CN116875577A - 胺脱氢酶突变体、核酸、表达载体、制备方法和应用 - Google Patents
胺脱氢酶突变体、核酸、表达载体、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种胺脱氢酶突变体、核酸、表达载体、制备方法和应用,该胺脱氢酶突变体包含SEQ ID NO:2第40、68、113、261、291、294位氨基酸中至少一个突变。该胺脱氢酶突变体可以催化高浓度前手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应合成手性胺,产率高且满足99%+立体选择性的要求,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种胺脱氢酶突变体,同时本发明还涉及一种编码上述胺脱氢酶突变体的核酸以及上述胺脱氢酶突变体的表达载体、制备方法和应用。
背景技术
随着人民生活水平的不断提高,脂肪族胺表面活性剂的人均用量将大大增加。此外,脂肪族胺经常用于各种产品,包括抗静电剂、颜料分散剂、金属防腐剂和药物。脂肪族胺市场预计将是增长最快的胺类市场,预计到2025年将达到29亿美元。手性脂肪族胺是药物分子、天然产物和有机材料中广泛存在的亚结构,是其他官能团和增值分子合成的常见手性组成部分。此外,在最畅销的200种药物中,超过一半的小分子药物是手性脂肪族胺的衍生物。因此,纯脂肪族胺的对映选择性合成已被公认为化学界的热点之一。通过蛋白质工程的手段可以将催化氨基酸底物的氨基酸脱氢酶改造为以酮、醛为底物的胺脱氢酶(AmDH)。采用AmDH催化以潜手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应合成手性胺的路线具有绿色高效、成本低及产物光学纯度高的优点,是手性胺合成最理想的反应之一。脂肪族但目前报道的AmDH种类极少且底物谱窄,严重限制了其工业应用。
发明内容
有鉴于此,本发明提出了一种胺脱氢酶突变体,以催化前手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应合成手性胺,提高产率。
为达上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种胺脱氢酶突变体,其特征在于,所述的胺脱氢酶突变体包含SEQ ID NO:2第40、68、113、261、291、294位氨基酸中至少一个突变。
进一步的,所述的胺脱氢酶突变体包含SEQ ID NO:2的下列任一种突变:
A):第40位由L突变为A或G;
B):第68位由K突变为S;
C):第113位由A突变为G;
D):第114位由E突变为V;
E):第134位由T突变为G;
F):第261位由N突变为L;
G):第291位由V突变为A、C或G;
H):第294位由V突变为A、C或G。
3.根据1或2所述的胺脱氢酶突变体,其特征在于,所述的胺脱氢酶突变体选自下列(a1)-(a16)中的任一种:
(a1)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L;
(a2)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L;第40位氨基酸残基由L突变为A;
(a3)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第40位氨基酸残基由L突变为G;
(a4)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第113位氨基酸残基由A突变为G;
(a5)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第114位氨基酸残基由E突变为V;
(a6)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第134位氨基酸残基由T突变为G;
(a7)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第291位氨基酸残基由V突变为A;
(a8)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,且第261位氨基酸残基由N突变为L,第291位氨基酸残基由V突变为C;
(a9)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,且第261位氨基酸残基由N突变为C,第291位氨基酸残基由V突变为G;
(a10)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,且第261位氨基酸残基由N突变为L,第294位氨基酸残基由V突变为C;
(a11)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第294位氨基酸残基由V突变为G;
(a12)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第294位氨基酸残基由V突变为A;
(a13)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第113位氨基酸残基由A突变为G,第134位氨基酸残基由T突变为G;
(a14)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第40位氨基酸残基由L突变为A,第113位氨基酸残基由A突变为G,第134位氨基酸残基由T突变为G;
(a15)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第113位氨基酸残基由A突变为G,第134位氨基酸残基由T突变为G,第294位氨基酸残基由V突变为A。
本发明还提出了一种编码上述的胺脱氢酶突变体的核酸。
本发明进一步提出了一种上述的胺脱氢酶突变体的表达载体。
本发明进一步提出了一种上述的胺脱氢酶突变体的制备方法,其特征在于,该方法包括将编码所述的胺脱氢酶突变体的核酸导入细胞中,培养该细胞,获得胺脱氢酶突变体。
本发明进一步提出了一种上述的胺脱氢酶突变体用于催化羟基酮和潜手性酮类化合物发生转氨反应制备手性胺中的应用。
本发明进一步提出了一种式I所示化合物的制备方法,该方法包括以式II为底物在上述的胺脱氢酶突变体催化下获得;
式I:式II:/>
本发明所述的胺脱氢酶突变体具有较高的还原胺化活性和产率,可以催化高浓度前手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应合成手性胺,且具有较高的立体选择性,具有广阔的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1:(R)-2-戊胺的不对称合成路线;
图2:(R)-2-己胺的不对称合成路线;
图3:(R)-2-庚胺的不对称合成路线;
图4:(R)-2-辛胺的不对称合成路线;
图5:(R)-2-壬胺的不对称合成路线;
图6:(R)-苯乙胺的不对称合成路线。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。另外,除本实施例特别说明之外,本实施例中所涉及的各术语及工艺依照现有技术中的一般认知及常规方法进行理解即可。
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
pET28a载体:Novagen,产品目录编号:69864-3。
大肠杆菌BL21(DE3):北京全式金生物技术有限公司,货号:CD601-02。
LB培养基:每升10g胰蛋白冻(Tryptone),5g酵母提取物(Yeast extract),5gNaCl,1ml 1mol/LNaOH调pH至7.4用去离子水定容至1L.高压下蒸汽灭菌20min。
TB培养基:每升12g胰蛋白冻(Tryptone),24g酵母提取物(Yeast extract),87%甘油4mL,磷酸缓冲溶液(pH 6.5)100mL,用去离子水定容至1L.高压下蒸汽灭菌20min。
实施例1、突变位点的筛选确定
对来源于Pueribacillus theae的天然氨基酸脱氢酶蛋白(如SEQ ID NO:2所示,其编码基因(AmDH基因)如SEQ ID NO:1所示)进行序列分析、突变和功能验证,特定选择了12个氨基酸位点,通过进一步研究分析从12个氨基酸位点中筛选出了4个重要的氨基酸位点。将这4个氨基酸位点进行不同形式突变,得到突变体蛋白。
4个氨基酸位点及其突变形式如表1所示。
表1:15种突变形式
实施例2、重组菌的制备
一、野生型重组表达载体的构建
将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列***至pET28a载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到重组表达载体pET28a-AmDH,测序验证正确。
二、突变体重组表达载体的构建
将编码突变体a1-a15的核苷酸序列(见表2)***至pET28a载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到重组表达载体pET28a-1-15,测序验证正确。
三、重组菌的制备
1、将步骤一得到的重组表达载体pET28a-AmDH转化大肠杆菌BL21(DE3),得到野生型重组菌。
2、将步骤二中制备的重组表达载体pET28a-1-15分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),得到突变体重组菌,依次编号为突变体重组菌1-15。
实施例3、氨基酸脱氢酶突变体蛋白的酶活力测定
培养实施例2得到的野生型重组菌和突变体重组菌1-15,提取蛋白,并检测酶活。
1、将重组菌接种于10mL LB液体培养基中,所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素,37℃、180rpm振荡培养16h,获得种子液。再将种子液接种到50mL的TB培养基中(接种量1%),所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素,37℃、180rpm振荡培养至菌液OD600nm0.6-0.8,加入终浓度0.5μM的IPTG,继续20℃、180rpm振荡培养20-24h,5000rcf离心15min收集菌体。
将所述重组菌菌体采用50mM 50mL的PBS洗涤重悬2次,重悬后利用匀浆机破碎,12000rpm离心15min,收集上清即为粗酶液。
2、野生型重组菌进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为野生型蛋白溶液。突变体重组菌1-15进行上述步骤得到的蛋白溶液依次命名为突变体1-突变体15蛋白溶液。Bradford法测蛋白质浓度。
配制酶活检测反应体系:反应缓冲溶液2M的NH4Cl/NH3·H2O 850μL,底物终浓度10mM,待测蛋白溶液100μL(蛋白含量约为0.1mg),NADH终浓度1mM。30℃反应3min。340nm处测定反应前后吸光值的变化。
根据吸光值变化计算酶活:
酶活计算公式:
其中,EW:340nm处1min吸光值的变化量;V:反应体系的总体积,单位为mL;6220:摩尔消光系数,单位为L/mol/cm;l:比色皿的光程距离
比酶活计算公式:
其中,U:酶活;mg:蛋白含量
结果见表3。
表3酶活统计结果
活性U/g | |
野生型 | 0 |
突变体1 | 78.1 |
突变体2 | 29.4 |
突变体3 | / |
突变体4 | 320.4 |
突变体5 | 89.7 |
突变体6 | 137.1 |
突变体7 | 97.4 |
突变体8 | 80.2 |
突变体9 | 73.5 |
突变体10 | 88.2 |
突变体11 | 92.1 |
突变体12 | 77.8 |
突变体13 | 725.7 |
突变体14 | 701.5 |
突变体15 | 791.4 |
实施例4:(R)-2-戊胺的不对称合成
合成路线见图1,将2-戊酮(0.5mol)、NAD+(0.005mol)、2M的NH4Cl/NH4OH溶液50mL、胺脱氢酶突变体1-15(PT-AmDH-M1-PT-AmDH-M15)(0.22mmol)、GDH(0.22mmol)、葡萄糖(1.5mol)、异丙醇2.5mL加入50mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物24h,反应完成后,用乙酸乙酯(3×5m L)萃取混合物。1mL萃取液,加入100μL乙酸酐,漩涡震荡10s。利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值,色谱条件:Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm),柱温程序:起始温度50℃,10℃/min速率升温至200℃,200℃保留5min。得到(R)-2-戊胺,收率99%,ee值为99%。
实施例5:(R)-2-己胺的不对称合成
合成路线见图2,将2-己酮((0.5mol)、NAD+(0.005mol)、2M的NH4Cl/NH4OH溶液50mL、胺脱氢酶突变体15(PT-AmDH-M15)(0.22mmol)、GDH(0.22mmol)、葡萄糖(1.5mol)、异丙醇2.5mL加入50mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物24h,反应完成后,用乙酸乙酯(3×5m L)萃取混合物。1mL萃取液,加入100μL乙酸酐,漩涡震荡10s。利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值,色谱条件:Agilent J&WCP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm),柱温程序:起始温度50℃,10℃/min速率升温至200℃,200℃保留5min。得到(R)-2-己胺,收率99%,ee值为99%。
实施例6:(R)-2-庚胺的不对称合成
合成路线见图3,将2-庚酮(0.5mol)、NAD+(0.005mol)、2M的NH4Cl/NH4OH溶液50mL、胺脱氢酶突变体15(PT-AmDH-M15)(0.22mmol)、GDH(0.22mmol)、葡萄糖(1.5mol)、异丙醇2.5mL加入50mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物24h,反应完成后,用乙酸乙酯(3×5m L)萃取混合物。1mL萃取液,加入100μL乙酸酐,漩涡震荡10s。利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值,色谱条件:Agilent J&WCP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm),柱温程序:起始温度50℃,10℃/min速率升温至200℃,200℃保留5min。得到(R)-2-庚胺,收率99%,ee值为99%。
实施例7:(R)-2-辛胺的不对称合成
合成路线见图4,将2-辛酮(0.5mol)、NAD+(0.005mol)、2M的NH4Cl/NH4OH溶液50mL、胺脱氢酶突变体1-15(PT-AmDH-M1-PT-AmDH-M15)(0.22mmol)、GDH(0.22mmol)、葡萄糖(1.5mol)、异丙醇2.5mL加入50mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物24h,反应完成后,用乙酸乙酯(3×5m L)萃取混合物。1mL萃取液,加入100μL乙酸酐,漩涡震荡10s。利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值,色谱条件:Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm),柱温程序:起始温度50℃,10℃/min速率升温至200℃,200℃保留5min。得到(R)-2-辛胺,收率92%,ee值为99%。
实施例8:(R)-2-壬胺的不对称合成
合成路线见图5,(0.5mol)、NAD+(0.005mol)、2M的NH4Cl/NH4OH溶液50mL、胺脱氢酶突变体15(PT-AmDH-M15)(0.22mmol)、GDH(0.22mmol)、葡萄糖(1.5mol)、异丙醇2.5mL加入50mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物24h,反应完成后,用乙酸乙酯(3×5m L)萃取混合物。1mL萃取液,加入100μL乙酸酐,漩涡震荡10s。利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值,色谱条件:Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm),柱温程序:起始温度50℃,10℃/min速率升温至200℃,200℃保留5min。得到(R)-2-壬胺,转化率82%,ee值为99%。
实施例9:(R)-苯乙胺的不对称合成
合成路线见图6,(0.5mol)、NAD+(0.005mol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液50mL、胺脱氢酶突变体15(PT-AmDH-M15)(0.22mmol)、GDH(0.22mmol)、葡萄糖(1.5mol)、异丙醇2.5mL加入50mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物24h,反应完成后,用乙酸乙酯(3×5m L)萃取混合物。1mL萃取液,加入100μL乙酸酐,漩涡震荡10s。利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值,色谱条件:Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm),柱温程序:起始温度50℃,10℃/min速率升温至200℃,200℃保留5min。得到(R)-苯乙胺,收率33%,ee值为99%。
本发明的胺脱氢酶突变体催化高浓度前手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应合成手性胺,产率高且满足99%+立体选择性的要求,具有广阔的应用前景。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
/>
/>
/>
/>
/>
Claims (8)
1.一种胺脱氢酶突变体,其特征在于,所述的胺脱氢酶突变体包含SEQ ID NO:2第40、68、113、261、291、294位氨基酸中至少一个突变。
2.根据权利要求1所述的胺脱氢酶突变体,其特征在于,所述的胺脱氢酶突变体包含SEQ ID NO:2的下列任一种突变:
A):第40位由L突变为A或G;
B):第68位由K突变为S;
C):第113位由A突变为G;
D):第114位由E突变为V;
E):第134位由T突变为G;
F):第261位由N突变为L;
G):第291位由V突变为A、C或G;
H):第294位由V突变为A、C或G。
3.根据1或2所述的胺脱氢酶突变体,其特征在于,所述的胺脱氢酶突变体选自下列(a1)-(a15)中的任一种:
(a1)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L;
(a2)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L;第40位氨基酸残基由L突变为A;
(a3)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第40位氨基酸残基由L突变为G;
(a4)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第113位氨基酸残基由A突变为G;
(a5)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第114位氨基酸残基由E突变为V;
(a6)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第134位氨基酸残基由T突变为G;
(a7)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S;第261位氨基酸残基由N突变为L,第291位氨基酸残基由V突变为A;
(a8)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,且第261位氨基酸残基由N突变为L,第291位氨基酸残基由V突变为C;
(a9)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,且第261位氨基酸残基由N突变为C,第291位氨基酸残基由V突变为G;
(a10)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,且第261位氨基酸残基由N突变为L,第294位氨基酸残基由V突变为C;
(a11)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第294位氨基酸残基由V突变为G;
(a12)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第294位氨基酸残基由V突变为A;
(a13)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第113位氨基酸残基由A突变为G,第134位氨基酸残基由T突变为G;
(a14)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第40位氨基酸残基由L突变为A,第113位氨基酸残基由A突变为G,第134位氨基酸残基由T突变为G;
(a15)SEQ ID NO:2第68位氨基酸残基由K突变为S,第261位氨基酸残基由N突变为L,第113位氨基酸残基由A突变为G,第134位氨基酸残基由T突变为G,第294位氨基酸残基由V突变为A。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述的胺脱氢酶突变体的核酸。
5.一种权利要求1-3任一所述的胺脱氢酶突变体的表达载体。
6.一种权利要求1-3任一所述的胺脱氢酶突变体的制备方法,其特征在于,该方法包括将编码所述的胺脱氢酶突变体的核酸导入细胞中,培养该细胞,获得胺脱氢酶突变体。
7.一种根据权利要求1-3任一项所述的胺脱氢酶突变体用于催化羟基酮和潜手性酮类化合物发生转氨反应制备手性胺中的应用。
8.一种式I所示化合物的制备方法,其特征在于,该方法包括以式II为底物在权利要求1-3任一所述的胺脱氢酶突变体催化下获得;
式I:式II:/>
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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