PD1”或“PD1-TIGIT”)杀伤TIGIT配体单阳性(“155tg K562”)、PD1配体单阳性(“112&155KO PDL1tg K562”)或TIGIT及PD1配体双阳性(“PDL1&155tg K562”)的肿瘤细胞时杀伤率均高于对照组，而杀伤TIGIT及PD1配体双阴性(“WT K562”)的肿瘤细胞时杀伤率与对照组无显著差别，而且，转导了双(或门)嵌合转换受体的NK细胞(“TIGIT-PD1”或“PD1-TIGIT”)杀伤TIGIT及PD1配体双阳性(“PDL1&155tg K562”)的肿瘤细胞时杀伤率高于转导了单独TIGIT或单独PD1嵌合转换受体的NK细胞。
结果表明，双(或门)嵌合转换受体能识别TIGIT/PD1配体表达具有异质性的肿瘤类型，相比TIGIT或PD1单一嵌合转换受体而言，或门能同时识别TIGIT配体单阳性、PD1配体单阳性、TIGIT及PD1配体双阳性几种情况的肿瘤，并能应对其中一种受体的配体表达丢失、而另一种受体的配体仍保留表达的情况，并进行杀伤。
实施例3
在该实施例中，按照下列方法，发明人进一步考察了表达实施例1的双(或门)嵌合转换受体的NK细胞在受到表达TIGIT和PD-1配体的肿瘤细胞刺激时，脱颗粒和产生干扰素γ水平：
先制备复制缺陷型慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人细胞的转导：将293T细胞铺在底面积为150平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Lipofectamine3000(购自Thermo Fisher，Waltham，USA)对293T细胞进行质粒转染。共分成4组，每组仅“慢病毒转基因质粒”不同：每盘细胞加入47.37微克的慢病毒转基因质粒(分别为Ctrl,TIGIT-NKR,PD1-NKR,TIGIT-PD1-NKR,PD1-TIGIT-NKR)、30.8微克的psPAX2质粒、16.58微克的pMD2.G质粒、189.48微升的P3000和118.43微升的Lipofectamine 3000。于24小时收集上清，经过250g 5分钟离心(离心机为湖南可城L4-5K)去除沉淀后，将上清与1/4体积的PEG-IT(购自Systems Biosciences，Palo Alto，USA)混合，在4摄氏度的条件下过夜放置，翌日离心1500g 30分钟。最后用0.3ml的DMEM无血清培养基对病毒载体沉淀进行重悬。从不记名健康志愿者供体的外周血通过人外周血淋巴细胞分离液(购自达科为，深圳，中国)密度梯度离心法分离得到外周血来源的淋巴细胞，并通过人NK细胞富集试剂盒(购自Miltenyi，BergischGladbach，Germany)的方法富集得到人原代人NK细胞。人NK细胞培养在RPMI-1640完全培养基中并使用终浓度为1000U/mL人IL-2及终浓度为20ng/mL人IL-21进行刺激激活，在人NK细胞激活48小时后，在24孔板中，每孔铺有0.5×106NK细胞，培养体积为0.3ml含有100U/mL的1640完全培养基。向每孔细胞中加入0.3ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8微克/ml)。12小时之后吸走0.45ml培养上清，加入0.85ml含有100U/mL的1640完全培养基。在慢病毒载体转导后的3-7天，收获转导的NK细胞，用于体外肿瘤细胞刺激脱颗粒及产生干扰素γ水平的检测实验。
实验设置WT K562、155tg K562、112&155KO PDL1tg K562、155&PDL1tg K562等4种测试的靶细胞实验组和“无靶细胞”组(“NT”)，共5个实验组。
将上述待测试的靶细胞与转导后NK细胞以1：4的效靶细胞比值(E:T)接种到96孔圆底板，每孔总体积是200微升，并加入每孔2微升抗人CD107a的荧光抗体。将细胞在37摄氏度培养箱中培养3小时。3小时后，从每孔中吸出全部细胞悬液，标记抗人CD56的荧光抗体，避光孵育15分钟后，经过洗涤，用固定液、穿膜液(购自Biolegend，San Diego，USA)根据说明书对细胞依次进行固定、穿膜，并标记抗人干扰素γ的荧光抗体，经过洗涤后，通过流式细胞仪Beckman Cytoflex(购自Beckman Coulter)检测CD56阳性的NK细胞中CD107a及干扰素γ阳性细胞的比例，其中前者即为NK细胞脱颗粒水平。
考察结果如图3、图4所示：转导了TIGIT嵌合转换受体(“TIGIT”)的NK细胞在与TIGIT配体阳性的肿瘤细胞(“155tg K562”或“PDL1&155tg K562”)共培养时产生IFN-γ及表达CD107a水平高于对照组NK细胞(“Ctrl”)，但与TIGIT配体阴性的肿瘤细胞(“WT K562”或“112&155KO PDL1tg K562”)共培养时产生IFN-γ及表达CD107a水平与对照组NK细胞没有显著差别；转导了PD1嵌合转换受体(“PD1”)的NK细胞与PD1配体阳性的肿瘤细胞(“112&155KO PDL1tg K562”、“PDL1&155tg K562”)共培养时产生IFN-γ及表达CD107a水平高于对照组NK细胞(“Ctrl”),但与PD1配体阴性的肿瘤细胞(“WT K562”或“155tg K562”)共培养时产生IFN-γ及表达CD107a水平与对照组NK细胞没有显著差别；而转导了双(或门)嵌合转换受体的NK细胞(“TIGIT-PD1”或“PD1-TIGIT”)与TIGIT配体单阳性(“155tg K562”)、PD1配体单阳性(“112&155KO PDL1tg K562”)或TIGIT及PD1配体双阳性(“PDL1&155tg K562”)的肿瘤细胞共培养时产生IFN-γ及表达CD107a水平均高于对照组，而与TIGIT及PD1配体双阴性(“WT K562”)的肿瘤细胞共培养时产生IFN-γ及表达CD107a水平与对照组无显著差别，而且，转导了双(或门)嵌合转换受体的NK细胞与TIGIT及PD1配体双阳性(“PDL1&155tgK562”)的肿瘤细胞共培养时产生IFN-γ及表达CD107a水平明显高于转导了单独TIGIT或单独PD1嵌合转换受体的NK细胞。
实施例4
将105个人类卵巢癌细胞HEY在100uL PBS悬液中分别与0.5μg下述流式荧光抗体避光孵育10分钟：PE-anti human PDL1,APC-anti human PDL2,PE-anti human CD155,APC-anti human CD112。随后用PBS洗涤一次，进行流式检测。结果显示人类卵巢癌细胞HEY同时高表达TIGIT和PD1的配体(如图5所示)，应该能够被双(或门)嵌合转换受体所识别，因而发明人首先选择HEY细胞进行双(或门)嵌合转换受体NK细胞抗肿瘤能力的鉴定。
在该实施例中，按照实施例3的方法，发明人考察了表达实施例1的双(或门)嵌合转换受体的NK细胞对人类卵巢癌细胞HEY的杀伤效率。
考察结果如图6所示：转导了TIGIT嵌合转换受体(“TIGIT”)或PD1嵌合转换受体(“PD1”)的NK细胞杀伤HEY细胞时杀伤率高于对照组NK细胞(“Ctrl”),而转导了双(或门)嵌合转换受体的NK细胞(“TIGIT-PD1”或“PD1-TIGIT”)杀伤HEY细胞时杀伤率均高于对照组，且高于转导了单独TIGIT或单独PD1嵌合转换受体的NK细胞。本实验结果表明，TIGIT-PD1或PD1-TIGIT或门嵌合转换受体能识别表达TIGIT/PD1配体的肿瘤类型(如卵巢癌)，相比单独TIGIT或PD1嵌合转换受体而言，可能具有更高的杀伤效率。
进一步地，基于上述有效性结果，发明人进一步鉴定了表达实施例1的双(或门)嵌合转换受体的NK细胞在小鼠体内抗肿瘤能力。具体方法如下：
以人类卵巢癌HEY细胞进行腋下皮下注射，建立卵巢癌模型。选择6周龄免疫缺陷型非肥胖糖尿病(NOD)-scidγ小鼠(NSG)(NOD-SCID小鼠背景，并且具有IL-2受体γ链缺陷)进行皮下荷瘤，每只小鼠皮下注射5×106个HEY细胞。在荷瘤后第三天开始、每周一次尾静脉注射107NK92细胞直到实验结束；在第一次注射NK92细胞当天开始，每周腹腔注射两次50000单位白细胞介素2用于提高NK92细胞在体内的存活水平。每周量取肿瘤的长径和短径，计算出肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
考察结果如图7所示：与NK92野生型(WT)相比，转导了TIGIT嵌合转换受体(“TIGIT”)或PD1嵌合转换受体(“PD1”)的NK92细胞具有一定的抑制肿瘤生长的治疗效果，而与之相比，转导了双(或门)嵌合转换受体的NK92细胞(“TIGIT-PD1”或“PD1-TIGIT”)的NK92细胞具有更好的治疗效果，能够更大幅度地抑制肿瘤的生长(图7)。说明本发明的双(或门)嵌合转换受体使NK92细胞获得了更强的识别肿瘤并激活抗肿瘤效应功能的能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (20)

1.一种嵌合转换受体，其特征在于，包括：
胞外区，所述胞外区包括第一结合片段和第二结合片段，所述第一结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述第二结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；
跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的C端相连，所述跨膜区包括CD8a分子跨膜段；所述CD8a分子跨膜段的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述共刺激结构域为4-1BB分子胞内段，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ分子胞内段，所述4-1BB共刺激因子结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述CD3ζ分子胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；
所述胞外区进一步包括连接肽；
所述第一结合片段的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述第二结合片段的N端相连接；或
所述第二结合片段的C端与所述连接肽的N端相连接，所述连接肽的C端与所述第一结合片段的N端相连接。
2.根据权利要求1所述的嵌合转换受体，其特征在于，所述连接肽选自(G4S)n，n为2～6之间的任意整数。
3.根据权利要求2所述的嵌合转换受体，其特征在于，所述连接肽是(G4S)4。
4.根据权利要求1所述的嵌合转换受体，其特征在于，所述胞外区不包括Hinge结构域。
5.根据权利要求1所述的嵌合转换受体，其特征在于，所述嵌合转换受体具有如SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列。
6.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～5任一项所述的嵌合转换受体。
7.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求6所述的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是非致病性病毒载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述非致病性病毒载体任选自反转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体之一。
10.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述非致病性病毒载体是慢病毒载体。
11.一种慢病毒载体，其特征在于，携带核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15所示的核酸分子。
12.一种转基因免疫细胞，其特征在于，所述转基因免疫细胞包括：
表达权利要求1～5任一项所述的嵌合转换受体；或者
携带权利要求6所述的核酸分子、权利要求7～10任一项所述的表达载体或权利要求11所述的慢病毒载体。
13.根据权利要求12所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述转基因免疫细胞任选自T细胞、NK细胞、巨噬细胞的至少之一。
14.根据权利要求13所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述T细胞选自NKT细胞、γδT细胞的至少之一，所述NK细胞选自外周血NK细胞、脐带血NK细胞的至少之一。
15.根据权利要求13或14任一项所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述T细胞、NK细胞或巨噬细胞是iPSC来源的。
16.根据权利要求12所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述转基因免疫细胞任选自NK细胞。
17.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～5任一所述的嵌合转换受体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7～10任一项所述的表达载体、权利要求11所述的慢病毒载体或权利要求12～16任一项所述的转基因免疫细胞。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括：药学上可接受的辅料。
19.权利要求1～5任一项所述的嵌合转换受体、权要求6所述的核酸分子、权利要求7～10任一项所述的表达载体、权利要求11所述的慢病毒载体、权利要求12～16任一项所述的转基因免疫细胞或权利要求17～18任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于***，所述肿瘤是实体瘤或血液瘤，所述血液瘤为何杰金氏淋巴瘤。
20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，所述实体瘤包括选自发生在脏器中的有形瘤，包括胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、***、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、***癌、黑色素瘤的至少之一。
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