CN116813713B - 一种改造体抗菌肽ri-18及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改造体抗菌肽RI‑18及其应用，属于抗菌肽技术领域。本发明旨在获得壁虎来源的抗菌肽，并对其进行改造以期实现更优异的抗菌效果，经验证，改造体抗菌肽RI‑18具有广谱抗菌活性，无细胞毒性和溶血作用，且具有双亲性α螺旋结构，可以靶向破坏细菌细胞膜发挥杀菌作用，在耐药菌株的抑制方面表现优异。抗菌肽RI‑18有望成为新型广谱性抗菌候选药物，在抗“超级细菌”方面具有良好的应用前景。

Description

一种改造体抗菌肽RI-18及其应用

技术领域

本发明涉及一种改造体抗菌肽RI-18及其应用，属于抗菌肽技术领域。

背景技术

近年来由于广谱抗生素、抗菌药物的大量使用或滥用，使得各种耐药性细菌大量涌现，每年，全球有近100万人死于无法用普通抗生素治疗的细菌感染。同时，由于细菌的耐药基因可横向传播，进一步加速了“超级细菌”的诞生。此外，也由于新型抗生素研发能力不足，人类有可能面临无有效抗生素使用的后抗生素时代的到来。2017年2月27日，世界卫生组织(WHO)发布迫切需要新型抗生素的细菌清单用于指导和促进新型抗生素的研究与开发。这份清单列出的12种耐药细菌中有9种属于革兰氏阴性细菌，3种属于***。其中，碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌和绿脓杆菌是所列革兰氏阴性菌中耐药性最为严重的两类菌。在所列的3种革兰氏阳性菌中，甲氧西林耐药及万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌在全球范围内的耐药情况最为严重。

抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽类小分子，因其具有强大且广谱的抗菌活性受到全世界的关注，可用于新型抗菌候选药物分子的开发。抗菌肽在昆虫、植物及动物中分布广泛，一些抗菌肽在动物自身的免疫防御***中发挥重要的作用，如抗菌、抗氧化及免疫抑制等。抗菌肽一般具有阳离子性及两亲性等特点，使其能够特异与带有负电荷的细菌细胞膜结合，发挥抗菌功能。抗菌肽与传统抗生素作用方式不同，相对传统抗生素，抗菌肽以抗菌谱广、杀菌能力强、杀菌速度快、不易产生耐药性等特点被用于新型替抗产品的开发。以抗菌肽为新型抗菌候选药物分子进行开发不仅可以对感染性疾病的治疗提供帮助，更可以对全球耐药性细菌的扩散及“超级细菌”的治疗提供有效的解决办法。

发明内容

为应对当前越来越严重的耐药性细菌的传播和引起的感染等问题，本发明提供了一种具有广谱抗菌活性、无细胞毒性和溶血作用，靶向破坏细菌细胞膜的新型抗菌肽，其在降低抗菌药物耐药性方面具有应用价值。

本发明的第一个目的是提供一种改造体抗菌肽，经SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列改造得到。

进一步地，改造体抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述改造体抗菌肽的碳端经酰胺化修饰。

本发明的第二个目的是提供SEQ ID NO.1所示的抗菌肽或上述改造体抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用。

进一步地，所述抗细菌感染药物用于抑制***或革兰氏阴性细菌。

进一步地，所述的***包括金黄色葡萄球菌。

进一步地，所述的革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、鲍曼不动杆菌或绿脓杆菌。

进一步地，所述抗细菌感染药物中还包括抗生素。

本发明的第三个目的是提供SEQ ID NO.2所示的改造体抗菌肽在制备耐药细菌感染治疗药物中的应用。

进一步地，所述耐药细菌包括***或革兰氏阴性细菌。

进一步地，所述的***包括金黄色葡萄球菌。

进一步地，所述的革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、鲍曼不动杆菌或绿脓杆菌。

本发明的第四个目的是提供SEQ ID NO.1所示的抗菌肽或上述改造体抗菌肽在制备抗生物膜药物中的应用。

进一步地，所述抗生物膜药物用于清除生物膜或抑制生物膜的形成。

本发明的有益效果：

本发明以壁虎来源的抗菌肽为基础进行改造，得到包含18个氨基酸的改造体抗菌肽RI-18，分子量为2167.83道尔顿，等电点为12.06，为直链多肽，所有氨基酸均为L型。体外抑菌实验表明，RI-18具有广谱抗菌活性，对鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株和临床来源耐药菌株均表现较好的抗菌作用，最小抑菌浓度(MIC)值为1.17-18.75μg/mL。抗菌机理实验表明RI-18可靶向破坏细菌的细胞膜。同时，该多肽无细胞毒性和溶血作用。

附图说明

图1是抗菌肽RA-48和RI-18的helical wheel模型。

图2是抗菌肽RI-18在0-8mM浓度SDS时的圆二色谱图。

图3是抗菌肽RI-18对人角质化细胞HaCaT(A)和人胚肾细胞HEK293T(B)的细胞毒性实验结果。

图4是抗菌肽RI-18对人红细胞的溶血作用实验结果。其中，PC指Triton X-100(10％)对照，NC为生理盐水对照。

图5是抗菌肽RI-18对鲍曼不动杆菌0357和金黄色葡萄球菌ATCC6538细胞膜破膜的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：RI-18序列及其制备

获取壁虎(Gekko japonicus)基因组中预测的cathelicidin相关多肽为母本，该母本肽的氨基酸序列见SEQ ID NO.1，具体为：RRGIKKFIKKVKKVKKAIKEGIKKGIKKLLSGGGSNIAHGPGGRRHIA，命名为RA-48。

通过分子改造方法，截取母本肽中的关键氨基酸片段，获得改造体，命名为RI-18，该片段可以形成双亲性α螺旋结构，其氨基酸序列为RRGIKKFIKKVKKVKKAI(SEQ ID NO.2)。包含18个氨基酸，碳端酰胺化，分子量为2167.83道尔顿，等电点为12.06，为直链多肽，所有氨基酸均为L型。

RA-48和RI-18的helical wheel模型通过网站：https://heliquest.ipmc.cnrs.fr构建，如图1所示，该图显示RI-18呈现更为典型的双亲性结构。

以下实施例中用到的抗菌肽RA-48和RI-18，委托吉尔生化(上海)有限公司，通过固相合成方式进行合成，其C端做了酰胺化修饰，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

实施例2：抗菌肽RA-48和RI-18对鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌标准菌株及临床来源耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)测试

将测试菌株接种到LB固体平板上，待菌落长出后挑取单菌落转接到LB液体培养基中，置于37℃、180rpm震荡培养5h，在紫外分光光度计下测定菌液OD600，按照1OD600＝1×10⁹CFU/mL的方法，用LB液体培养基将菌液稀释到2×10⁵CFU/mL的浓度。在无菌的96孔板中各加入100μL稀释后的菌液，随后每孔再加入用生理盐水按梯度稀释好的待测样品100μL，用移液枪吹吸打匀，混匀后置于37℃恒温培养箱中缓慢震荡培养过夜。经过恒温培养后，用酶标仪测定菌液在OD600nm处的吸收值，按照检测不到细菌生长的孔和相邻孔的样品浓度平均值作为MIC值。其中，临床菌株来自昆明医科大学第一附属医院检验科。

实验结果如表1所示，对比母肽RA-48，RI-18对所有测试菌种的MIC值更低，总体降低了2-16倍，即RI-18的抑菌活性比RA-48总体提升了2-16倍。具体为RI-18对鲍曼不动杆菌标准菌株(ATCC19606)和临床来源菌株(编号为10769和0357)均表现出较好的抑菌作用，MIC值均为2.34μg/mL。RI-18对大肠杆菌标准菌株(ATCC8739)和临床来源菌株(编号为0894和5017)也表现出较好的抑菌作用，MIC值为2.34-18.75μg/mL。RI-18对绿脓杆菌标准菌株(ATCC27853)和临床来源菌株(编号为90068和17068)也表现出较好的抑菌作用，MIC值为1.17-2.34μg/mL。RI-18对金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC6538)和临床来源菌株(编号为220823和15775)均表现出较好的抑菌作用，MIC值均为2.34μg/mL。

表1抗菌肽RA-48和RI-18对测试菌株的最小抑菌浓度值

实施例3：RI-18的圆二色谱分析

在开氏温度298K时，选用型号为J-810的圆二色谱仪(日本分光，JASCO)测定RI-18在不同SDS浓度(0、4、8mM)溶液环境中的CD光谱，测定条件如下：扫描范围：190-250nm；扫描速度：100nm/min；带宽：1nm；样品池长：0.1cm；反应时间：1s；每个样品进行3次连续扫描。

结果如图2所示，由该图可知，RI-18在SDS的浓度为0Mm，即在纯水中，RI-18的CD谱在198nm附近有一负峰，在220-230nm范围内有一小而宽的正峰，表明在纯水中RI-18为无规卷曲的构象。在加入SDS之后，RI-18的CD谱在192nm附近有一正峰，在208nm、222nm处呈两个负的特征肩峰，此峰形为典型的α-螺旋结构，表明RI-18在SDS溶液中形成典型的α-螺旋结构。即RI-18在亲水性环境中为无规卷曲的构象，在结合到细菌的细胞质膜由于疏水性的增加转变为两亲性的α-螺旋构象，该构象为RI-18的杀菌作用提供了重要依据。

实施例4：RI-18的细胞毒性检测

检测多肽样品对人角质形成细胞HaCaT和胚肾细胞HEK293T的细胞毒作用，这两种细胞使用DMEM培养基常规培养。方法如下：待细胞长至培养瓶80％时先用PBS洗涤3次，再用0.25％胰酶消化细胞，用DMEM培养液配成5×10⁵个/ml浓度的细胞悬液，在无菌96孔板中每孔加入200μl细胞悬液，继续培养过夜培养。第二天分别加入不同浓度梯度的RI-18样品，每个浓度设置3个重复，再培养24h。培养结束后每孔加入15μl浓度为5mg/ml的MTT溶液，避光继续培养4h，随后吸弃板孔中的培养液，每孔加入200μl DMSO，将培养板置于摇床上轻摇10min以溶解结晶，随后用酶标仪在450nm处测定各孔吸光度值。结果如图3所示，由该结果可知，RI-18对这两种细胞没有明显毒性。

实施例5：RI-18的溶血作用测试

将新鲜人全血与阿什液按照1:1的比例混合，1000rpm离心5min，将上清液弃去，红细胞用生理盐水洗涤，重复3次，至上清液不再出现红色为止。将上述洗涤好的红细胞用生理盐水稀释到10⁷-10⁸个/ml的密度，将该红细胞悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的待测多肽样品于37℃恒温孵育30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm检测吸收值。阴性对照使用生理盐水(NC)，阳性对照使用相同体积的Triton X-100(10％)(PC)。结果如图4所示，由该结果可知，RI-18对红细胞没有溶血作用。

实施例6：RI-18对细菌的破膜作用

我们选取鲍曼不动杆菌(0357)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)作为测试菌株，检测RI-18对这两株细菌的破膜作用。将处于对数期生长的菌液离心(1500g×5min)，弃上清，所得的菌体沉淀用生理盐水洗涤2次后，继续用生理盐水重悬菌液，调整菌液浓度为2×10⁸CFU/mL。将配制好的菌液加入到黑色透明底的96孔板，每孔100μL，用酶标仪连续检测溶液在15min内的荧光强度。检测条件：激发波长Ex为535nm，发射波长Em为615nm，读数间隔为1min。后加入10μL碘化丙啶(PI)溶液，使之终浓度为2.5μg/mL，用酶标仪连续检测溶液在15min内的荧光强度。继续加入100μL梯度浓度的多肽溶液或等体积的对照溶液，用酶标仪连续检测溶液在60min内的荧光强度。多肽样品的终浓度分别为对各菌株相应最小抑菌浓度的1、5、10倍(即1×MIC、5×MIC、10×MIC)，阳性对照AMP(G+)或Colistin(G-)的终浓度为5×MIC，阴性对照为等体积的生理盐水。结果如图5所示，由该结果可知，RI-18对鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌表现出浓度依赖的破膜作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种改造体抗菌肽，其特征在于：所述改造体抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，且改造体抗菌肽的碳端经酰胺化修饰。

2.权利要求1所述的改造体抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用，其特征在于：所述细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌或绿脓杆菌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗细菌感染药物中还包括抗生素。

4.权利要求1所述的改造体抗菌肽在制备耐药细菌感染治疗药物中的应用，其特征在于：所述耐药细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌或绿脓杆菌。