CN116836231B - 一种t(8;21)AML的新抗原肽及其应用 - Google Patents
一种t(8;21)AML的新抗原肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116836231B CN116836231B CN202310806345.5A CN202310806345A CN116836231B CN 116836231 B CN116836231 B CN 116836231B CN 202310806345 A CN202310806345 A CN 202310806345A CN 116836231 B CN116836231 B CN 116836231B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aml
- peptide
- cells
- hla
- kvlhsslvck
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 72
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 claims abstract 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 49
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 17
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 93
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 18
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108010036972 HLA-A11 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010087480 HLA-B40 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001010810 Homo sapiens Erbin Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000594 effect on fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100001264 fatal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011293 immunotherapeutic strategy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150083701 npm1 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
- G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种t(8；21)AML的新抗原肽及其应用，所述新抗原肽的氨基酸序列为KVLHSSLVCK。本发明通过分析，发现AE融合蛋白可以产生上述的新抗原，并可以被HLA‑A*31:01或HLA‑A*11:01递呈。本发明还发现上述的新抗原可以促进CTL对t(8；21)AML细胞进行有效的杀伤，表明以KVLHSSLVCK为靶点的DC‑CTL细胞免疫治疗疗法具有潜在疗效。上述的新抗原肽可应用于开发t(8；21)AML药物组合物，或应用于更为特异、有效的多肽疫苗的制备，或应用于诱导产生特异性的细胞毒性T细胞，在t(8；21)AML特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种t(8；21)AML的新抗原肽及其应用。
背景技术
白血病是全球十大高发恶性肿瘤之一，其中急性髓系白血病(acute myelocyticleukemia,AML)的发病率为2-4/10万人，占成人急性白血病的80％-90％。AML发病机制复杂，死亡率高，治疗费用昂贵，给社会和患者家庭带来了沉重的经济负担。在急性白血病中染色体易位是最为常见的遗传学异常，其中t(8；21)(q22；q22)在AML中发生率最高，t(8；21)AML占所有AML的10％-15％，在M2型AML中更是高达40％-60％。t(8；21)AML的诱导缓解率为85％-90％，有10％-15％的患者存在原发耐药，获得缓解的患者中30％-50％出现复发，即半数以上患者最终成为难治/复发t(8；21)AML，而提升此部分患者的再诱导缓解率，延长其总生存期是临床亟需解决的重大难题。
基于肿瘤新抗原(Neo-antigens)的个体化免疫细胞治疗为肿瘤免疫治疗提供了新的思路并成为研究热点。肿瘤新抗原是在肿瘤发生、发展过程中因基因点突变或融合形成的，能被T细胞特异性识别的肿瘤特有的抗原。肿瘤新抗原特异性T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织没有交叉免疫反应，不会引起重要器官(如心、肝、肺等)的致命性毒性。细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)是体内自然存在的杀伤肿瘤细胞的最主要免疫效应细胞，新抗原在体内通常会刺激多克隆的CTL产生。靶向新抗原的免疫治疗策略通常采集患者自身淋巴细胞在体外通过新抗原刺激扩增CTL后回输入体内或用疫苗诱导体内的新抗原特异性CTL扩增。
近年来，靶向肿瘤新抗原的免疫治疗临床研究大多数集中在实体瘤的治疗上，2014年Science杂志报道了一个非常成功案例，研究者将一例晚期胆管癌患者的肺部转移灶切除，获得肿瘤浸润T细胞，并进一步分离出能特异性识别由肿瘤ERBB2IP基因突变产生新抗原的T细胞，先后两次回输经体外扩增的新抗原特异性T细胞使患者获得完全缓解。在非t(8；21)AML的基础研究中，研究者发现t(16；16)AML细胞内存在CBFB-MYH11融合基因，可以编码产生对应的融合蛋白，来源于融合蛋白的新抗原肽REEMEVHEL可以被HLA-B*40:01递呈，并诱导新抗原特异性CTL对AML细胞进行杀伤；Dyantha等人的研究显示NPM1基因因移码突变而产生NPM1c蛋白，来源于NPM1c蛋白的新抗原WQWRKSL、CLAVEEVSL和AVEEVSLRK可以在体外刺激特异性CTL扩增，进而识别和杀伤AML细胞。可见，靶向肿瘤新抗原的细胞免疫治疗在非t(8:21)AML的AML治疗中具有潜在的可观疗效。然而，应用新抗原特异性CTL治疗t(8:21)AML的研究尚未见任何报道。因此，进一步开发靶向t(8:21)AML肿瘤新抗原的新抗原肽对于提升难治/复发t(8:21)AML患者的再诱导缓解率，延长其总生存期具有积极意义。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种t(8；21)AML的新抗原肽及其应用，旨在解决目前缺乏靶向t(8:21)AML肿瘤新抗原的新抗原肽的问题。
本发明的技术方案如下：
一种t(8；21)AML的新抗原肽，其中，所述新抗原肽的氨基酸序列如SEQ.ID NO.1所示。
所述的t(8；21)AML的新抗原肽，其中，所述新抗原肽被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈。
所述的t(8；21)AML的新抗原肽，其中，所述新抗原肽被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈后，诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
一种t(8；21)AML的新抗原肽的开发方法，其中，包括步骤：
提供t(8；21)AML细胞的转录组高通量二代测序数据；
根据所述转录组高通量二代测序数据分析白血病相关融合基因的融合突变，并预测得到候选融合新抗原；
通过肿瘤特异性抗原预测筛选平台将所述候选融合新抗原与正常蛋白进行比对，筛选获得所述t(8；21)AML的新抗原肽。
所述的t(8；21)AML的新抗原肽开发方法，其中，所述新抗原肽的氨基酸序列如SEQ.ID NO.1所示。
一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含如上任一所述的新抗原肽。
所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂，其药用形式可为疫苗。
一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，其中，将如上任一所述的新抗原肽应用于制备t(8；21)AML抗原特异性的疫苗，或应用于诱导产生所述新抗原肽特异性的细胞毒性T细胞，或应用于制备所述新抗原肽致敏的抗原提呈细胞。
一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，其中，将如上任一所述的新抗原肽应用于TCR-T、CAR-T或CAR-NK产品的开发。
一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，其中，将如上任一所述的新抗原肽应用于t(8；21)AML诊断试剂盒的开发。
有益效果：本发明提供了一种t(8；21)AML的新抗原肽及其应用。本发明通过对t(8:21)AML细胞系和t(8；21)AML患者原代AML细胞的RNA-seq数据进行分析，发现AE融合蛋白可以产生新抗原KVLHSSLVCK，并可以被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈。通过合成KVLHSSLVCK肽段，使用抗原肽-DC-CTL培养体系，本发明发现了AE融合蛋白所产生的新抗原KVLHSSLVCK可以促进CTL对t(8；21)AML细胞进行有效的杀伤，表明以KVLHSSLVCK为靶点的DC-CTL细胞免疫治疗疗法对于t(8；21)AML的治疗具有潜在疗效。本发明首次通过数据分析和实验验证的方法鉴定出了AE融合蛋白可以产生新抗原，而AE融合蛋白在所有t(8；21)AML患者均存在。因此，靶向AE产生的新抗原肽的DC-CTL疗法可以覆盖所有的t(8；21)AML患者。故而，上述的新抗原肽可应用于开发t(8；21)AML药物组合物，或应用于更为特异、有效的多肽疫苗的制备，或应用于诱导产生特异性的细胞毒性T细胞，在t(8；21)AML特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中AE产生的肿瘤新抗原的鉴定结果示意图。
图2为本发明实施例中新抗原特异性CTL体外杀伤t(8；21)AML细胞的结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种t(8；21)AML的新抗原肽及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种t(8；21)AML的新抗原肽，所述新抗原肽的氨基酸序列如SEQ.ID NO.1所示。
SEQ.ID NO.1：KVLHSSLVCK
t(8；21)AML中最突出的特征就是存在AE(AML1-ETO，白血病相关融合基因)融合蛋白，AE融合蛋白的产生是t(8；21)AML发生的第一打击，存在于AML发生、发展的全过程。本发明实施例通过对t(8；21)AML细胞系和t(8；21)AML患者原代AML细胞的RNA-seq数据进行分析，发现AE融合蛋白可以产生新抗原KVLHSSLVCK，其可分别被HLA-A*31:01和HLA-A*11:01递呈，而HLA-A*11:01是中国人群发生率最高的基因型，约1/4中国人为此型阳性。通过合成KVLHSSLVCK肽段，使用抗原肽-DC-CTL培养体系，本发明实施例发现了AE融合蛋白所产生的KVLHSSLVCK可以促进CTL对融合蛋白细胞进行有效的杀伤，表明以KVLHSSLVCK为靶点的DC-CTL细胞免疫治疗疗法对于融合蛋白的治疗具有潜在疗效。
在一些实施方式中，所述新抗原肽被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈。
在一些实施方式中，所述新抗原肽被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈后，诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
本发明实施例通过化学合成的方式，合成KVLHSSLVCK多肽，用DMSO溶解合成的抗原肽。采集HLA-A*31:01/11:01阳性的健康供者的外周血，分离单个核细胞(PBMC)，在体外分离培养DC，并添加已合成的新抗原肽刺激DC，最终使得呈递抗原肽激活可识别抗原的CD8+T细胞成熟，并通过扩增获得多克隆CTL杀伤细胞群。结果发现，本发明提供的新抗原肽能显著诱导CD8+T细胞的扩增。
本发明实施例还提供一种t(8；21)AML的新抗原肽的开发方法，包括步骤：
S10、提供t(8；21)AML细胞的转录组高通量二代测序数据；
S20、根据所述转录组高通量二代测序数据分析白血病相关融合基因的融合突变，并预测得到候选融合新抗原；
S30、通过肿瘤特异性抗原预测筛选平台将所述候选融合新抗原与正常蛋白进行比对，筛选获得所述t(8；21)AML的新抗原肽。
在一些实施方式中，所述开法方法的具体步骤包括：
S100、提供t(8；21)AML细胞和t(8；21)AML患者原代肿瘤细胞的转录组高通量二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)数据；
S200、NGS数据由SOAP-nuke软件进行非目标序列和低质量序列过滤，并通过STAR软件进行参考基因组序列比对，后采用EasyFuse软件检测融合突变；
S300、使用in-house流程将所述融合突变翻译成融合蛋白序列，剪切成8-11个氨基酸长度的候选融合新抗原，并与正常蛋白(Uniprot数据库)进行比对，过滤掉存在正常蛋白序列的候选融合新抗原；
S400、采用肿瘤特异性抗原预测筛选平台GIANT，对候选融合新抗原与中国人高频HLA分型(HLA-A11:01、HLA-A02:01和HLA-A24:02)以及t(8；21)AML细胞对应HLA分型进行预测，筛选获得t(8；21)AML细胞AE融合新抗原肽。
在一些实施方式中，所述新抗原肽的氨基酸序列如SEQ.ID NO.1所示：KVLHSSLVCK
本发明实施例还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述的新抗原肽KVLHSSLVCK。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方式中，所述药物组合物的药用形式可为疫苗。
本发明实施例还提供一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，将新抗原肽KVLHSSLVCK应用于制备t(8；21)AML抗原特异性的疫苗，或应用于诱导产生所述新抗原肽特异性的细胞毒性T细胞，或应用于制备所述新抗原肽致敏的抗原提呈细胞，但不限于此。
本发明实施例还提供一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，将新抗原肽KVLHSSLVCK应用于以其为靶点的TCR-T、CAR-T或CAR-NK产品的开发，但不限于此。
本发明实施例还提供一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，将新抗原肽KVLHSSLVCK应用于t(8；21)AML诊断试剂盒的开发。
AE能否产生新抗原是本领域的未知，目前尚无涉及AE新抗原的研究发表。本发明通过测序、生物信息学分析及合成验证等工作，找到AE新抗原KVLHSSLVCK，并证明其具备免疫原性，可在体外刺激新抗原特异性CTL扩增，并具有应用于以其为靶点的特异性CTL对于t(8；21)AML的治疗的潜力。本发明通过合成KVLHSSLVCK肽段，使用抗原肽-DC-CTL培养体系，发现了AE融合蛋白所产生的新抗原KVLHSSLVCK可以促进CTL对t(8；21)AML细胞进行有效的杀伤，表明以KVLHSSLVCK为靶点的DC-CTL细胞免疫治疗疗法对于t(8；21)AML的治疗具有潜在疗效。本发明首次通过数据分析和实验验证的方法鉴定出了AE融合蛋白可以产生新抗原，而AE融合蛋白在所有t(8；21)AML患者均存在。因此，靶向AE产生的新抗原肽的DC-CTL疗法可以覆盖所有的t(8；21)AML患者。上述的新抗原肽可应用于开发t(8；21)AML药物组合物，或应用于更为特异、有效的多肽疫苗的制备，或应用于诱导产生特异性的细胞毒性T细胞，在t(8；21)AML特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
下面通过具体实施例对本发明一种t(8；21)AML的新抗原肽及其应用做进一步的解释说明：
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本领域常规试剂、方法和设备。
实施例1AE产生的肿瘤新抗原的分析
通过t(8；21)AML细胞(细胞系SNKO-1)和t(8；21)AML患者原代肿瘤细胞的转录组高通量二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)，分析融合突变以及预测筛选融合新生抗原。
首先，NGS数据将由SOAP-nuke软件进行非目标序列和低质量序列过滤，并通过STAR软件进行参考基因组序列比对，后采用EasyFuse软件进行融合突变检测；再使用in-house流程将融合突变翻译成融合蛋白序列，剪切成8-11个氨基酸长度的候选融合新抗原，并与正常蛋白(Uniprot数据库)进行比对过滤掉存在正常蛋白序列的候选融合新抗原；最终，本实施例将采用基于AI技术开发的国际领先的肿瘤特异性抗原预测筛选平台GIANT，对候选融合新抗原与中国人高频HLA分型(HLA-A11:01、HLA-A02:01和HLA-A24:02)和t(8；21)AML细胞系对应HLA分型进行预测，筛选获得t(8；21)AML细胞系AE融合新抗原序列。通过肿瘤新抗原的生物信息学分析，发现t(8；21)AML细胞(细胞系)和t(8；21)AML患者原代肿瘤细胞中AE融合蛋白均可以产生新抗原KVLHSSLVCK，且可以被HLA-A11:01呈递(如表1所示)
表1AE产生的肿瘤新抗原的分析结果
由上表可知，通过对t(8；21)AML细胞系SKNO-1和t(8；21)AML患者的原代肿瘤细胞的新抗原生物信息学分析，发现AE融合蛋白可以产生新抗原KVLHSSLVCK，且具有较强的免疫原性、亲和力和呈递能力。
实施例2AE产生的肿瘤新抗原的鉴定
通过化学合成的方式，合成KVLHSSLVCK多肽，用DMSO溶解合成的抗原肽。采集HLA-A*31:01/11:01阳性的健康供者的外周血，分离单个核细胞(PBMC)，在体外分离培养DC，并添加已合成的相应抗原肽刺激DC，最终使得呈递抗原肽激活可识别抗原的CD8+T细胞成熟，并通过扩增获得多克隆CTL杀伤细胞群，具体的步骤如下：
a.依据筛选出的新抗原或靶细胞对应的HLA-A配型，采集健康志愿者外周血，使用Ficoll密度梯度离心法分离纯化PBMC；
b.通过贴壁分离的方法，将细胞培养于淋巴细胞无血清培养基中2h，获得贴壁单核细胞，以及悬浮细胞(80％为T细胞)；
c.使用人源Naive CD8+T Cell分离试剂盒(130-093-244,MiltenyiBiotec)分选悬浮细胞部分，获得Naive CD8+T细胞，并冻存；
d.通过含10ng/ml IL-4、1,600IU/ml GM-CSF细胞因子的培养体系，培养贴壁单核细胞6天，介导其分化形成Mo-DC。在分化第5天时，往培养基中添加10ug/ml的对应AE产生的新抗原肽库，形成对应多肽负载的DC。设置无肽库负载的DC作为对照。在分化第6天时，向负载了多肽的DC以及对照细胞中加入500U/ml TNFα和1000U/ml IFNγ促进DC成熟；
e.复苏步骤c中冻存的Naive CD8+T细胞，用IFN-γ激活后，与负载抗原肽的DC细胞混合；
f.用含20U/ml IL-2、10ng/ml IL-7、10ng/ml IL-15培养体系继续培养DC与T混合细胞7-8天；
g.通过流式检测CD137和CD28的表达来确定T细胞被激活的情况，计数T细胞的总量来确定T细胞是否出现扩增，通过Elisa检测培养液IFN-γ水平，综合多指标的结果来确认CTL的产生。
最终，本发明发现新抗原肽能显著诱导CD8+T细胞的扩增(如图1A-B)，流式结果显示活化的CD8+T细胞(CD137+)约占总数的45.86％(图1C)，检测效应和靶细胞混合后的培养液上清的INFγ的水平，发现相比于对照组，添加抗原肽组的INFγ含量显著上调(图1D)。其中，A为添加AE新抗原KVLHSSLVCK组流式检测CD8+T细胞的比例；B为细胞计数检测CD8+T细胞扩增情况；C为流式检测添加AE新抗原KVLHSSLVCK组CD8+T细胞中活化的比例；D为Elisa检测培养液中IFNγ的含量。
实施例3新抗原特异性CTL体外杀伤t(8；21)AML细胞
以t(8；21)AML细胞系SKNO-1为靶细胞，得到的CTL为效应细胞，设定效靶比依次为5:1和1:1。使用CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒(G1780，Promega)，采用LDH的方法检测CTL对靶细胞的杀伤水平，计算CTL杀伤效率，结果显示KVLHSSLVCK组均可以产生很好的特异性杀伤(如图2所示)。
综上所述，本发明提供了一种t(8；21)AML的新抗原肽及其应用。本发明通过对t(8:21)AML细胞系和t(8；21)AML患者原代AML细胞的RNA-seq数据进行分析，发现AE融合蛋白可以产生新抗原KVLHSSLVCK，并可以被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈。通过合成KVLHSSLVCK肽段，使用抗原肽-DC-CTL培养体系，本发明发现了AE融合蛋白所产生的新抗原KVLHSSLVCK可以促进CTL对t(8；21)AML细胞进行有效的杀伤，表明以KVLHSSLVCK为靶点的DC-CTL细胞免疫治疗疗法对于t(8；21)AML的治疗具有潜在疗效。本发明首次通过数据分析和实验验证的方法鉴定出了AE融合蛋白可以产生新抗原，而AE融合蛋白在所有t(8；21)AML患者均存在。因此，靶向AE产生的新抗原肽的DC-CTL疗法可以覆盖所有的t(8；21)AML患者。故而，上述的新抗原肽可应用于开发t(8；21)AML药物组合物，或应用于更为特异、有效的多肽疫苗的制备，或应用于诱导产生特异性的细胞毒性T细胞，在t(8；21)AML特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种t(8；21)AML的新抗原肽，其特征在于，所述新抗原肽的氨基酸序列如SEQ.IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的t(8；21)AML的新抗原肽，其特征在于，所述新抗原肽被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈。
3.根据权利要求2所述的t(8；21)AML的新抗原肽，其特征在于，所述新抗原肽被HLA-A*31:01或HLA-A*11:01递呈后，诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-3任一所述的新抗原肽。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂，其药用形式可为疫苗。
6.一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，其特征在于，将如权利要求1-3任一所述的新抗原肽应用于制备t(8；21)AML抗原特异性的疫苗，或应用于制备诱导产生所述新抗原肽特异性的细胞毒性T细胞，或应用于制备所述新抗原肽致敏的抗原提呈细胞。
7.一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，其特征在于，将如权利要求1-3任一所述的新抗原肽应用于TCR-T产品的开发。
8.一种t(8；21)AML的新抗原肽的应用，其特征在于，将如权利要求1-3任一所述的新抗原肽应用于t(8；21)AML诊断试剂盒的开发。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310806345.5A CN116836231B (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 一种t(8;21)AML的新抗原肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310806345.5A CN116836231B (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 一种t(8;21)AML的新抗原肽及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116836231A CN116836231A (zh) | 2023-10-03 |
| CN116836231B true CN116836231B (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=88168404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310806345.5A Active CN116836231B (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 一种t(8;21)AML的新抗原肽及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116836231B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1657250A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-05-17 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | HLA-A *01-binding T-cell epitope of WT1 |
| CN114650838A (zh) * | 2019-11-07 | 2022-06-21 | 深圳吉诺因生物科技有限公司 | 肿瘤特异性多肽序列及其应用 |
| CN114649054A (zh) * | 2020-12-18 | 2022-06-21 | 深圳吉诺因生物科技有限公司 | 基于深度学习的抗原亲和力预测方法和*** |
| CN114746109A (zh) * | 2019-09-02 | 2022-07-12 | 居里研究所 | 靶向肿瘤新抗原性肽的免疫疗法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2325666A1 (fr) * | 2000-12-01 | 2002-06-01 | Institut Pasteur | Peptides immunogeniques mutes derives de r9m, polynucleotides les codants et leurs usages therapeutiques |
-
2023
- 2023-06-30 CN CN202310806345.5A patent/CN116836231B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1657250A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-05-17 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | HLA-A *01-binding T-cell epitope of WT1 |
| CN114746109A (zh) * | 2019-09-02 | 2022-07-12 | 居里研究所 | 靶向肿瘤新抗原性肽的免疫疗法 |
| CN114650838A (zh) * | 2019-11-07 | 2022-06-21 | 深圳吉诺因生物科技有限公司 | 肿瘤特异性多肽序列及其应用 |
| CN114649054A (zh) * | 2020-12-18 | 2022-06-21 | 深圳吉诺因生物科技有限公司 | 基于深度学习的抗原亲和力预测方法和*** |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "CBFB-MYH11 fusion neoantigen enables T cell recognition and killing of acute myeloid leukemia";Biernacki, MA等;J Clin Invest.;第130卷(第10期);参见第5127页，方法 * |
| "Neoantigen-specific TCR-T cell-based immunotherapy for acute myeloid leukemia";Weijun Zhou等;Exp Hematol Oncol.;第11卷(第1期);参见第3页、表1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116836231A (zh) | 2023-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Butterfield et al. | Adenovirus MART-1–engineered autologous dendritic cell vaccine for metastatic melanoma | |
| AU2008290061B2 (en) | CDCA1 peptide and pharmaceutical agent comprising the same | |
| CN111481662A (zh) | 一种肿瘤个体化特异性的治疗性疫苗及其制备方法 | |
| WO2016040900A1 (en) | Personalized cancer vaccines and methods therefor | |
| WO2019205783A1 (zh) | 人类dc细胞扩增方法和人类dc细胞资源库 | |
| CN1282485C (zh) | 负载凋亡的热休克肿瘤细胞的树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN116970058B (zh) | 针对tp53基因r249s突变的肿瘤新抗原多肽及其应用 | |
| CN113101363B (zh) | 一种环状rna疫苗及其应用 | |
| CN115974986A (zh) | 乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用 | |
| CN104491857B (zh) | 一种用于免疫治疗ebv相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法 | |
| US11976299B2 (en) | Methods of preparing an isolated population of dendritic cells and methods of treating cancer using same | |
| CN116836231B (zh) | 一种t(8;21)AML的新抗原肽及其应用 | |
| CN111944018A (zh) | 诱导肝癌特异性细胞毒性t淋巴细胞的抗原多肽及其应用 | |
| CN113292642B (zh) | 第三代表皮生长因子受体抑制剂耐药突变新生抗原及应用 | |
| CN113416240B (zh) | 一种用于诱导肿瘤特异性免疫响应的通用型抗原肽库及试剂盒 | |
| CN111434674B (zh) | 多肽组合物及其在癌症免疫治疗中的用途 | |
| CN113355283A (zh) | 基于rna疫苗的抗原反应性t细胞的制备方法及应用 | |
| EP3858998A1 (en) | Mrfft1 cell | |
| CN116948004B (zh) | 针对ctnnb1基因h36p突变的肿瘤新抗原多肽及其应用 | |
| US20110287442A1 (en) | Tumor Antigen Protein, Gene, or Peptides from Topoisimerase 2 Alpha | |
| CN115785204B (zh) | 肺癌特异性分子靶标08及其用途 | |
| CN114134221B (zh) | 一种筛选肿瘤特异tcr的方法 | |
| CN113416241B (zh) | 一种用于诱导肿瘤特异性免疫响应的通用型抗原肽库及试剂盒 | |
| JP2023539332A (ja) | 個別化された免疫原性組成物及びその製造方法及びその使用 | |
| EP3865582A1 (en) | Hafft1 cell |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |