CN116867498A - 用于通过选择性饲料添加剂干预减少致病性大肠杆菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及通过施用包含脱水部分的糖组合物来调节动物的胃肠道中存在的致病性大肠杆菌(EIIEC、EPEC、APEC)的水平的方法。致病性大肠杆菌菌株的存在/载量可以经由宿主动物的微生物群系中LEE和非LEE致病基因的水平来评定。

Description

用于通过选择性饲料添加剂干预减少致病性大肠杆菌的方法
技术领域
本发明涉及减少大肠杆菌(E.coli)发病机理。本发明涉及一种通过减少动物胃肠道中大肠杆菌病原体的群体来改善生产动物的健康的方法。更具体地，本发明涉及减少宿主动物的微生物群系中致病性大肠杆菌菌株的肠上皮细胞清除基因座(locus forenterocyte effacement,LEE)基因和非LEE致病基因的群体的方法。本发明还涉及减少宿主动物的微生物群系中的多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的群体。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种用途极其广泛的微生物。除了作为正常肠道菌群的成员外，大肠杆菌菌株还会引起膀胱感染、脑膜炎和腹泻。致泻性大肠杆菌包括至少五种类型的大肠杆菌，它们会引起范围从霍乱样腹泻到极度结肠炎的各种症状。每种类型的致腹泻性大肠杆菌都具有特定的毒力因子集合，所述毒力因子包括粘附素、侵袭素和/或毒素，所述所述毒力因子负责导致特定类型的腹泻。
致肠病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)是全世界婴儿腹泻的主要原因。EPEC疾病的特征为不同严重程度的水样腹泻，以及常伴有体液损失的呕吐和发烧。除了发达国家日托和托儿所中的孤立暴发外，EPEC对发展中国家幼儿(<6个月)构成了主要的地方性健康威胁。
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorragic E.coli，EHEC)，也称为产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin producing E.coli,STEC)，会导致比EPEC(肠性结肠炎)更严重的腹泻，并且在约10％的病例中，这种疾病会进展为一种往往致命的肾脏疾病，溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)。EHEC O157:H7是加拿大和美国最常见的血清型，并且与食物和水中毒相关联(Perna等人，2001,Nature 409:529-533)。EHEC的其他血清型也在世界范围内引起重大问题。EHEC寄生于牛并引起A/E病变，但不会引起成年动物患病，而是替代地将生物体排入环境中。然而，这会导致严重的健康问题，因为感染人类所需的EHEC相对较少。
与其他大肠杆菌腹泻(例如产肠毒素大肠杆菌)不同，EHEC和EPEC引起的腹泻不是由毒素介导的。相反，EPEC和EHEC与肠表面结合(EPEC与小肠表面结合，EHEC与大肠表面结合)并引起特征性组织学病变，称为粘附和消除(attaching and effacing,A/E)病变(Tauschek等人2002,Mol.Microbiol 44；1533-1550.)。A/E病变的标志是细菌附着部位处的肠刷状缘表面溶解和上皮微绒毛丧失(消除)。一旦结合，细菌就会驻留在杯状突起或基座上。在上皮细胞中在这个基座下方是几种细胞骨架组分，包括肌动蛋白和肌动蛋白相关的细胞骨架蛋白。在附着的细菌下方A/E病变和富含肌动蛋白的基座的形成是A/E病原体的组织病理学标志(Nataro等人,1998,Clin Microbiol Rev 11:142-201,和Frankel等人,1998Mol Microbiol 30:911-921)。
EPEC和EHEC属于A/E病原体家族，包括几种引起兔子(REPEC)、猪(PEPEC)和小鼠(鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium))疾病的类EPEC动物病原体。这些病原体包含致病岛(pathogenicity island,PAI)，所述致病岛编码对疾病至关重要的专门分泌***和分泌的毒力因子。A/E病变形成所需的基因被认为聚集在单个染色体毒力岛中，所述单个染色体毒力岛被称为肠上皮细胞清除基因座(LEE)，所述LEE包括调控元件、III型分泌***(type III secretion system,TTSS)、分泌的效应蛋白及其同源伴侣(Elliott等人,1998,Mol Microbiol 28:1-4；Perna等人,1998,Infect Immun 66:3810-3817；Zhu等人,2001,Infect Immun 69:2107-2115；Deng等人,2001,Infect Immun 69:6323-6335)。
LEE包含41个基因，使其成为较复杂的PAI之一。LEE TTSS的主要功能是将效应物递送到宿主细胞内，它们在所述宿主细胞破坏宿主细胞功能并介导疾病。已鉴定出五种LEE编码的效应物(Tir、EspG、EspF、Map和EspH)。Tir(用于易位的紧密黏附素受体)易位到宿主细胞中，它在所述宿主细胞中结合宿主细胞骨架和信号传导蛋白并在细菌附着位点处启动肌动蛋白聚合，从而导致在粘附细菌下方形成肌动蛋白基座结构，所述肌动蛋白基座结构经由细菌外膜蛋白紧密黏附素直接与Tir的细胞外环相互作用。CesT作为Tir稳定性和分泌的伴侣蛋白发挥作用。
A/E病原体中还已表征了另外四种LEE编码的TTSS易位效应物：EspH增强肌动蛋白基座的伸长；EspF在拆分肠上皮细胞之间的紧密接合部中发挥作用；EspG与志贺氏菌属微管结合效应物VirA相关；并且Map定位于线粒体，但也在肌动蛋白动力学中发挥作用。Ler(用于LEE编码的调节物)是鉴定出的唯一LEE编码的调节物。
禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli,APEC)是禽类肠外感染的病原体，是属于ExPEC类的致病型。APEC引起的肠外感染被称为大肠杆菌病并且表征为内脏器官周围的纤维蛋白病变，例如败血症、肠炎、肉芽肿、脐炎、鼻窦炎、气囊炎、关节炎/滑膜炎、腹膜炎、心包炎、肝周炎、蜂窝组织炎和肿头综合征(Kunert等人,2015,World's PoultryScience Journal.71；249-258)。APEC感染还会导致蛋的产量、品质和孵化率下降。必须考虑人畜共患传播的可能性，因为家禽是APEC的主要宿主并且食用未煮熟的家禽可能会感染人类，人类可作为这种病原体的贮库(Markland等人,Zoonoses and Public Health.2015；doi:10.1111/zph.12194)。
这种致病型是肉鸡和蛋鸡肠外感染的病原体，并且这些感染统称为大肠杆菌病。大肠杆菌病在许多国家造成了重大经济损失。它影响家禽业的所有生产周期和所有部门。它导致肉鸡和蛋鸡的高发病率和死亡率。大肠杆菌菌株当从具有大肠杆菌病病变特征的禽类和被这种细菌杀死的禽类中分离出时可被指定为APEC。被指定为APEC的大肠杆菌必须具有一些毒力基因，例如编码粘附素、铁清除***、保护素和其他毒力性状的毒力基因。仅基于诱发因素的控制方法无法有效预防大肠杆菌病。
细菌多形拟杆菌是在人类和小鼠中均最丰富的拟杆菌门物种之一，拟杆菌门是肠道微生物菌群的三大门之一(Qin J等人,2010,Nature,464,第59-65页)。已经观察到，参与代谢、定殖和毒力的EHEC NIPH-11060424基因的表达响应于与多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)的直接接触以及从多形拟杆菌释放的可溶性因子而受到调节。有人建议与多形拟杆菌的直接接触可以作为生态位特异性信号起作用，所述生态位特异性信号使EHEC准备好与宿主细胞更有效地相互作用，从而增加毒力潜力(Iversen等人,2015,PLoSONE 10(2):e0118140.doi:10.1371/journal.pone.0118140)。
传统上，减少或消除生产动物中的致病性大肠杆菌菌株通常聚焦于借助于例如抗生素的药物来消除动物胃肠道中的细菌。鉴于人们关于微生物群系及其在宿主动物的消化***中的作用的了解不断增加，需要确定新颖的非抗生素方式来减少生产动物中的致病性大肠杆菌群体。换句话说，需要确定调节微生物群系中致病性大肠杆菌群体的新颖方式，并由此改善宿主动物的健康。
发明内容
本发明涉及一种用于减少动物的胃肠道(GIT)中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在一个实施方式中，外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体被测量为在所述动物的微生物群系内检测到的LEE基因和非LEE基因的组合拷贝数与在所述微生物群系内检测到的基因的总拷贝数的比率％。
本发明还涉及一种用于减少动物的胃肠道(GIT)中的多形拟杆菌的群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在一个实施方式中，多形拟杆菌的群体被测量为在所述动物的微生物群系内检测到的多形拟杆菌的群体与所述微生物群系内的微生物的总群体的比率％。
本发明还涉及一种用于减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在一个实施方式中，所述炎症的减少被测量为在所述动物的微生物群系内检测到的LEE基因和非LEE基因的拷贝数与在所述微生物群系内检测到的基因的总拷贝数的比率％。
在上述发明的一些实施方式中，所述微生物群系是从动物的粪便样品或从动物的GIT内收集的样品收集的。在一些实施方式中，基因拷贝数测量通过RT-PCR计数、全长16SRNA测序或宏基因组DNA测序执行。在一个实施方式中，LEE基因包括：Tir、Map、EspB、EspF、EspG、EspH和EspZ，并且非LEE致病基因包括：EspG2、EspJ、EspM1/2、EspT、EspW、Cif、NleA、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF和NleH。在一个实施方式中，本发明的方法适用于生产动物。
附图说明
图1是示出饲喂包含本发明的寡糖制备物的日粮的鸡和饲喂不包含所述寡糖制备物的对照日粮的对照鸡组的GIT中多形拟杆菌的相对丰度的变化的图表；后者设置为100％。
图2是示出饲喂包含本发明的寡糖制备物的日粮的鸡和饲喂不包含所述寡糖制备物的对照日粮的对照鸡组的GIT的宏基因组中LEE基因和非LEE致病基因的相对丰度的图表。
具体实施方式
本文所用的术语仅出于描述特定情况的目的，而并不旨在进行限制。如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个(种)”和“该”旨在也包括复数形式。此外，在详细描述和/或权利要求书中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“含有”或其变体的范围内，此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式为包含性的。
应当理解的是，诸如“包含”、“包括”、“含有”的术语具有美国专利法中赋予其的含义；即，它们意谓“包括”、“包含”、“含有”等并且旨在是包含性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤；并且例如“基本上由……组成”的术语具有美国专利法赋予其的含义；即，它们允许未明确列举的要素，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特性的要素。
定义
如本文中例如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“寡糖”可指单糖、或含有两个或更多个通过糖苷键连接的单糖亚基的化合物。寡糖制备物中的寡糖还可以指脱水单糖；或含有两个或更多个单糖亚基的化合物，其中至少一个单糖单元被脱水亚基替换。“寡糖”可以任选地被官能化。如本文所用，术语寡糖涵盖所有种类的寡糖，其中寡糖中的每个单糖亚基独立地且任选地被其对应的脱水单糖亚基官能化和/或替换。
术语“寡糖制备物”和“合成寡糖制备物”在本文中可互换使用，并且是指如WO2020/097458中详细描述且如下所述制造的寡糖制备物。
“脱水亚基”可以是单糖(或单糖亚基)或糖焦糖化产物的可逆热脱水产物。例如，“脱水亚基”可以是脱水单糖，例如脱水葡萄糖。作为另一个示例，“脱水亚基”可以通过糖苷键与一个或多个常规或脱水单糖亚基连接。
寡糖制备物中的寡糖的特征可在于含有两个或更多个通过糖苷键连接的单糖亚基。就此而言，术语“低聚葡萄糖”可指葡萄糖或含有通过糖苷键连接的两个或更多个葡萄糖单糖亚基的化合物。“低聚葡萄糖”还可以指脱水葡萄糖；或含有通过糖苷键连接的两个或更多个葡萄糖单糖亚基的化合物，其中至少一个单糖亚基被脱水葡萄糖亚基替换。类似地，“低聚半乳糖”可以指半乳糖；或含有通过糖苷键连接的两个或更多个半乳糖单糖亚基的化合物。“低聚半乳糖”还可指脱水半乳糖；或含有通过糖苷键连接的两个或更多个半乳糖单糖亚基的化合物，其中至少一个单糖亚基被脱水半乳糖亚基替换。类似地，低聚葡萄糖-半乳糖可以是低聚葡萄糖；低聚半乳糖；或含有通过糖苷键连接的一个或多个葡萄糖单糖亚基和一个或多个半乳糖单糖亚基的化合物，其中所述单糖亚基中的至少一个单糖亚基被其相应的脱水单糖亚基替换。低聚葡萄糖-半乳糖-木糖可以指由葡萄糖、半乳糖和木糖的缩合反应产生的化合物。包含低聚葡萄糖-半乳糖-木糖的寡糖制备物可包含低聚葡萄糖-半乳糖、低聚葡糖-木糖、低聚半乳糖-木糖，以及含有通过糖苷键连接的一个或多个葡萄糖单糖亚基、一个或多个木糖单糖亚基和一个或多个半乳糖单糖亚基的化合物。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“单糖单元”和“单糖亚单元”可互换使用。“单糖亚基”可指寡糖中的单糖单体。对于寡糖制备物中聚合度为1的寡糖，该寡糖可以被称为单糖亚基或单糖。对于寡糖制备物中聚合度高于1的寡糖，其单糖亚基经由糖苷键连接。
如本文所用，术语“常规单糖”可指不含脱水亚基的单糖。术语“常规二糖”可指不含脱水亚基的二糖。因此，术语“常规亚基”可指不是脱水亚基的亚基。
如本文所用，术语“相对丰度”或“丰度”可指就物质存在的普遍或稀有程度而言所述物质的丰度。例如，包含以相对丰度计10％的含脱水亚基的寡糖的DP1级分可以指多种DP1寡糖，其中所述DP1寡糖的按数量计10％是脱水单糖。
聚合度(DP)分布：寡糖制备物的聚合度分布可以通过任何合适的分析方法和仪器来确定，包括但不限于端基法、渗透压法(渗透压测定法)、超速离心、粘度测量、光散射法、尺寸排阻色谱法(SEC)、SEC-MALLS、场流分级法(field flow fractionation,FFF)、不对称流场流分级法(asymmetric flow field flow fractionation,A4F)、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)和质谱法(mass spectrometry,MS)。例如，聚合度的分布可以通过质谱法(例如MALDI-MS、LC-MS或GC-MS)确定和/或检测。对于另一个示例，聚合度分布可以通过SEC，例如凝胶渗透色谱法(gel permeationchromatography,GPC)来确定和/或检测。作为又一个示例，聚合度分布可以通过HPLC、FFF或A4F来确定和/或检测。在另一示例中，寡糖制备物的聚合度可基于其分子量和分子量分布来确定(关于更详细的描述，请参见WO 2020/097458)。
脱水亚基水平：在一些实施方式中，本文所述的寡糖制备物的n个寡糖级分中的每个寡糖级分独立地包含脱水亚基水平。例如，在一些实施方式中，DP1级分包含以相对丰度计10％的含脱水亚基的寡糖，并且DP2级分包含以相对丰度计15％的含脱水亚基的寡糖。对于另一个示例，在一些实施方式中，DP1级分、DP2级分和DP3级分各自包含以相对丰度计分别为5％、10％和2％的含脱水亚基的寡糖。在其他实施方式中，两个或更多个寡糖级分可以包含相似水平的含脱水亚基的寡糖。例如，在一些实施方式中，DP1级分和DP3级分各自包含以相对丰度计约5％的含脱水亚基的寡糖。
脱水亚基水平可以通过任何合适的分析方法来测定，所述分析方法为例如核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)光谱法、质谱法、HPLC、FFF、A4F、或它们的任何组合。在一些实施方式中，脱水亚基水平是至少部分地通过质谱法例如MALDI-MS测定的。在一些实施方式中，脱水亚基水平可至少部分地通过NMR测定。在一些实施方式中，脱水亚基水平可至少部分地通过HPLC测定。例如，在一些实施方式中，脱水亚基的水平可以通过MALDI-MS测定，如在WO 2020/097458中更详细说明的。
糖苷键：在一些实施方式中，本文所述的寡糖制备物包含多种糖苷键。糖苷键的类型和分布可以取决于寡糖制备物的来源和制造方法。在一些实施方式中，各种糖苷键的类型和分布可以通过本领域已知的任何合适的方法(例如NMR)来测定和/或检测。例如，在一些实施方式中，糖苷键是通过质子NMR、碳NMR、2D NMR(例如2D JRES、HSQC、HMBC、DOSY、COSY、ECOSY、TOCSY、NOESY或ROESY)或它们的任何组合来测定和/或检测的。在一些实施方式中，糖苷键是至少部分地通过质子NMR测定和/或检测的。在一些实施方式中，糖苷键是至少部分地通过碳NMR测定和/或检测的。在一些实施方式中，糖苷键是至少部分地通过2DHSQC NMR测定和/或检测的。
在一些实施方式中，寡糖制备物可包含一个或多个α-(1,2)糖苷键、α-(1,3)糖苷键、α-(1,4)糖苷键、α-(1,6)糖苷键、β-(1,2)糖苷键、β-(1,3)糖苷键、β-(1,4)糖苷键、β-(1,6)糖苷键、α(1,1)α糖苷键、α(1,1)β糖苷键、β(1,1)β糖苷键，或它们的任何组合。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物的糖苷键类型分布为约0mol％至60mol％、5mol％至55mol％、5mol％至50mol％、5mol％至45mol％、5mol％至40mol％、5mol％至35mol％、5mol％至30mol％、5mol％至25mol％、10mol％至60mol％、10mol％至55mol％、10mol％至50mol％、10mol％至45mol％、10mol％至40mol％、10mol％至35mol％、15mol％至60mol％、15mol％至55mol％、15mol％至50mol％、15mol％至45mol％、15mol％至40mol％、15mol％至35mol％、20mol％至60mol％、20mol％至55mol％、20mol％至50mol％、20mol％至45mol％、20mol％至40mol％、20mol％至35mol％、25mol％至60mol％、25mol％至55mol％、25mol％至50mol％、25mol％至45mol％、25mol％至40mol％、或25mol％至35mol％的α-(1,6)糖苷键。
分子量：寡糖制备物的分子量和分子量分布可以通过任何合适的分析手段和仪器来确定，所述分析手段和仪器为例如端基法、渗透压(渗透压测定法)、超速离心、粘度测量、光散射法、SEC、SEC-MALLS、FFF、A4F、HPLC和质谱分析法。在一些实施方式中，分子量和分子量分布是通过质谱分析法，例如MALDI-MS、LC-MS或GC-MS测定的。在一些实施方式中，分子量和分子量分布是通过尺寸排阻色谱法(SEC)，例如凝胶渗透色谱法(GPC)测定的。在其他实施方式中，分子量和分子量分布是通过HPLC测定的。在一些实施方式中，分子量和分子量分布是通过MALDI-MS测定的。
在一些实施方式中，寡糖制备物的重均分子量为约100g/mol至10000g/mol、200g/mol至8000g/mol、300g/mol至5000g/mol、500g/mol至5000g/mol、700g/mol至5000g/mol、900g/mol至5000g/mol、1100g/mol至5000g/mol、1300g/mol至5000g/mol、1500g/mol至5000g/mol、1700g/mol至5000g/mol、300g/mol至4500g/mol、500g/mol至4500g/mol、700g/mol至4500g/mol、900g/mol至4500g/mol、1100g/mol至4500g/mol、1300g/mol至4500g/mol、1500g/mol至4500g/mol、1700g/mol至4500g/mol、1900g/mol至4500g/mol、300g/mol至4000g/mol、500g/mol至4000g/mol、700g/mol至4000g/mol、900g/mol至4000g/mol、1100g/mol至4000g/mol、1300g/mol至4000g/mol、1500g/mol至4000g/mol、1700g/mol至4000g/mol、1900g/mol至4000g/mol、300g/mol至3000g/mol、500g/mol至3000g/mol、700g/mol至3000g/mol、900g/mol至3000g/mol、1100g/mol至3000g/mol、1300g/mol至3000g/mol、1500g/mol至3000g/mol、1700g/mol至3000g/mol、1900g/mol至3000g/mol、2100g/mol至3000g/mol、300g/mol至2500g/mol、500g/mol至2500g/mol、700g/mol至2500g/mol、900g/mol至2500g/mol、1100g/mol至2500g/mol、1300g/mol至2500g/mol、1500g/mol至2500g/mol、1700g/mol至2500g/mol、1900g/mol至2500g/mol、2100g/mol至2500g/mol、300g/mol至1500g/mol、500g/mol至1500g/mol、700g/mol至1500g/mol、900g/mol至1500g/mol、1100g/mol至1500g/mol、1300g/mol至1500g/mol、2000-2800g/mol、2100-2700g/mol、2200-2600g/mol、2300-2500g/mol、或2320-2420g/mol。在一些实施方式中，寡糖制备物的重均分子量为约2000g/mol至2800g/mol、2100g/mol至2700g/mol、2200g/mol至2600g/mol、2300g/mol至2500g/mol、或2320g/mol至2420g/mol。
寡糖的类型：在一些实施方式中，本文提及的寡糖制备物中存在的寡糖的种类可取决于一种或多种进料糖的类型。例如，在一些实施方式中，当进料糖包括葡萄糖时，寡糖制备物包含低聚葡萄糖。例如，在一些实施方式中，当进料糖包括半乳糖时，寡糖制备物包含低聚半乳糖。对于另一个示例，在一些实施方式中，当进料糖包括半乳糖和葡萄糖时，寡糖制备物包含低聚葡萄糖-半乳糖。
在一些实施方式中，寡糖制备物包含一种或多种种类的单糖亚基。在一些实施方式中，寡糖制备物可包含具有1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种不同种类的单糖亚基的寡糖。
寡糖制备物的制造方法：WO 2020/097458中详细描述了制造根据本发明的寡糖制备物的方法，所述方法包括将包含一种或多种进料糖和催化剂的水性组合物加热至足以诱导聚合的温度和时间，其中所述催化剂选自由以下项组成的组：(+)-樟脑-10-磺酸；2-吡啶磺酸；3-吡啶磺酸；8-羟基-5-喹啉磺酸水合物；α-羟基-2-吡啶甲磺酸；(β)-樟脑-10-磺酸；丁基膦酸；二苯基次膦酸；己基膦酸；甲基膦酸；苯基次膦酸；苯基膦酸；叔丁基膦酸；SS)-VAPOL磷酸氢盐；6-喹啉磺酸、3-(1-吡啶基)-1-丙磺酸盐；2-(2-吡啶基)乙磺酸；3-(2-吡啶基)-5,6-二苯基-1,2,4-三嗪-p,p'-二磺酸一钠盐水合物；1,1'-联萘基-2,2'-二基-磷酸氢盐；双(4-甲氧基苯基)次膦酸；苯基(3,5-二甲苯基)次膦酸；L-磺基丙氨酸一水合物；聚(苯乙烯磺酸-共聚-二乙烯基苯)；赖氨酸；乙二磺酸；乙磺酸；羟乙磺酸；同型半胱氨酸；HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(4-丁磺酸))；HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；2-羟基-3-吗啉代丙磺酸；2-(N-吗啉代)乙磺酸；甲磺酸；甲酰肼；萘-1-磺酸；萘-2-磺酸；全氟丁磺酸；6-磺基奎诺糖；三氟甲磺酸；2-氨基乙磺酸；苯甲酸；氯乙酸；三氟乙酸；己酸；庚酸；辛酸；壬酸；月桂酸；棕榈酸；硬脂酸；花生酸；天冬氨酸；谷氨酸；丝氨酸；苏氨酸；谷氨酰胺；半胱氨酸；甘氨酸；脯氨酸；丙氨酸；缬氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；甲硫氨酸；苯丙氨酸；酪氨酸；色氨酸。
在一些实施方式中，进料糖的聚合是通过逐步增长聚合来实现的。在一些实施方式中，进料糖的聚合是通过缩聚来实现的。
进料糖：制造本文所述的寡糖制备物的方法中所用的一种或多种进料糖可包含一种或多种类型的糖。在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括单糖、二糖、三糖、四糖、或它们的任何混合物。
在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括葡萄糖。在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括葡萄糖和半乳糖。在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括葡萄糖、木糖和半乳糖。在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括葡萄糖和甘露糖。在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括葡萄糖和果糖。在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括葡萄糖、果糖和半乳糖。在一些实施方式中，所述一种或多种进料糖包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一”、“一个(种)”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“一种试剂”包括多种此类试剂，提及“该寡糖”包括提及一种或多种寡糖(或多种寡糖)及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
当范围在本文中用于物理性质(例如分子量)或化学性质(例如化学式)时，旨在包括范围的所有组合和子组合以及其中的具体实施方式。当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所体积的数字或数值范围是在实验变异性(或统计实验误差)内的近似值，并且因此在一些情况下，数字或数值范围将在所述数字或数值范围的1％与15％之间变化。
在本申请中可互换使用的术语“微生物群系”和“肠道微生物群系”是指驻留在消化道中的微生物，例如细菌、病毒、真菌、霉菌、原生动物等，负责将动物饮食中未消化和未吸收的组分转化为数以千计的生物活性代谢物。这些代谢物继而与动物的局部和全身生理学以及动物的外部环境相互作用。
减少动物的微生物群系中致病性大肠杆菌的群体的方法
在本发明中，展示了一种改善生产动物的健康的方法。本发明的方法的优选实施方式涉及一种通过减少动物的微生物群系中大肠杆菌的群体来改善生产动物的健康的方法。在一个实施方式中，本发明的方法涉及一种通过减少动物的微生物群系中致病性大肠杆菌的群体，与此同时对非致病性大肠杆菌产生较小或不显著的影响来改善生产动物的健康的方法。在优选实施方式中，大肠杆菌群体的选择性调节是通过减少动物的微生物群系中致病性大肠杆菌细菌(例如肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC))的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体实现的。在另一实施方式中，本发明涉及一种通过减少动物的微生物群系中多形拟杆菌的群体来改善生产动物的健康的方法。在一个具体实施方式中，上述健康益处通过用选择性饲料添加剂(例如寡糖和精油)饲喂生产动物来激发。
肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)是致腹泻性人类病原体。被这些致病性大肠杆菌菌株感染的标志是在肠上皮细胞中形成附着和消除(A/E)病变，所述病变的特征为富含肌动蛋白的基座状结构中刷状缘微绒毛的消除以及细菌与肠上皮细胞的紧密附着。致病性大肠杆菌基因组中的肠上皮细胞消除基因座(LEE)编码了III型蛋白分泌***(T3SS)，所述T3SS将多种效应蛋白易位到宿主细胞中以破坏细胞功能，从而使病原体受益。这些效应物由LEE区域内和外的基因编码。体外细胞培养感染已经表明，细菌与上皮细胞的紧密附着需要LEE效应物，而非LEE效应物主要在调节肠道上皮细胞的炎症和细胞凋亡中发挥作用(Massiel等人，2020,DOI:10.5772/intechopen.91677)。
令人惊讶的是，本申请的发明人已经鉴定出了一些选择性营养饲料添加剂，例如寡糖和精油，它们可以显著干扰致病性大肠杆菌(例如EHEC、EPEC和APEC)的生长。本发明中已表明，饲喂适量的上述选择性饲料添加剂可有助于减少宿主动物的微生物群系中LEE基因和非LEE致病基因的群体。换句话说，当通过选择性营养添加剂处理宿主动物时，致病性大肠杆菌细菌的LEE基因(其负责在宿主动物的肠道上皮细胞中形成附着和消除(A/E)病变)在其在所述宿主动物的GIT微生物群系中的群体％方面有所减少。此外，本申请的发明人观察到负责调节肠上皮中的炎症和细胞凋亡的致病性大肠杆菌细菌的非LEE致病基因也在其在宿主动物的GIT微生物群系中的群体％方面有所减少。这导致宿主动物的GIT的全身感染和局部感染减少。
本申请的发明人还观察到，选择性营养饲料添加剂可降低宿主动物的GIT微生物群系中大肠杆菌的群体％。具体地，GIT微生物群系中致病性大肠杆菌细菌的群体％减少，这可能是由于观察到EHEC、EPEC和APEC的LEE编码的效应物和非LEE编码的效应物的丰度降低。
同样令人惊讶的是，本申请的发明人发现，相同的选择性营养饲料添加剂可以显著减少GIT微生物群系中多形拟杆菌的群体％。据报道，肠出血性大肠杆菌(EHEC)的毒力与肠道共生体多形拟杆菌相协调。影响这种共生体可对EHEC有后续影响。已知多形拟杆菌作为生态位特异性信号发挥作用，所述生态位特异性信号使EHEC准备好与宿主细胞更有效地相互作用，从而增加了毒力潜力。因此，从GIT微生物群系中减少或去除多形拟杆菌可以减少EHEC与宿主动物的GIT上皮细胞的相互作用，并由此防止或减轻大肠杆菌(例如EHEC)对宿主动物的致病性。
在动物的生理水平上，本申请中鉴定的选择性营养饲料添加剂有助于治疗动物的腹泻和营养吸收障碍以及其他不良健康结局。这是通过减少宿主动物的微生物群系中致病性大肠杆菌细菌和/或其协调者(coordinator)多形拟杆菌的群体并由此减轻由此类细菌引起的致病性来实现的。
因此，本发明的优选实施方式涉及一种用于减少动物的胃肠道(GIT)中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物的步骤：寡糖和精油，其中所述外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
在一个实施方式中，外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体的减少通过LEE基因和非LEE基因与微生物群系中基因总量的比率％来测量。换句话说，所述减少被测量为微生物群系中致病性大肠杆菌的群体的变化。在另一实施方式中，所述减少通过LEE基因和非LEE基因与大肠杆菌管家基因拷贝数的比率％来测量。换句话说，所述减少被测量为微生物群系的总大肠杆菌群体中致病性大肠杆菌的群体的变化。在一些实施方式中，以LEE基因和非LEE基因的比率％计的群体减少为相较于对照动物低至少5％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一个实施方式中，LEE基因包括：Tir、Map、EspB、EspF、EspG、EspH和EspZ。在另一实施方式中，非LEE致病基因包括：EspG2、EspJ、EspM1/2、EspT、EspW、Cif、NleA、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF和NleH。
本发明的另一优选实施方式涉及一种用于减少动物的胃肠道(GIT)中的多形拟杆菌的群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
在一些实施方式中，以多形拟杆菌与微生物群系中的微生物总数的比率％计的群体减少是相对于对照动物低至少5％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。
本发明的另一优选实施方式涉及一种用于减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
在一些实施方式中，以炎症相关的非LEE基因与微生物群系中基因总量的比率％计的群体减少是相对于对照动物低至少5％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、或至少60％。在一个实施方式中，炎症相关的非LEE基因包括：NleA、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF和NleH。
本发明的另一优选实施方式涉及一种减少动物的胃肠道(GIT)中的大肠杆菌群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在具体实施方式中，所述大肠杆菌是致病性大肠杆菌。在具体实施方式中，所述致病性大肠杆菌包括EPEC、EHEC和APEC。
在一个实施方式中，动物的GIT中的大肠杆菌的群体被测量为所述动物的微生物群系内的大肠杆菌标记基因的拷贝数相对于在所述微生物群系内检测到的细菌标记基因的总拷贝数的％。在一些实施方式中，动物的GIT中的大肠杆菌群体的减少是相对于对照动物低至少5％、至少15％、至少20％或至少30％。
在一个实施方式中，微生物群系是从动物的粪便消化物样品中收集的。在另一实施方式中，微生物群系是从动物GIT内的某一位置收集的。在一个实施方式中，微生物群系是从鸡的GIT收集的。在一些实施方式中，所述位置是鸡的十二指肠、空肠、回肠、盲肠或结直肠。
微生物群系中任何微生物的任何基因的群体或微生物群系的群体的测量可以使用适用于该目的的任何现有或未来方法进行。在一个实施方式中，这种测量是通过宏基因组DNA测序执行的。在另一实施方式中，所述测量是通过RT-PCT计数执行的。在具体实施方式中，细菌管家标记基因rpoB用于RT-PCT计数。在另一实施方式中，测量是通过全长16SRNA测序执行的。
在本发明中已经观察到，通过向生产动物的饲料中添加选择性饲料添加剂产生了上述健康益处。这些添加剂是精密化合物，所述精密化合物选择性地调节宿主动物的微生物群系的组成和功能。这种微生物群系的选择性调节靶向宿主动物的微生物群系中的致病性大肠杆菌及其协调者多形拟杆菌。
在实施方式中，饲料添加剂是寡糖。在优选的实施方式中，寡糖包括但不限于聚糖、酵母细胞壁产物和/或合成寡糖制备物。在另一优选实施方式中，寡糖是合成寡糖制备物，其中所述合成寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且其中每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。为了产生本申请中所述的健康益处，根据于动物的类型及其生长阶段需要合适量的寡糖。然而，为了获得健康益处，需要最少量的寡糖。在一种实施方式中，寡糖为至少200mg/L饲料。在另一实施方式中，寡糖为至少400mg/L饲料。在一个实施方式中，寡糖在200mg/L饲料与2000mg/L饲料之间。在一个实施方式中，寡糖的浓度是给予生产动物组的饲料的至少50ppm(例如至少50ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm)。
在一些实施方式中，寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物的至少一个级分包含以相对丰度计小于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的含脱水亚基的寡糖；和/或其中所述寡糖制备物的每个级分包含以相对丰度计大于0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的含脱水亚基的寡糖。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物的重均分子量为具有约300g/mol至5000g/mol(例如，约2000g/mol至2800g/mol、2100g/mol至2700g/mol、2200g/mol至2600g/mol、2300g/mol至2500g/mol、或2320g/mol至2420g/mol)、500g/mol至5000g/mol、700g/mol至5000g/mol、500g/mol至2000g/mol、700g/mol至2000g/mol、700g/mol至1500g/mol、300g/mol至1500g/mol、300g/mol至2000g/mol、400g/mol至1300g/mol、400g/mol至1200g/mol、400g/mol至1100g/mol、500g/mol至1300g/mol、500g/mol至1200g/mol、500g/mol至1100g/mol、600g/mol至1300g/mol、600g/mol至1200g/mol、或600g/mol至1100g/mol；和/或其中所述寡糖制备物的数均分子量为约1000g/mol至2000g/mol、1100g/mol至1900g/mol、1200g/mol至1800g/mol、1300g/mol至1700g/mol、1400g/mol至1600g/mol、或1450g/mol至1550g/mol。
在一些实施方式中，寡糖制备物的n个级分中的每个级分中的所述寡糖相对丰度随其聚合度单调递减。
在一些实施方式中，在寡糖制备物的至少5个、10个、20个或30个DP级分中的所述寡糖相对丰度随着其聚合度而单调降低。
在一些实施方式中，寡糖制备物包含以相对丰度计少于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的含脱水亚基的寡糖。
在一些实施方式中，寡糖制备物的每个级分包含以相对丰度计少于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的含脱水亚基的寡糖。
在一些实施方式中，寡糖制备物的至少一个级分包含以相对丰度计大于2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、或80％的含脱水亚基的寡糖。
在一些实施方式中，寡糖制备物包含以相对丰度计大于2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％、30％、40％、50％、60％、70％、或80％的含脱水亚基的寡糖。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物的每个级分包含以相对丰度计大于20％、21％、22％、23％、24％或25％的含脱水亚基的寡糖。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物的大于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％的含脱水亚基的寡糖具有仅一个脱水亚基。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物具有以相对丰度计1％至40％的DP1级分含量。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物具有以相对丰度计1％至35％的DP2级分含量。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物具有以相对丰度计1％至30％的DP3级分含量。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物具有以相对丰度计0.1％至20％的DP4级分含量。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物具有以相对丰度计0.1％至15％的DP5级分含量。
在一些实施方式中，寡糖制备物的DP2级分与DP1级分的比率以相对丰度计为0.02-0.40。
在一些实施方式中，寡糖制备物的DP3级分与DP2级分的比率以相对丰度计为0.01-0.30。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物中DP1级分和DP2级分的总计含量以相对丰度计小于50％、30％或10％。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物包含至少103种、104种、105种、106种或109种不同的寡糖种类。
在一些实施方式中，寡糖制备物的两种或更多种独立的寡糖包含不同的脱水亚基。
在一些实施方式中，寡糖制备物包含一个或多个脱水亚基，所述一个或多个脱水亚基是单糖可逆热脱水的产物。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物包含一个或多个脱水葡萄糖、脱水半乳糖、脱水甘露糖、脱水阿洛糖、脱水阿卓糖、脱水古洛糖、脱水艾杜糖、脱水塔罗糖、脱水果糖、脱水核糖、脱水***糖、脱水鼠李糖、脱水来苏糖或脱水木糖亚基。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物包含一个或多个脱水葡萄糖、脱水半乳糖、脱水甘露糖、或脱水果糖亚基。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物包含一个或多个1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖或1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖亚基。在一些实施方式中，所述寡糖制备物包含1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖和1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖脱水亚基两者。
在一些实施方式中，寡糖制备物中1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖与1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖之比为约10:1至1:10、9:1至1:10、8:1至1:10、7:1至1:10、6:1至1:10、5:1至1:10、4:1至1:10、3:1至1:10、2:1至1:10、10:1至1:9、10:1至1:8、10:1至1:7、10:1至1:6、10:1至1:5、10:1至1:4、10:1至1:3、10:1至1:2、或1:1至3:1。
在一些实施方式中，寡糖制备物中1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖与1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖之比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:8、1:9、或1:10。
在一些实施方式中，寡糖制备物中1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖与1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖之比为约2:1。
在一些实施方式中，寡糖制备物的每种级分中1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖与1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖之比为约10:1至1:10、9:1至1:10、8:1至1:10、7:1至1:10、6:1至1:10、5:1至1:10、4:1至1:10、3:1至1:10、2:1至1:10、10:1至1:9、10:1至1:8、10:1至1:7、10:1至1:6、10:1至1:5、10:1至1:4、10:1至1:3、10:1至1:2、或1:1至3:1。
在一些实施方式中，寡糖制备物的每个级分中1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖与1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖之比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:8、1:9、或1:10。
在一些实施方式中，寡糖制备物的每个级分中1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖与1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖之比为约2:1。
在一些实施方式中，寡糖制备物中的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的脱水亚基选自由以下项组成的组：1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖和1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物的重均分子量为约300g/mol至5000g/mol、500g/mol至5000g/mol、700g/mol至5000g/mol、500g/mol至2000g/mol、700g/mol至2000g/mol、700g/mol至1500g/mol、300g/mol至1500g/mol、300g/mol至2000g/mol、400g/mol至1300g/mol、400g/mol至1200g/mol、400g/mol至1100g/mol、500g/mol至1300g/mol、500g/mol至1200g/mol、500g/mol至1100g/mol、600g/mol至1300g/mol、600g/mol至1200g/mol、或600g/mol至1100g/mol。
在一些实施方式中，所述寡糖制备物的数均分子量为约300g/mol至5000g/mol、500g/mol至5000g/mol、700g/mol至5000g/mol、500g/mol至2000g/mol、700g/mol至2000g/mol、700g/mol至1500g/mol、300g/mol至1500g/mol、300g/mol至2000g/mol、400g/mol至1000g/mol、400g/mol至900g/mol、400g/mol至800g/mol、500g/mol至900g/mol、或500g/mol至800g/mol。
在一些实施方式中，聚合度分布是通过MALDI-MS、GC-MS、LC-MS、SEC、HPLC和/或他们的组合(例如MALDI-MS和SEC)测定和/或检测的。
在一些实施方式中，寡糖制备物的聚合度可以基于其分子量和分子量分布来确定。
本文提及的寡糖制备物的特征可为如上所述的寡糖制备物的任何一种、两种或更多种或甚至全部的单独特征。换句话说，寡糖制备物的特征可为上述单独特征的任意组合。例如，在根据本发明的方法的具体实施方式中，寡糖制备物的特征可为组合的寡糖制备物特征的组合，所述寡糖制备物的特征可为寡糖制备物的至少5、10、20或30DP级分的相对寡糖丰度随着其聚合度单调降低；寡糖制备物的DP2级分含量以相对丰度计为1％至35％；寡糖制备物中DP1级分和DP2级分的总计含量以相对丰度计小于50％、30％或10％；以及寡糖制备物中1,6-脱水-β-D-呋喃葡萄糖与1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖的比率为约2:1。
在一些实施方式中，寡糖制备物以至少50g/吨饲料(例如至少70g/吨饲料、100g/吨饲料、200g/吨饲料、300g/吨饲料、400g/吨饲料、500g/吨饲料、600g/吨饲料、700g/吨饲料、800g/吨饲料、900g/吨饲料)被包含在营养组合物中；和/或其中寡糖制备物以至少50ppm(例如至少50ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm)的包含率被包含在营养组合物中；和/或其中所述寡糖制备物以至少50ppm(例如至少50ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm)的浓度被包含在营养组合物中。
在一些实施方式中，施用寡糖制备物达至少一天，优选至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天、100天、101天、102天、103天、104天、105天、106天、107天、108天、109天、110天、111天、112天、113天、114天、115天、116天、117天、118天、119天、120天、121天、122天、123天、124天、125天、126天、127天、128天、129天、130天、131天、132天、133天、134天、135天、136天、137天、138天、139天、140天、141天、142天、143天、144天、145天、146天、147天、148天、149天、150天、151天、152天、153天、154天、155天、156天、157天、158天、159天、160天、161天、162天、163天、164天、165天、166天、167天、168天、169天、170天、171天、172天、173天、174天、175天、176天、177天、178天、179天、180天、181天、182天、183天、184天、185天、186天、187天、188天、189天、190天、191天、192天、193天、194天、195天、196天、197天、198天、199天、200天、201天、202天、203天、204天、205天、206天、207天、208天、209天、210天、211天、212天、213天、214天、215天、216天、217天、218天、219天、220天、221天、222天、223天、224天、225天、226天、227天、228天、229天、230天、231天、232天、233天、234天、235天、236天、237天、238天、239天、240天、241天、242天、243天、244天、或245天，最优选持续地(即不间断地)施用营养组合物。
寡糖制备物可以以粉末制剂形式提供，所述粉末制剂包含至少20％(w/w)的本文提及的寡糖制备物；至少25％(wt/wt)的平均粒径D小于或等于3000μm(例如100-500μm、200-500μm、200-300μm)的基于二氧化硅的吸附物(例如硅藻土、无定形沉淀二氧化硅)；以及任选的0-25％(wt/wt)的水和/或辅助物质；其中％基于所述粉末制剂的总重量。例如，此类粉末制剂可包含30-70％(wt/wt)的本文提及的寡糖制备物；30-70％(wt/wt)的基于二氧化硅的吸附物(例如平均粒径为至少50μm)；和0-21％(wt/wt)的水；其中％基于所述粉末制剂的总重量。在一些实施方式中，寡糖制备物如WO 2020/097458的实施例22-26和33中任一所述配制，所述文献以引用方式并入本文。
在另一实施方式中，饲料添加剂是精油。为了产生本申请中所述的健康益处，根据动物的类型及其生长阶段需要合适量的精油。然而，为了获得健康益处，需要最少量的精油。在一些实施方式中，精油为所述饲料的200ppm、至少250ppm、至少300ppm、至少350ppm、至少400ppm、至少450ppm、或至少500ppm。在一些实施方式中，饲料中精油的浓度介于100-1000ppm之间、介于100-800ppm之间、介于100-600ppm之间、介于200-500ppm之间、介于200-400ppm之间。
在一些实施方式中，本发明涉及寡糖(例如聚糖、酵母细胞壁和/或(合成)寡糖制备物)和/或精油用于以下的用途：a)减少动物的胃肠道(GIT)中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体，其中所述外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；b)减少动物的胃肠道(GIT)中的多形拟杆菌的群体，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；c)减少动物的胃肠道(GIT)中的大肠杆菌的群体，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；和/或d)减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。在一些实施方式中，所述用途涉及寡糖制备物用于以下的用途：a)减少动物的胃肠道(GIT)中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体，其中所述外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；b)减少动物的胃肠道(GIT)中的多形拟杆菌的群体，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；c)减少动物的胃肠道(GIT)中的大肠杆菌的群体，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；和/或d)减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；其中所述寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且其中每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。
动物类型
本发明的方法一般适用于生产动物。在一个实施方式中，本发明的方法适用于家禽。
可以将上述饲料添加剂提供给任何合适的动物。在一些实施方式中，动物是单胃的。通常认为单胃动物具有单腔胃。在其他实施方式中，所述动物是反刍动物。通常认为，反刍动物具有多腔胃。在一些实施方式中，所述动物是处于反刍前阶段的反刍动物。这种处于反刍前阶段的反刍动物的示例包括保育期小牛(nursery calve)。
在一些实施方式中，所述动物是家禽(例如，雏鸡、火鸡)、海鲜(例如虾)、绵羊、奶牛、家牛、水牛、野牛、猪(例如，保育猪、生长猪/育肥猪)、猫、狗、兔子、山羊、豚鼠、驴、骆驼、马、鸽子、雪貂、沙鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、禽类、或人类。
在一些实施方式中，所述动物是牲畜。在一些实施方式中，所述动物是伴侣动物。在一些实施方式中，所述动物是家禽。家禽的示例包括鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑或康沃尔游戏母鸡(Cornish game hen)。在一种变型中，所述动物是雏鸡。在一些实施方式中，所述家禽是蛋鸡、肉鸡或火鸡。
在其他实施方式中，所述动物是哺乳动物，包括例如奶牛、猪、山羊、绵羊、鹿、野牛、兔子、羊驼、美洲驼、骡子、马、驯鹿、水牛、牦牛、豚鼠、大鼠、小鼠、羊驼、狗或猫。在一种变型中，所述动物是奶牛。在另一种变型中，所述动物是猪。在另一种变型中，所述动物是猪。
饲料添加剂的施用
在一些实施方式中，施用包括向动物提供本文所述的饲料添加剂，使得所述动物可以随意摄取饲料添加剂。在此类实施方式中，动物摄取饲料添加剂的某一部分。
可按任何合适的时间表向动物提供本文所述的饲料添加剂。在一些实施方式中，基于每天、基于每周、基于每月、基于每隔一天、每周至少三天、或每月至少七天向动物施用本文所述的饲料添加剂。
在一些实施方式中，一天内多次向动物施用本文所述的饲料添加剂。例如，在一些实施方式中，每天向动物施用本文所述的饲料添加剂至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在一些实施方式中，每天向动物施用本文所述的营养组合物、饲料添加剂至多1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。
在一些实施方式中，一天内多次向动物施用本文所述的饲料添加剂。例如，在一些实施方式中，每周向动物施用本文所述的饲料添加剂至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在一些实施方式中，每周向动物施用本文所述的营养组合物、饲料添加剂至多1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在一些实施方式中，每天、每隔一天、每3天、每4天、每周、每隔一周或每月向动物施用本文所述的饲料添加剂。
在一些实施方式中，在某些日粮阶段期间向动物施用本文所述的饲料添加剂。例如，在0至14日龄之间向一些动物提供育雏日粮。在其他实施方式中，在15至28日龄之间、在15至35日龄之间、或在15至39日龄之间向动物提供生长日粮。在其他实施方式中，在29至35日龄之间、在36至42日龄之间或在40至46日龄之间向动物提供育肥日粮。
在某些实施方式中，在育雏日粮阶段、生长日粮阶段或育肥日粮阶段或它们的任何组合期间向动物提供本文所述的饲料添加剂。在某些实施方式中，动物是家禽，并且向家禽提供在0至15日龄之间的育雏日粮、在16至28日龄之间的生长日粮、和在29至35日龄之间的育肥日粮。在其他实施方式中，动物是家禽，并且向家禽提供在0至14日龄之间的育雏日粮、在15至35日龄之间的生长日粮、和在36至42日龄之间的育肥日粮。在其他实施方式中，动物是家禽，并且向家禽提供在0至14日龄之间的育雏日粮、在15至39日龄之间的生长日粮、和在20至46日龄之间的育肥日粮。
在一些实施方式中，在育雏日粮阶段、生长日粮阶段或育肥日粮阶段或它们的任何组合期间向家禽提供本文所述的饲料添加剂。
可将本文所述的饲料添加剂饲喂给个体动物或动物群体。例如，在动物是家禽的一种变型中，可将本文所述的饲料添加剂饲喂给个体家禽或家禽群体。
本文所述的饲料添加剂可以任何合适的形式提供给动物，包括例如固体形式、液体形式或它们的组合。在某些实施方式中，本文所述的饲料添加剂是液体，例如糖浆剂或溶液剂。在其他实施方式中，本文所述的饲料添加剂是固体，例如丸剂或粉末剂。在又其他实施方式中，本文所述的饲料添加剂可以以液体组分和固体组分两者，例如以糊状物形式饲喂给动物。
实施例
实施例1
本研究的实施例1描述了本发明中用于生成和分析数据的方案和方法。
样品收集
根据来自阴性对照和处理组(1只禽类/围栏和21次重复/处理)两者的物种和生长时间表，在不同的日子收集盲肠消化物样品。在进行DNA提取以用于宏基因组学或进行溶剂提取以用于代谢组学分析之前，将盲肠样品在-80℃下冷冻保存。
DNA提取和测序
可以通过任何鸟枪法测序测量方法对基因拷贝进行定量测量。在本申请中，宏基因组DNA是按照制造商的使用说明(Qiagen,Germany)使用MoBio Powersoil提取的。将DNA在Diversigen(TX,USA)在Illumina HiSeq 3000设备上进行测序，每个样品的靶深度为5GB。
分类学读段处理
为了选择合适的过滤和修剪参数，使用FastQC v0.11.5检查来自浅122鸟枪法测序的原始fastq文件。基于质量报告，使用Cutadapt来修剪每个读段的前10个碱基，将每个读段缩短到最大130bp，并丢弃任何小于120bp长的读段。这去除了所有剩余的衔接子片段，并消除了在读段末尾附近的质量下降的区域，如通过来自FastQC的另一份质量报告所证实。
分类学分析
然后可以使用任何比对算法将从仪器读取的序列与至少包含LEE和非LEE基因的基因的参考数据库进行比对。在本申请中，使用MetaPhlan 2.0，分析类型“rel_ab_w_read_stats”以仅使用正向读段从经处理的读段构建每个样品的分类学相对丰度概况。
函数映射
使用BWA-MEM算法，用bwa v0.7.5将经处理的读段映射到专门针对鸡肠道微生物群系定制的内部基因目录。使用Python脚本从BAM文件中提取每个样品的基因计数表，将所述基因计数表用作下游分析的输入。只有映射到正确对中的读段才被认为是对基因的成功命中。内部基因目录已使用公开可得的KEGG直系同源性(KEGG Orthology,KO)数据库进行注释，并且在此讨论的宏基因组分析中的大部分宏基因组分析都是基于来自KEGG(京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes))的函数信息。
实施例2
执行饲喂试验以研究畜牧业中寡糖制备物对禽类的影响。测试期从试验第0天(雏鸡孵化日)开始，此时开始向雏鸡饲喂商业型丸粒形式饲料(进一步粉碎用于育雏饲料)；并在试验第42天结束。每个实验单元包含40只雄性肉鸡(Hubbard-Cobb)，所述雄性肉鸡被随机分配到每组21个重复中，研究中每次处理的动物总数为840只。将肉鸡随机分配至试验第0天(或孵化日)的处理，并且在试验过程期间不进行更换。每天观察雏鸡是否有异常生长模式或健康问题的迹象。在试验第0天、第10天、第24天和第42天测量体重、饲料消耗量和饲料转化率。在24日龄和42日龄时从每围栏1只鸡收集盲肠内容物样品、回肠组织样品和血浆样品。对于疫苗接种程序，所有鸡都接种马立克氏疫苗并喷洒抗球虫病的疫苗(Merck AnimalHealth USA的其是从鸡中分离出的活卵囊疫苗，根据产品说明由堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、巨型艾美耳球虫MFP、变位艾美耳球虫(E.mivati)和柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的抗球虫敏感菌株制备而成)和针对新城疫支气管炎的疫苗。在研究过程期间没有施用饲料级抗生素。所有鸡都在新的褥草上生长。在整个研究过程中饲料和水是随意提供的。
本研究中所采用的商业模拟测试模型使用了以正常家禽业育雏日粮(0-10日龄)、生长日粮(11-24日龄)和育肥日粮(25-42日龄)饲养的肉鸡(鸡(Gallus gallusdomesticus))，每只鸡的地面空间要求最小为0.85ft2，饲养在装有新褥草的地面围栏中。日粮配方是经由计算机生成的线性回归程序进行的，该程序模拟实际家禽生产技术期间进行的配方。在雄性肉鸡中测试处理。从试验第0天(孵化日)放置时至42日龄，向肉鸡连续饲喂其实验日粮。所有日粮均含有1000FYT/kg的植酸酶(HiPhos)。
在孵化日(试验第0天)对肉鸡进行称重并随机放入每个围栏内并饲喂其相应的日粮。每个围栏都有对于至多42日龄的鸡的每个养成区域足够的地板密度、喂食器和饮水器空间。在42天养成后，对肉鸡进行称重，测定饲料消耗量，并计算饲料转化率(饲料消耗量/体重)并针对死亡率进行调整。
所述寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，各个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1级分至DPn级分)，其中n是大于3的整数；其中DP1级分和DP2级分中的每一者独立地包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计约0.5％至约15％的含脱水亚基的寡糖。寡糖制备物如本文所述以及如WO 2020/097458和WO 2016/007778中所公开的生产，所述文献以引用方式并入本文，特别是在其中所述的实施例中，特别是在WO 2020/097458 A1的实施例1-7、16-18中的任一者中、在WO 2016/007778 A1的段落[317]和/或实施例73-77、80-89、97-99、101-110中的任一者中所述的方法中。
测试材料说明：测试材料以液体或粉末形式提供，并混合到处理饲料中。然后将处理饲料丸粒化(并进一步粉碎以用于育雏饲料)并根据本研究的围栏设计放入围栏中。从试验第0-42天开始持续饲喂处理。将测试材料处理(包含根据本发明的寡糖制备物)与对照处理(不包含根据本发明的寡糖制备物)进行比较。
实验设计：在试验第0天(与孵化日期相同)，从商业孵化场获得了总共8,000只雄性肉鸡(数量足以确保至少7,560只健康雄性雏鸡用于研究进行的可用性)。这些雄性肉鸡立即被运送到温度受控条件下的饲养试验设施，以确保鸡舒适。在到达所述设施后，将肉鸡立即随机化。每围栏有40只健康/有活力的雄性肉鸡，每个测试组21个围栏，并且每个处理组总共840只肉鸡。从孵化日(试验第0天)至42日龄，向肉鸡随意饲喂其相应的处理饲料。
肉鸡详细描述：动物护理实践符合《农业研究和教学中农业动物的护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in AgriculturalResearch and Teaching)》(FASS，2010，第3版)。商用肉鸡(Hubbard-Cobb)是从商业孵化场在孵化时(试验第0天)获得的。在收到肉鸡后对可能影响研究结局的疾病或其他并发症的迹象进行评估。在检查后，对肉鸡进行称重。使用随机化区组设计将肉鸡分配到每个围栏并分配到处理组。在饲喂前通过比较各个测试组的平均值标准偏差与对照组的平均值标准偏差来评定处理组的体重分布。对照组与测试组之间的差异在一个标准差之内，并且因此，处理组的体重分布被认为是对于本研究可接受的。
在清晨收集肉鸡(在孵化日，称为第0天)，并在孵化的12小时内随机分配到每个实验围栏。将体弱的鸡取出并人道地宰杀。研究期间没有更换鸡。
笼养和日常观察：肉鸡混合性别鸡围栏的每个实验测试单元都笼养在分开的围栏中，位于容纳有强制空气加热器和跨笼舍通风***的房间内中。将肉鸡放置在5ft×10ft的围栏地面区域中，提供每只鸡至少0.85ft2(没有喂食器和饮水器空间)。提供每围栏至少两个***式饮水器(经由井水)。
养成期采用喂食器并每天检查，以确保所有鸡都能随时获得饲料。
所采用的光照程序使用白炽灯照明，对于第0天至第7天每天达约23小时连续光照和1小时黑暗，并对于研究的其余时间每天约20小时连续光照和4小时黑暗。
每天观察鸡的整体健康状况、行为和/或毒性证据以及环境条件。每天检查测试设施中的温度。证实饮用水和饲料是随意提供的。
在整个饲喂时段期间，没有施用任何类型的药物(测试材料除外)。每天收集死亡率并记录所有发现死亡或垂死的肉鸡的体重。
数据和观察：在生长期期间第0天、第10天、第24天和第42天收集活体性能体重和采食量。针对0-42日龄以及孵化体重与上市体重之间的其他年龄阶段计的增重、饲料摄入量、饲料:增益比(饲料效率)。在典型的方差分析测试模型中，采用处理x重复RCB(随机化完全区组)，以P<0.05统计评估饲喂对照组和测试组的肉鸡之间的差异。对照组被认为如下：处理1，用无添加的测试材料。
在研究结束时，在人道安乐死后，所有经尸检的肉鸡和研究结束时剩余的所有鸡的胴体均根据当地法规经由农场堆肥技术进行处置。
日粮准备：使用由经过家禽饲料配方培训的合格营养学家采用的配方来配制每个阶段的基础日粮，以满足或超过典型商用肉鸡日粮的最低营养要求，并且所配制的日粮满足或超过NRC家禽营养要求指南(NRC Nutrient Requirements for Poultry as aguideline)(第9版，1994)。饲料配方由兽医提供，通过在家禽业中常用于最低成本饲料配方的回归分析程序进行。然后将测试材料混合到基础日粮中。
通过调整玉米和大豆粕成分以及家禽生产中常用的其他次要成分的浓度，满足了膳食蛋白质、赖氨酸、甲硫氨酸、甲硫氨酸+胱氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸、总磷、有效磷、总钙、膳食钠和膳食胆碱的要求。在每次准备日粮之前，用磨碎的玉米冲洗混合设备。所有日粮均使用桨式混合器制备。在每次日粮之间使用压缩空气和真空清洁混合器，在每个处理组之间用磨碎的玉米冲洗混合设备，并保留冲洗材料以供处置。
日粮和水施用：日粮分三个饲喂阶段饲喂：育雏日粮(0-10日龄)、生长日粮(11-24日龄)和育肥日粮(25-42日龄)。所有日粮均随意提供，没有限制。随意提供新鲜井水(来自研究设施深井)。
饲料配方参数：
测量和取样时间表：第0天、第10天、第24天和第42天：表现；每围栏基础上的BWG、FI和FCR(已针对死亡率校正和未校正)。第24天和第42天：盲肠样品(1只鸡/围栏)，21个重复/处理；回肠组织(1只鸡/围栏)，21个重复/处理；血浆(1只鸡/围栏)，21个重复/处理。第0天(家禽放置前)和第42天：褥草样品(每围栏一个复合样品)，21个重复/处理(前面3个，中间3个，并且后面3个)。
结果：测试期从试验第0天(雏鸡孵化日)开始，并且向雏鸡饲喂商业型丸粒形式饲料(在第0天至第10天粉碎)，直到研究结束。每个处理包含每随机分配的处理21个重复，并且每重复包含40只雄性肉鸡。雏鸡在试验第0天(或孵化日)被随机分配至各处理。在42日龄时，确定活体性能(生长增重、死亡率和饲料转化率)和其他标准。
关于日常观察，每天都对每个围栏进行密切监测，以确定整体健康状况、鸡行为和/或毒性证据以及环境条件。每天检查本研究所采用的生长区域内的温度。本研究所采用的温度程序是在前七(7)天将温度维持在约86+/-5℉，此后每天降低约1℉，直到达到约70+/-5℉的目标，贯穿整个研究一直维持该温度。
对于整个养成期(第0天至第42天)，当向肉鸡饲喂含有寡糖制备物的日粮时，体重增加显示出相较于对照组的显著改善。试验第0天至第42天的饲料转化遵循与最终体重相似的模式。所有组中的这种品种从整个生长期到42日龄的死亡率被认为是平均的，没有显著差异。当鸡在垫褥草的地板上生长时，正常家禽业死亡率通常<4.5％。
下表中显示了关于平均体重、饲料转化率(针对死亡率进行校正)、死亡率％和平均体重增加的观察数据。每个观察结果的统计评估显示在下面的相应行中。
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1行内没有共同上标的均值显著不同(P<0.05)，如通过最小显著差异确定的。
微生物群系分析：从对照组以及从测试组(1只鸡/围栏和21个重复/处理)收集盲肠消化物样品并如实施例1中所述进行处理。发现饲喂测试组饲料(包含如上所述的寡糖制备物形式的寡糖)的鸡的微生物群系显示出多形拟杆菌的几乎4倍的减少，图1。据报道，肠出血性大肠杆菌(EHEC)的毒力与肠道共生多形拟杆菌相协调。影响多形拟杆菌会对EHEC有后续影响(Turner等人，Biochem Soc Trans 2019.47(1):229-238)。多形拟杆菌丰度的急剧减少表明这两种生物体之间的协同作用已被破坏，从而导致伴随的大肠杆菌减少，特别是GIT中的EHEC、EPEC、APEC的外源LEE基因和/或非LEE致病基因的伴随减小。
LEE基因和非LEE致病基因的丰度分析：将在第14天从对照组以及从测试组收集的GIT内容物样品按如下所述进行处理。使用MoBio Powersoil试剂盒提取每个GIT样品的DNA。然后在Illumina HiSeq 3000上对DNA进行测序以产生代表GIT中的微生物的DNA的>200万个100bp随机读段。使用Burrows-Wheeler比对算法将来自测序运行的读段与先前已经使用KEGG(京都基因与基因组百科全书)注释的基因参考数据库进行比对。发现，在用包含本文所述的寡糖制备物的饲料饲喂的鸡中，LEE基因和非LEE致病基因确实被下调。特别地，图2示出了测试组的宏基因组中LEE和非LEE基因的相对丰度的减小。

Claims (36)

1.一种用于减少动物的胃肠道(GIT)中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中外源性LEE基因和非LEE致病基因的所述群体被测量为在所述动物的所述微生物群系内检测到的所述LEE基因和非LEE基因的组合拷贝数与在所述微生物群系内检测到的基因的总拷贝数的比率％。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述微生物群系是从所述动物的粪便样品或从所述动物的所述GIT内收集的样品收集的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因拷贝数测量通过RT-PCR计数、全长16SRNA测序或宏基因组DNA测序执行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述动物是生产动物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述LEE基因包括：Tir、Map、EspB、EspF、EspG、EspH和EspZ。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述非LEE致病基因包括：EspG2、EspJ、EspM1/2、EspT、EspW、Cif、NleA、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF和NleH。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述寡糖是聚糖、酵母细胞壁和/或合成寡糖制备物，其中所述合成寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且其中每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述寡糖的浓度介于200mg/L饲料与2000mg/L饲料之间或为待给予所述生产动物组的饲料的至少50ppm(例如至少50ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm)。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述精油的浓度为待给予所述生产动物组的饲料的介于100-1000ppm之间。
11.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生产动物是：肉鸡、火鸡、鸭、蛋鸡、仔猪、生长期肉猪、育肥猪和母猪。
12.一种用于减少动物的胃肠道(GIT)中的多形拟杆菌的群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多形拟杆菌的群体被测量为在所述动物的所述微生物群系内检测到的所述多形拟杆菌的群体与所述微生物群系内的微生物的总群体的比率％。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述微生物群系是从所述动物的粪便样品或在所述动物的所述GIT内收集的样品收集的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中群体测量通过RT-PCT计数、全长16S RNA测序或宏基因组DNA测序执行。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述动物是生产动物。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述寡糖是聚糖、酵母细胞壁和/或合成寡糖制备物，其中所述合成寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且其中每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述寡糖的浓度介于200mg/L饲料与2000mg/L饲料之间或为待给予所述生产动物组的饲料的至少50ppm(例如至少50ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm)。
19.一种减少动物的胃肠道(GIT)中的大肠杆菌群体的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述大肠杆菌是致病性大肠杆菌。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述致病性大肠杆菌包括EPEC、EHEC和APEC。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述动物的所述GIT中的所述大肠杆菌的群体被测量为所述动物的所述微生物群系内的大肠杆菌标记基因的拷贝数相对于在所述微生物群系内检测到的细菌标记基因的总拷贝数的％。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述微生物群系是从所述动物的粪便样品或在所述动物的所述GIT内收集的样品收集的。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述测量通过RT-PCT计数、全长16S RNA测序或宏基因组DNA测序执行。
25.根据权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述动物是生产动物。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述寡糖是聚糖、酵母细胞壁和/或合成寡糖制备物，其中所述合成寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且其中每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述寡糖的浓度介于200mg/L饲料与2000mg/L饲料之间或为待给予所述生产动物组的饲料的至少50ppm(例如至少50ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm)。
28.一种用于减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症的方法，所述方法包括用以下饲料添加剂中的一种或多种饲料添加剂饲喂所述动物：寡糖和精油，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述炎症的减少被测量为在所述动物的所述微生物群系内检测到的所述LEE基因和非LEE基因的拷贝数与在所述微生物群系内检测到的基因的总拷贝数的比率％。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物群系是从所述动物的粪便样品或在所述动物的所述GIT内收集的样品收集的。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述测量通过RT-PCT计数、全长16S RNA测序或宏基因组DNA测序执行。
32.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述动物是生产动物。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述寡糖是聚糖、酵母细胞壁和/或合成寡糖制备物，其中所述合成寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且其中每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述寡糖的浓度介于200mg/L饲料与2000mg/L饲料之间或为待给予所述生产动物组的饲料的至少50ppm(例如至少50ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm)。
35.寡糖(例如聚糖、酵母细胞壁和/或(合成)寡糖制备物)和/或精油用于以下的用途：
a)减少动物的胃肠道(GIT)中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体，其中所述外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；
b)减少动物的胃肠道(GIT)中的多形拟杆菌的群体，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；
c)减少动物的胃肠道(GIT)中的大肠杆菌的群体，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；和/或
d)减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％。
36.寡糖制备物用于以下的用途
a)减少动物的胃肠道(GIT)中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的外源性肠上皮细胞清除基因座(LEE)基因和外源性非LEE致病基因的群体，其中所述外源性LEE基因和非LEE致病基因的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；
b)减少动物的胃肠道(GIT)中的多形拟杆菌的群体，其中所述多形拟杆菌的群体相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；
c)减少动物的胃肠道(GIT)中的大肠杆菌的群体，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；和/或
d)减少由大肠杆菌感染引起的动物的全身炎症和/或局部炎症，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％，其中所述动物的全身炎症和/或局部炎症相较于除所述饲料添加剂外用相同的日粮饲喂的对照动物减少了至少10％；
其中所述寡糖制备物包含至少n个寡糖级分，每个寡糖级分具有选自1至n的不同聚合度(DP1至DPn级分)，其中n是大于或等于2的整数；并且其中每个级分包含以如通过质谱分析法测定的相对丰度计至少约0.5％至约90％(例如1％至90％；或例如约0.5％至约15％)的含有脱水亚基的寡糖。
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