CN116875550B - 一种FABP4+C1q+巨噬细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞及其制备方法和用途，属于肿瘤免疫学及生物技术领域，具体公开了一种同时高表达FABP4和C1q的双阳性巨噬细胞的制备方法和在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途，该群FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞具有强大的炎性细胞因子产生及吞噬能力，具有更强的抗肿瘤功能，FABP4⁺C1q⁺双阳性巨噬细胞在肿瘤部位及区域引流***免疫微环境中浸润多，提示肿瘤免疫治疗疗效更好。可见，本发明得到的体外培养诱导的FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞，作为肿瘤免疫治疗药物的有效组分，对恶性肿瘤对具有很好的治疗作用。

Description

一种FABP4+C1q+巨噬细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于肿瘤免疫学及生物技术领域，尤其涉及一种FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞及其制备方法和用途。

背景技术

恶性肿瘤是一类预后极差的疾病，涉及到细胞异常增殖和分化，其主要的治疗途径包括手术切除、放疗、化疗、靶向以及免疫治疗等方法。

近十年，免疫检查点抑制剂（immune checkpointinhibitors，ICIs）药物为主导的免疫治疗显著改善了恶性肿瘤患者预后。然而，ICIs等免疫治疗的确切作用机制以及如何筛获益人群成为巨大挑战。目前，只有少数研究阐述了免疫治疗的疗效可能与个体肿瘤免疫微环境（tumor immunemicroenvironment, TME）免疫浸润异质性有关。因此，探究肿瘤免疫治疗的潜在预测标志物至关重要，可为患者提供个体化精准治疗策略。

研究表明，经过免疫治疗后恶性肿瘤TME将会发生重塑。巨噬细胞作为TME中最具异质性的一群细胞，基因表达谱具有多样性，不同基因表达谱的巨噬细胞也具有不同功能，有必要对巨噬细胞亚群按照基因表达谱细致划分，探究肿瘤免疫治疗相关的新型巨噬细胞亚群的功能机制。

目前，尚未见有关FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞及其制备方法和用途。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、外周血单个核细胞（PBMC）提取：从外周血密度梯度离心法获取单个核细胞，使用磁珠分选CD14⁺单核细胞；

S2、FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞诱导：用含有10% FBS，1%双抗，50ng/ml M-CSF的RPMI-1640完全培养基重悬并培养步骤S1分选出的CD14⁺单核细胞，调整浓度至1×10⁶个/ml，并接种于细胞培养皿中培养；

S3、诱导培养条件：以2-3天为周期进行半定量换液，培养7-9天，培养出M0巨噬细胞，通过流式荧光分选出FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞。

在步骤S1中，用等体积PBS缓冲液稀释健康外周血形成稀释液，细胞分层液与稀释液的比为1:1，将稀释液沿着管壁缓慢加到细胞分层液里，梯度离心1800r/min，18min；离心后，将上层透明PBS缓冲液用无菌吸管慢慢吸取并弃掉，剩下1-2ml，无菌吸管***云雾带吸取外周血单个核细胞并洗涤2遍； CD14 Microbeads磁珠分选CD14⁺单核细胞。

本发明的另一目的是提供上述制备方法得到的FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞。

本发明的另一目的是提供一种上述FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞的用途。

实现上述目的的技术方案如下：

FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途。

进一步地，所述FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞同时高表达FABP4及C1q。

进一步地，所述FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞产生的炎性细胞因子包括但不限于TNF-α、IL-6和IL-1β。

进一步地，所述肿瘤的类型包括实体瘤和非实体瘤。

进一步地，所述肿瘤的类型包括肺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、舌癌、黑色瘤、淋巴瘤、甲状腺癌、乳腺癌、头颈鳞癌和胃癌。

进一步地，所述肿瘤的类型为肺癌。

脂肪酸结合蛋白FABP4属于脂肪酸结合蛋白家族的重要成员之一，参与脂质代谢过程和炎症性疾病。FABP4对细胞和全身脂质信号介质组成以及炎症过程有重要影响，表达FABP4的巨噬细胞经常诱导巨噬细胞炎症，并在动脉粥样硬化、新型冠状病毒感染和多种癌症的发展中发挥重要作用。

补体蛋白C1q是补体经典途径的识别分子，具有补体和非补体功能，在TME中发挥重要作用。C1q可以结合源自自身、非自身的各种配体，并调节免疫和非免疫细胞功能发挥补体功能；C1q的非补体功能体现在诱导血管生成、突触修剪、参与炎症感染坏死细胞和肿瘤细胞以及其他凋亡细胞的清除等方面。

本发明的有益效果为：

本发明公开了一种同时高表达FABP4和C1q的双阳性巨噬细胞的制备方法和在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途，该群FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞具有强大的炎性细胞因子产生及吞噬能力，具有更强的抗肿瘤功能，FABP4⁺C1q⁺双阳性巨噬细胞在肿瘤部位及区域引流***免疫微环境中浸润多，提示肿瘤免疫治疗疗效更好。

可见，本发明得到的体外培养诱导的FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞，作为肿瘤免疫治疗药物的有效组分，对恶性肿瘤对具有很好的治疗作用。特别是针对肺癌具有很好的疗效。

此外，本发明的FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞可作为生物学标志物对肿瘤免疫治疗效果等进行评估，且该群FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞为肿瘤免疫治疗提供一种新的途径，具有临床转化前景。

附图说明

下面通过参考附图并结合实例具体地描述本发明，本发明的优点和实现方式将会更加明显，其中附图所示内容仅用于对本发明的解释说明，而不构成对本发明的任何意义上的限制，在附图中：

图1为肿瘤组织和局部引流***内CD68⁺FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞多色免疫组化染色图。

图2为图1中不同患者***内CD68⁺FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞浸润数量的对比图。

图3为图1中不同患者肿瘤组织内CD68⁺FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞浸润数量的对比图。

图4为FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞和非FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞产生炎性细胞因子的归一化模式荧光锋图。

图5为FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞和非FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞产生炎性细胞因子的平均荧光强度对比图。

图6为FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞和非FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞吞噬作用的归一化模式荧光峰图。

图7为FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞和非FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞吞噬作用的平均荧光强度对比图。

图8为FABP4⁺巨噬细胞进行siRNA转染后炎性细胞因子表达水平对比图。

图9为FABP4⁺巨噬细胞进行siRNA转染后巨噬细胞脂肪酸分解途径酶和巨噬细胞脂肪酸合成酶的表达水平对比图。

图10为FABP4⁺巨噬细胞进行siRNA转染后巨噬细胞凋亡检测图。

图11为FABP4⁺巨噬细胞进行siRNA转染后巨噬细胞凋亡率对比图。

图12为C1q⁺巨噬细胞进行siRNA转染后炎性细胞因子的归一化模式荧光峰图。

图13为C1q⁺巨噬细胞进行siRNA转染后炎性细胞因子的平均荧光强度对比图。

图14为C1q⁺巨噬细胞进行siRNA转染后炎性细胞因子表达水平对比图。

图15为C1q⁺巨噬细胞进行siRNA转染后巨噬细胞吞噬作用的归一化模式荧光峰图。

图16为C1q⁺巨噬细胞进行siRNA转染后巨噬细胞吞噬作用的平均荧光强度对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

多色免疫组化染色：

S1、烤片：将石蜡包埋的病理组织切片置于架子内，65 ℃烤片2 h；

S2、走罐：二甲苯-Ⅰ，二甲苯-Ⅱ，二甲苯-Ⅲ中依次梯度脱蜡；复水：无水乙醇-Ⅰ，无水乙醇-Ⅱ，95%乙醇，75%乙醇；

S3、用10%中性***固定10 min；

S4、抗原修复：应用（pH = 9.0）抗原修复液微波炉高温抗原修复；

S5、洗片：切片晾凉后，用免疫组化疏水笔勾画组织边界，应用Opal-7-color-Manual IHC试剂盒内的一抗稀释液（封闭液）封闭10 min，降低非特异性；

S6、孵育一抗：甩去切片表面封闭液，滴加一抗，覆盖组织，将湿盒置于4 ℃过夜；

S7、孵育二抗：第二天，将湿盒从冰箱内取出，放在室温复温半小时，将Opal-7-color-Manual IHC试剂盒内的辣根过氧化物酶二抗（鼠兔通用）滴加在组织上，室温孵育10min；

S8、荧光染料孵育：二抗孵育完成后，选取特定通道的Opal荧光染料滴加至切片组织内，覆盖组织，室温孵育10 min；

S9、第二轮抗原修复：荧光染料孵育完毕后，用1× TBST洗片3遍，每遍3 min；进行第二轮次抗原修复，微波炉高温修复抗原，多轮次的染色：重复步骤S6-S9；

S10、细胞核染色：晾凉后，加入DAPI染料染细胞核，室温孵育10 min；

S11、封片：孵育DAPI完毕后，应用抗荧光衰减封片剂封片；

结果表明：

如图1至图3所示：通过多色免疫组化进行染色，发现在MPR（主要病理缓解）患者肿瘤组织及局部引流***组织中CD68⁺FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞浸润多于non-MPR（非主要病理缓解）患者。

这一结果提示了FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞浸润多少影响免疫治疗的有效率，尤其是anti-PD-1治疗的有效率。

本发明应用MPR对免疫治疗疗效进行评估，手术切除的肿瘤组织内活性肿瘤成分小于10%定义为疗效良好。

体外CD68⁺FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞功能探究：

外周血单个核细胞（PBMC）提取及FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞诱导：

S1、用等体积PBS缓冲液稀释健康外周血形成稀释液，细胞分层液（Ficoll）：稀释液= 1:1，将稀释液沿着管壁缓慢加到Ficoll里，梯度离心 1800r/min，18 min（升9降0）；离心后，将上层透明PBS缓冲液用无菌吸管慢慢吸取并弃掉，剩下约1-2ml，吸管***云雾带吸取PBMCs并洗涤2遍；磁珠（CD14 Microbeads）分选CD14⁺单核细胞；

S2、培养诱导巨噬细胞：用含有10% FBS，1%双抗（青链霉素混合液），50ng/ml M-CSF的RPMI-1640完全培养基重悬并培养上述分选出的CD14⁺单核细胞，调整浓度至1×10⁶个/ml，并接种于细胞培养皿中培养；

S3、培养时，以2-3天为周期进行半定量换液；培养7-9天，培养出M0巨噬细胞，应用流式荧光分选出FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞。

应用流式细胞术分别检测FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞及非FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞炎性细胞因子产生水平及吞噬能力。

结果表明：

如图4和图5所示：FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞（FABP4^highC1q⁺巨噬细胞）的TNF-α（α肿瘤坏死因子）、 IL-6（白细胞介素-6）、 IL-1β（白细胞介素-1β）炎性细胞因子产生能力强于非FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞（非FABP4^highC1q⁺巨噬细胞）。

如图6和图7所示：FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞（FABP4^highC1q⁺巨噬细胞）吞噬能力强于非FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞（非FABP4^highC1q⁺巨噬细胞）。

敲降巨噬细胞中FABP4表达将降低巨噬细胞炎性细胞因子IL-6及IL-1β产生水平，增加巨噬细胞凋亡率，促进巨噬细胞脂肪酸分解：

提取PBMC并分选出CD14⁺单核细胞，应用M-CSF等因子培养7天后，将诱导成功的巨噬细胞进行siRNA转染。

结果表明：

如图8所示：siFABP4组（干扰FABP4组）的巨噬细胞炎性细胞因子IL-6和IL-1β表达水平下降。这一结果提示了FABP4可以增强巨噬细胞的炎性细胞因子产生能力。

如图9所示：siFABP4组（干扰FABP4组）的巨噬细胞脂肪酸分解途径酶（CPT1、ACADM、HADHA）表达增加，脂肪酸合成酶（FASN、ACACA）表达降低。这一结果提示了FABP4促进巨噬细胞脂肪酸合成，调节巨噬细胞能量代谢和储存。

如图10和图11所示：siFABP4组（干扰FABP4组）的巨噬细胞凋亡比率更高。这一结果提示了FABP4可以对巨噬细胞存活起重要作用。

敲低巨噬细胞中C1q表达将降低其炎性细胞因子产生及吞噬功能：

提取PBMC并分选出CD14⁺单核细胞，应用M-CSF等因子培养7天后，将诱导成功的巨噬细胞进行siRNA转染。

结果表明：

如图12至14所示：siC1q组（干扰C1q组）的巨噬细胞的炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α产生水平下降。这一结果提示了C1q可以增强巨噬细胞的炎性细胞因子产生能力。

如图15和16所示：siC1q组（干扰C1q组）的巨噬细胞吞噬能力降低。这一结果提示了C1q对巨噬细胞吞噬功能起到重要作用。

其中，图2、图3、图5、图7、图8、图9、图11、图13、图14和图16中的p值为判定假设检验结果的参数，*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001，****p值<0.0001，ns p值>0.05。

本发明在实验过程中，应用单细胞测序技术分析了ICIs联合化疗后手术的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的肿瘤及其相关组织内巨噬细胞景观差异，鉴定了一群与免疫联合化疗疗效相关的FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞。

ICIs 联合化疗后MPR患者肿瘤组织及局部引流***组织中浸润更多的 FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞。且FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞具有强大的促炎性细胞因子产生及吞噬能力。上述结果提示FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞可以作为恶性肿瘤免疫治疗的预测靶标，具有强大的抗肿瘤作用。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (1)

1.一种FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞在制备非小细胞肺癌免疫治疗药物中的用途，其特征在于：所述FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、外周血单个核细胞提取：从外周血密度梯度离心法获取单个核细胞，使用磁珠分选CD14⁺单核细胞；

S2、FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞诱导：用含有10% FBS，1%双抗，50ng/ml M-CSF的RPMI-1640完全培养基重悬并培养步骤S1分选出的CD14⁺单核细胞，调整浓度至1×10⁶个/ml，并接种于细胞培养皿中培养；

S3、诱导培养条件：以2-3天为周期进行半定量换液，培养7-9天，培养出M0巨噬细胞，通过流式荧光分选出FABP4⁺C1q⁺巨噬细胞。