CN116813714A - 一种注射型药物缓释肽水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种注射型药物缓释肽水凝胶及其制备方法，该注射型药物缓释肽水凝胶包括离子互补型多肽和一种逆转细胞耐药性的多肽；该离子互补型多肽和该逆转细胞耐药性的多肽的混合物在盐溶液中自组装成肽水凝胶；该逆转细胞耐药性的多肽由自组装肽段、柔性连接肽段以及细胞穿透肽段组成。该肽水凝胶可局部注射，具有良好的肿瘤细胞选择性毒性和生物相容性，对药物活性成分有缓释作用，且能预防肿瘤术后出血。此外，该肽水凝胶可增强肿瘤对药物的摄取，同时降低细胞药物外排蛋白的表达水平，从而维持细胞内较高的药物浓度，提高同等剂量药物的杀伤能力，对抗肿瘤细胞耐药性。

Description

一种注射型药物缓释肽水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种注射型药物缓释肽水凝胶及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是危及人类生命健康的主要原因。手术联合术后化疗是当前恶性肿瘤的主要治疗方式，然而，术中无法切除的肿瘤残余灶和多药耐药性的出现使肿瘤患者的复发率和死亡率高居不下，***应用化疗药物的全身毒性也严重降低患者的生活质量和用药依从性，这是当前肿瘤治疗面临的严峻挑战。另外，术中止血不完善引起的术后出血使再次手术、医源性肿瘤散播和伤口感染的风险增加，甚至危及患者生命。

与***给药相比，局部给药可最大限度地增加病灶部位药物浓度并降低药物全身毒性，因此瘤内注射、介入和灌注等局部治疗手段已成功被开发用于肿瘤治疗。随着生物纳米材料技术的发展，功能性水凝胶作为化疗药物递送载体成为肿瘤局部治疗的理想策略。肽纳米纤维水凝胶是由小分子多肽自组装成纳米纤维进而相互交联形成的凝胶材料，因其良好的体内可降解性、生物相容性和药物缓释功能在肿瘤治疗、组织修复再生和细胞三维培养中得到了广泛的应用。RADA16是一种经典的离子互补型多肽，在盐离子溶液中可自发组装成基于β折叠结构的片层状纳米纤维，进而形成含水量高的凝胶。其体内降解产物为氨基酸，不会长期存在于体内从而引起免疫排斥反应和炎性反应。目前，RADA16已被证明可有效延缓亲疏水性药物的释放，并具有优秀的止血和抗粘连能力，但其自身不具有抗癌活性，对抗肿瘤药物的增效作用较为有限。

功能化的肽片段可通过固相合成法连接到基础离子互补肽侧端构建功能性离子互补肽。因此，通过该方法将具有抗癌功能的多肽连接到RADA16上形成新肽，并按照一定比例与RADA16混合，可形成用于肿瘤术后药物治疗的理想水凝胶载体，该水凝胶将有潜力同时具有控制药物缓释、增强肿瘤杀伤以及预防术后出血和粘连的多重功能。但该方法仍然具有一定的局限性，即连接的功能化片段序列不宜过长(如蜂毒肽melittin:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)，否则将无法形成稳定的β片层结构而无法自组装成凝胶。且过长的肽链其生产成本也相对较高，投入临床或将加重患者的经济负担。

细胞穿透肽(cell penetratingpeptides，CPPs)是一系列可直接穿过细胞膜的短肽，长度一般不超过30个氨基酸，分为阳离子肽、两亲性肽和疏水性肽三种类型。其序列通常含有较高相对丰度的带正电荷的氨基酸，或含有极性带电荷氨基酸和非极性疏水性氨基酸的交替模式。CPPs的这种聚阳离子结构或两亲性结构的模式促使其可通过内吞途径、形成脂质筏或形成孔隙结构等方式协助药物或纳米载体更加容易地通过细胞膜，已被证明能增强肿瘤对化疗药、蛋白类物质和siRNA等的摄取从而增加细胞内的药物浓度以增强药物效能。另一方面，有研究报道CPPs可降低药物外排蛋白如P-糖蛋白(P-gp)的水平，从而抑制肿瘤细胞对药物的外排作用，以抵抗肿瘤耐药性。八聚精氨酸(RRRRRRRR，简称R8)是一种阳离子细胞穿透肽，其肽链较短、易获得、成本相对较低，近年来广泛被用于肿瘤治疗的脂质体和肽-药共价结合物的构建。然而，目前R8乃至CPPs修饰的纳米材料多为***给药方式，无法改善和避免药物的全身毒性反应。

发明内容

为了改善和避免药物的全身毒性反应，本发明提供一种可局部给药的注射型药物缓释肽水凝胶，并提供了一种用于制备该注射型药物缓释肽水凝胶的逆转细胞耐药性的多肽、试剂盒以及制备方法。

本发明提供的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供一种逆转细胞耐药性的多肽，该多肽由自组装肽段、柔性连接肽段以及细胞穿透肽段组成。自组装肽段位于C端，细胞穿透肽段位于N端，柔性连接肽段位于两者之间。

作为上述技术方案的优选，所述自组装肽段为RADA16，所述细胞穿透肽包含5～15个氨基酸，所述柔性连接肽段包含2～5个氨基酸。

作为上述技术方案的优选，所述细胞穿透肽为八聚精氨酸；所述柔性连接肽段为GG。

第二方面，本发明提供一种注射型药物缓释肽水凝胶，包括药物活性成分、离子互补型多肽和上述逆转细胞耐药性的多肽；所述离子互补型多肽和所述逆转细胞耐药性的多肽的混合物在盐溶液中自组装成肽水凝胶，将药物活性成分负载其中。

该注射型药物缓释肽水凝胶具有肿瘤细胞选择性毒性、生物相容性、可增强药物杀伤能力、可逆转耐药同时又能预防术后出血。将负载抗肿瘤药物的肽水凝胶局部注射至肿瘤患者尤其是耐药肿瘤患者的术后肿瘤残余灶及残腔，可增强抗肿瘤药物杀伤能力并在一定程度上逆转肿瘤耐药性。同时该注射型药物缓释肽水凝胶对药物具有一定的控制释放能力，有利于维持肿瘤组织周围稳定的药物浓度并延长药物作用时间，避免高剂量药物的使用，从而降低药物毒性反应和获得性耐药性的发生率。此外，该注射型药物缓释肽水凝胶通过注射的方式递送至目标区域，可根据疗效定期给药，无需其他有创性操作，有利于提高患者依存性，局部给药方式可避免***运输造成的药物损耗和严重毒性反应，药物仍可在局部被吸收以到达潜在转移灶部位。肽水凝胶降解产物为氨基酸，不诱导产生炎性反应和免疫排斥反应，对全身重要脏器无毒性反应，具有优良的生物相容性。

作为上述技术方案的优选，所述注射型药物缓释肽水凝胶的药物活性成分为在细胞内发挥作用的药物。

作为上述技术方案的优选，药物活性成分为抗癌药物，例如阿霉素。

第三方面，本发明提供一种用于制备注射型药物缓释肽水凝胶的试剂盒，包括独立包装的肽存储液和盐溶液；所述肽存储液包括离子互补型多肽和上述逆转细胞耐药性的多肽，二者混为一体或独立包装。

第四方面，本发明提供一种制备注射型药物缓释肽水凝胶的方法，包括：

提供肽水凝胶前驱体溶液；所述肽水凝胶前驱体溶液包括离子互补型多肽、上述逆转细胞耐药性的多肽、盐离子、药物活性成分；

将肽水凝胶前驱体溶液静置，自组装成肽水凝胶。

作为上述技术方案的优选，将肽水凝胶前驱体溶液静置于不高于4℃的环境中自组装成肽水凝胶，以更好地保持肽水凝胶稳定性和药物活性。

作为上述技术方案的优选，肽水凝胶前驱体溶液中离子互补型多肽、上述逆转细胞耐药性的多肽的总浓度为1～5w/v％，优选为2w/v％。

作为上述技术方案的优选，所述自组装肽段与所述离子互补型多肽为同一物质。

作为上述技术方案的优选，离子互补型多肽和上述逆转细胞耐药性的多肽的质量比为1：0.1～1.5，优选为1：1。

作为上述技术方案的优选，提供肽水凝胶前驱体溶液包括：

使用超纯水分别溶解离子互补型多肽和上述逆转细胞耐药性的多肽，得到两种多肽储存液；

将两种多肽储存液按质量比为1：0.1～1.5混合，得到混合多肽储存液；

将混合多肽储存液与药物活性成分的盐溶液混合，得到肽水凝胶前驱体溶液。

肽水凝胶肽水凝胶与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的注射型药物缓释肽水凝胶可局部注射于肿瘤病灶或者术后肿瘤残余灶，能大大增加药物的肿瘤治疗效果，并为产生耐药性的患者提供更多治疗机会；同时，局部注射的给药方式可避免***用药的严重毒性反应，可减轻患者痛苦，提高患者依从性。本发明提供的逆转细胞耐药性的多肽氨基酸序列较短，合成价格低廉，具有逆转肿瘤耐药活性，可在盐粒子溶液中与离子互补型多肽自组装成生物相容性良好、体内可降解、具有肿瘤细胞选择性毒性、可逆转肿瘤耐药、增强肿瘤对药物敏感性、实现药物控制释放同时又能预防肿瘤术后出血的肽水凝胶。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RADA16-GG-R8肽的结构模式图；

图2为RADA16肽(图中简称R16)和RADA16-GG-R8肽(图中简称R16GGR8)的化学结构式；

图3为RADA16-GG-R8肽的质谱检测图(A)和高效液相色谱HPLC检测图(B)；

图4为RADA16肽水凝胶、RADA16-R8溶液、RADA16-GG-R8/RADA16纳米纤维肽水凝胶(RR)以及装载阿霉素的RADA16-GG-R8/RADA16纳米纤维肽水凝胶(RRD)的宏观图(A)和肽纳米纤维的原子力显微镜图(B)；

图5为RADA16肽水凝胶、RADA16-R8溶液、RR肽水凝胶以及RRD肽水凝胶的圆二色谱图；

图6为RRD肽水凝胶的体外降解(A)和药物释放曲线(B)；

图7为RR肽水凝胶对正常细胞(IOSE80卵巢细胞和L929成纤维细胞)和卵巢癌细胞(A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞)的CCK8细胞毒性曲线；

图8为阿霉素溶液(DOX)、装载阿霉素的RADA16肽水凝胶(RD)和RRD肽水凝胶对A2780卵巢癌细胞增殖活性影响的CCK8检测图(A)以及不同浓度的DOX和RRD肽水凝胶对SKOV3卵巢癌亲本细胞株和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞株的细胞毒性(B)；

图9为DOX溶液、RD肽水凝胶和RRD肽水凝胶对A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的迁移和侵袭能力影响的显微镜照片；

图10为DOX溶液、RD肽水凝胶和RRD肽水凝胶对A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞杀伤效果的活死染色图；

图11为DOX溶液和RRD肽水凝胶处理后A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞内DOX摄取量的流式细胞术检测；

图12为DOX溶液和RRD肽水凝胶处理后A2780细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞内DOX摄取量和核质定位的共聚焦显微镜照片；

图13为SKOV3卵巢癌细胞、SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞和RR肽水凝胶处理过的SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞中耐药相关药物外排蛋白P-gp(A)和BRCP(B)mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测图；

图14为DOX溶液、RD肽水凝胶和RRD肽水凝胶治疗后皮下异种移植瘤裸鼠的肿瘤体积(A)和质量(B)的统计图；

图15为DOX溶液、RD肽水凝胶和RRD肽水凝胶治疗皮下荷瘤裸鼠后的内脏HE染色图；

图16为DOX溶液、RD肽水凝胶和RRD肽水凝胶在体内释放的小动物活体荧光成像图；

图17为RADA16肽水凝胶和RR肽水凝胶的体内止血时间(A)和出血量(B)的统计图；

图7～图17中：CON代表使用0.9％NaCl溶液处理的组，DOX表示使用DOX溶液处理的组，RADA16代表使用RADA16肽水凝胶处理的组，RR代表使用RR肽水凝胶处理的组，RD代表使用RD肽水凝胶处理的组，RRD代表使用RRD肽水凝胶处理的组。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。但是，所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。

以下实施例中提供的逆转细胞耐药性的多肽由自组装肽段、柔性连接肽段以及细胞穿透肽段组成；其中，自组装肽段为RADA16肽(SEQ ID NO.1)，位于C端；柔性连接肽段包含2个氨基酸，即GG，位于自组装肽段和细胞穿透肽段之间；细胞穿透肽段为R8，位于N端。

发明人在实验过程中将阳离子肽R8通过柔性连接肽段GG共价结合于RADA16肽上，形成RADA16-GG-R8肽(SEQ ID NO.2)，发现侧端引入阳离子肽R8并不影响自组装肽段RADA自发组装成β折叠片层样纳米纤维结构，然而，RADA16-GG-R8肽所组装成的β折叠片层样纳米纤维结构无法进一步互相交联，因而无法形成肽水凝胶。发明人将RADA16-GG-R8肽与RADA16肽混合后，惊讶地发现两者可以共组装形成肽水凝胶—RADA16-GG-R8/RADA16纳米纤维肽水凝胶(RR)，该肽水凝胶具有缓释药物、逆转细胞耐药的作用。

本发明所提供的RADA16-GG-R8肽的结构如图1、图2所示，其包括RADA16作为组装结构域、GG作为柔性连接域、R8作为逆转耐药活性域。细胞穿透肽R8锚定于RADA16肽侧端后仍能自组装成长度为微米级的纳米纤维，其宽度宽于RADA16肽自组装成的纳米纤维，表明RADA16-GG-R8自组装成的纳米纤维侧端具有丰富的细胞穿透肽R8表位，可增强肿瘤对药物的摄取并降低耐药相关药物外排蛋白，实现逆转肿瘤耐药。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。

实施例1：RADA16-GG-R8肽的合成

实验中所需的多肽分子采用自动多肽合成仪合成，并通过高效液相色谱纯化，用质谱仪、氨基酸及多肽分析仪检测其纯度和序列。RADA16-GG-R8肽的质谱MS检测图和高效液相色谱HPLC检测图如图3(A)、图3(B)所示。

RADA16-GG-R8肽的氨基酸序列为Ac-RADARADARADARADA-GG-RRRRRRRR-CONH2，由图3(A)所得，RADA16-GG-R8的分子量为3076.50Da，由图3(B)所得，RADA16-GG-R8的纯度大于95％。

实施例2：RADA16-GG-R8/RADA16肽水凝胶(RR)的构建与表征

取10mg RADA16-GG-R8肽与10mg RADA16肽的粉末分别溶解于500微升无菌超纯水中，分别获得质量体积比为2％的RADA16-GG-R8储存液和RADA16储存液。于4℃下低温超声分散30分钟。按照RADA16-GG-R8储存液与RADA16储存液体积比为50:50涡旋混匀，低温超声分散30分钟，获得RADA16-GG-R8/RADA16储存液。

将获得的质量体积比为2％的100微升RADA16储存液、RADA16-GG-R8储存液和RADA16-GG-R8/RADA16储存液与100微升1.8％NaCl溶液等体积混合，并置于4℃下放置6小时。此外，将100微升RADA16-GG-R8/RADA16储存液与100微升1.8％NaCl溶液(含阿霉素2mg/mL)等体积混合，获得RADA16-GG-R8/RADA16/DOX混合液，并置于4℃下放置6小时。

RADA16-GG-R8储存液与盐溶液混合，无法有效形成肽水凝胶，以下简称RADA16-R8溶液，而RADA16储存液和RADA16-GG-R8/RADA16储存液与盐溶液混合后均可形成肽水凝胶，以下分别简称RADA16肽水凝胶和RR肽水凝胶。此外，RADA16-GG-R8/RADA16/DOX混合液与盐溶液混合后亦可形成肽水凝胶，简称为RRD肽水凝胶，说明阿霉素的载入不阻止RADA16-GG-R8/RADA16储存液形成肽水凝胶，图4(A)展示了各肽水凝胶或溶液的宏观图。如图4(B)所示，RADA16、RADA16-GG-R8、RR和RRD均可自组装形成肽纳米纤维。由RADA16-GG-R8自组装形成的肽纳米纤维的宽度明显宽于由RADA16自组装形成的肽纳米纤维，而RR和RRD自组装形成的肽纳米纤维的宽度介于RADA16-GG-R8和RADA16自组装形成的肽纳米纤维之间，肽纳米纤维中存在许多增厚的部分，表明R8暴露于肽纳米纤维侧端。此外，由RADA16、RR或RRD自组装形成的肽纳米纤维之间相互交联，因此可进一步形成肽水凝胶，而RADA16-GG-R8自组装形成的肽纳米纤维之间多呈平行排列，交联较少，故无法进一步形成三维结构的肽水凝胶。

通过扫描190～260nm范围内的圆二色谱来分析肽水凝胶的二级结构表征。如图5所示，RADA16肽水凝胶、RR肽水凝胶和RRD肽水凝胶均分别在195nm和216nm附近形成波峰和波谷，表明其可形成β折叠样二级结构，而RADA16-GG-R8则单独无法形成β折叠结构。该结果说明R8在一定程度上影响β折叠二级结构的形成，而装载DOX不影响多肽的二级结构形成。

实施例3：RRD肽水凝胶的体外降解和药物释放试验

将500微升RRD肽水凝胶(含30μg DOX)加入1.5毫升EP管底部，4℃放置6h后再分别加入500微升含或不含5unit/mL蛋白激酶K的0.9％NaCl溶液，置于37℃静置。在特定时间点吸尽上层液体，对剩余凝胶进行称重，并重新加入500微升含或不含5unit/mL蛋白激酶K的0.9％NaCl溶液，继续放置于37℃。使用PerlinElmer多功能酶标仪检测上清液在激发波长和发射波长分别为478nm和596nm时的荧光吸光度值以确定DOX浓度。

如图6(A)所示，RRD肽水凝胶在添加了蛋白激酶K(模拟体内酶环境)的NaCl溶液里降解速度较单纯的NaCl溶液更快，在第12天左右基本上完全降解，说明RRD肽水凝胶具有良好的生物可降解性，不会长期残留于体内而产生免疫反应和炎性反应。如图6(B)所示，存在蛋白酶K的情况下，药物整体释放速率更快。前12h呈现爆发释放，累积释放量达到50％左右，12h后释放速率逐渐变缓并持续释放长达8天，说明RRD肽水凝胶具有良好的药物缓释功能。

实施例4：RR肽水凝胶对肿瘤细胞的选择性毒性

以5000个细胞/孔的密度将正常IOSE80卵巢细胞、L929成纤维细胞、A2780卵巢癌细胞和顺铂诱导的SKOV3多药耐药细胞(简称SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞)种于96孔板，并在培养箱中培养，待其处于对数生长期后更换新鲜培养基，并分别加入不同浓度的RR肽水凝胶，培养24小时后采用CCK8实验定量检测RR肽水凝胶对肿瘤细胞A2780、SKOV3/DDP和正常细胞IOSE80、L929的细胞毒性。

如图7所示，RR肽水凝胶对肿瘤细胞的细胞毒性比对正常细胞更强，其对A2780、SKOV3/DDP、IOSE80和L929细胞的半抑制浓度分别为23.19、39.76、100.40和51.77μL/mL。当RR肽水凝胶浓度小于20μL/mL时，其对正常细胞具有很小的细胞毒性，同时却可以抑制40～50％的肿瘤细胞生长，表现出优秀的肿瘤细胞选择性。

实施例5：RR肽水凝胶增强肿瘤对药物的敏感性并逆转肿瘤耐药

(1)CCK8细胞增殖活性实验

以5000个细胞/孔的密度将A2780卵巢癌细胞、SKOV3卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞种于96孔板并在培养箱中培养，待其处于对数生长期时进行干预。对于A2780卵巢癌细胞，分别加入含等量DOX的DOX溶液、装载DOX的RADA16肽水凝胶(简称RD肽水凝胶)和RRD肽水凝胶，空白对照组(图中用CON表示)加入等体积的0.9％NaCl溶液，培养24h、48h和72h后采用CCK8检测细胞活性。对于SKOV3卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞，分别加入等体积不同DOX浓度梯度的DOX溶液和RRD肽水凝胶，培养24小时后采用CCK8实验定量检测细胞活性。

如图8(A)所示，与DOX溶液相比，RRD肽水凝胶对A2780卵巢癌细胞具有更强的细胞活性，且细胞活性抑制率随着时间的推移不断增强，而RD肽水凝胶尽管具有比DOX溶液稍强的抑制效果，但不具有统计学差异。因此，RR肽水凝胶可提高A2780卵巢癌细胞对DOX的敏感性，在达到相同细胞活性抑制效果的前提下，可降低DOX的给药浓度。如图8(B)所示，DOX溶液对SKOV3卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的半抑制浓度分别为0.36和3.34μM，SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞对DOX的耐药系数高达9.28，表明为有效耐药株。与DOX溶液相比，RRD肽水凝胶对SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的半抑制浓度为1.02μM，约为DOX溶液半抑制浓度的1/3，表明RR肽水凝胶有效逆转了SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞对DOX的耐药性，能有效抑制SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的生长和增殖。

(2)Transwell侵袭和迁移实验

肿瘤细胞的侵袭迁移是癌症转移的关键因素之一，因而抑制肿瘤细胞这一行为也是肿瘤治疗的重要举措。在Transwell 24孔板(8微米孔径)下室中加入600微升10％胎牛血清培养基，分别加入含等量DOX的DOX溶液、RD肽水凝胶和RRD肽水凝胶，空白对照组加入等体积的0.9％NaCl溶液。A2780卵巢癌细胞或SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞用不含胎牛血清的培养基重悬，将200微升细胞悬液加入不含基质胶和预先铺好基质胶的上室中(A2780卵巢癌细胞：6×10⁴个/孔；SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞：3×10⁴个/孔)。将上室轻轻置于下室培养基中，培养箱中培养24h后，弃去上室中的培养基并用PBS洗涤3次，棉签擦除聚酯纤维膜上层细胞，PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定30min，结晶紫染色30min，PBS再次洗涤3次，晾干后于倒置显微镜下拍照。

如图9所示，与DOX溶液相比，RRD肽水凝胶更加明显地抑制了A2780卵巢癌细胞的增殖和迁移能力，而RD肽水凝胶的作用效果与DOX溶液相似。与空白对照组相比，DOX溶液和RD肽水凝胶对SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的增殖和迁移的抑制效果较差，但RRD肽水凝胶具有明显的抑制作用，表明RR肽水凝胶有效逆转了SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞对DOX的耐药性，可抑制SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的侵袭和迁移能力，从而抑制肿瘤转移。

(3)细胞活死染色实验

以1×10⁵个/孔的密度将A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞种于12孔板中并培养24h后，更换新鲜培养基并分别加入含等量DOX的DOX溶液、RD肽水凝胶和RRD肽水凝胶，空白对照组加入等体积的0.9％NaCl溶液，72h后去除培养基并用PBS洗涤干净，每孔加入1mL Calcein-PI工作液，37℃避光孵育30min，吸除培养基，PBS洗涤2次，加入无血清培养基，然后于荧光倒置显微镜下拍照。

如图10所示，与DOX溶液相比，RRD肽水凝胶对A2780卵巢癌细胞具有更强的杀伤效果，而RD肽水凝胶的作用效果与DOX溶液相似。与空白对照组相比，DOX溶液和RD肽水凝胶对SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的杀伤效果较差，但RRD肽水凝胶具有明显的杀伤效果，表明RR肽水凝胶有效逆转了SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞对DOX的耐药性，能有效杀伤耐药细胞。

实施例6：RR肽水凝胶增强肿瘤细胞对药物的摄取以增强药物敏感性并逆转耐药

1.流式细胞术

以3×10⁵个/孔的密度将A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞种于6孔板中，培养24h后更换新鲜培养基，分别加入含等量DOX的DOX溶液和RRD肽水凝胶，37℃孵育2h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心后PBS洗涤，再次离心，重复洗涤3次后，将100微升PBS细胞悬液(含1×10⁵细胞)转移至流式管中，1h内流式上机检测细胞内DOX自发的荧光强度。

如图11所示，在DOX浓度一致的前提下，SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞对DOX的摄取能力显著低于A2780卵巢癌细胞，与其耐药性相符。在DOX浓度为2.5μM、5μM和10μM的情况下，RRD肽水凝胶处理的A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的DOX荧光强度均强于DOX溶液处理组，表明RR肽水凝胶可有效增强肿瘤细胞对DOX的摄取，从而提高细胞内DOX浓度，增强肿瘤细胞对药物敏感性，并逆转耐药。因此，使用RR肽水凝胶装载抗肿瘤药物，可降低达到有效治疗剂量的给药浓度，在一定程度上可降低产生获得性耐药性的风险。

2.激光共聚焦显微镜

以5×10⁴个/孔的密度将A2780卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞种于预先铺好盖玻片的12孔板中并培养24h后，更换新鲜培养基并分别加入含等量DOX的DOX溶液和RRD肽水凝胶，37℃孵育2h，PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定30min，PBS再次洗涤3次，DAPI工作液染色5min，PBS洗涤3次后用抗荧光淬灭封片剂封片，共聚焦显微镜下拍照查看细胞内DOX荧光强度和分布。DOX为蒽环类抗生素，其通过抑制细胞核内DNA和RNA的合成发挥抗肿瘤作用。

如图12所示，在A2780和SKOV3/DDP细胞中，RRD肽水凝胶组细胞核内的DOX荧光强度比DOX溶液组明显加强，说明RR肽水凝胶增加了肿瘤细胞对DOX的核摄取。值得注意的是，在SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞中，DOX溶液组存在很大一部分聚集在细胞膜附近而无法进入细胞核发挥作用的DOX，这可能是其产生耐药性的原因之一。而在RRD肽水凝胶组中，细胞膜附近的DOX荧光基本消失，而细胞核中的荧光强度显著增强，说明RR肽水凝胶可以通过增加肿瘤细胞对DOX的核摄取以对抗耐药性。

实施例7：RR肽水凝胶降低肿瘤耐药细胞药物外排蛋白水平以逆转耐药

ATP结合盒转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)是在肿瘤中高表达并参与肿瘤耐药性发生的跨膜蛋白，它们通过主动将抗肿瘤药物泵出细胞而赋予肿瘤耐药性。以3×10⁵个/孔的密度将SKOV3卵巢癌细胞和SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞种于6孔板中并培养24h，更换新鲜培养基，往其中一组SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞培养基中加入RR肽水凝胶，继续培养24h后分别提取SKOV3卵巢癌细胞、SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞以及RR肽水凝胶处理过的SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞的总RNA，去除残留DNA后进行逆转录得到cDNA，通过实时荧光定量PCR检测细胞中P-gp、BCRP的mRNA表达水平。

如图13所示，与作为亲本的SKOV3卵巢癌细胞相比，SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞中P-gp和BRCP的含量明显升高，而RR肽水凝胶处理有效降低了SKOV3/DDP卵巢癌耐药细胞中P-gp和BRCP的表达水平，表明RR肽水凝胶不仅能增加药物摄取，还能通过降低药物外排蛋白P-gp和BRCP的水平减少药物排出，从而逆转肿瘤细胞耐药。

实施例8：RRD肽水凝胶的体内抗癌效果和生物相容性

建立裸鼠异种移植皮下肿瘤模型：以每只鼠1×10⁶个A2780卵巢癌细胞的接种量接种于裸鼠皮下，待肿瘤体积达到约100mm³(约10天)时分别注射100微升的0.9％NaCl溶液(空白对照组)、DOX溶液(DOX治疗组)、RD肽水凝胶(RD治疗组)和RRD肽水凝胶(RRD治疗组)，每3天测量瘤体大小，2周后安乐死小鼠，剥离肿瘤组织进行称重并拍照，对小鼠内脏进行HE染色以观察药物毒性反应。

如图14所示，RRD治疗组裸鼠的肿瘤体积始终维持在较小水平，该组第14天剥离后的肿瘤质量最低，治疗效果显著强于DOX治疗组和RD治疗组，充分证明RR肽水凝胶可有效增强DOX的抗肿瘤效果，在达到相同治疗效果的前提下，RR肽水凝胶作为载体将能减小药物用量。如图15所示，各组裸鼠的心、肝、脾、肺和肾脏组织均为正常形态，未观察到明显的毒副反应，表明RR肽水凝胶作为抗肿瘤药物载体具有良好的安全性和生物相容性。

实施例9：RRD肽水凝胶的体内药物缓释性能

C57BL/6小鼠背部剃毛后皮下注射100微升DOX溶液和RRD肽水凝胶(DOX浓度：1mg/mL)，于特定时间点使用IVIS^@LuminaXRMS III小动物活体成像***对小鼠进行激发光和发射光分别为478和596nm的荧光成像以检测小鼠体内DOX的荧光强度和分布。如图16所示，DOX溶液在给药后第1天荧光信号已经基本消失，RRD肽水凝胶和RD肽水凝胶组给药后直至第5天仍具有较强的荧光信号，说明引入了R8活性结构域的RR肽水凝胶仍能有效实现对DOX的控制释放，有利于维持肿瘤组织周围稳定的药物浓度并延长药物作用时间，避免高剂量药物的使用，从而降低药物毒性反应和获得性耐药性的发生率。

实施例10：RR肽水凝胶的体内止血性能

RADA16肽水凝胶已被用作商业止血材料，本发明使用小鼠肝切口模型探究了RR肽水凝胶是否依然具有良好的体内止血功能。小鼠肝切口模型构建：C57BL/6小鼠麻醉后做腹部正中切口，暴露肝脏后用纱布吸干周围体液，将肝脏置于预先称重的滤纸上，手术刀在肝脏作一深3mm、长10mm的切口，迅速往切口注射等量0.9％NaCl溶液(阴性对照)、RADA16肽水凝胶(阳性对照)和RR肽水凝胶，观察并记录凝血时间，止血后再次称量滤纸重量以计算出血量。如图17所示，与0.9％NaCl溶液相比，RADA16肽水凝胶和RR肽水凝胶均表现出优秀的体内止血效果，两者无统计学差异，说明引入R8后的RR肽水凝胶仍保持良好的止血性能。术后注射载药的RR肽水凝胶至肿瘤残余灶周围，将同时发挥抗肿瘤和预防术后出血的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种逆转细胞耐药性的多肽，其特征在于：该多肽由自组装肽段、柔性连接肽段以及细胞穿透肽段组成。

2.根据权利要求1所述的逆转细胞耐药性的多肽，其特征在于：所述自组装肽段为RADA16，所述细胞穿透肽包含5～15个氨基酸，所述柔性连接肽段包含2～5个氨基酸。

3.根据权利要求1所述的逆转细胞耐药性的多肽，其特征在于：所述细胞穿透肽为八聚精氨酸；所述柔性连接肽段为GG。

4.一种注射型药物缓释肽水凝胶，其特征在于，包括药物活性成分、离子互补型多肽和权利要求1～3任一项所述的逆转细胞耐药性的多肽；所述离子互补型多肽和所述逆转细胞耐药性的多肽的混合物在盐溶液中自组装成肽水凝胶，将药物活性成分负载其中。

5.根据权利要求4所述的注射型药物缓释肽水凝胶，其特征在于：所述注射型药物缓释肽水凝胶的药物活性成分为在细胞内发挥作用的药物。

6.一种用于制备注射型药物缓释肽水凝胶的试剂盒，其特征在于，包括独立包装的肽存储液和盐溶液；所述肽存储液包括离子互补型多肽和权利要求1～3任一项所述的逆转细胞耐药性的多肽，二者混为一体或独立包装。

7.一种制备注射型药物缓释肽水凝胶的方法，其特征在于，包括：

提供肽水凝胶前驱体溶液；所述肽水凝胶前驱体溶液包括离子互补型多肽、权利要求1～3任一项所述的逆转细胞耐药性的多肽、盐离子、药物活性成分；

将肽水凝胶前驱体溶液静置，自组装成肽水凝胶。

8.根据权利要求7所述的制备注射型药物缓释肽水凝胶的方法，其特征在于：肽水凝胶前驱体溶液中离子互补型多肽、权利要求1～3任一项所述的逆转细胞耐药性的多肽的总浓度为1～5w/v％。

9.根据权利要求4所述的注射型药物缓释肽水凝胶、根据权利要求6所述的用于制备注射型药物缓释肽水凝胶的试剂盒、根据权利要求7所述的制备注射型药物缓释肽水凝胶的方法，其特征在于：所述自组装肽段与所述离子互补型多肽为同一物质。

10.根据权利要求4所述的注射型药物缓释肽水凝胶、根据权利要求6所述的用于制备注射型药物缓释肽水凝胶的试剂盒、根据权利要求7所述的制备注射型药物缓释肽水凝胶的方法，其特征在于：离子互补型多肽和权利要求1～3任一项所述逆转细胞耐药性的多肽的质量比为1：0.1～1.5。