CN116855634A - 一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的核酸检测试剂盒 - Google Patents

一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的核酸检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一体化快速检测中枢神经***感染病原的引物和探针，包括针对8种病原体的特异性引物和探针，如SEQ ID NO.1～30所示。本发明还公开了一体化快速检测中枢神经***感染病原的核酸检测试剂盒，包括上述针对8种病原体的特异性引物和探针。本发明通过8种细菌病原体各自的基因组进行生物信息学分析，筛选出了各自的保守基因序列，设计了针对8种病原体的引物探针，具有很高的灵敏度、敏感性、特异性和精密性，适于三级医院或基层医院可独立完成腰椎穿刺术，怀疑中枢神经***感染的临床疾病初筛并能快速指导治疗。

Description

一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的核酸检 测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的核酸检测试剂盒。
背景技术
神经梅毒向来以症状和体征多变著称，故实验室诊断显得尤为重要，但是，当前最经典的脑脊液性病研究实验室试验(VDRL)不仅敏感性相对较低，同时也存在操作相对复杂等问题。而***颗粒凝集试验(TPPA)只能用做神经梅毒的辅助诊断，不能用于确诊。与其有鉴别诊断意义的中枢神经***感染是最为严重的感染性疾病之一，包括脑膜炎、脑炎和脑脊髓膜炎等。近年来此类疾病发病率呈上升趋势，致残率和致死率逐年升高。引起中枢神经***感染的病原体较多，有细菌、真菌、病毒、结核杆菌、***等。其中，以细菌性脑膜炎最为凶险，但由于抗生素的不合理使用导致脑脊液细菌培养的阳性率明显降低，且常规脑脊液培养往往至少需要7 -10天，严重影响了细菌性脑膜炎的早期诊断和识别。美国感染性疾病协会(IDSA)指出尽可能早期运用敏感抗生素，减少不必要的检查，可有效提高患者生存率并缩短住院时间，对其预后意义非凡。细菌性感染与病毒、结核杆菌等病原体引起的颅内感染的早期症状和体征相似，传统的实验室检测指标如脑脊液白细胞计数(white blood cell count，WBC)、总蛋白(total protein，TP)、葡萄糖(glucose，Glu)、降钙素原(procalcitonin，PCT)等，难以准确鉴别引起颅内感染的病原体，尽管脑脊液细菌培养一直被视为诊断细菌性颅内感染的金标准，但是由于耗时较长且阳性率低，常常造成诊断困难，甚至误诊。新型隐球菌脑膜炎与结核性脑膜炎的临床表现和脑脊液生化极其相似，且脑脊液中新型隐球菌和结核分支杆菌的阳性率低(<10％)，且新型隐球菌抗原检测、墨汁染色和脑脊液找抗酸杆菌敏感性差，使其早期临床误诊率高达60％以上，因此两者的鉴别诊断一直是颅内感染界的难题。
综上所述，各种类型中枢神经***感染疾病临床表现相似，确诊此类疾病往往需要查找甚至培养脑脊液病原体，这些方法阳性率低，细菌和真菌培养周期长，不利于早期诊断，导致延误病情，无法用于感染的快速诊断。
近年来，随着精准医疗发展，脑脊液基因检测技术发展迅速，其具有检测耗时少、灵敏度高、不受标本中抗菌或抑菌物质干扰等优点，但因其引物设计复杂、实验条件要求高、试剂价格昂贵及污染后假阳性率高等缺点，尤其对结核分支杆菌及真菌的检测率低，易造成假阴性，目前尚不能在临床中广泛应用。
因此，寻找具有实用价值的实验室方法来快速诊断中枢神经***感染，迫在眉睫。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的引物、探针，及核酸检测试剂盒。本发明选择中枢神经***感染最常见的8种病原体进行检测，可以准确的鉴定出每种微量感染的病原体。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的引物和探针，包括针对8种病原体的特异性引物和探针，具体的引物、探针的序列如下：
(1)单纯性孢疹病毒1型：
上游引物：5'-GAGACGCTGATGAAGCGCGAACTGA-3′；
下游引物：5'-ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGAGCT-3′；
探针：FAM-5'-TGACGAGGCCGCAGCTCACCAAG-3′-TAMRA；
(2)单纯性孢疹病毒2型：
上游引物：5'-CCCAAGCTCCCGCTA AGG-3′；
下游引物：5'-CGCCTTGGCAGCA CAACT-3′；
探针：FAM-5'-CCTGCTCT AGATATCCT-3′-TAMRA；
(3)EB病毒：
上游引物：5'-GCCATTTTTCCACCCTGTAG-3′
下游引物：5-ACCATCTGGGCCACCTT-3′
探针：Fam-5'-TGCCGATTATTTTGAATACCTCCAA-3′-eclipse
(4)水痘带状孢疹病毒：
上游引物：5'-CGA ACA CGT TCC CCA TCA A-3′
下游引物：5'-CCC GGC TTT GTT AGT TTT GG-3′
探针：FAM-5'-TCC AGG TTT TAG TTG ATA CCA-3′-BkFQ
(5)金黄色葡萄球菌：
nuc F-上游：5'-CACCTGAAACAAAGCATCCTAAA-3′
nuc F-下游：5'-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3′
探针：Texas-Red-5'-TGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3′-BHQ1
mecA上游：5'-CCC AAT TTT GAT CCA TTT GTT-3′
mecA下游：5'-GGC CAA TAC AGG AAC AGC ATA-3′
探针：mecA P:HEX-5'-CAT TCT TTG GGA CGA TGC CTA TCT CA-3′-BHQ1
(6)新型隐球菌：
Cryptococcus cyt b-上游：5'-TTCTAGCAGCTCTAGCTCTAG-3′
Cryptococcus cyt b-下游：5'-GCATTTGAGCTAATACCTTCAGG-3′
探针：FAM-5'-TACATATGCTAACACTTCACACACA-3′-BHQ1
(7)***：
TP-F1上游：5'-GAGGTATTGGGCGAAAAGGTT-3'
TP-R1下游：5'-CGCTTGGGTCAGTCTCGTACTC-3'
探针：FAM-5'-AAGCAGGAGACCGAAGACAGC-3'-eclipse
(8)结核分枝杆菌：
引物1-上游：5'-CCGAAGAATCCGCTGAGCT-3′
引物1-下游：5'-AGAAAGCCGACGCGGTCT-3′
探针1：FAM-5′-CAGCGCACAACGCCGAATTGCGAAGGCGCTG-3′-BHQ引物2-上游：5'-ATGCACTAGCCGAGACGATCA-3′
引物2-下游：5'-GCCAACTCGACATCCTCGA-3′
探针2：
FAM-5′-CAGCGCGAGCTGATCAAACCCGGCAAGCGCTG-3′-BHQ
上述引物、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～30所示。
一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的核酸检测试剂盒，包括上述引物和探针。
进一步地，还包括用于核酸检测的试剂。
进一步地，上述用于核酸检测的试剂包括buffer混合液、热启动taq酶、UNG酶、dUTPS。
本发明相对于现有技术，具有如下优点：
1.先进的DNA提取方法——可最大限度地提取临床采集的标本中病原体的DNA成份，极大提高DNA提取效果，使产品的检测灵敏度明显提高。
2.本产品的关键技术在于分子信标荧光探针及特异性引物的设计，我们通过软件辅助和实验筛查等方法，同时考虑8种病原微生物保守DNA序列互相影响等多方面因素确定探针及引物序列，探针、引物序列均为目的菌株的特异序列，并通过实验证实了探针及引物的各类参数(长度、退火温度、△G、Tm)均非常适宜。
3.具有很高的灵敏度、敏感性、特异性和精密性，使用本课题组制备并精确定量的参比品进行检测，其灵敏度可达5.0×102copies/mL，特异性参比品检测全部阴性，敏感性参比品阴阳性符合率100％，精密度试验CV值小于10％。
4.防污染：与电泳法等不同，该试剂盒无须PCR后处理，完全闭管扩增和检测，同时采用了dUTP-UNG***，有效地防范了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性。
5.操作简单、耗时短。试剂盒在特定的荧光PCR检测仪上进行扩增和检测，不需要进行电泳或杂交的操作，只需1.5-2小时即可完成PCR过程，有利于提高实验结果报告的速度。
6.结果客观可靠无需人为判断，仪器自动收集和分析数据。
7.可一次性快速区分几种常见的致病原，为临床诊断和治疗赢取宝贵时间，适于三级医院或基层医院可独立完成腰椎穿刺术，怀疑中枢神经***感染的临床疾病初筛并能快速指导治疗。
附图说明
图1为双环探针及其反应原理示意图。
图2为本发明采用的整体技术路线图。
图3为疑似中枢神经***感染患者就诊流程图1。
图4为疑似中枢神经***感染患者就诊流程图2。
图5为荧光PCR实验路线图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
主要原材料来源及制备方法
本试剂盒中主要原材料均从国际知名的分子生物学试剂公司订购，因此其来源可靠、安全且质量稳定，可作为试剂盒的稳定原材料来源(如下)。
化学原材料
Tris：分析纯，Sigma公司产品或有合格资质的供应厂商的产品，含量99.7％，红外合格，pH(5％水)10.3-10.9，水份0.3％，熔点167-171℃，吸收***合格，杂质最高含量合格。
MgCl2：分析纯，Sigma公司产品或有合格资质的供应厂商的产品，含量不少于99％，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。(MgCl2极易吸潮，启用新瓶后放于干燥器下保存)。
KCl：分析纯，北京化学试剂公司产品或有合格资质的供应厂商的产品
EDTA：分析纯，Sigma公司或有合格资质的供应厂商的产品，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99.5％，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。
HCl：分析纯，北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。
纯化水：购买乐百氏桶装纯净水，然后经Millipore公司的Milli-Q Biocel型纯水机处理，电阻率16～18MΩ。
引物和探针
本产品在研制开发及生产过程中所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成，并经Sigma质检合格(含质谱鉴定)；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。
dNTPs
dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司或上海生工生物工程公司，或其他有合格资质的供应商，并经出厂检测合格；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。
Taq酶
本产品在研制开发及生产过程中，所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司，或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。
基础试剂配制
10×浓缩清洗液A
配制0.2N NaOH，5mL/管分装；
10×浓缩清洗液B
配制10×TE缓冲液(pH8.0)，10mL/管分装；
DNA提取液
按Triton X-100 2％、NP-401％、正辛酸0.04M浓度配制成DNA提取液，充分混匀后按5mL/管分装。
提取固形物
取直径为0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比约为：0.5mm:1.0mm＝9:1比例配制出提取固形物，每管约0.15g分装。
dNTPS的配制
名称 dATP dCTP dGTP dUTP 超纯水
体积 100μL 100μL 100μL 150μL 550μL
从冰箱/柜中取出所需试剂，平衡至室温。按上述比例加入所有试剂后用磁力搅拌器混匀。
引物和探针的稀释
取出合成的引物和探针，在高速台式冷冻离心机上离心8000r/min，3min。取出待测引物和探针，计算并加超纯水稀释引物和探针到100μM，在涡旋混匀器上混合均匀，取出后在手掌型离心机离心。
质控品的制备方法及溯源情况：
内参照
组成为103copies/mL含内参照基因质粒；领用经分光光度计精确定量的含内参照基因的高浓度质粒，用1×TE作10倍梯度稀释至103copies/mL作为内参照，1mL/管分装。
阳性对照
组成为106copies/mL～107copies/mL含目的片段质粒；领用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至106copies/mL～107copies/mL作为阳性对照，1mL/管分装。
阴性对照
组成为1×清洗液B，将配制好的10×清洗液B用纯化水作10倍稀释，制得1×清洗液B作为阴性对照，1mL/管分装。
实施例1引物、探针、核酸检测试剂盒
根据文献及我们临床经验，目前脑脊液中检测阳性率较高的四种致病病毒为单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)，单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)，EB病毒及水痘带状疱疹病毒。故研究者设计的中枢神经***感染快速检测试剂盒主要检测内容为HSV-1，HSV-2，EB病毒及水痘带状疱疹病毒，细菌，真菌，***和结核分支杆菌共8种致病原。此8种致病原检测均采用实时荧光PCR技术。
1.试验方法、关键技术的实施方案及采取措施a)实时荧光PCR技术
本试剂盒检测采用实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。随着荧光PCR技术与相关PCR仪的出现，彻底改变了以往利用末端法对基因进行定量的方法。这种实时的PCR定量技术较传统的方法有如下的优势：
a.缩短实验时间，不需要进行PCR后的电泳跑胶鉴定，定量工作由PCR仪完成；
b.由于数据的采集与分析都由仪器完成，不再依靠肉眼观察电泳的结果，所以检测的灵敏度与重复性大大提高；
c.由于PCR后无需开盖，所以可以非常好地防止污染的发生。
试验过程包括了两部分：待检物标本制备和PCR检测。
b)Taqman探针机理
我们参照相应的致病原隐蔽性质粒作为靶序列，设计引物，采用核酸扩增技术对特异性基因进行检测，设计实时PCR所需的Taqman探针和特异引物，原理图见图1。针对相应病毒保守序列分别设计特异引物，对待测样品进行检测，只有存在相应致病原DNA的样品能被顺利扩增出双链DNA产物，该产物才能与Taqman探针结合，发出荧光信号从而被检测到，因此可以确切指示出样品中是否含有相应致病原DNA。本试剂盒对样品中含量低至5×102基因拷贝/mL的核酸DNA就可以检出。核酸扩增的方法敏感性高、特异性强而且重复性好。
在产物分析方面我们采用Taqman探针实时跟踪分析技术，使检测方法易于自动化。探针是一种荧光标记的寡核苷酸探针，它的荧光特性与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针5′末端称为报告基团，吸收光谱与报告基团发射光谱重合的淬灭剂则标记在探针的3′末端成为淬灭基团。在探针游离状态下，其荧光集团激发出的荧光通过共振能量转移被淬灭基团吸收，表现为荧光被淬灭。但在核酸扩增过程中，扩增产物延伸反应时，扩增的产物与探针结合，使得Taqman探针被Taq酶的5′－3′外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
c)内参照原理
试剂盒设置了内参照基因，即拟南芥基因。它在各致病原基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因和内参照基因结果都为阴时，该试验视为无效，需再重复。
d)阳性对照和阴性对照原理
每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测***是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。
为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。
本发明的整体技术路线见图2，图3、图4分别为疑似中枢神经***感染患者就诊流程图，荧光PCR实验路线图见图5。
实施例2试剂盒性能测试
1.检测灵敏度：验证本试剂盒检测阳性质控品的检测下限
HSV-1、HSV-2、EB病毒及水痘带状疱疹病毒，金黄色葡萄球菌，隐球菌，***和结核分支杆菌8种致病原的检测灵敏度测定结果如表1～16。
表1试剂盒检测HSV-1灵敏度的测定结果表(ABI7500)
表2试剂盒检测HSV-1灵敏度的测定结果表(STRATAGENE Mx3000p)
表1，表2试验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，5.0×102copies/mL样本每批试剂盒都能检出，5.0×101copies/mL样本，每批试剂在不同的仪器上表现不同，总检出率达不到100％，故我们将试剂盒HSV-1的最低检出量定为5.0×102copies/mL。
表3试剂盒检测HSV-2灵敏度的测定结果表(ABI7500)
表4试剂盒检测HSV-2灵敏度的测定结果表(STRATAGENE Mx3000p)
表3，表4试验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，5.0×102copies/mL样本每批试剂盒都能检出，5.0×101copies/mL样本，每批试剂在不同的仪器上表现不同，总检出率达不到100％，故我们将试剂盒的HSV-2最低检出量定为5.0×102copies/mL。
表5试剂盒检测金黄色葡萄球菌灵敏度的测定结果(ABI7500)
表6试剂盒检测金黄色葡萄球菌灵敏度的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
/>
表5，表6试验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，103copies/mL样本每批试剂盒都能检出，102copies/mL样本，每批试剂在不同的仪器上表现不同，总检出率不到50％，故我们将试剂盒的最低检出量定为103copies/mL。
表7试剂盒结核分枝杆菌最低检出量测定结果(ABI7500)
表8试剂盒结核分枝杆菌最低检出量测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
表7、表8实验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，101个菌/ml样本每批试剂盒都能检出，100个菌/ml样本，每批试剂在不同仪器上表现不同，总检出率为50％，故我们将试剂盒的最低检出量定为101个菌/ml。
表9试剂盒检测隐球菌灵敏度的测定结果表(ABI7500)
表10试剂盒检测隐球菌灵敏度的测定结果表(STRATAGENE Mx3000p)
表9，表10试验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，5.0×102copies/mL样本每批试剂盒都能检出，5.0×101copies/mL样本，每批试剂在不同的仪器上表现不同，总检出率达不到100％，故我们将试剂盒的隐球菌最低检出量定为5.0×102copies/mL。
表11试剂盒检测***灵敏度的测定结果表(ABI7500)
表12试剂盒检测***灵敏度的测定结果表(STRATAGENE Mx3000p)
表11，表12试验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，5.0×102copies/mL样本每批试剂盒都能检出，5.0×101copies/mL样本，每批试剂在不同的仪器上表现不同，总检出率达不到100％，故我们将试剂盒的***最低检出量定为5.0×102copies/mL。
表13试剂盒检测金黄色葡萄球菌灵敏度的测定结果(ABI7500)
表14试剂盒检测金黄色葡萄球菌灵敏度的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
表13，表14试验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，103copies/mL样本每批试剂盒都能检出，102copies/mL样本，每批试剂在不同的仪器上表现不同，总检出率不到50％，故我们将试剂盒的最低检出量定为103copies/mL。
表15试剂盒结核分枝杆菌最低检出量测定结果(ABI7500)
表16试剂盒结核分枝杆菌最低检出量测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
表15、表16实验结果表明，在ABI7500荧光PCR仪和STRATAGENE Mx3000p荧光PCR仪上，101个菌/ml样本每批试剂盒都能检出，100个菌/ml样本，每批试剂在不同仪器上表现不同，总检出率为50％，故我们将试剂盒的最低检出量定为101个菌/ml。
2.检测特异性：验证本试剂盒是否只扩增本试剂盒相关的病原，跟其它病原体无交叉反应。
HSV-1、HSV-2、EB病毒及水痘带状疱疹病毒，金黄色葡萄球菌，隐球菌，***和结核分支杆菌8种致病原的检测特异性测定结果如表17～32。
表17试剂盒检测HSV-1特异性的测定结果(ABI7500)
表18试剂盒检测HSV-1特异性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表17，表18试验结果，三批试剂检测HSV-1全部阴性参比品全部为阴性，说明试剂具有很好的特异性。
表19试剂盒检测HSV-2特异性的测定结果(ABI7500)
表20试剂盒检测HSV-2特异性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表19，表20试验结果，三批试剂检测HSV-2全部阴性参比品全部为阴性，说明试剂具有很好的特异性，不会与其他病原体产生交叉反应。
表21试剂盒检测金黄色葡萄球菌特异性的测定结果(ABI7500)
表22试剂盒检测金黄色葡萄球菌特异性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表21，表22试验结果，三批试剂检测金黄色葡萄球菌全部阴性参比品全部为阴性，说明试剂具有很好的特异性，不会与其他病原体产生交叉反应。
表23试剂盒结核分枝杆菌阴性参考品符合率检测结果(ABI7500)
表24试剂盒结核分枝杆菌阴性参考品符合率测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表23、表24实验结果，三批试剂检测中国药品生物制品检定所结核杆菌16份阴性参考品结果全部阴性，说明试剂具有很好的特异性。
表25试剂盒检测隐球菌特异性的测定结果(ABI7500)
表26试剂盒检测隐球菌特异性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表25，表26试验结果，三批试剂检测水隐球菌全部阴性参比品全部为阴性，说明试剂具有很好的特异性，不会与其他病原体产生交叉反应。
表27试剂盒检测***特异性的测定结果(ABI7500)
表28试剂盒检测***特异性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表27，表28试验结果，三批试剂检测***全部阴性参比品全部为阴性，说明试剂具有很好的特异性，不会与其他病原体产生交叉反应。
表29试剂盒检测金黄色葡萄球菌特异性的测定结果(ABI7500)
表30试剂盒检测金黄色葡萄球菌特异性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表29，表30试验结果，三批试剂检测金黄色葡萄球菌全部阴性参比品全部为阴性，说明试剂具有很好的特异性，不会与其他病原体产生交叉反应。
表31试剂盒结核分枝杆菌阴性参考品符合率检测结果(ABI7500)
表32试剂盒结核分枝杆菌阴性参考品符合率测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表31、表32实验结果，三批试剂检测中国药品生物制品检定所结核杆菌16份阴性参考品结果全部阴性，说明试剂具有很好的特异性。
3.检测准确性：以临床标本作为检测对象，以验证试剂盒对临床标本重复检测的准确性，说明本试剂盒具有良好的重复性和抗干扰能力。
HSV-1、HSV-2、EB病毒及水痘带状疱疹病毒，金黄色葡萄球菌，隐球菌，***和结核分支杆菌8种致病原的检测准确性测定结果如表33～48。
表33试剂盒检测HSV-1准确性的测定结果(ABI7500)
表34试剂盒检测HSV-1准确性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表33，表34试验结果，三批试剂检测HSV-1全部阳性准确性参比品全部为阳性，全部阴性准确性参比品全部为阴性说明试剂盒对临床样本检测具有很好的准确性。
表35试剂盒检测HSV-2准确性的测定结果(ABI7500)
表36试剂盒检测HSV-2准确性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表35，表36试验结果，三批试剂检测HSV-2全部阳性准确性参比品全部为阳性，全部阴性准确性参比品全部为阴性说明试剂盒对临床样本检测具有很好的准确性。
表37试剂盒检测金黄色葡萄球菌准确性的测定结果(ABI7500)
表38试剂盒检测准确性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表37，表38试验结果，三批试剂检测金黄色葡萄球菌全部阳性准确性参比品全部为阳性，全部阴性准确性参比品全部为阴性说明试剂具有很好的准确性。
表39试剂盒结核分枝杆菌阳性参考品符合率测定结果(ABI7500)
表40试剂盒结核分枝杆菌阳性参考品符合率测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表39、表40结果，三批试剂盒检测中国药品生物制品检定所结核杆菌14株阳性参考品结果全部为阳性，说明试剂盒具有很好的敏感性。
表41试剂盒检测隐球菌准确性的测定结果(ABI7500)
表42试剂盒检测隐球菌准确性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表41，表42试验结果，三批试剂检测隐球菌全部阳性准确性参比品全部为阳性，全部阴性准确性参比品全部为阴性说明试剂盒对临床样本检测具有很好的准确性。
表43试剂盒检测***准确性的测定结果(ABI7500)
表44试剂盒检测***准确性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表43，表44试验结果，三批试剂检测***全部阳性准确性参比品全部为阳性，全部阴性准确性参比品全部为阴性说明试剂盒对临床样本检测具有很好的准确性。
表45试剂盒检测金黄色葡萄球菌准确性的测定结果(ABI7500)
表46试剂盒检测准确性的测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表45，表46试验结果，三批试剂检测金黄色葡萄球菌全部阳性准确性参比品全部为阳性，全部阴性准确性参比品全部为阴性说明试剂具有很好的准确性。
表47试剂盒结核分枝杆菌阳性参考品符合率测定结果(ABI7500)
表48试剂盒结核分枝杆菌阳性参考品符合率测定结果(STRATAGENE Mx3000p)
根据表47、表48结果，三批试剂盒检测中国药品生物制品检定所结核杆菌14株阳性参考品结果全部为阳性，说明试剂盒具有很好的敏感性。
4.检测精密度：验证试剂盒检测的精密性
HSV-1，HSV-2，EB病毒及水痘带状疱疹病毒，细菌，真菌，***和结核分支杆菌8种致病原的检测精密度测定结果如表49～64。
表49三个批号的试剂对样本重复5次测定HSV-1的结果(ABI7500)
表50三个批号的试剂对样本重复5次测定HSV-1的结果(STRATAGENE Mx3000p)
表49，表50表明，三批试剂盒检测HSV-1均具有较好的精密性，CV值小于10％。
表51三个批号的试剂对样本重复5次测定HSV-2的结果(ABI7500)
表52三个批号的试剂对样本重复5次测定HSV-2的结果(STRATAGENE Mx3000p)
/>
表51，表52表明，三批试剂盒检测HSV-2均具有较好的精密性，CV值小于10％。
表53-1：对1.0×106copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(ABI7500)
表53-2对1.0×104copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(ABI7500)
表54-1对1.0×106copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(STRATAGENEMx3000p)
表54-2对1.0×104copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(STRATAGENEMx3000p)
表53，表54表明，三批试剂盒检测金黄色葡萄球菌均具有较好的精密性，CV值小于10％。
表55 103个菌/ml灵敏度标准品重复10管测定的结果(ABI7500)
表55结果表明，三批试剂盒检测结核分枝杆菌均具有较好的精密性。
表56三个批号的试剂对样本重复5次测定带状疱疹病毒的结果(STRATAGENEMx3000p)
表55，表56表明，三批试剂盒检测带状疱疹病毒均具有较好的精密性，CV值小于10％。
表57三个批号的试剂对样本重复5次测定隐球菌的结果(ABI7500)
表58三个批号的试剂对样本重复5次测定隐球菌的结果(STRATAGENE Mx3000p)
表57，表58表明，三批试剂盒检测隐球菌均具有较好的精密性，CV值小于10％。
表59三个批号的试剂对样本重复5次测定***的结果(ABI7500)
表59，表60表明，三批试剂盒检测***均具有较好的精密性，CV值小于10％。
表61-1：对1.0×106copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(ABI7500)
/>
表61-2对1.0×104copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(ABI7500)
表62-1对1.0×106copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(STRATAGENEMx3000p)
/>
表62-2对1.0×104copies/mL金黄色葡萄球菌阳性样本测定结果表(STRATAGENEMx3000p)
表61，表62表明，三批试剂盒检测金黄色葡萄球菌均具有较好的精密性，CV值小于10％。
表63 103个菌/ml灵敏度标准品重复10管测定的结果(ABI7500)
表63结果表明，三批试剂盒检测结核分枝杆菌均具有较好的精密性。
实施例3临床检验
本研究中，脑脊液常规检查包括：脑脊液常规、生化、细胞学、细菌培养、真菌培养、墨汁染色、隐球菌抗原检测、找抗酸杆菌。共有421名患者完善上述检验，其中经脑脊液常规检查诊断为颅内感染或神经梅毒的患者共有281名，其中病毒性脑膜炎或脑膜脑炎98名，神经梅毒130名，结核性脑膜炎18名，化脓性脑膜炎20名，隐球菌性脑膜炎15名。使用本试剂盒检查诊断为颅内感染或神经梅毒的患者共有290名，其中病毒性脑膜炎或脑膜脑炎101名，神经梅毒132名，结核性脑膜炎19名，化脓性脑膜炎21名，隐球菌性脑膜炎17名。本试剂盒检测为阳性而临床常规检测为阴性的患者加做基因检测(表一)。结合基因检测结果，提示本试剂盒的特异性均为100％(表二)，敏感性不劣于现有的脑脊液常规检查(表三)，且时限短，从收集标本到得到数据不超过3小时(表四)。
表一临床常用检测方法与本试剂盒诊断颅内感染阳性率比较
病种 临床常用检测方法/阳性例数 本试剂盒阳性率 P值
病毒性脑膜炎或脑膜炎 CSF常规生化和或基因检测/98 101 p>0.05
神经梅毒 CSF TPPA+CLIA/130 132 p>0.05
结核性脑膜炎 CSF结核杆菌/18 19 p>0.05
化脓性脑膜炎 CSF细菌培养/20 21 p>0.05
隐球菌性脑膜炎 CSF墨汁染色+隐球菌抗原+真菌培养/15 17 p>0.05
本试剂盒检测为阳性而临床常规检测为阴性的患者加做基因检测。
表二临床常用检测方法与本试剂盒诊断颅内感染特异性比较
表三临床常用检测方法与本试剂盒诊断颅内感染敏感性比较
病种 临床常用检测方法 本试剂盒敏感性 P值
病毒性脑膜炎或脑膜炎 CSF常规生化和或基因检测 103.06％ p>0.05
神经梅毒 CSF TPPA+CLIA 101.54％ p>0.05
结核性脑膜炎 CSF结核杆菌 105.56％ p>0.05
化脓性脑膜炎 CSF细菌培养 105.00％ p>0.05
隐球菌性脑膜炎 CSF墨汁染色+隐球菌抗原+真菌培养 113.33％ p>0.05
本试剂盒为阳性而临床常规检测为阴性的患者加做基因检测。
表四临床常用检测方法与本试剂盒诊断颅内感染时限性比较
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (4)

1.一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的引物和探针，其特征在于：包括针对8种病原体的特异性引物和探针，具体的引物、探针的序列如下：
(1)单纯性孢疹病毒1型：
上游引物：5'-GAGACGCTGATGAAGCGCGAACTGA-3′；
下游引物：5'-ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGAGCT-3′；
探针：FAM-5'-TGACGAGGCCGCAGCTCACCAAG-3′-TAMRA；
(2)单纯性孢疹病毒2型：
上游引物：5'-CCCAAGCTCCCGCTA AGG-3′；
下游引物：5'-CGCCTTGGCAGCA CAACT-3′；
探针：FAM-5'-CCTGCTCT AGATATCCT-3′-TAMRA；
(3)EB病毒：
上游引物：5'-GCCATTTTTCCACCCTGTAG-3′
下游引物：5-ACCATCTGGGCCACCTT-3′
探针：Fam-5'-TGCCGATTATTTTGAATACCTCCAA-3′-eclipse
(4)水痘带状孢疹病毒：
上游引物：5'-CGA ACA CGT TCC CCA TCA A-3′
下游引物：5'-CCC GGC TTT GTT AGT TTT GG-3′
探针：FAM-5'-TCC AGG TTT TAG TTG ATA CCA-3′-BkFQ
(5)金黄色葡萄球菌：
nuc F-上游：5'-CACCTGAAACAAAGCATCCTAAA-3′
nuc F-下游：5'-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3′
探针：Texas-Red-5'-TGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3′-BHQ1
mecA上游：5'-CCC AAT TTT GAT CCA TTT GTT-3′
mecA下游：5'-GGC CAA TAC AGG AAC AGC ATA-3′
探针：mecA P:HEX-5'-CAT TCT TTG GGA CGA TGC CTA TCT CA-3′-BHQ1
(6)新型隐球菌：
Cryptococcus cyt b-上游：5'-TTCTAGCAGCTCTAGCTCTAG-3′
Cryptococcus cyt b-下游：5'-GCATTTGAGCTAATACCTTCAGG-3′
探针：FAM-5'-TACATATGCTAACACTTCACACACA-3′-BHQ1
(7)***：
TP-F1上游：5'-GAGGTATTGGGCGAAAAGGTT-3'
TP-R1下游：5'-CGCTTGGGTCAGTCTCGTACTC-3'
探针：FAM-5'-AAGCAGGAGACCGAAGACAGC-3'-eclipse
(8)结核分枝杆菌：
引物1-上游：5'-CCGAAGAATCCGCTGAGCT-3′
引物1-下游：5'-AGAAAGCCGACGCGGTCT-3′
探针1：FAM-5′-CAGCGCACAACGCCGAATTGCGAAGGCGCTG-3′-BHQ
引物2-上游：5'-ATGCACTAGCCGAGACGATCA-3′
引物2-下游：5'-GCCAACTCGACATCCTCGA-3′
探针2：
FAM-5′-CAGCGCGAGCTGATCAAACCCGGCAAGCGCTG-3′-BHQ 。
2.一种一体化快速检测中枢神经***感染性疾病病原的核酸检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括用于核酸检测的试剂。
4.根据权利要求3所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述用于核酸检测的试剂包括buffer混合液、热启动taq酶、UNG酶、dUTPS。
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