CN116814811B - SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合及其在分子辅助育种中的应用 - Google Patents
SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合及其在分子辅助育种中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合及其应用，SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合扩增选自如下SNP1~SNP4合计4个位点：SNP1位于NC_052538.1染色体7上第19643427位，其为C或T多态；SNP2位于NC_052538.1染色体7上第19642671位，其为A或G多态；SNP3位于NC_052538.1染色体7上第19645928位，其为T或C多态；SNP4位于NC_052538.1染色体7上第19633704位，其为G或A多态。在育种中可以将SNP1~SNP4的TCAATTAA优势等位基因型作为选育胸部皮肤亮度L*值的重要分子标记，通过选留具有TC、AA、TT、AA基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高胸皮乌色度的选育，加快胸皮乌色度世代选育进展。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体地，涉及SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合及其在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用。
背景技术
乌骨鸡具有药用和食用价值，具有乌皮、乌肉等特点，以其黑色素含量高和独特的滋补、药用价值而深受广大消费者的喜爱。黑色素沉积是造成乌色形成的主要原因，人们在消费中惯于以其乌色的深浅来评判品质的优劣。黑色素沉积是一个复杂的调控***，经历黑色素细胞的分化及迁移、黑色素的合成及转运等过程，受到多种基因和信号通路等因子调控。溶质载体（solute carrier family, SLC）家族是一类重要的跨膜蛋白，负责神经递质、氨基酸等多种物质的跨膜运输和吸收。溶质载体SLC共有395个成员，分为52个家族，氨基酸转运蛋白家族SLC38由11个成员组成（SLC38A1-11），这些成员在大脑中表达，且仅在神经元或星形胶质细胞中表达，有些在两者中都表达。SLC38A11（溶质载体家族38，成员11），是一种含有406个氨基酸的多通道膜蛋白，属于氨基酸/多胺转运蛋白2家族。SLC38A11蛋白被鉴定为一种钠依赖性氨基酸/质子反向转运蛋白。我们前期通过对乌骨鸡和非乌骨鸡转录组测序发现，SLC38A11在乌骨鸡中高度表达，SLC38A11基因可能是影响乌色度的重要候选基因。
研究表明，皮肤亮度L*值反映皮肤肌肉表面的亮度，L*值越低，皮肤肌肉颜色越暗，乌色度越高，黑色素含量越高，确立了亮度L*值可作为乌色度性状选育的参考指标。目前在育种过程中通常以肉眼观察皮肤乌色度进行选育，世代遗传进展缓慢，因此，寻找皮肤乌色度显著相关的分子标记，对于提高皮肤乌色度世代选育进展具有重要意义。
发明内容
针对目前乌骨鸡皮肤乌色度选育进展缓慢的问题，本发明提供了SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合及其在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用。所述SLC38A11基因SNPs分子标记（SNP1~SNP4）相关信息如下：
各SNP位点引物的核苷酸序列如下：
所述SNP分子标记的筛选方法如下：
采用基于飞行时间质谱分析技术的MassARRAY平台对黑色素沉积相关基因的60个SNP位点进行基因分型，剔除没有多态性的SNP位点。使用SPSS 16.0软件的一般线性模型中的单变量方差分析进行多态性位点基因型与肤色亮度L*值关联分析。经过分析，筛选到SLC38A11基因的4个SNPs位点具有多态性，首先分析单个SNP标记与皮肤肤色亮度L*值性状的相关性，4个SNPs位点不同基因型间背部肤色和大腿部肤色亮度L*值均差异不显著，3个SNP位点与胸部皮肤亮度L*值显著相关。采用Haploview软件分析SLC38A11基因的4个SNPs位点的连锁不平衡（LD）程度，发现SNP2、SNP3、SNP4三个位点处于强连锁状态，连锁产生了3种单倍型，3种单倍型组合后产生6种基因型组合，分析不同单倍型组合与肤色亮度L*值性状的相关性，H3H3单倍型（AATTAA基因型）胸部肤色亮度L*值最低，乌色度最高。SNP1~SNP4四个位点基因型合并后产生8种基因型，TCAATTAA胸部皮肤亮度L*值较低，乌色度较高，为胸部皮肤乌色度的优势基因型。SLC38A11基因4个SNPs的TC、AA、TT、AA基因型可以作为乌骨鸡胸部乌色度分子辅助育种的重要分子标记。
本发明另一方面提供一种上述SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用。
具体地，应用方法包括如下步骤：
（1）提取待测鸡基因组总DNA；
优选地，所述待测鸡的基因组DNA由该鸡种的个体翅静脉采血得到。
（2）背部皮肤亮度L*值、大腿部皮肤亮度L*值和胸部皮肤亮度L*值测定方法：将活鸡背部、大腿部和翅根下面的胸部三个部位的羽毛拔掉1cm2左右的片区，用75%酒精棉球擦拭一下，再用TC.PIIG 型全自动测色色差计测定背部皮肤、胸部皮肤、大腿部皮肤的亮度L*值。所有肤色测定均由同一人测量，所测部位基本一致。
（3）根据4个SNPs位点设计引物，进行PCR扩增，并进行测序验证和基因分型；
PCR产物送生物公司进行测序，将所得序列与鸡的参考基因组进行比对，找出多态性位点。4个SNPs位点PCR产物的核苷酸序列如下所示：
SNP1：SLC38A11-第11外显子，rs740324212（突变位点C/T），PCR产物：196 bp。
ATTTTTCCATGGGAGCCTCTCAGCAGTTTTCCATATTGTTGTGACAGTAATTATCATTGCTGTGGK[C/T]GACTGGTGTATCATTAGTGTATGACTGCCTTGGAATAGTTTTAGAGCTGAATGTAAGTGAACCTGTATATTCTTCTATTTAATAAATCACTTTAAAAAAAATAAAATAGAGCAGAGTTCTGAGATATCCG。
SNP2：SLC38A11-第10外显子，rs313490398（突变位点A/G），
PCR产物: 230 bp。
ATGCAAGAGGAAAGGGGATTAGGAAGTCTCAATTATTCCAGTGATTCTATTAACTTATTCTTCAATTTACAAATAAGTAAATGAGGTGACTTCAATCTAATTGATGTTTTGCTATACCTTAGGAGATATATTTGAAAACTACTGTAGAGATGACAACCTTGCTACK[A/G]TTTGGAAGGTTTTGTTATGGAGTTACTGTAATTCTGACCTTTCCTCTTGAATGTTTTGTCACCA。
SNP3：SLC38A11-第12外显子，rs16594209（突变位点T/C），PCR产物: 241 bp。
GTCTGAAGAGCGATGGAACCATTCAGATAAACTCATCTCCTGCCTGATTCTTGCTGTTGGTGTGCTAGTGATGACAGTTGGGTTTGTTTTGACTATCTTGCATCCCCAGGAATGTAGCCATGGAAAAGAAATGTTCTACTGCTTTGCTAGK[T/C]AATGTTTCTTTGTACAACAGTACACTTCCCCCATAGGTAATGCTCCAATCTCTGCACTAGATCAGGGGCATCTCCCAGGAAGCCATATGA。
SNP4：SLC38A11-第7外显子，rs313831938(突变位点G/A)，PCR产物长度: 232 bp。
AGACGATGGTGTAGGACAAGCTACATGATTATAAATATTTGATATGTGATATTTAGAAATGTAGTTGTTGGTTAATAAGTCTTTAAAAAAATGTGCTGCTTAGAAGAGAGCTTTTCAGCAGTTTACTGACTGAATTTGTGTGTTTTCTTCTATAGGTATCK[G/A]CTTGTTTCTCTGCTTTTAACTGTTGTCATCCTGTTTATTGTGATGGTGAGGACAGTAACACTTGGTCCACA。
注：以上序列中标注的K为突变位点，括号中为突变碱基，为等位基因突变。
（4）根据基因型结果，选留皮肤乌色度较高的优势基因型个体，淘汰乌色度较低的劣势基因型个体。
步骤（4）中优势基因型个体的具体判断方法为：SNP1（rs740324212）位点TC基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于CC和TT基因型（P＜0.05）；SNP2（rs313490398）位点AA基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于GG与GA基因型（P＜0.05）；SNP3（rs16594209）位点TT基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于CC与CT基因型（P＜0.05）。SNP4（rs313831938）位点的三种基因型AA、AG、GG基因型个体间胸部L*值差异不显著（P>0.05）。4个SNPs连锁不平衡分析表明，SNP2、SNP3、SNP4之间的强连锁产生了3种单倍型，其中H1（AGC）和H2（GGC），H3（AAT）。3种单倍型组合后产生了6种基因型，关联分析发现，H3H3单倍型（AATTAA基因型）胸部肤色亮度L*值最低，显著低于单倍型H2H3（GACTAG）和H2H1（GGCCAA）。6种单倍型组合间背部和大腿部皮肤亮度L*值均差异不显著。SNP1~SNP4四个位点基因型合并后产生8种基因型，TCAATTAA胸部皮肤亮度L*值较低，乌色度较高，为胸部皮肤乌色度的优势基因型。
通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
在育种中可以将TCAATTAA优势等位基因型作为选育胸部皮肤亮度L*值的重要分子标记，通过选留具有TC、AA、TT、AA基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高胸皮乌色度的选育，加快胸皮乌色度世代选育进展。
附图说明
图1-图4分别是本发明实施例中SLC38A11基因4个SNPs位点质谱分型图；
图5是本发明实施例中SLC38A11基因4个SNP位点连锁不平衡分析图，图中方块颜色由浅至深表示连锁程度由低到高；数值代表位点间连锁不平衡的强弱（数值=D’值×100）。
具体实施方式
本发明针对乌骨鸡皮肤乌色度常规选育进展慢和不准确的问题，提供了SLC38A11基因SNPs分子标记及其在乌骨鸡胸部皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用，下面通过实施例具体说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1筛选乌骨鸡皮肤乌色度显著相关的分子标记
1、材料与方法
随机选取丝羽乌骨鸡母鸡192只，记录脚号，并进行翅下静脉采血1 mL，ACD抗凝，混匀后放入-20 ℃保存备用。采用常规苯酚-氯仿法提取DNA。将192个个体的DNA样品送到生物公司开展丝羽乌骨鸡黑色素相关SLC38A11基因开展基于飞行时间质谱MassARRAY平台进行质谱检测，收集数据，并进行SNP位点基因分型。
2、背部皮肤、大腿部皮肤和胸部皮肤亮度L*值测定
将活鸡背部、大腿部和胸部三个部位的羽毛拔掉1cm2左右的片区，用75%酒精棉球擦拭一下，再用TC.PIIG 型全自动测色色差计测定背部皮肤、胸部皮肤、大腿部皮肤的亮度L*值。所有肤色测定均由同一人测量，所测部位基本一致。
3、基因分型及其与皮肤亮度L*值相关性分析
3.1 SNPs位点基因分型
采用基于飞行时间质谱分析技术的MassARRAY平台对黑色素沉积相关基因的60个SNP位点的192个个体进行基因分型，剔除45个没有多态性的SNP位点。其中SLC38A11基因具有4个多态性SNPs位点，4个SNPs位点信息见表1。SLC38A11基因有4个SNPs位点具有多态性，且均有三种基因型，质谱分型结果见图1-图4。图1是SNP1（rs740324212 C>T）质谱分型图，NO call (0), T(27), TC(8), C(157) ，CC=0.82，TC=0.04, TT=0.14；图2是SNP2（rs313490398,G>A）质谱分型图，NO call (0), G(127), GA(57), A(8)，GG=0.66, GA=0.30, AA=0.04；图3是SNP3（rs16594209C>T）质谱分型图，NO call (0), C(127), CT(57), T(8)，CC=0.66, CT=0.30,TT=0.04；图4是SNP4（rs313831938A>G）质谱分型图，NOcall (0), A(80),AG (83), G(29)， AA=0.42, AG=0.43, GG=0.15。
表1SLC38A11基因多态性性SNPs位点信息
3.2SLC38A11SNP位点的遗传多态性分析
利用PopGene（version 1.31）统计4个SNPs位点基因型频率、基因频率、杂合度（He）和多态信息含量（PIC）。对所有SNP位点利用Hapoview4.1进行连锁不平衡分析，利用卡方检验（2）检测SNP位点是否处Hardy-Weinberg（H-W）平衡状态。分析结果见表2。
由表2可知，4个SNP位点均有3种基因型。每个SNP位点不同基因型频率不同。经H-W平衡检测，SLC38A11基因SNP1（第11外显子）偏离H-W平衡（P<0.05），SNP2（第10外显子）、SNP3（第12外显子）和SNP4（第7外显子）均处于H-W平衡状态（P>0.05）。SNP1位点遗传多样性较低（PIC<0.25）。其他3个突变位点 0.25＜PIC＜0.5，为中度多态。
表2SLC38A11基因4个位点遗传多态性与哈代-温伯格平衡检验
3.3 单个SNP标记与皮肤肤色亮度L*值性状的相关性分析
使用SPSS 16.0软件的一般线性模型中的单变量方差分析进行多态性位点基因型与肤色亮度L*值关联分析。固定因子：SNP标记的不同基因型，因变量：毛肤色亮度L*值，采用LSD法多重比较不同标记基因型之间的肤色亮度L*值的差异显著性，P＜0.05表示差异显著。
单个SNP标记与皮肤肤色亮度L*值性状的相关性分析，发现SLC38A11基因的3个SNP位点（SNP1、SNP2、SNP3）与胸部皮肤亮度L*值显著相关，结果见表3。4个SNPs位点不同基因型间背部皮肤和大腿部皮肤亮度L*值均差异不显著。
SNP1（rs 740324212）位点在TC基因型的肤色亮度L*值显著低于CC和TT基因型（P＜0.05）；SNP2（rs313490398）位点AA基因型的肤色亮度L*值显著低于GG与GA基因型（P＜0.05）；SNP3（rs16594209）位点TT基因型的肤色亮度L*值显著高于CC与CT基因型（P＜0.05）。SNP4（rs313831938）位点三种基因型AA、AG、GG基因型个体间胸部L*值差异不显著（P>0.05）。
表3 基因位点与皮肤肤色亮度L*值性状的关联分析
（平均值±标准差）
注：同一位点中同列不同小写字母表示不同基因型肤色亮度L*值差异显著(P＜0.05)
3.4SNPS位点连锁不平衡分析
采用Haploview软件分析SLC38A11基因的4个SNPs位点的连锁不平衡（LD）程度，连锁不平衡分析结果见图5。图5方框中的数值为D’值乘以100后得到。由图5可见，丝羽乌骨鸡SLC38A11的4个SNP位点构建了1个连锁不平衡（LD）Block（单倍型区块）。Block1由3个SNP位点（SNP2、SNP3、SNP4）构成，SNP2~SNP4存在强连锁关系，D’值均为1。SNP2、SNP3、SNP4之间的连锁产生了3种单倍型，其中H1（AGC）和H2（GGC），H3（AAT），单倍型频率分别为0.443、0.367、0.190。
3.5SLC38A11单倍型与皮肤亮度L*值性状关联分析
SNP2、SNP3和SNP4连锁产生的3种单倍型组合后产生了6种基因型，结果见表4。由表4关联分析发现，H3H3单倍型（AATTAA基因型）胸部肤色亮度L*值最低，显著低于单倍型H2H3（GACTAG）和H2H1（GGCCAA）。6种单倍型组合之间的背部和大腿部肤色亮度L*值均差异不显著。
SNP1~SNP4四个位点处的基因型合并后，基因型与皮肤亮度L*值相关性分析结果见表5。由表5结果可见，将SNP1~SNP4处的基因型组合后，个体数小于6的单倍型组合不参与统计与比较，所以有8种基因型组合，其中TCAATTAA胸部皮肤亮度L*值较低，显著低于CCGGCCAA、TTGACTAG、CCGACTAG，但8种基因型的个体间背部皮肤和腿部皮肤亮度L*值均差异不显著。
表4SLC38A11基因SNP2、SNP3、SNP4位点单倍型组合与皮肤亮度L*值性状关联分析（平均值±标准差）
注：同一位点中同列不同小写字母表示同一性别不同基因型肤色亮度L*值差异显著(P＜0.05)
表5SLC38A11基因SNP1~SNP4位点合并基因型与皮肤亮度L*值性状关联分析（平均值±标准差）
综合分析发现，SLC38A11基因SNP1、SNP2、SNP3、SNP4位点TC、AA、TT、AA基因型可以为乌骨鸡胸部乌色度“分子辅助育种”提供重要遗传信息。在育种中可以将TCAATTAA优势等位基因型作为选育胸部皮肤亮度L*值的重要分子标记，通过选留TC、AA、TT、AA基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高胸皮乌色度的选育，加快胸皮乌色度世代选育进展。
实施例2 乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种
通过丝羽乌骨鸡皮肤乌色度相关基因的分子标记辅助育种，对乌骨鸡配套系的乌骨鸡品系A皮肤亮度L*值进行选择，进而提高种雏鸡皮肤乌色度。
4周龄时，对乌骨鸡品系A群体内的鸡进行基因分型，保留皮肤乌色度较高的优势基因型个体。具体方案如下：
（1）4周龄时，利用一次性注射器翅静脉采血对800只丝羽乌骨鸡品系A（公母各半）翅静脉采血，酚氯仿法提取DNA，提取待测鸡基因组总DNA；设计并合成相关基因SLC38A11（rs740324212、rs313490398、rs16594209、rs313831938）的引物，引物序列相关见表6。
表6 引物序列相关信息
（2）PCR扩增、电泳与测序基因分型：PCR扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并测序进行基因分型。对丝羽乌骨鸡公、母鸡进行基因分型，保留皮肤乌色度较高的优势基因型个体。
PCR总反应体系50μL：DNA模板4μL，dNTP（2 mmol/L）2μL，Mg2+（3 mmol·L-1）0.6μL，1×PCR反应缓冲液5μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1μL，Taq聚合酶（1U·μL-1）2.5μL，补超纯水至50μL。
PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增目的片段用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物送生物公司进行测序，将所得序列与鸡的参考基因组进行比对，找出多态性位点。4个SNPs位点PCR产物的核苷酸序列如下所示：
SNP1：SLC38A11-第11外显子，rs740324212（突变位点C/T），PCR产物：196bp。
ATTTTTCCATGGGAGCCTCTCAGCAGTTTTCCATATTGTTGTGACAGTAATTATCATTGCTGTGGK[C/T]GACTGGTGTATCATTAGTGTATGACTGCCTTGGAATAGTTTTAGAGCTGAATGTAAGTGAACCTGTATATTCTTCTATTTAATAAATCACTTTAAAAAAAATAAAATAGAGCAGAGTTCTGAGATATCCG。
SNP2：SLC38A11-第10外显子，rs313490398（突变位点A/G），PCR产物: 230bp。
ATGCAAGAGGAAAGGGGATTAGGAAGTCTCAATTATTCCAGTGATTCTATTAACTTATTCTTCAATTTACAAATAAGTAAATGAGGTGACTTCAATCTAATTGATGTTTTGCTATACCTTAGGAGATATATTTGAAAACTACTGTAGAGATGACAACCTTGCTACK[A/G]TTTGGAAGGTTTTGTTATGGAGTTACTGTAATTCTGACCTTTCCTCTTGAATGTTTTGTCACCA。
SNP3：SLC38A11-第12外显子，rs16594209（突变位点T/C），PCR产物: 241bp。
GTCTGAAGAGCGATGGAACCATTCAGATAAACTCATCTCCTGCCTGATTCTTGCTGTTGGTGTGCTAGTGATGACAGTTGGGTTTGTTTTGACTATCTTGCATCCCCAGGAATGTAGCCATGGAAAAGAAATGTTCTACTGCTTTGCTAGK[T/C]AATGTTTCTTTGTACAACAGTACACTTCCCCCATAGGTAATGCTCCAATCTCTGCACTAGATCAGGGGCATCTCCCAGGAAGCCATATGA。
SNP4：SLC38A11-第7外显子，rs313831938(突变位点G/A)，PCR产物长度: 232bp。
AGACGATGGTGTAGGACAAGCTACATGATTATAAATATTTGATATGTGATATTTAGAAATGTAGTTGTTGGTTAATAAGTCTTTAAAAAAATGTGCTGCTTAGAAGAGAGCTTTTCAGCAGTTTACTGACTGAATTTGTGTGTTTTCTTCTATAGGTATCK[G/A]CTTGTTTCTCTGCTTTTAACTGTTGTCATCCTGTTTATTGTGATGGTGAGGACAGTAACACTTGGTCCACA。
注：序列中标注的K为突变位点，括号中为突变碱基，为等位基因突变。
（3）10周龄时皮肤亮度L*值测定方法：将活鸡背部、大腿部、和翅根下的胸部羽毛拔掉1cm2左右的片区，用75%酒精棉球擦拭一下，再用TC.PIIG 型全自动测色色差计测定胸部皮肤亮度L*值。所有肤色测定均由同一人测量，所测部位基本一致。
（4）乌骨鸡胸皮乌色度分子标记辅助选育
SLC38A11基因SNP1~SNP4四个位点的基因型组合后，个体数小于6的单倍型组合不参与统计与比较，有8种基因型组合，其中TCAATTAA胸部皮肤亮度L*值最低，显著低于CCGGCCAA、TTGACTAG、CCGACTAG。TCAATTAA为胸部皮肤乌色度的优势基因型，通过选留TCAATTAA基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高胸皮乌色度的选育。
对乌骨鸡品系A第5世代和6世代胸皮乌色度采用分子标记辅助育种，操作简便，能更快的提高胸部皮肤乌色度，经过2个世代的选育，公、母胸部皮肤亮度L*值分别比4世代降低了8.3、7.6，平均每个世代L*值降低4左右，比1~4世代L*值平均每个世代进展2左右，L*值显著降低，乌色度显著提高，加快了选育进展。经过2个世代的分子标记辅助育种，背部皮肤和大腿部皮肤亮度L*值也显著降低，乌色度显著提高。
表7 乌骨鸡品系A不同世代皮肤亮度L*值测定结果
以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (3)
1.SLC38A11基因SNPs分子标记引物组合在乌骨鸡皮肤乌色度分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待测鸡基因组总DNA；
（2）根据所选SNP组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；
（3）将PCR扩增产物测序后，判断基因型；
（4）根据基因型结果，选留胸部皮肤乌色度较高的优势基因型个体；
步骤（2）中，所述引物组合扩增选自如下SNP1~SNP4合计4个位点：
SNP1位于NC_052538.1染色体7上第19643427位，其为C或T多态；
SNP2位于NC_052538.1染色体7上第19642671位，其为A或G多态；
SNP3位于NC_052538.1染色体7上第19645928位，其为T或C多态；
SNP4位于NC_052538.1染色体7上第19633704位，其为G或A多态；
各SNP引物的核苷酸序列为：
SNP1-F：5’ATTTTTCCATGGGAGCCTCT 3’
SNP1-R：5’CGGATATCTCAGAACTCTGCTC 3’
SNP2-F：5’ATGCAAGAGGAAAGGGGATT 3’
SNP2-R：5’TGGTGACAAAACATTCAAGAGG 3’
SNP3-F：5’GTCTGAAGAGCGATGGAACC 3’
SNP3-R：5’TCATATGGCTTCCTGGGAGA 3’
SNP4-F：5’AGACGATGGTGTAGGACAAGC 3’
SNP4-R：5’TGTGGACCAAGTGTTACTGTCC 3’；
步骤（4）中，SNP1~SNP4的基因型对应乌骨鸡的胸部皮肤乌色度较高的优势基因型依次为TC、AA、TT、AA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SNP分子标记的筛选方法为：
采用基于飞行时间质谱分析技术的MassARRAY平台对黑色素沉积相关基因的60个SNP位点在丝羽乌骨鸡192个个体中进行基因分型，剔除没有多态性的SNP位点；使用SPSS 16.0软件的一般线性模型中的单变量方差分析进行多态性位点基因型与肤色亮度L*值关联分析；筛选到SLC38A11基因的4个SNPs位点具有多态性，首先分析单个SNP标记与皮肤肤色亮度L*值性状的相关性，4个SNPs位点不同基因型间背部肤色和大腿部肤色亮度L*值均差异不显著，3个SNP位点与胸部皮肤亮度L*值显著相关；SNP1位点TC基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于CC和TT基因型；SNP2位点AA基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于GG与GA基因型；SNP3位点TT基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于CC与CT基因型；SNP4位点的三种基因型AA、AG、GG基因型个体间胸部L*值差异不显著；采用Haploview软件分析SLC38A11基因的4个SNPs位点的连锁不平衡程度，发现SNP2、SNP3、SNP4三个位点处于强连锁状态，连锁产生了3种单倍型，3种单倍型组合后产生6种基因型组合，分析不同单倍型组合与肤色亮度L*值性状的相关性；SNP1~SNP4四个位点的基因型组合后，个体数小于6的单倍型组合不参与统计与比较，有8种基因型组合，其中TCAATTAA胸部皮肤亮度L*值最低，显著低于CCGGCCAA、TTGACTAG、CCGACTAG；TCAATTAA为胸部皮肤乌色度的优势基因型，通过选留具有TC、AA、TT、AA基因型个体，淘汰其他基因型个体的方法来辅助提高胸皮乌色度的选育。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，SNP1的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ NO.1或SEQ NO.2所示，长度为196 bp；
SNP2的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ NO.3或SEQ NO.4所示，长度为230 bp；
SNP3的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ NO.5或SEQ NO.6所示，长度为241 bp；
SNP4的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ NO.7或SEQ NO.8所示，长度为232 bp。
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