CN116904418A - yfdH基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了yfdH基因突变体及其在制备L‑缬氨酸中的应用，属于生物技术领域。所要解决的技术问题是如何提高大肠杆菌L‑缬氨酸的产量。为了解决该技术问题，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质、其编码基因、相关生物材料及其在提高L‑缬氨酸产量中的应用。本发明构建了过表达突变型yfdHT743C基因或野生型yfdH基因的重组菌，以及点突变重组菌，实验结果表明：过表达yfdH基因或yfdHT743C基因均可以显著提高L‑缬氨酸的产量。对yfdH基因进行点突变(T‑C)也有助于L‑缬氨酸产量的提高。本发明方法构建的基因工程菌种，可以显著促进L‑缬氨酸的积累，提高L‑缬氨酸的产量。

Description

yfdH基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及yfdH基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用。
背景技术
L-缬氨酸(L-Valine)是一种含有五个碳原子的支链非极性α-氨基酸，是哺乳动物的必需氨基酸和生糖氨基酸，人和动物自身不能合成。L-缬氨酸具有促进蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增强机体的免疫防护作用，有助于纠正因手术、创伤、感染等引起的负氮平衡。此外，L-缬氨酸还具有抗中枢疲劳的作用，抗外周疲劳作用，延缓运动性疲劳，加快运动后机体的修复，因此在动物饲料、化妆品、食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。由L-缬氨酸配制的复合支链氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。L-缬氨酸在食品工业上主要用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，可以制备形成水凝胶，其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛应用。
目前，L-缬氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、收率低，污染严重，难以实现工业化生产。微生物直接发酵法生产L-缬氨酸具有原料来源广泛，成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是一种非常经济、高效的生产方法。而工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。随着基因工程育种技术的不断发展，从分子水平上改造生产菌，研究和挖掘相关基因的功能，为L-缬氨酸的工业化发酵生产提供了广阔的前景。因此，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的积累，进一步提高L-缬氨酸的产量有利于促进L-缬氨酸产业化的进程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何通过基因的遗传改造提高大肠杆菌L-缬氨酸的产量，所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称可为YfdHI248T，所述蛋白质可包括下述任一种：
A1)氨基酸序列包含如SEQ ID No.4所示的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
本文所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了核酸分子，名称可为yfdHT743C，所述核酸分子可包括下述任一种：
B1)编码所述蛋白质YfdHI248T的核酸分子；
B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。
SEQ ID No.3所示的DNA分子即为本发明所述突变型基因yfdHT743C。
SEQ ID No.3所示的DNA分子(yfdHT743C基因)编码SEQ ID No.4所示的突变蛋白质YfdHI248T。
所述yfdHT743C基因的核苷酸序列(SEQ ID No.3)中第743位胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)突变而来，所述蛋白质YfdHI248T氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第248位苏氨酸(T)是由异亮氨酸(I)突变而来。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可包括下述任一种：
C1)含有所述核酸分子yfdHT743C的表达盒；
C2)含有所述核酸分子yfdHT743C的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；
C3)含有所述核酸分子yfdHT743C的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；
C4)含有所述核酸分子yfdHT743C的重组细胞、或含有C1)所述表达盒的重组细胞、或含有C2)所述重组载体的重组细胞。
进一步地，C3)所述重组微生物可为下述任一种：
D1)将氨基酸序列包含如SEQ ID No.4所示蛋白质的编码基因导入目的微生物得到的重组微生物；
D2)将编码序列包含如SEQ ID No.3所示的DNA分子导入目的微生物得到的重组微生物；
D3)将目的微生物基因组中SEQ ID No.1所示DNA分子第743位的核苷酸T突变为C后得到的重组微生物。
本发明还提供了所述蛋白质YfdHI248T、所述核酸分子yfdHT743C或所述生物材料的下述任一种应用：
E1)在调控微生物L-缬氨酸的产量中的应用；
E2)在制备L-缬氨酸中的应用；
E3)在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用。
本文所述调控可为提高(上调)或降低(下调)。
进一步地，本文所述调控微生物L-缬氨酸的产量可为提高(上调)或降低(下调)微生物中L-缬氨酸的积累量(即促进或抑制L-缬氨酸的生物合成)。
本发明还提供了F1)-F4)中任一项在调控微生物L-缬氨酸的产量、制备L-缬氨酸或构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用，其中所述F1)-F4)为：
F1)氨基酸序列包含如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
F2)编码F1)所述蛋白质的核酸分子；
F3)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
F4)含有F2)所述核酸分子或F3)所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞。
SEQ ID No.1所示的DNA分子也为本发明所述yfdH基因。
SEQ ID No.1所示的DNA分子(yfdH基因)编码SEQ ID No.2所示的蛋白质YfdH。
本发明还提供了一种提高目的微生物L-缬氨酸的产量或制备L-缬氨酸的方法，所述方法可包括下述任一种：
G1)提高目的微生物中的所述核酸分子yfdHT743C的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
G2)提高目的微生物中的F2)所述核酸分子或F3)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
G3)对目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物，所述突变可包括：将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第248位的异亮氨酸突变为苏氨酸。
进一步地，所述G1)可通过如下任一方法实现：(1)增加目的微生物中yfdHT743C基因(SEQ ID No.3)的拷贝数(如将单拷贝或多拷贝的yfdHT743C基因导入目的微生物)；(2)在(1)的基础上通过表达调控序列增强yfdHT743C基因的表达(如修饰yfdHT743C基因的表达调控序列)。
进一步地，所述G2)可通过如下任一方法实现：(1)增加目的微生物中yfdH基因(SEQ ID No.1)的拷贝数(如将单拷贝或多拷贝的yfdH基因导入目的微生物)；(2)通过表达调控序列增强yfdH基因的表达(如修饰yfdH基因的表达调控序列)。
所述表达调控序列可为启动子、增强子或沉默子序列。
进一步地，G3)中所述突变可通过基因编辑技术、同源重组技术或定点突变等方法进行。
上述方法中，所述目的微生物可为大肠杆菌(Escherichia coli)。
上述方法中，所述方法可包括下述任一种：
H1)将氨基酸序列包含如SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.2所示蛋白质的编码基因导入所述目的微生物；
H2)将编码序列包含如SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.1所示的DNA分子导入所述目的微生物；
H3)将目的微生物基因组中SEQ ID No.1所示DNA分子第743位的核苷酸T突变为C。
本发明还提供了所述蛋白质YfdHI248T、所述核酸分子yfdHT743C、所述生物材料、本文中F1)所述的蛋白质、F2)所述的核酸分子、F3)所述的DNA分子、F4)所述的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞在制备含有L-缬氨酸的食品、化妆品、药品或饲料中的应用。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、肠杆菌属(Enterobacteriasp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)等但不限于此。
进一步地，所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)。
本文所述细胞可为植物细胞或动物细胞。所述细胞可为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。
本文所述重组载体可为重组载体pSTV28-yfdH和/或重组载体pSTV28-yfdHT743C。
所述重组载体pSTV28-yfdH含有SEQ ID No.6所示的DNA分子(即yfdH基因和调控元件片段)。SEQ ID No.6所示的DNA分子包含启动子PJ23105、pTrc99a质粒的RBS序列、野生型的yfdH基因、终止子Ttrc。启动子PJ23105和RBS序列则设计在引物P1(SEQ ID No.8)和引物P6(SEQ ID No.13)，终止子Ttrc则设计在引物P4(SEQ ID No.11)和引物P5(SEQ ID No.12)中。
所述重组载体pSTV28-yfdHT743C含有SEQ ID No.7所示的DNA分子(即yfdHT743C基因和调控元件片段)。SEQ ID No.7所示的DNA分子包含启动子PJ23105、pTrc99a质粒的RBS序列、yfdHT743C基因、终止子Ttrc。启动子PJ23105和RBS序列则设计在引物P1(SEQ ID No.8)和引物P6(SEQ ID No.13)，终止子Ttrc则设计在引物P4(SEQ ID No.11)和引物P5(SEQ ID No.12)中。
本文所述重组微生物可为VHY22(过表达yfdH基因)、VHY23(过表达yfdHT743C基因)、VHY24(yfdHT743C点突变)、MG1655-02(过表达yfdH基因)、MG1655-03(过表达yfdHT743C基因)和/或MG1655-04(yfdHT743C点突变)。
所述重组微生物VHY22和VHY23是将所述重组载体pSTV28-yfdH和pSTV28-yfdHT743C分别导入大肠杆菌VHY20得到的重组微生物。
所述重组微生物MG1655-02和MG1655-03是将所述重组载体pSTV28-yfdH和pSTV28-yfdHT743C分别导入大肠杆菌MG1655得到的重组微生物。
所述重组微生物VHY24是将大肠杆菌VHY20基因组中SEQ ID No.1所示DNA分子第743位的核苷酸T突变为C得到的重组微生物。
所述重组微生物MG1655-04是将大肠杆菌MG1655基因组中SEQ ID No.1所示DNA分子第743位的核苷酸T突变为C得到的重组微生物。
本文所述导入可为通过化学转化法(如Ca2+诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法)或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌；也可为通过噬菌体转导的方法将本发明DNA分子转导进入宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。
本文所述制备L-缬氨酸的方法可为发酵法制备L-缬氨酸，具体可为利用所述重组微生物VHY22、VHY23、VHY24、MG1655-02、MG1655-03和/或MG1655-04通过发酵法生产L-缬氨酸。
本文所述目的微生物可为大肠杆菌(Escherichia coli)，具体可为大肠杆菌VHY20或大肠杆菌MG1655。
利用本发明所述yfdH基因或其变体(如yfdHT743C基因)构建的重组微生物或重组细胞还可用于生产多种产物，包括但不限于赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、α酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸和/或瓜氨酸。
本发明以大肠杆菌MG1655和大肠杆菌VHY20为出发菌，构建了过表达yfdHT743C基因(SEQ ID No.3)或yfdH基因(SEQ ID No.1)的重组菌，并对大肠杆菌MG1655和大肠杆菌VHY20的yfdH基因进行点突变，构建了点突变的重组菌，将构建的工程菌株进行发酵实验，结果表明：无论是在L-缬氨酸生产菌株(如VHY20)还是在野生型大肠杆菌(如MG1655)中过表达yfdH基因或yfdHT743C基因均有助于L-缬氨酸的合成，过表达yfdHT743C基因可以更显著提高L-缬氨酸的产量。此外，无论对于L-缬氨酸生产菌株还是野生型大肠杆菌，对yfdH基因进行点突变，将第743位的T突变为C后(相应地突变蛋白YfdHI248T氨基酸序列的第248位由异亮氨酸突变为苏氨酸)，都有助于L-缬氨酸产量的明显提高。同时，缺失yfdH基因的表达不利于L-缬氨酸的合成。由于补糖量相同，因此产量提高意味着转化率的提高。本发明构建的基因工程菌种，可以显著促进L-缬氨酸的积累，提高L-缬氨酸的产量。本发明培育了符合工业化生产的高产、高质量菌种，有利于推动L-缬氨酸的工业化生产进程。
附图说明
图1为实施例7中的L-缬氨酸发酵培养基组成。
图2为实施例7中的L-缬氨酸发酵实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pSTV28质粒为宝生物公司产品，货号：3331。
下述实施例中的大肠杆菌MG1655来源于北京北纳创联生物技术研究院(BNCC)，菌株编号为：BNCC363342。
下述实施例中的大肠杆菌VHY20记载于如下文献中：王加初,伍法清,吴鹤云,等.限氧发酵生产缬氨酸工程菌株及发酵过程优化[J].食品与发酵工业,2023,49(1):8.。
下述实施例中的pREDCas9质粒和pGRB载体为addgene公司产品。
实施例1、构建包含点突变的yfdH基因和野生型的yfdH基因编码区片段
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组序列，设计并合成两对扩增yfdH基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在大肠杆菌MG1655(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的yfdH基因)的yfdH基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将yfdH基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第743位胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的yfdH基因，名称为yfdHT743C)。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为蛋白质YfdH)。
SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为YfdHI248T)。所述突变蛋白质YfdHI248T氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第248位苏氨酸(T)由异亮氨酸(I)突变而来。
采用PCR构建突变片段，引物设计如下(苏州金唯智公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：
P1:5'-TAGGTACTATGCTAGCAGGAAACAGACCATGAAGATATCTCTTGTAGTTCC-3'(带下划线的核苷酸序列含基因调控元件序列)(SEQ ID No.8)，
P2:
P3:
P4:5'-CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTT GTCATTTTTTGACTCTCTTGATG-3'(带下划线的核苷酸序列含基因调控元件序列)(SEQ IDNo.11)。
构建方法：以大肠杆菌MG1655为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，长度分别为784bp和230bp的yfdH基因编码区的DNA片段(yfdHT743C-Up和yfdHT743C-Down)。以大肠杆菌MG1655为模板，分别以引物P1和P4，进行PCR扩增，获得一条长度为988bp的含yfdH基因编码区的DNA片段。
PCR扩增体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，引物(10pM)各2μL，模板(<200ng)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，添加无菌水到总体积50μL。
PCR扩增反应程序为：98℃预变性10sec，(95℃变性5min；55℃退火30s；72℃延伸60sec；30个循环)，72℃过度延伸10min。
将两条DNA片段(yfdHT743C-Up和yfdHT743C-Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，以yfdHT743C-Up和yfdHT743C-Down为模板，以引物P1和P4进行重叠PCR扩增，获得长度为988bp的含yfdHT743C基因编码区的DNA片段。
实施例2、构建过表达yfdH基因或yfdHT743C基因的重组载体
采用PCR构建pSTV28质粒线性化载体片段，引物设计如下(苏州金唯智公司合成)：
P5:5'-AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAA TGTGAGCGAGGAAGCGGAATA-3'(带下划线的核苷酸序列含基因调控元件序列)(SEQ IDNo.12)，
P6:5'-GCTAGCATAGTACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAAGAAGATGCCAGGAAGATACTTAACA-3'(带下划线的核苷酸序列含基因调控元件序列)(SEQ ID No.13)。
构建方法：以pSTV28质粒(含有氯霉素抗性标记)为模板，分别以引物P5和P6进行PCR扩增，获得长度为3027bp的pSTV28质粒线性化载体片段，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后备用。pSTV28质粒线性化载体片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
将实施例1中构建的含yfdH基因编码区的DNA片段(988bp，不含点突变)和含yfdHT743C基因编码区的DNA片段(988bp，含点突变)分别与pSTV28质粒线性化载体片段连接，得到重组载体，分别命名为：pSTV28-yfdH和pSTV28-yfdHT743C。
将阳性重组载体pSTV28-yfdHT743C送苏州金唯智公司测序鉴定，并将含有正确点突变(T-C)的重组载体pSTV28-yfdHT743C保存备用。测序结果表明yfdH基因编码区的第743位胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)，最终导致编码蛋白的第248位异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)。
重组载体pSTV28-yfdH含有SEQ ID No.6所示的DNA分子(即yfdH基因和调控元件片段)。SEQ ID No.6所示的DNA分子包含启动子PJ23105、pTrc99a质粒的RBS序列、野生型的yfdH基因、终止子Ttrc。启动子PJ23105和RBS序列则设计在引物P1和引物P6，终止子Ttrc则设计在引物P4和引物P5中。
重组载体pSTV28-yfdHT743C含有SEQ ID No.7所示的DNA分子(即yfdHT743C基因和调控元件片段)。SEQ ID No.7所示的DNA分子包含启动子PJ23105、pTrc99a质粒的RBS序列、yfdHT743C基因、终止子Ttrc。启动子PJ23105和RBS序列则设计在引物P1和引物P6，终止子Ttrc则设计在引物P4和引物P5中。
实施例3、构建含质粒pSTV28、pSTV28-yfdH、pSTV28-yfdHT743C的工程菌株
构建方法：将质粒pSTV28和实施例2中的质粒(pSTV28-yfdH、pSTV28-yfdHT743C)分别电转导入大肠杆菌VHY20中后，在培养基中进行培养，对培养产生的单菌落分别通过引物P7(5'-CAGGGATTGGCTGAGACGAA-3'，SEQ ID No.14)和引物P8(5'-TGTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTC-3'，SEQ ID No.15)进行鉴定，阳性菌株能分别扩增出1075bp、1996bp、1996bp大小条带。阳性菌株被分别命名为VHY21、VHY22、VHY23。重组菌VHY21含有质粒pSTV28；重组菌VHY22含有质粒pSTV28-yfdH；重组菌VHY23含有质粒pSTV28-yfdHT743C。
实施例4、在野生型大肠杆菌MG1655中构建包含质粒pSTV28、pSTV28-yfdH、pSTV28-yfdHT743C的工程菌株
构建方法：将质粒pSTV28和实施例2中的质粒(pSTV28-yfdH、pSTV28-yfdHT743C)分别电转导入大肠杆菌野生型MG1655中后，在培养基中进行培养，对培养产生的单菌落分别通过引物P7(SEQ ID No.14)和引物P8(SEQ ID No.15)进行鉴定，阳性菌株能分别扩增出1075bp、1996bp、1996bp大小条带。阳性菌株被分别命名为MG1655-01、MG1655-02、MG1655-03。重组菌MG1655-01含有质粒pSTV28；重组菌MG1655-02含有质粒pSTV28-yfdH；重组菌MG1655-03含有质粒pSTV28-yfdHT743C。
实施例5、野生型大肠杆菌MG1655和缬氨酸生产菌VHY20中yfdHT743C点突变的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将MG1655和L-缬氨酸生产菌VHY20的yfdH基因编码区内第743bp处的胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)，以此更深入研究突变型yfdHT473C基因在野生型大肠杆菌及L-缬氨酸生产菌VHY20中对L-缬氨酸合成量的影响。
一、sgRNA质粒的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。
扩增含有sgRNA靶序列的DNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-F 10μL，sgRNA-R10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段(含有sgRNA靶序列的DNA片段)，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。
pGRB质粒用Spe I酶切得到线性化pGRB质粒后进行去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10×Buffer 5μL，SpeⅠ2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH2O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10×Buffer 5μL，线性化pGRB质粒DNA 1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH2O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性化pGRB质粒。
将含有sgRNA靶序列的DNA片段与线性化pGRB质粒利用Gibson Assembly试剂盒(New England公司)进行同源重组连接。重组体系：NEB组装酶2.5μL，线性化pGRB质粒2μL，含有sgRNA靶序列的DNA片段0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的sgRNA质粒命名为pGRB-sgRNA-yfdH。
本实验所用引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，带下划线的碱基为pGRB克隆载体同源臂序列，小写字体的碱基为sgRNA靶序列：
sgRNA-F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTactttggaatttagcacttgGTT TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'(SEQ ID No.16)，
sgRNA-R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACcaagtgctaaattccaaagtACT AGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'(SEQ ID No.17)，
sgRNA-PF：5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'(SEQ ID No.18)，
sgRNA-PR：5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'(SEQ ID No.19)。
二、yfdH基因点突变的DNA片段Up-yfdHT743C-Down的获得
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组序列，设计并合成两对扩增上下游同源臂序列的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式分别在大肠杆菌MG1655和缬氨酸生产菌VHY20的yfdH基因中引入T743C点突变。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：
P9:5'-CCTGTCTTCAATGAAGAAGAAG-3'(SEQ ID No.20)，
P10:5'-AATATGATAGTATCTAAAGT CATCCACGCCCCATAAATAA-3'(SEQ ID No.21)，
P11:5'-TTATTTATGGGGCGTGGATGACTTTAGATACTATCATATT-3'(SEQ ID No.22)，
P12:5'-ACATTGACAGTGTTGATGAAG-3'(SEQ ID No.23)。
以MG1655或缬氨酸生产菌VHY20基因组DNA为模板，以引物P9/P10和P11/P12及KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得上同源臂片段740bp和下同源臂片段620bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。以回收后的DNA为模板，以引物P9和P12进行overlap PCR扩增，获得yfdH基因点突变的DNA片段Up-yfdHT743C-Down 1320bp。
PCR扩增和overlap PCR扩增体系：5×HiFi with Mg2+Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH2O至总体积50μL。
PCR扩增和overlap PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸150s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
三、感受态细胞的制备及转化
pREDCas9质粒(含有壮观霉素抗性基因)分别转化到MG1655和缬氨酸生产菌VHY20感受态细胞，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素(100mg/L)的单菌落以pRedCas9-PF/pRedCas9-PR为引物用r Taq进行PCR鉴定，获得943bp的为含有pREDCas9质粒的MG1655-Cas9、VHY20-Cas9转化子。
制备MG1655-Cas9、VHY20-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD600＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD600＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pGRB-sgRNA-yfdH质粒和Up-yfdHT743C-Down片段，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P13/P14用r Taq进行PCR鉴定，PCR扩增出大小660bp的片段送测序，经对测序结果进行比对发生T743C点突变的为阳性菌。
将阳性转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％的***糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-yfdH，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，通过引物P13/P14用r Taq PCR再次鉴定，PCR扩增出含有大小660bp片段，经测序，发生T743C点突变的为阳性转化子。
将对MG1655进行基因编辑，得到的含有点突变yfdHT473C的重组菌(MG1655/yfdHT473C)命名为MG1655-04，将对缬氨酸生产菌VHY20进行基因编辑，得到的含有点突变yfdHT473C的重组菌(VHY20/yfdHT473C)命名为VHY24。
重组菌MG1655-04和VHY24基因组均含有点突变的yfdHT743C基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P13:5'-AAATGGCAAGCAGGTGCTG-3'(SEQ ID No.24)，
P14:5'-CTTCAATTAATGGCTTAATG-3'(SEQ ID No.25)，
pRedCas9-PF:5'-GCAGTGGCGGTTTTCATG-3'(SEQ ID No.26)，
pRedCas9-PR:5'-CCTTGGTGATCTCGCCTTTC-3'(SEQ ID No.27)。
PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH2O总体积25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
实施例6、基因工程菌MG1655:ΔyfdH及VHY20:ΔyfdH的构建
以大肠杆菌MG1655或VHY20基因组为模板，根据yfdH基因编码区外上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yfdH-S、UP-yfdH-A)和下游同源臂引物(DN-yfdH-S、DN-yfdH-A)。以引物UP-yfdH-S/UP-yfdH-A和DN-yfdH-S/DN-yfdH-A及KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得上同源臂片段461bp和下同源臂片段898bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物UP-yfdH-S和DN-yfdH-A进行overlap PCR扩增获得敲除yfdH基因的DNA片段Up-ΔyfdH-Down 1359bp。
PCR扩增和overlap PCR扩增体系：5×HiFi with Mg2+Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPA HiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH2O至总体积50μL。
PCR扩增和overlap PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸150s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
构建pGRB-yfdH：使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yfdH-S和gRNA-yfdH-A的退火制得。
制备MG1655或缬氨酸生产菌VHY20的感受态细胞，构建具有降低yfdH基因表达强度的工程菌株MG1655:ΔyfdH和VHY20：ΔyfdH。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1359bp，原菌PCR扩增片段长度应为1842bp。将得到的MG1655:ΔyfdH命名为MG1655-05；将得到的VHY20：ΔyfdH命名为VHY25。MG1655-05为MG1655的基因组中缺失yfdH基因的菌株；VHY25为VHY20的基因组中缺失yfdH基因的菌株。
引物序列如下所示：
引物UP-yfdH-S：5’-TTTGTGTGTATAAGTTTTGTC-3’(SEQ ID No.28)，
引物UP-yfdH-A：5’-ATGATACTTTTATTGCTTTATTTCGCATCCCTAAAGACAATG-3’(SEQ IDNo.29)，
引物DN-yfdH-S：5’-CATTGTCTTTAGGGATGCGAAATAAAGCAATAAAAGTATCAT-3’(SEQ IDNo.30)，
引物DN-yfdH-A：5’-AAAAGAGTGCATTCGAAAACG-3’(SEQ ID No.31)，
引物gRNA-yfdH-S：5’-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTACTTTGGAATTTAGCACTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’(SEQ ID No.32)，
引物gRNA-yfdH-A：5’-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCAAGTGCTAAATTCCAAAGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3’(SEQ ID No.33)。
实施例7、L-缬氨酸发酵实验
将上述实施例构建的菌株VHY21(空载体对照)、VHY22(过表达yfdH基因)、VHY23(过表达yfdHT743C基因)、VHY24(yfdHT743C点突变)、VHY25(缺失yfdH基因)、MG1655-01(空载体对照)、MG1655-02(过表达yfdH基因)、MG1655-03(过表达yfdHT743C基因)、MG1655-04(yfdHT743C点突变)、MG1655-05(缺失yfdH基因)和对照菌株VHY20、MG1655在ZQZY-CS8T型号的振荡培养箱(购自上海知楚仪器有限公司)进行摇瓶发酵测试。以图1所示的培养基，于37℃、80rpm进行发酵试验，每个菌株重复三次，结果如图2所示。其中种子液用LB培养基培养12h，发酵接种量为10％(27mL发酵液、3mL种子液)。
结果如图2所示，本发明构建的过表达和点突变基因工程菌(VHY22、VHY23、VHY24、MG1655-02、MG1655-03和MG1655-04)的产量均有显著提高，而基因敲除后的重组菌(VHY25和MG1655-05)产量下降，其中，相较对照组VHY21的产量13.53g/L，菌株VHY23的产量为16.23g/L，显著提升了19.96％。同时菌株VHY21(空载体对照)的产量(13.53g/L)与空白对照组VHY20的产量(13.24g/L)无明显差异。
由以上发酵结果可见，无论是在L-缬氨酸生产菌株(如VHY20)还是在野生型大肠杆菌(如MG1655)中过表达yfdH基因或yfdHT743C基因均有助于L-缬氨酸的合成，过表达yfdHT743C基因可以更显著提高L-缬氨酸的产量。此外，无论对于L-缬氨酸生产菌株还是野生型大肠杆菌，对yfdH基因进行点突变，将第743位的T突变为C后(相应地突变蛋白YfdHI248T氨基酸序列的第248位由异亮氨酸突变为苏氨酸)，都有助于L-缬氨酸产量的明显提高。同时，缺失yfdH基因的表达不利于L-缬氨酸的合成。由于补糖量相同，因此产量提高意味着转化率的提高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包括下述任一种：
A1)氨基酸序列包含如SEQ ID No.4所示的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括下述任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述任一种：
C1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；
C2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；
C3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；
C4)含有权利要求2所述核酸分子的重组细胞、或含有C1)所述表达盒的重组细胞、或含有C2)所述重组载体的重组细胞。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，C3)所述重组微生物为下述任一种：
D1)将氨基酸序列包含如SEQ ID No.4所示蛋白质的编码基因导入目的微生物得到的重组微生物；
D2)将编码序列包含如SEQ ID No.3所示的DNA分子导入目的微生物得到的重组微生物；
D3)将目的微生物基因组中SEQ ID No.1所示DNA分子第743位的核苷酸T突变为C后得到的重组微生物。
5.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2所述的核酸分子或权利要求3或4所述生物材料的下述任一种应用：
E1)在调控微生物L-缬氨酸的产量中的应用；
E2)在制备L-缬氨酸中的应用；
E3)在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用。
6.F1)-F4)中任一项在调控微生物L-缬氨酸的产量、制备L-缬氨酸或构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用，其中所述F1)-F4)为：
F1)氨基酸序列包含如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
F2)编码F1)所述蛋白质的核酸分子；
F3)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
F4)含有F2)所述核酸分子或F3)所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞。
7.一种提高目的微生物L-缬氨酸的产量或制备L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：
G1)提高目的微生物中的权利要求2所述核酸分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
G2)提高目的微生物中的权利要求6中F2)所述核酸分子或F3)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
G3)对目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物，所述突变包括：将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第248位的异亮氨酸突变为苏氨酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目的微生物为大肠杆菌。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：
H1)将氨基酸序列包含如SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.2所示蛋白质的编码基因导入所述目的微生物；
H2)将编码序列包含如SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.1所示的DNA分子导入所述目的微生物；
H3)将目的微生物基因组中SEQ ID No.1所示DNA分子第743位的核苷酸T突变为C。
10.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3或4所述的生物材料、权利要求6中所述的蛋白质、核酸分子、DNA分子、表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞在制备含有L-缬氨酸的食品、化妆品、药品或饲料中的应用。
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