CN116802214A - 新的缓慢释放前药 - Google Patents

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CN116802214A CN202180092124.5A CN202180092124A CN116802214A CN 116802214 A CN116802214 A CN 116802214A CN 202180092124 A CN202180092124 A CN 202180092124A CN 116802214 A CN116802214 A CN 116802214A
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A·博斯哈特
J·阿勒斯卡格
B·施莱思
P·阿姆斯图茨
S·方泰纳
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Abstract

本发明涉及包含结合部分和药物分子的组合物，其中所述结合部分可逆地结合至所述药物分子以形成前药复合物，该前药复合物在施用后在体内缓慢释放该药物分子。本发明还涉及形成这种组合物的方法和使用这种组合物的治疗方法。还描述了结合部分、编码所述结合部分的核酸以及使用宿主细胞制备这些核酸的方法。

Description

新的缓慢释放前药
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年12月16日提交的US 63/126356、于2020年12月22日提交的EP20216705和于2021年4月30日提交的US 63/182,394的优先权益。这些专利申请的公开内容以引用方式整体并入本文用于所有目的。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，其全部内容通过引用并入本文。于2021年12月16日创建的所述ASCII副本被命名为13081_0027-00304_SL.txt并且大小为54,310字节。
技术领域
本发明涉及包含结合部分和药物分子的组合物，其中所述结合部分可逆地结合所述药物分子以形成前药复合物，该前药复合物在施用后在体内缓慢释放该药物分子。本发明还涉及形成这种组合物的方法和使用这种组合物的治疗方法。还描述了结合部分、编码所述结合部分的核酸以及使用宿主细胞制备这些核酸的方法。
背景技术
显然，可行的药物候选物需要满足某些功效标准，但药物候选物具有可接受的安全概况也是重要的。许多药物分子具有一些不良的脱靶(off-target)和/或靶上(on-target)副作用，并且一些药物分子也可能由于对药物分子的预期靶标的夸大的和不良的药理学作用而导致不利的靶上作用。对于某些药物种类，不良作用不能避免，因此它们必须被减轻。对此有几种选择。例如，非类固醇类抗炎药(NSAID)可损害胃的内层，因此它们通常与保护胃的药剂(诸如质子泵抑制剂奥美拉唑(omeprazole))共施用。对于其他药物分子，不良作用或其风险可使用特定剂量方案来减轻，使得药物以多剂量或在较长时间内连续地施用于患者。这种情况的示例可以包括每天多次服用药物，或静脉内(IV)输注药物。
尽管分次剂量和IV药物输注是公认的和可接受的给药方式，但它们并非没有缺点。对患者而言繁重的剂量方案，诸如在相对短的时间段内需要多次用药的那些剂量方案，与差的患者依从性以及因此更差的治疗结果相关。尽管IV输注方法不太可能遭受差的患者依从性，但患者必须在医疗护理下。这对于患者是破坏性的，并且导致对医疗保健***增加的负担。因此，本领域需要减轻不良药物作用的改进方式。
与使用各种药物相关的特别成问题的不良作用是细胞因子释放综合征(CRS)和高细胞因子血症，也称为“细胞因子风暴”。例如，CRS或高细胞因子血症可在用某些免疫疗法(诸如单克隆抗体和CAR-T细胞)治疗后发生。高细胞因子血症通常在第一剂药物后迅速发生，其特征在于体内细胞因子的不受控制的过量释放。虽然细胞因子释放是正常免疫功能的关键部分，但是过多的细胞因子过快地释放到血液中会导致诸如高热、发炎、严重疲劳、恶心以及有时甚至是多器官衰竭和死亡的症状。在参与者发展出严重的高细胞因子血症后，不得不放弃意欲用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病和类风湿关节炎的药物西拉利珠单抗(Theralizumab)的临床试验。症状的发作在给药一小时内发生，并且试验中的所有参与者都需要紧急的医院护理。CRS还由受免疫疗法影响的免疫细胞向血液中大量、快速释放细胞因子引起。CRS的症状包括发烧、恶心、头痛、皮疹、快速心跳、低血压和呼吸困难。有时，CRS可能是严重的或威及生命的。
已知与CRS相关的一类药物是T细胞接合剂(TCE)。TCE也与全身性内皮活化和大量淋巴细胞再分布以及神经毒性相关，特别是在首次剂量施用后(Velasquez,Blood,2018,131(1),30-38)。这些毒性经常影响临床试验设计和剂量递增策略，并且已经证明尤其是在具有高疾病负荷的患者中，由于严重程度而具有剂量限制。也可能需要预先用药和/或主动干预，最终导致复杂的临床试验设计。
已经设计了几种策略用于与施用药物(如T细胞接合剂)相关的CRS的临床管理。这些策略包括逐步给药(逐步剂量递增)、用类固醇(尤其是***(dexamethasone))预治疗或用托珠单抗(tocilizumab)(抗IL6受体抗体)治疗(参见例如Aldoss等人CurrentOncology Reports，2019，21:4)。用类固醇的预治疗延迟了治疗的开始，这对于侵袭性疾病状态是不推荐的，并且在具有高体重指数(BMI)和/或血压的患者中使用类固醇可能是禁忌的。FDA在2017年批准用托珠单抗治疗以避免CRS。然而，这种药物的免疫抑制作用可使患者易受其他感染性疾病的伤害。
总之，仍然需要新的或改进的方法来避免、减少或减轻用于治疗疾病(包括癌症)的药物分子的不良作用或其风险。
发明内容
本申请寻求提供一种避免或减轻施用药物分子后的不良作用或其风险的新方法。本发明提供一种在施用药物产品后将活性药物分子缓慢释放到体内的方法。该方法使用所谓的“缓慢释放”组合物(在本文中也称为前药复合物)，其在延长的时间段内将活性药物分子释放到体内，从而避免施用后不久体内活性药物分子浓度的峰值。该方法的有益应用的示例是使用包含TCE的缓慢释放组合物降低施用TCE后的CRS风险。
通常采用前药策略来减轻与特定药物如何被吸收、分布、代谢和***相关的问题。许多通常可获得的前药含有体内水解的小部分(诸如酯和酰胺基团)，或在施用后将被磷酸化或去磷酸化的基团。
在本申请中，我们描述了使用结合部分的新的前药方法，该结合部分可逆地结合至药物分子并且当结合时抑制药物分子的生物活性。药物分子的这种生物活性可以是例如药物分子与生物靶标的结合。本发明的前药复合物包含可逆地结合至药物分子的这种结合部分。结合部分与药物分子的结合性质允许药物分子随着时间变化而释放。随着时间变化的药物分子的这种释放可以例如在将本发明的前药复合物施用于受试者(包括人)后发生。本发明的结合部分对药物分子具有高亲和力和/或从药物分子的低解离速率。本发明的结合部分包括具有不同结构的分子，诸如免疫球蛋白分子或非免疫球蛋白分子。结合部分包括抗体、替代性支架(诸如工程化支架)和多肽。这种工程化支架的示例是经设计的锚蛋白重复结构域。
总之，本发明提供了包含结合部分和药物分子的缓慢释放组合物、制备这种组合物的方法和使用这种组合物的治疗方法。本发明还提供了新的结合部分、编码所述结合部分的核酸以及使用宿主细胞制备这些核酸的方法。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到或仅能够使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施方案(E)涵盖。
1.在第一实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含(i)结合部分和(ii)药物分子；其中所述结合部分可逆地结合至所述药物分子；并且其中所述结合部分当结合时抑制所述药物分子的生物活性。
2.在第二实施方案中，本发明涉及根据实施方案1所述的组合物，其中所述结合部分包含抗体、替代性支架或多肽。
3.在第三实施方案中，本发明涉及根据实施方案1或2所述的组合物，其中所述结合部分包含免疫球蛋白分子或其片段。
4.在第四实施方案中，本发明涉及根据实施方案1或2所述的组合物，其中所述结合部分包含非免疫球蛋白分子。
5.在第五实施方案中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
6.在第六实施方案中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域衍生自以下或与以下相关：阿德耐汀(adnectin)、单抗体、亲和体(affibody)、阿菲林(affilin)、阿菲默(affimer)、适体、阿非汀(affitin)、α抗体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默(atrimer)、阿维默(avimer)、锚蛋白重复结构域、非诺莫(fynomer)、打结素(knottin)、库尼兹结构域(Kunitzdomain)或T细胞受体(TCR)。
6a.在实施方案6a中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿德耐汀或与其相关的抗原结合结构域。
6b.在实施方案6b中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自单抗体或与其相关的抗原结合结构域。
6c.在实施方案6c中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自亲和体或与其相关的抗原结合结构域。
6d.在实施方案6d中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿菲林或与其相关的抗原结合结构域。
6e.在实施方案6e中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿菲默或与其相关的抗原结合结构域。
6f.在实施方案6f中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自适体或与其相关的抗原结合结构域。
6g.在实施方案6g中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿非汀或与其相关的抗原结合结构域。
6h.在实施方案6h中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自α抗体或与其相关的抗原结合结构域。
6i.在实施方案6i中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自重复蛋白结构域或与其相关的抗原结合结构域。
6j.在实施方案6j中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自犰狳重复结构域或与其相关的抗原结合结构域。
6k.在实施方案6k中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿去默或与其相关的抗原结合结构域。
6l.在实施方案6l中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿维默或与其相关的抗原结合结构域。
6m.在实施方案6m中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所
述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自锚蛋白重复结构域或与其相关的抗原结合结构域。
6n.在实施方案6n中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自非诺莫或与其相关的抗原结合结构域。
6o.在实施方案6o中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自打结素或与其相关的抗原结合结构域。
6p.在实施方案6p中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自库尼兹结构域或与其相关的抗原结合结构域。
6q.在实施方案6q中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自T细胞受体(TCR)或与其相关的抗原结合结构域。
7.在第七实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
8.在第八实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
9.在第九实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分对所述药物分子的结合亲和力允许在将所述组合物施用于哺乳动物后随着时间变化释放药物分子。
10.在第十实施方案中，本发明涉及根据实施方案9所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。
11.在第十一实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分以小于10nM(诸如小于10nM、小于1nM、小于100pM、小于10pM或小于1pM)的解离常数(KD)结合所述药物分子。
12.在第十二实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分与所述药物分子的解离速率(koff)介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1或介于约1×10- 6s-1与约1×10-5s-1之间。
13.在第十三实施方案中，本发明涉及根据实施方案11或12所述的组合物，其中所述解离常数(KD)或解离速率(koff)是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测量。
14.在第十四实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分当与所述药物分子复合时具有阻断半衰期(T1/2)，其中所述阻断半衰期根据下式计算：
阻断
15.在第十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案14所述的组合物，其中所述阻断半衰期(T1/2)为至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时，诸如至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约55小时或至少约60小时。
16.在第十六实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域。
17.在第十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案16所述的组合物，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
18.在第十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案16所述的组合物，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1至10，以及(2)与SEQ ID NO:1至10中任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
19.在第十九实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子包含抗体、替代性支架或多肽。
20.在第二十实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子包含免疫球蛋白分子或其片段。
21.在第二十一实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子包含非免疫球蛋白分子。
22.在第二十二实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
23.在第二十三实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域衍生自以下或与以下相关：阿德耐汀、单抗体、亲和体、阿菲林、阿菲默、适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默、阿维默、锚蛋白重复结构域、非诺莫、打结素、库尼兹结构域或T细胞受体(TCR)。
23a.在实施方案23a中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿德耐汀或与其相关的抗原结合结构域。
23b.在实施方案23b中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自单抗体或与其相关的抗原结合结构域。
23c.在实施方案23c中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自亲和体或与其相关的抗原结合结构域。
23d.在实施方案23d中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自阿菲林或与其相关的抗原结合结构域。
23e.在实施方案23e中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自阿菲默或与其相关的抗原结合结构域。
23f.在实施方案23f中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自适体或与其相关的抗原结合结构域。
23g.在实施方案23g中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自阿非汀或与其相关的抗原结合结构域。
23h.在实施方案23h中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自α抗体或与其相关的抗原结合结构域。
23i.在实施方案23i中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自重复蛋白结构域或与其相关的抗原结合结构域。
23j.在实施方案23j中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自犰狳重复结构域或与其相关的抗原结合结构域。
23k.在实施方案23k中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自阿去默或与其相关的抗原结合结构域。
23l.在实施方案23l中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组
合物，其中所述结合部分包含衍生自阿维默或与其相关的抗原结合结构域。
23m.在实施方案23m中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自锚蛋白重复结构域或与其相关的抗原结合结构域。
23n.在实施方案23n中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自非诺莫或与其相关的抗原结合结构域。
23o.在实施方案23o中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自打结素或与其相关的抗原结合结构域。
23p.在实施方案23p中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自库尼兹结构域或与其相关的抗原结合结构域。
23q.在实施方案23q中，本发明涉及根据任一前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自T细胞受体(TCR)或与其相关的抗原结合结构域。
24.在第二十四实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子对CD3具有结合特异性。
25.在第二十五实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子还包含至少一个对肿瘤相关抗原(TAA)具有结合特异性的结合结构域。
25a.在实施方案25a中，本发明涉及根据实施方案25所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原(TAA)是CD33。
25b.在实施方案25b中，本发明涉及根据实施方案25所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原(TAA)是CD123。
26.在第二十六实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子是T细胞接合剂药物分子(TCE)。
27.在第二十七实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中该药物分子包含经设计的锚蛋白重复结构域。
28.在第二十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案27所述的组合物，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:12至15，以及(2)与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
29.在第二十九实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述药物分子包含抗体。
30.在第三十实施方案中，本发明涉及根据实施方案29所述的组合物，其中所述药物分子是作为T细胞接合剂药物分子(TCE)的抗体。
31.在第三十一实施方案中，本发明涉及根据实施方案30所述的组合物，其中所述TCE包含结合至CD3的结合结构域并且还包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域。
31a.在实施方案31a中，本发明涉及根据实施方案31所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原(TAA)是CD33。
31b.在实施方案31b中，本发明涉及根据实施方案31所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原(TAA)是CD123。
32.在第三十二实施方案中，本发明涉及根据实施方案24至31b中任一项所述的组合物，其中所述结合部分与所述TCE药物分子的结合抑制所述TCE药物分子与T细胞的结合和/或T细胞的活化。
33.在第三十三实施方案中，本发明涉及根据实施方案24至28和30至32中任一项所述的组合物，其中所述TCE是双特异性抗体。
34.在第三十四实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述结合部分是所述药物分子的抗独特型结合物。
35.在第三十五实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，该组合物另外包含药学上可接受的载体或赋形剂。
36.在第三十六实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的组合物，该组合物用于疗法。
37.在第三十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案36使用的组合物，该组合物用于治疗增殖性疾病，任选地其中所述增殖性疾病是癌症。
38.在第三十八实施方案中，本发明涉及一种治疗方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1至35中任一项所定义的组合物的步骤。
39.在第三十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案38所述的方法，其中所述方法是治疗增殖性疾病的方法，任选地其中所述增殖性疾病是癌症。
40.在第四十实施方案中，本发明涉及有需要的受试者中T细胞活化的方法，该方法包括向所述受试者施用根据实施方案24至28和30至32中任一项所述的组合物的步骤，任选地其中所述组合物另外包含药学上可接受的载体或赋形剂。
41.在第四十一实施方案中，本发明涉及控制活性药物分子在体内释放的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1至35中任一项所述的组合物。
42.在第四十二实施方案中，本发明涉及根据实施方案38至41中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
43.在第四十三实施方案中，本发明涉及制备控释制剂的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供根据实施方案1至6、9和11至18中任一项所定义的结合部分；
(ii)提供根据实施方案19至23中任一项所定义的药物分子；以及
(iii)使所述结合部分和活性药物分子达到平衡，使得基本上所有所述药物分子都被所述结合部分结合。
44.在第四十四实施方案中，本发明涉及控制药物分子的生物活性的方法，该方法包括将根据实施方案1至6、9和11至18中任一项所定义的结合部分与根据实施方案19至23中任一项所定义的药物分子组合以形成组合物，并向有需要的患者施用所述组合物。
45.在第四十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案44所述的方法，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
46.在第四十六实施方案中，本发明涉及根据实施方案45所述的方法，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
47.在第四十七实施方案中，本发明涉及对药物分子具有结合特异性的结合部分，其中当与所述药物分子结合时，所述结合部分抑制所述药物分子的生物活性。
48.在第四十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案47所述的结合部分，其中所述结合部分与所述药物分子的结合形成可逆地抑制所述药物分子的生物活性的复合物。
49.在第四十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案47或48中任一项所述的结合部分，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
50.在第五十实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至49中任一项所述的结合部分，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
51.在第五十一实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至50中任一项所述的结合部分，该结合部分对所述药物分子具有小于10nM、诸如小于10nM、小于1nM、小于100pM、小于10pM或小于1pM的结合亲和力(KD)。
52.在第五十二实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至51中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分与所述药物分子的解离速率(koff)介于约1×10-8s-1与约1×10- 4s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×
10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10- 6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。
53.在第五十三实施方案中，本发明涉及根据实施方案51或52所述的结合部分，其中所述解离常数(KD)或解离速率(koff)是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测量。
54.在第五十四实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至53中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分在与所述药物分子复合时具有阻断半衰期(T1/2)，并且其中所述阻断半衰期根据下式计算：
阻断
55.在第五十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案54所述的结合部分，其中所述阻断半衰期(T1/2)为至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时，诸如至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约55小时或至少约60小时。
56.在第五十六实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至55中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含抗体、替代性支架或多肽。
57.在第五十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至56中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含免疫球蛋白分子或其片段。
58.在第五十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至56中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含非免疫球蛋白分子。
59.在第五十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至58中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
60.在第六十实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域衍生自以下或与以下相关：阿德耐汀、单抗体、亲和体、阿菲林、阿菲默、适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默、阿维默、锚蛋白重复结构域、非诺莫、打结素、库尼兹结构域或T细胞受体(TCR)。
60a.在实施方案60a中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿德耐汀或与其相关的抗原结合结构域。
60b.在实施方案60b中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自单抗体或与其相关的抗原结合结构域。
60c.在实施方案60c中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自亲和体或与其相关的抗原结合结构域。
60d.在实施方案60d中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿菲林或与其相关的抗原结合结构域。
60e.在实施方案60e中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿菲默或与其相关的抗原结合结构域。
60f.在实施方案60f中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自适体或与其相关的抗原结合结构域。
60g.在实施方案60g中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿非汀或与其相关的抗原结合结构域。
60h.在实施方案60h中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自α抗体或与其相关的抗原结合结构域。。
60i.在实施方案60i中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自重复蛋白结构域或与其相关的抗原结合结构域。
60j.在实施方案60j中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项
所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自犰狳重复结构域或与其相关的抗原结合结构域。
60k.在实施方案60k中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿去默或与其相关的抗原结合结构域。
60l.在实施方案60l中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自阿维默或与其相关的抗原结合结构域。
60m.在实施方案60m中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自锚蛋白重复结构域或与其相关的抗原结合结构域。
60n.在实施方案60n中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自非诺莫或与其相关的抗原结合结构域。
60o.在实施方案60o中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自打结素或与其相关的抗原结合结构域。
60p.在实施方案60p中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自库尼兹结构域或与其相关的抗原结合结构域。
60q.在实施方案60q中，本发明涉及根据实施方案47至59中任一项所述的组合物，其中所述结合部分包含衍生自T细胞受体(TCR)或与其相关的抗原结合结构域。
61.在第六十一实施方案中，本发明涉及根据实施方案47至60中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分是经设计的锚蛋白重复结构域。
62.在第六十二实施方案中，本发明涉及根据实施方案61所述的结合部分，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
63.在第六十三实施方案中，本发明涉及根据实施方案61或62中任一项所述的结合部分，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1至10，以及(2)与SEQ ID NO:1至10中任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
64.在第六十四实施方案中，本发明涉及编码根据实施方案47至60中任一项所述的结合部分的核酸。
65.在第六十五实施方案中，本发明涉及编码实施方案61至63中任一项的经设计的锚蛋白重复结构域的核酸。
66.在第六十六实施方案中，本发明涉及包含根据实施方案64或65所述的核酸分子的宿主细胞。
67.在第六十七实施方案中，本发明涉及制备根据实施方案47至63中任一项所述的结合部分的方法，该方法包括在其中表达所述结合部分的条件下培养根据实施方案66所述的宿主细胞。
68.在第六十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案67所述的方法，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
69.在第六十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案67所述的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
附图说明
图1：在向患者单次剂量施用本发明的前药复合物后，总药物分子(“总药物”)、前药复合物(“复合药物”)、未结合的药物分子(“游离药物”)和未结合的结合部分(“游离结合物”)在血浆中的浓度的计算机模拟。图1说明不同分子和前药复合物的浓度随时间(10周的时段)的发展，在施用时从基本上完全复合的药物分子开始。未结合的(活性)药物的浓度在约10天后达到高于复合的(非活性)药物的浓度，并在5周后占总药物的绝大部分。游离的结合物从***中快速清除，因此在从其解离后不能再结合药物分子。如所说明，游离(活性)药物的浓度在施用时从未达到总药物的浓度。因此，由于药物分子从前药复合物中缓慢释放，与施用相同总量的未复合形式的药物分子后获得的Cmax相比，施用本发明前药复合物后获得的游离(活性)药物的最大浓度(Cmax)显著降低。
图2：重复剂量施用未结合的药物分子(“无结合物的游离药物”，虚线)或包含结合至结合部分的药物分子的前药复合物(“药物+结合物”，实线)后未结合的(活性)药物分子的浓度的计算机模拟，其中在每种情况下将相同总量的药物分子施用至患者。显示了三种不同的前药复合物，其由对药物分子具有不同结合亲和力的结合部分产生，如所指示。图2显示了用本发明的前药复合物可实现降低的Cmax和活性药物分子暴露的缓慢增加。此外，Cmax降低的程度和暴露增加的减缓取决于结合部分对药物分子的结合亲和力。结合亲和力越高，Cmax的降低越强，暴露的增加越慢。
图3a：在将前药复合物施用于患者之前，结合部分(“结合物”)与药物分子(“药物”)紧密结合，从而形成前药复合物。由于在前药制剂中结合部分和药物的浓度都很高，所以kon支配结合平衡并且基本上所有的药物分子都被结合部分结合。如果被结合部分结合，则药物分子的生物活性被抑制。
图3b：在施用于患者后，溶液中结合部分和药物的浓度大大降低，并且平衡向有利于前药复合物解离的方向移动(即，koff支配结合平衡)。因此，药物分子随时间从结合部分解复合，从而将活性药物分子缓慢释放到患者体内。
图4：与结合物#9的前体一起测试的不同结合部分(结合物#1、结合物#4和结合物#5)以及作为参考的亲本结合物的表面等离子体共振(SPR)数据，显示亲本结合物具有1小时-2小时的阻断T1/2，而实施例2中测试的结合部分在2小时测量时段后显示远更少的解离。与亲本结合物相比，这种大大降低的解离导致长得多的阻断T1/2。
图5a和图5b：用TCE#1和3种不同的结合部分(结合物#4、结合物#5和结合物#9)以及中等亲和力亲本结合物的标准肿瘤细胞杀伤和T细胞活化测定。样品制备如实施例3中所述。肿瘤细胞杀伤(通过乳酸脱氢酶(LDH)释放确定，OD492-OD620)显示在图5a中，T细胞活化(CD25+细胞以CD8+细胞的％表示)显示在图5b中。以nM表示的IC50值如所指示。
图6a：通过确定在连续稀释的TCE(TCE#1)存在下表达TAA的肿瘤细胞(用NucLight/>标记)的T细胞介导的生长抑制(用作T细胞介导的杀伤的替代物)；参见实施例4。以规则的间隔确定总红色物体面积(对应于肿瘤细胞)。误差棒显示每个图像的标准误差(每个孔4个图像)。
图6b：直至时间点4.5天来自实验的AUC(曲线下面积)数据对TCE#1的浓度的图。EC50值以pM指示；参见实施例4。
图7a至图7e：用于比较超高亲和力和中等亲和力结合部分随时间推移阻断表达TAA的肿瘤细胞的T细胞介导的生长抑制(用作T细胞介导的杀伤的替代物)的能力的“简单”实验，如实施例4中所述。测试以下条件：不添加TCE或结合部分(背景)；仅添加10nM结合部分(结合物#4、结合物#5和结合物#9；图7e)；仅添加TCE(TCE#1)；以结合部分:TCE(TCE#1+亲本结合物)的递减比率添加预平衡的TCE#1和亲本结合物；以结合部分:TCE(TCE#1+结合部分#5)的递减比率添加预平衡的TCE和超高亲和力结合部分(结合部分#5)。将TCE浓度设定为10pM最终浓度，大致对应于基于先前LDH实验的TCE#1的EC80。以规则的间隔确定总红色物体面积(对应于肿瘤细胞)。误差棒显示每个图像的标准误差(每个孔4个图像)。
图8a至图8d：用于比较不同超高亲和力结合部分随时间阻断表达TAA的肿瘤细胞的T细胞介导的生长抑制(用作T细胞介导的杀伤的替代物)的能力的“简单”实验。将恒定浓度的TCE(TCE#1，10pM最终浓度)与不同结合部分(结合物#4、结合物#5和结合物#9)的滴定液混合。将混合物以100x浓度(以允许>99.9％的TCE被结合部分结合)预温育至少24小时，然后在开始/>实验之前立即稀释100倍。仅10nM结合部分(结合物#4、结合物#5和结合物#9)的阴性对照曲线显示在图8d中。背景曲线是在不添加TCE或结合部分的情况下完成。以规则的间隔确定总红色物体面积(对应于肿瘤细胞；参见实施例4。误差棒显示每个图像的标准误差(每个孔4个图像)。
图9a至图9b：用于比较不存在或存在功能槽隔室下超高亲和力结合部分阻断T细胞介导的表达TAA的肿瘤细胞随时间推移的生长抑制(用作T细胞介导的杀伤的替代物)的能力的“复杂”实验(参见实施例6)。用含有未包被的珠的入口(即不存在功能槽隔室)(图9a)或用含有包被有能够捕获解离的结合物的CD3结合结构域的珠的入口(即存在功能槽隔室)(图9b)进行实验。在存在T细胞和用不同摩尔比的TCE#1与结合物#9制备的前药复合物下，表达TAA的肿瘤细胞的T细胞介导的生长抑制曲线显示在图9a中用于未包被的珠的设置，并且显示在图9b中用于包被的珠的设置。如所指示，对照是用未结合的TCE#1(代替前药复合物)和没有任何TCE或前药复合物(背景)进行。以规则的间隔确定总红色物体面积(对应于肿瘤细胞)。误差棒显示每个图像的标准误差(每个孔36个图像)。
图10a至图10f：通过将对照或药物分子掺入含有CD123+和CD33+靶细胞的新鲜人全血中并在旋转轮上温育样品以避免血液凝固，在离体测定中确定的细胞因子释放。测试的对照和药物分子包括媒介物(星形)、1nMα-CD123 xα-CD3工业对照(实心三角形)和1nMTCE#1(空心正方形)，或与其比较的1nM TCE#1+1.2nM结合物#5(空心菱形)。(A)和(B)显示了未结合形式(A)和与结合物#5的复合形式(B)的TCE药物分子。在0小时、2小时、4小时、8小时、24小时通过Meso Scale技术确定TNF-α(C)、IFN-γ(D)、IL-2(E)和IL-6(F)的细胞因子释放。数据来自在Immuneed AB，Sweden用来自一个健康人供体的血液进行的单个实验。
图11a至图11g：比较了携带Molm-13肿瘤、移植PBMC的NOG小鼠中A)未结合的TCE与B)与两种不同结合物复合的TCE的抗肿瘤活性的体内功效研究。C)体内功效研究的研究设计。在第0天移植来自两个人供体的PBMC，并且在第2天s.c.注射Molm-13肿瘤细胞，在第6天肿瘤大小为约70mm3时开始治疗。将以200μg/kg和1000μg/kg两种不同剂量给予的未结合的TCE#2与1000μg/kg TCE#2和对CD3结合结构域具有不同亲和力的两种不同结合物的复合物进行比较。用2倍摩尔过量的结合物预平衡复合物以保证在治疗开始时TCE的100％复合率。i.v.给予治疗。除了非半衰期延长的α-CD33 xα-CD3工业对照(第2组，其中每日以200μg/kg给予治疗)外，所有治疗组(包括媒介物)每周3次。在第一治疗剂量之前和第一治疗剂量后4小时采集血样以确定以这些相对小的肿瘤在治疗开始时的细胞因子水平。D)用供体A或供体B的PBMC人源化的n＝10只小鼠的所有六个治疗组的肿瘤生长曲线，绘制为平均值±SEM，除了第2组(工业对照)，其中由于供体B的人源化不成功而排除了两只动物。指示了在第6天开始并在第16天结束的治疗阶段。E)用供体A的PBMC人源化的n＝5只小鼠的所有6个治疗组的肿瘤生长曲线，绘制为平均值±SEM。F)用供体B的PBMC人源化的n＝5只小鼠的所有六个治疗组的肿瘤生长曲线，绘制为平均值±SEM，除了第2组，其中由于未成功人源化而排除两只动物。G)所有六个治疗组的图例。
图12a至图12d：在体内功效研究期间，在第一剂量之前(前)或第一剂量后4小时采集的血样的血清中测量的人细胞因子水平，其中肿瘤在治疗开始时相对小(约70mm3)。对于图11中引入的六个治疗组，将单个动物的细胞因子水平绘制为实心符号(供体A，n＝5)或空心符号(供体B，n＝5)，平均值展示为棒±SD。如图11所示，由于供体B的人源化不成功，因此不得不排除第2治疗组的两只小鼠。A)以pg/ml表示的TNF-α水平B)以pg/ml表示的IFN-γ水平。C)以pg/ml表示的IL-2水平，以及D)以pg/ml表示的IL-6水平。
图13a至图13d：比较在携带Molm-13肿瘤的PBMC移植NOG小鼠中A)未结合的TCE与B)与两种不同结合物复合的TCE的细胞因子释放的独立体内安全性研究。C)体内安全性研究的研究设计。在第0天移植来自两个人供体的PBMC，在第2天将MOLM-13肿瘤细胞皮下(s.c.)注射到后胁腹中，并且在第14天在肿瘤大小为约300mm3-800mm3时静脉内(i.v.)注射单剂量(攻击)。将以1000μg/kg给予的未结合的TCE#2与TCE#2和三种不同结合物的复合物进行比较，该三种不同结合物对CD3结合结构域具有在KD≤1pM至两位数pM范围内的不同亲和力。用2倍摩尔过量的结合物预平衡复合物以保证在治疗开始时TCE的100％复合率。在给药前、第一治疗剂量后2小时、4小时、8小时和24小时取血样，以用中等大小肿瘤确定细胞因子水平。D)在用已建立的肿瘤(300mm3-800mm3)的体内安全性研究中，来自单次剂量治疗之前或之后采集的血样的血清中的人细胞因子水平(TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6)。通过CBA人Th1/Th2/Th17试剂盒(BD Biosciences)对未稀释的血清样品确定细胞因子水平。将单个动物的细胞因子水平绘制为实心符号(供体A，n＝5)或空心符号(供体B，n＝5)，并且对于未阻断的TCE#2与TCE#2+结合物治疗组，平均值分别展示为黑色实线和灰色实线。体内安全性研究1使用TCE#2±结合物#1或结合物#4进行，而单独但可比较的体内安全性研究2集中于TCE#2±结合物#10。
具体实施方式
概述
本发明涉及包含结合部分和药物分子的组合物，其中所述结合部分可逆地结合至药物分子，并且其中当结合时，所述结合部分抑制药物分子的生物活性。本发明的这种组合物是在施用时体内缓慢释放药物分子的前药复合物。施用后活性药物分子的缓慢释放可使不良作用或其风险最小化，否则与药物分子相关。
不希望受理论束缚，应理解本文所述的结合部分以非共价方式与药物分子紧密结合。结合可发生在药物分子的活性位点，或药物分子上的另一位点。结合可以是抗独特型。不考虑结合位置，结合部分的结合抑制药物分子的生物活性(即，作用模式)。药物分子与过量的结合部分一起配制，导致药物分子的完全或几乎完全的复合和抑制，并形成组合物(即前药复合物)。当施用于患者时，将前药复合物强烈稀释，导致活性药物分子随时间连续释放，因为结合部分的再结合由于i)体内结合部分和药物的非常低的浓度和ii)结合部分从***中快速消除而变得可忽略。
图1至图3提供了本发明的结合部分和组合物(前药复合物)的缓慢释放概念和性质的进一步说明和解释。
本发明还涉及形成此类组合物的方法和使用此类组合物的治疗方法以及此类组合物在疗法中的用途。例如，本发明涉及此类组合物在治疗增殖性疾病(诸如癌症)中的用途。
还描述了对药物分子具有结合特异性的结合部分，其中所述结合部分与所述药物分子的结合形成可逆地抑制所述药物分子的生物活性的复合物。例如，所述药物分子的这种生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
本发明还涉及编码所述结合部分的核酸以及使用宿主细胞制备这些核酸的方法。
定义
除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般来讲，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学使用的命名法以及其技术是本领域熟知的和常用的那些。
除非另外说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被理解为开放式术语。如果本发明的各方面被描述为“包括”特征，则还设想到“由该特征组成”或“基本上由该特征组成”的实施方案。除非另外提出权利要求，否则本文所提供的任何和全部实例或示例性语言(例如“诸如”)仅仅旨在更好地举例说明本公开，并且并不用来限制本公开的范围。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何不受权利要求书保护的要素是实施本公开所必需的。除了在操作示例中，或在另外指明的情况下，本文所用的表示成分或反应条件的量的所有数字在所有情况下均应理解为由相关领域的技术人员将理解的术语“约”修饰。除非另有说明，否则如本文所用的术语“约”等同于给定数值的±10％。
除非本文另外说明，否则本文对值的范围的表述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值和每个端点的简略方法，并且每个单独值和端点并入本说明书中，如同其在本文中被单独地表述一样。
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”是指包含多肽的分子，其中多肽的至少一部分通过在单个多肽链内和/或多个多肽链之间形成二级、三级和/或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两个或更多个多肽链，则单个多肽链可例如通过两个多肽之间的二硫键非共价连接或共价连接。通过形成二级和/或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域技术人员熟知的。
术语“药物分子”(在本文中与术语“药物”可互换使用)是指包含多肽或蛋白质的治疗剂，其中所述多肽或蛋白质含有能够被结合部分结合的位点。
在重组蛋白、重组多肽等中使用的术语“重组”是指所述蛋白质或多肽是通过使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术产生的。例如，可将编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pQE30，QIAgen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的DNA中。如果例如将此类重组细菌表达质粒***适当的细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))中，则这些细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。对应产生的多肽或蛋白质被称为重组多肽或重组蛋白。
在本发明的上下文中，术语“结合部分”或“结合物”是指包含多肽或蛋白质的结合物，其中所述多肽或蛋白质能够非共价结合至药物分子。结合部分不一定需要与药物分子的活性位点结合。然而，结合部分必须以抑制药物的作用模式的方式结合。这可以是通过与药物的活性位点结合，但也可以是通过与药物分子上的另一位点结合以改变所述药物的构象(即，变构抑制)或在空间上阻碍药物分子的活性位点。药物分子的活性位点参与药物分子的生物活性。生物活性可以是酶活性或与生物靶标的结合。结合部分与药物分子的结合抑制药物分子的生物活性。例如，结合部分与药物分子的结合抑制药物分子的酶活性或抑制药物分子与生物靶标的结合。结合部分与药物分子的结合可以是抗独特型。因此，结合部分可以是药物分子的抗独特型结合物。
用于本发明的结合部分包括抗体、替代性支架和多肽。如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，诸如当免疫***检测到外源抗原时通常由免疫***产生的那些抗体分子，而且也指保留抗原结合能力的抗体分子的任何片段、变体和合成或工程化类似物。此类片段、变体和类似物也是本领域熟知的，并且定期地在体外和体内使用。因此，术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子、抗体片段，诸如例如Fab、Fab'、F(ab')2和单链V区片段(scFv)、双特异性或多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合蛋白、非常规抗体和包含衍生自免疫球蛋白分子的抗原结合结构域的蛋白质。如本文所用，术语“替代性支架”是指包含蛋白质或由蛋白质组成但不是抗体的任何分子。
任何这些不同结构类型的结合部分可与药物分子紧密结合，从而阻断药物分子的作用模式并形成前药复合物。前药复合物在体内缓慢地解复合，从而将药物分子释放到体内。在一个优选的实施方案中，结合部分包含对药物分子具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在另一个优选的实施方案中，结合部分包含对药物分子具有结合特异性的抗体。在另一个优选的实施方案中，结合部分包含对药物分子具有结合特异性的替代性支架，其中该替代性支架不包含锚蛋白重复结构域。在一个优选的实施方案中，药物分子包含抗体，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述抗体具有结合特异性的抗独特型抗体。在另一个优选的实施方案中，药物分子包含抗体，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述抗体具有结合特异性的抗独特型替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域。在另一个优选的实施方案中，药物分子包含替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述替代性支架具有结合特异性的抗独特型抗体。在另一个优选的实施方案中，药物分子包含替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述替代性支架具有结合特异性的抗独特型替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域。
术语“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸分子，其可以是单链或双链的核糖核酸(RNA)分子或脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且包括DNA或RNA的经修饰形式和人工形式。核酸分子可以以分离的形式存在，或者被包含在重组核酸分子或载体中。
术语“靶标”是指单个分子，诸如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物或任何其他天然存在的分子，包括此类单个分子的任何部分，或者两种或更多种此类分子的复合物，或整个细胞或组织样品，或任何非天然化合物。优选地，靶标是天然存在的或非天然的多肽或蛋白质，或含有化学修饰(例如天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化)的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，生物靶标是免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞或另一种类型的免疫细胞。在一些其他实施方案中，生物靶标是肿瘤细胞。
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的链组成的分子。优选地，多肽由八个以上经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的S-S桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。
专利申请WO2002/020565和Forrer等人，2003(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.,Plückthun,A.,2003.FEBS Letters 539,2-6)包含重复蛋白特征和重复结构域特征、技术和应用的一般描述。术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选地，重复蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个或六个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含附加的非重复蛋白质结构域、多肽标签和/或肽接头。重复结构域可以是结合结构域。
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述重复模块具有结构和序列同源性。优选地，重复结构域还包含N-末端和/或C-末端的封端模块。为了清楚起见，封端模块可以是重复模块。本领域从业人员根据以下各项的示例熟知此类重复结构域、重复模块和封端模块、序列基序以及结构同源性和序列同源性：锚蛋白重复结构域(Binz等人，J.Mol.Biol.332,489–503,2003；Binz等人，NatureBiotech.22(5):575-582(2004)；WO2002/020565；WO2012/069655)、富含亮氨酸的重复结构域(WO2002/020565)、三角形四肽重复结构域(Main,E.R.,Xiong,Y.,Cocco,M.J.,D'Andrea,L.,Regan,L.,Structure 11(5),497-508,2003)和犰狳重复结构域(WO2009/040338)。本领域技术人员还熟知，此类重复结构域不同于包含重复氨基酸序列的蛋白质，其中每个重复氨基酸序列能够形成单个结构域(例如纤连蛋白的FN3结构域)。
术语“锚蛋白重复结构域”是指包含两个或更多个连续的锚蛋白重复模块作为结构单元的重复结构域。可使用标准重组DNA技术(参见例如Forrer,P.等人，FEBS letters，第539卷，第2页-第6页，2003，WO2002/020565、WO2016/156596、WO2018/054971)，将锚蛋白重复结构域模块化地组装成较大锚蛋白重复蛋白，任选地具有半衰期延长结构域。
如在经设计的锚蛋白重复蛋白和经设计的重复结构域等中所用，术语“经设计的”是指此类重复蛋白和重复结构域分别是人造的并且在自然界中不存在的性质。本文所述的经设计的重复蛋白包含至少一个经设计的重复结构域。优选地，该经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。
术语“靶标相互作用残基”是指有助于与药物分子直接相互作用的结合部分的氨基酸残基。例如，如果结合部分是经设计的锚蛋白重复结构域，则术语“靶标相互作用残基”是指有助于与药物分子直接相互作用的经设计的锚蛋白重复结构域的氨基酸残基。
术语“框架残基”或“框架位置”是指有助于折叠拓扑结构、即有助于重复模块的折叠或有助于与相邻模块的相互作用的所述重复模块的氨基酸残基。此类贡献可为与重复模块中其他残基的相互作用，或是对如α-螺旋或β-片层中存在的多肽主链构象的影响，或是参与形成直链多肽或环的氨基酸延伸。
此类框架和靶标相互作用残基可通过分析由物理化学方法(诸如X射线晶体学、NMR和/或CD光谱)获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学领域从业者熟知的已知和相关结构信息进行比较来鉴定。
术语“重复模块”是指经设计的重复结构域的重复氨基酸序列和结构单元，其最初来源于天然存在的重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的每个重复模块来源于天然存在的重复蛋白家族或亚家族(优选地锚蛋白重复蛋白家族)的一个或多个重复单元。此外，包含在重复结构域中的每个重复模块可以包含从同源重复模块导出的“重复序列基序”，该同源重复模块从靶标上选择的重复结构域获得并且具有相同的靶标特异性。
因此，术语“锚蛋白重复模块”是指最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员熟知的。经设计的锚蛋白重复蛋白先前已有描述；参见，例如，国际专利公开号WO2002/020565、WO2010/060748、WO2011/135067、WO2012/069654、WO2012/069655、WO2014/001442、WO2014/191574、WO2014/083208、WO2016/156596和WO2018/054971，所有这些都通过引用以其整体并入。通常，锚蛋白重复模块包含约31个至33个氨基酸残基，这些氨基酸残基形成由环隔开的两个α螺旋。
重复模块可以包含具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中未被随机化的氨基酸残基的位置(“非随机化位置”或“固定位置”在本文中可互换使用)和具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中已被随机化的氨基酸残基的位置(“随机化位置”)。非随机化位置包含框架残基。随机化位置包含靶标相互作用残基。“已被随机化”意指在重复模块的氨基酸位置处允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许通常二十种天然存在的氨基酸中的任一种，或者其中允许二十种天然存在的氨基酸中的大多数，诸如除半胱氨酸之外的氨基酸，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复模块导出的氨基酸序列。优选地，所述重复模块来自对相同靶标具有结合特异性的重复结构域。此类重复序列基序包含框架残基位置和靶标相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复模块的框架残基位置。同样，所述靶标相互作用残基位置对应于重复模块的靶标相互作用残基的位置。重复序列基序包含非随机化位置和随机化位置。
术语“重复单元”是指包含一种或多种天然存在的蛋白质的序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在于多个拷贝中，并且表现出确定蛋白质折叠的所有所述基序共有的限定的折叠拓扑结构。此类重复单元的示例包括富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、犰狳重复单元、三十四肽重复单元、HEAT重复单元和富含亮氨酸的变体重复单元。
如果结合部分与特定药物分子的反应或缔合比与替代性靶标(例如，细胞或物质)的反应或缔合更频繁、更迅速、持续时间更长、亲和力更高和/或亲合力更高，则结合部分“特异性结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)该药物分子。通过在给定的一组条件下比较与适当药物分子的结合和与替代药物分子的结合，可以测试结合部分的结合特异性。在一些实施方案中，如果结合分子与适当药物分子结合的亲和力比与替代药物分子结合的亲和力高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍或至少1000倍，则认为其是特异性的。通过阅读该定义还应当理解，例如，特异性或优先结合第一药物分子的结合部分可以或可以不特异性或优先结合第二药物分子。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合。一般来讲，在指定的测定条件下，锚结合部分优先结合特定药物分子，并且不以显著量结合测试样品中存在的其他组分。
任何分子与另一种分子的结合由两种力控制，即结合速率(kon)和解离速率(koff)。任何结合物[B]对靶标[T]的亲和力则可由平衡解离常数KD表示，其为koff/kon的商。
kon是结合反应的二阶速率常数，单位为M-1s-1，而解离反应koff是一阶速率常数，单位为s-1。由此清楚的是，缔合反应取决于反应物的浓度，而解离独立于浓度，遵循简单的指数衰减函数。因此，前药复合物的形成受kon和koff控制。
前药复合物的半衰期在本文中称为“阻断半衰期”或“阻断T1/2”，因为前药复合物(或其中的结合部分)“阻断”或“抑制”药物的作用模式。阻断T1/2可根据下式计算：
阻断其中“ln(2)”是数字2的自然对数(自然对数)，近似为0.693。可以类似地说，当与本发明组合物中的药物分子复合时，结合部分具有阻断半衰期(或阻断T1/2)。多种测定格式可用于选择或表征特异性结合所关注的药物分子的结合部分。例如，固相ELISA免疫测定法、免疫沉淀法、BIAcoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、荧光活化细胞分选法(FACS)、OctetTM(ForteBio公司，Menlo Park，CA)和蛋白质印迹分析是可用于鉴定与靶药物分子特异性结合的结合部分的许多测定法。通常，特定或选择性结合将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更典型地是背景信号的10倍以上。甚至特别地，当平衡解离常数(KD)值<1μΜ，诸如<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<100pM、<10pM或<1pM时，结合部分被认为“特异性地结合”靶标。
测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任一种均可用于本发明的目的。例如，如本文所示例的，特定结合部分对药物分子靶标的结合亲和力可表示为KD值，其是指结合部分和药物分子靶标的解离常数。KD是解离速率(也称为“解离率(koff)”)与缔合速率或“结合率(kon)”的比率。因此，KD等于koff/kon并且表示为摩尔浓度(M)，并且KD越小，结合的亲和力越强。
KD值可使用任何合适的方法测定。用于测量KD的一种示例性方法是表面等离子体共振(SPR)(参见例如Nguyen等人，Sensors(Basel).2015年5月5日；15(5):10481-510)。KD值可通过SPR使用生物传感器***诸如***来测量。BIAcore动力学分析包括例如分析抗原与其表面具有固定的分子(例如包含表位结合结构域的分子)的芯片的结合和解离。用于确定蛋白质的KD的另一种方法是通过使用生物层干涉测量法进行的(参见例如Shah等人，J Vis Exp.2014；(84):51383)。KD值可使用/>技术(Octet QKe***，ForteBio)测量。或者或另外地，也可使用/>(动力学排除测定)测定，购自SapidyneInstruments(Boise，同上)。本文涵盖适用于评估两个结合配偶体之间的结合亲和力的任何方法。表面等离子体共振(SPR)是特别优选的。最优选地，在PBS中并通过SPR确定KD值。
术语“PBS”意指含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
如本文所用，术语“基本上”意指至少95％。因此，如本文所用，短语“基本上所有的药物分子被结合部分结合”等意指所有药物分子的至少95％被结合部分结合。在一些实施方案中，“基本上”意指至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％。在一些实施方案中，“基本上”意指至少99.9％。
术语“处理”以及与其相关的词语不一定暗示100％或完全固化。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在的有益效果或治疗效果不同程度的治疗。在这方面，本文所述的治疗方法和医疗用途可提供任何量或任何水平的治疗。此外，由本公开的方法提供的治疗可包括治疗(即，缓解)一种或多种病症或症状。在示例性方面，本发明提供用药物分子治疗的方法，该方法包括向患者施用前药复合物，其中与如果不以前药复合物形式(即，以具有本发明的结合部分的复合物形式)施用相同量的药物分子时患者将经历的不良作用或其风险相比，施用前药复合物的患者经历的不良作用或其风险降低。因此，使用本发明的结合部分来形成前药复合物允许具有降低的不良作用或降低的其风险的治疗方法，和/或使用更高剂量的药物分子或在缩短时间段内施用药物分子的治疗方法。
任何给定疾病或病症中的治疗应答可通过特定于该疾病或病症的标准化应答标准来确定。经历疗法的受试者可经历与疾病相关的症状的改善以及与施用治疗剂相关的不良作用或其风险的降低的有益作用。
如本文所用，术语“增殖性疾病”是指特征在于细胞过量产生的疾病。增殖性疾病的示例包括但不限于癌症、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、特发性肺纤维化、硬皮病和肝硬化。在一个优选的实施方案中，增殖性疾病是癌症。
结合部分
本文所述的结合部分是具有多种不同结构的多肽或蛋白质，其可以高亲和力结合药物分子。用于本发明的结合部分的示例包括抗体、替代性支架和多肽。
抗体包括包含衍生自抗体或免疫球蛋白分子的抗原结合结构域的任何多肽或蛋白质。抗原结合结构域可衍生自例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和单结构域抗体，例如来自例如人或骆驼科动物来源的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)。在一些情况下，有利的是抗原结合结构域衍生自结合部分最终将在其中使用的相同物种。例如，对于在人中的应用，本文所述的结合部分的抗原结合结构域包含人或人源化抗原结合结构域可能是有益的。抗体可使用本领域熟知的技术获得。
在一个实施方案中，结合部分是骆驼科动物纳米抗体。骆驼科动物纳米抗体(也称为骆驼科动物单一结构域抗体或VHH)衍生自哺乳动物的骆驼科家族，诸如美洲驼、骆驼和羊驼。与其他抗体不同，骆驼科动物抗体缺乏轻链并且由两条相同的重链构成。骆驼科动物抗体通常具有大约15kDa的相对低的分子量。
在一个实施方案中，结合部分是鲨鱼抗体结构域。鲨鱼抗体结构域，如骆驼科动物纳米抗体，也缺乏轻链。
替代性支架包括包含结合结构域的任何多肽或蛋白质，该结合结构域能够结合抗原(诸如药物分子)且不衍生自抗体或免疫球蛋白分子。替代性支架的结合结构域可包含或可衍生自多种不同的多肽或蛋白质结构。替代性支架包括但不限于阿德耐汀(单抗体)、亲和体、阿菲林、阿菲默和适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、基于犰狳重复蛋白的支架、阿去默、阿维默、基于锚蛋白重复蛋白的支架(诸如蛋白)、非诺莫、打结素和库尼兹结构域肽。替代性支架描述于以下中：例如Yu等人，Annu Rev Anal Chem(Palo Alto Calif).2017年6月12日；10(1):293–320.doi:10.1146/annurevanchem-061516-045205。
阿德耐汀最初衍生自人III型纤连蛋白蛋白的第十个细胞外结构域(10Fn3)。III型纤连蛋白结构域具有7个或8个β链，其分布在两个β片层之间，该两个β片层自身彼此堆积以形成蛋白质的核心，并且还含有环(类似于CDR)，该环将β链彼此连接并且暴露于溶剂。在β片层夹层的每个边缘处存在至少三个这样的环，其中边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见美国专利号6,818,418)。由于这种结构，这种非抗体支架模拟在性质和亲和力上与抗体的性质和亲和力类似的抗原结合性质。这些支架可用于体外的环随机化和改组策略，其类似于体内抗体的亲和力成熟过程。
亲和体亲和配体由基于蛋白A的IgG结合结构域之一的支架的三螺旋束构成，该蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个氨基酸被随机化以产生具有大量配体变体的亲合体文库(参见例如美国专利号5,831,012)。亲和体分子模拟抗体，但与抗体的约150kDa的分子量相比，亲和体分子相当小，具有约6kDa的分子量。尽管大小不同，但亲和体分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
阿菲林是结构上衍生自人泛素(历史上也衍生自γ-B晶体蛋白)的合成抗体模拟物。阿菲林由两个相同的结构域组成，主要具有β片层结构，总分子质量为约20kDa。它们含有几种适于修饰的表面暴露的氨基酸。阿菲林在其对抗原的亲和力和特异性方面类似于抗体，但在结构上不类似。
阿菲默是一种肽适体，具有已知为SQT(胱抑蛋白A四重突变体-Tracy)的结构。适体和阿菲默是负责与用于结构限制的惰性和刚性蛋白支架亲和结合的短肽，其中结合肽的N-末端和C-末端都嵌入惰性支架中。
阿非汀是DNA结合蛋白Sac7d的变体，其被工程化以获得特异性结合亲和力。Sac7d最初衍生自古细菌超嗜热菌嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)并与DNA结合以防止其热变性。阿非汀在商业上被称为纳米菲汀(Nanofitin)。
α抗体是小的(大约10kDa)蛋白质，其被工程化以结合多种抗原，因此是抗体模拟物。α抗体支架是基于卷曲螺旋结构计算设计的。标准α抗体支架含有三个α-螺旋，每个由四个七肽重复(7个残基的片段)构成，通过富含甘氨酸/丝氨酸的接头连接。标准七肽序列是“IAAIQKQ”。α抗体靶向细胞外和细胞内蛋白的能力以及它们的高结合亲和力可允许它们结合抗体不能达到的靶标。
抗运载蛋白是具有在脂质运载蛋白中发现的稳健且保守的β-桶结构的一组结合蛋白。脂质运载蛋白是一类包含一条肽链(150个-190个氨基酸)的细胞外蛋白，其负责识别、储存和运输各种生物分子，诸如信号传导分子。
基于犰狳重复蛋白的支架在真核生物中是丰富的，并且涉及广泛的生物过程，尤其是与核运输相关的那些过程。基于犰狳重复蛋白的支架通常由三至五个内部重复和两个封端元件组成。它们还具有串联伸长的超螺旋结构，其使得能够以延伸构象与其相应的肽配体结合。
阿去默是来源于称为四连蛋白的三聚血浆蛋白的支架，该四连蛋白属于由三个相同单元组成的C型凝集素家族。四连蛋白内的C型凝集素结构域(CTLD)的结构具有介导与靶向分子的相互作用的五个柔性环。
阿维默衍生自含有天然A结构域的蛋白质，诸如HER3，并且由通过氨基酸接头连接的许多不同的“A结构域”单体(2个-10个)组成。可使用例如美国专利申请公开号2004/0175756、2005/0053973、2005/0048512和2006/0008844中描述的方法产生可与靶抗原结合的阿维默。
在一个实施方案中，结合部分是锚蛋白重复蛋白。经设计或工程化的锚蛋白重复蛋白(诸如蛋白)可以像抗体模拟蛋白一样起作用，通常表现出高度特异性和高亲和力的靶结合。经设计的锚蛋白重复蛋白包含一个或多个经设计的锚蛋白重复结构域。经设计的锚蛋白重复结构域衍生自天然锚蛋白重复蛋白，并且每个经设计的锚蛋白重复结构域通常以高特异性和亲和力结合靶蛋白。由于它们的高特异性、稳定性、效力和亲和力，以及由于它们在形成单特异性、双特异性或多特异性蛋白方面的灵活性，经设计的锚蛋白重复蛋白特别适合用作高亲和力结合部分。经设计的锚蛋白重复蛋白药物候选物还展示出有利的开发性质，包括快速、低成本和高产率的制造以及在4℃下长达数年的贮存期限。经设计的锚蛋白重复蛋白是本发明结合部分的优选实施方案。/>是MolecularPartners AG拥有的注册商标。
非诺莫是从人Fyn酪氨酸激酶的Src同源结构域3(SH3)的氨基酸83-145进化而来的小的球状蛋白(大约7kDa)。非诺莫是有吸引力的结合分子，这是由于它们的高热稳定性、不含半胱氨酸的支架和人源，这降低了潜在的免疫原性。
打结素，也称为半胱氨酸结小蛋白，通常是长度为30个氨基酸的蛋白质，其包含三个反向平行的β-片层和由二硫键束缚的限制环，该二硫键产生半胱氨酸结。这种二硫键赋予高热稳定性，使得打结素成为有吸引力的抗体模拟物。
库尼兹结构域肽或库尼兹结构域抑制剂是一类具有不规则二级结构的蛋白酶抑制剂，该不规则二级结构含有具有三个二硫键和三个环的约60个氨基酸，其可在不使结构框架不稳定的情况下突变。
在一个实施方案中，结合部分是包含衍生自T细胞受体(TCR)的抗原结合结构域的多肽或蛋白质。
结合部分的示例
用于本发明的锚蛋白重复结构域的示例由SEQ ID NO:1至10提供(参见实施例)。
SEQ ID NO:1至10的锚蛋白重复结构域以高亲和力特异性结合具有选自SEQ IDNO:12至15的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。例如，SEQ ID NO:1至10的锚蛋白重复结构域以高亲和力特异性结合具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。在一个实施方案中，SEQ ID NO:1至10的锚蛋白重复结构域特异性结合具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。在另一个实施方案中，SEQ IDNO:1至10的锚蛋白重复结构域特异性结合具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。具有选自SEQ ID NO:12至15的氨基酸序列的CD3特异性结合分子可以与对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的另一种结合分子基因融合以形成T细胞接合剂(TCE)药物分子。SEQ ID NO:1至10中任一者的锚蛋白重复结构域与这种T细胞接合剂药物分子的结合抑制T细胞接合剂药物分子与CD3的结合，并因此抑制T细胞接合剂药物分子的生物活性。
因此，在一个实施方案中，本发明的结合部分是锚蛋白重复结构域，该锚蛋白重复结构域包含与选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的锚蛋白重复结构域具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合部分是锚蛋白重复结构域，该锚蛋白重复结构域包含与选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的锚蛋白重复结构域具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合部分是锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域是选自由SEQ ID NO:1至10组成的组。
在一个实施方案中，结合部分是经设计的锚蛋白重复结构域，该经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1至10，以及(2)与SEQID NO:1至10中任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，结合部分是经设计的锚蛋白重复蛋白，该经设计的锚蛋白重复蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQID NO:30至51中任一者中的至多9个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中任一者中的至多8个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中任一者中的至多7个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是经设计的锚蛋白重复蛋白，该经设计的锚蛋白重复蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中任一者中的至多6个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中任一者中的至多5个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中任一者中的至多4个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ IDNO:30至51中任一者中的至多3个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中任一者中的至多2个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中任一者中的至多1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。
在本文所述的所有结合部分中，结合部分的氨基酸序列可以被一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，在本文所述的任何结合部分中进行至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2或至多1个取代。
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，在任何锚蛋白重复结构域中进行至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多15个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多14个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ IDNO:1至10序列中任一者，进行至多13个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多12个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多11个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多10个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多9个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多8个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多7个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多6个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多3个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多2个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至10序列中任一者，进行至多1个取代。
在一些实施方案中，氨基酸取代全部在框架位置进行。在一些实施方案中，氨基酸取代全部在非随机位置进行。在经设计的锚蛋白重复结构域中随机位置的定位公开于例如Binz等人，Nature Biotech.22(5):575-582(2004)。
在一些实施方案中，与未取得的结合部分的KD值相比，氨基酸取代使KD值改变不超过约1000倍、不超过约100倍或不超过约10倍。例如，在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:1至10的序列中任一者的结合部分与包含SEQ ID NO:12至15的序列中任一者的药物分子的结合的KD值相比，氨基酸取代使KD值改变不超过约1000倍、不超过约300倍、不超过约100倍、不超过约50倍、不超过约25倍、不超过约10倍或不超过约5倍。
在某些实施方案中，结合部分中的氨基酸取代是根据下表1的保守取代。
表1氨基酸取代
当结合部分是锚蛋白重复结构域时，在一些实施方案中，可在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外、例如在连接α-螺旋的β环中进行取代。在其他实施方案中，可在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域可包含共有序列：xDxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNA(SEQ ID NO:52)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)；或xDxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNA(SEQ ID NO:53)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)，并且“z”是选自由天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸组成的组。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。
另外，结合部分的任何锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置可以是“A”或“L”，和/或最后一个位置可以是“A”或“N”。因此，在一些实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，并且其中任选地倒数第二个位置处的A被L取代，和/或最后一个位置处的A被N取代。在一个示例性实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者至少约90％相同的氨基酸序列，并且其中任选地倒数第二个位置处的A被L取代，和/或最后一个位置处的A被N取代。此外，结合部分的任何锚蛋白重复结构域的序列可任选地在其N-末端包含G、S或GS(见下文)。
此外，结合部分的每个锚蛋白重复结构域可任选地在其N-末端包含“G”、“S”或“GS”序列。因此，在一些实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，并且还任选地在其N-末端包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者至少约90％相同的氨基酸序列，并且其中所述锚蛋白重复结构域还任选地在其N-末端包含G、S或GS。此外，结合部分的任何锚蛋白重复结构域的序列可以任选地在倒数第二个位置具有被L取代的A和/或在最后一个位置具有被N取代的A(见上文)。
N-末端和C-末端封端序列
当本文所述的结合部分包含锚蛋白重复结构域时，该锚蛋白重复结构域可包含N-末端或C-末端封端序列。封端序列是指融合到锚蛋白重复序列基序或模块的N-末端或C-末端的附加多肽序列，其中所述封端序列与锚蛋白重复结构域的相邻锚蛋白重复序列基元或模块形成紧密的三级相互作用(即三级结构相互作用)，从而提供保护一侧的锚蛋白重复结构域的疏水核免于暴露于溶剂的盖。
N末端和/或C末端封盖序列可来源于存在于邻近重复单元的天然存在的重复蛋白质中的封盖单元或其他结构单元。封端序列的示例描述于以下中：国际专利公开号WO2002/020565和WO2012/069655、美国专利公开号US2013/0296221以及Interlandi等人，J MolBiol.2008年1月18日；375(3):837-54。N-末端锚蛋白封端模块(即N-末端封端重复)的示例是SEQ ID NO:21至23，并且C-末端封端模块(即C-末端封端重复)的示例包括SEQ ID NO:28。
药物分子
在本发明的上下文中，药物分子是包含多肽或蛋白质的治疗剂，其中所述多肽或蛋白质含有能够被结合部分结合的位点。对用于本发明的药物分子没有特别限制，只要这些药物分子可以通过结合部分结合即可。这意味着，例如，药物分子可以属于与结合部分相同的“类别”或属于与结合部分不同的“类别”，使得，例如，药物分子和结合部分都可以是抗体，或药物分子和结合部分都可以是替代性支架(例如锚蛋白重复蛋白)，或药物分子可以是抗体且结合部分可以是替代性支架(例如锚蛋白重复蛋白)，或药物分子可以是替代性支架(例如锚蛋白重复蛋白)且结合部分可以是抗体。这进一步意味着，例如，药物分子本身可以包含不同的结构部分，例如，组合抗体部分和替代性支架部分，或组合不同替代性支架结构的部分。在药物分子和结合部分都是抗体的情况下，本领域技术人员将清楚，抗体将彼此不同，包括关于结合特异性。类似地，在药物分子和结合部分都是替代性支架的情况下，本领域技术人员将清楚，替代性支架将彼此不同，包括关于结合特异性。
此外，用于本发明的药物分子可以含有半衰期延长部分。与不具有半衰期延长部分的相同分子相比，半衰期延长部分延长了药物分子的体内血清半衰期。半衰期延长部分的示例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、人血清白蛋白(HSA)结合结构域或聚乙二醇(PEG)。在一些情况下，半衰期延长部分可包含对HSA具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在其他情况下，半衰期延长部分可包含免疫球蛋白结构域，诸如Fc结构域，例如人IgG1的Fc结构域，或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，用于本发明的药物分子包含替代性支架，其中该替代性支架是选自阿德耐汀(单抗体)、亲和体、阿菲林、阿菲默和适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、基于犰狳重复蛋白的支架、阿去默、阿维默、基于锚蛋白重复蛋白的支架(诸如蛋白)、非诺莫、打结素和库尼兹结构域肽。。替代性支架描述于以下中：例如Yu等人，Annu RevAnal Chem(Palo Alto Calif).2017年6月12日；10(1):293–320.doi:10.1146/annurevanchem-061516-045205。
用于本发明的药物分子还包括但不限于目前批准用于临床用途的不同种类的药物，诸如：
(1)免疫检查点抑制剂(ICI)；
(2)双特异性抗体；和
(3)遗传修饰的免疫细胞，诸如T细胞，特别是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，诸如CAR-T细胞。
用于本发明的药物分子还包括但不限于上调或下调免疫检查点活性的药物分子，本文中称为“免疫检查点调节剂”。免疫检查点是免疫***中增大(共刺激分子)或减小(抑制分子)免疫信号的分子。在癌症患者中，肿瘤可以使用这些免疫检查点来保护其自身免受免疫***攻击，特别是T细胞攻击。用于免疫检查点疗法的药物分子可阻断抑制性免疫检查点分子或活化刺激性免疫检查点分子，从而恢复免疫***功能。近年来，免疫检查点药物已经成为重要的新的癌症治疗选择。免疫检查点分子包括但不限于CD27、CD137、CD137L、2B4、TIGIT、CD155、ICOS、HVEM、CD40L、LIGHT、TIM-1、OX40、OX40L、DNAM-1、PD-L1、PD1、PD-L2、CTLA-4、CD8、CD40、CEACAMI、CD48、CD70、A2AR、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、BTLA、C5AR1、CCR8、CD226、CD28、CD33、CD38、CD3e、CD47、CD94、ETAR、NKG2A、SIRPα、TLR8、TNFRSF18、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAG-3、TIM-3、TIM-4和VISTA。在一个实施方案中，药物分子是免疫检查点调节剂。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含抗体。在另一个实施方案中，药物分子包含双特异性抗体。在另一个实施方案中，药物分子包含多特异性抗体。在另一个实施方案中，药物分子包含作为T细胞接合剂药物分子(TCE)的抗体。
双特异性抗体包括TCE。作为TCE的双特异性抗体的示例是被称为BiTeTM分子的分子。这些是由单个肽链上的两个单链可变片段(scFvs)组成的抗癌药物。这种TCE通过scFvs之一与T细胞表面上的CD3(分化簇3)分子结合，而另一种scFv与肿瘤细胞表面上的肿瘤相关抗原(TAA)结合。通过与CD3结合并且将T细胞与肿瘤细胞连接，T细胞被“活化”并且可以对肿瘤细胞发挥细胞毒性活性。作为TCE的双特异性抗体的一个示例是博纳吐单抗(blinatumomab)，其与T细胞表面上的CD3和B细胞表面上的CD19结合。博纳吐单抗被批准用于治疗急性淋巴母细胞白血病。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含双特异性替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含多特异性替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含作为T细胞接合剂药物分子(TCE)的替代性支架分子。在一个优选的实施方案中，所述替代性支架是锚蛋白重复结构域。在进一步优选的实施方案中，用于本发明的药物分子包含替代性支架，其中所述替代性支架是对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:12至15的氨基酸序列。在进一步优选的实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:12至15的氨基酸序列。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:13至14的氨基酸序列。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ IDNO:13。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:14。
双特异性或多特异性替代性支架分子包括TCE。在一个实施方案中，药物分子是双特异性或多特异性替代性支架分子，其中所述替代性支架分子是TCE，该TCE包含(i)作为锚蛋白重复结构域的CD3特异性结合结构域，和(ii)作为锚蛋白重复结构域的TAA特异性结合结构域。类似于被称为BiTeTM分子的TCE，这种包含替代性支架的TCE是抗癌药物，其通过结合结构域之一结合T细胞表面上的CD3分子，而另一结合结构域结合肿瘤细胞表面上的肿瘤相关抗原(TAA)。通过与CD3结合并且将T细胞与肿瘤细胞连接，T细胞被“活化”并且可以对肿瘤细胞发挥细胞毒性活性。
当药物分子是TCE时，本发明的结合部分的优选结合位点是TCE的CD3特异性结合结构域。通过与TCE的CD3特异性结合结构域结合，结合部分通过阻止TCE与T细胞结合来阻断TCE的作用模式。在一个实施方案中，结合部分与TCE的CD3特异性结合结构域的结合是抗独特型。
已经描述了许多作为TCE的双特异性抗体，包括下面列出的那些，括号中提供了它们各自的结合靶标。例如，如上所述，博纳吐单抗(CD19xCD3；Amgen)与T细胞上的CD3抗原结合，并与由B细胞谱系产生的肿瘤细胞上的CD19抗原结合。作为TCE的其他双特异性抗体包括但不限于AMG330(CD33xCD3；Amgen)；伏妥珠单抗(flotetuzumab)(CD123xCD3；Macrogenics)；MCLA117(Clec12AXCD3；Merus)；AMG160(HLE PSMAxCD3，Amgen)；AMG427(HLEFLT3xCD3，Amgen)；AMG562(HLE CD19xCD3，Amgen)；AMG596(HLE EGFRvIIIxCD3，Amgen)；AMG673(HLE CD33xCD3，Amgen)；AMG701(HLE BCMAxCD3，Amgen)；AMG757(HLE DLL3xCD3，Amgen)；AMG910(HLE Claudin18.2xCD3，Amgen)；奥尼妥单抗(odronextamab)(CD20xCD3，Regeneron)；莫妥珠单抗(mosunetuzumab)(CD20xCD3，Roche)；格罗菲妥单抗(glofitamab)(CD20xCD3，Roche)；和艾可瑞妥单抗(epcoritamab)(CD20xCD3,Genmab)。任何此类TCE可用作本发明组合物中的药物分子。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含抗体和替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含两种不同的替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含T细胞受体(TCR)衍生的抗原识别结构域。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含遗传修饰的免疫细胞。在一个优选的实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的T细胞，诸如表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的天然杀伤(NK)细胞，诸如表达CAR的NK细胞(CAR-NK细胞)。
结合亲和力
本文所述的结合部分和药物分子以非共价方式结合以形成前药复合物。任何分子与另一种分子的结合由两种力控制，即结合速率(kon)和解离速率(koff)。任何结合物[B]对靶标[T]的亲和力则可由平衡解离常数KD表示，其为koff/kon的商。
在某些实施方案中，结合部分对药物分子的结合亲和力以KD描述。在示例性实施方案中，KD为约10-7M或更少、约10-8M或更少、约10-9M或更少、约10-10M或更少、约10-11M或更少、约10-12M或更少、约10-13M或更少、约10-14M或更少、约10-7M至约10-15M、约10-8M至约10- 15M、约10-9M至约10-15M、约10-10M至约10-15M、约10-11M至约10-15M、约10-12M至约10-15M、约10-7M至约10-14M、约10-8M至约10-14M、约10-9M至约10-14M、约10-10M至约10-14M、约10-11M至约10-14M、约10-12M至约10-14M、约10-7M至约10-13M、约10-8M至约10-13M、约10-9M至约10-13M、约10-10M至约10-13M、约10-11M至约10-13M或约10-12M至约10-13M。
在示例性实施方案中，结合部分以为以下或小于以下的KD值结合药物分子：约100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约1nM的KD值结合药物分子。在另一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约100pM的KD值结合药物分子。在另一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约10pM的KD值结合药物分子。在另一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约1pM的KD值结合药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:4具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:4具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子结合：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQID NO:5具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:6具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:7具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:7具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:8具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:8具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:9具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:9具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:10具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合所述药物分子：小于约100nm，诸如小于约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约500fM、约250fM、约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM或约1fM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ IDNO:10具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1pM至约100pM范围内的KD值结合所述药物分子。
在示例性实施方案中，结合部分以以下Koff值结合药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10- 6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间或介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1x 10-7s-1与约1x 10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10- 5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:4具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:4具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1x 10-7s-1与约1x 10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1x 10-7s-1与约1x 10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1x 10-7s-1与约1x 10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:7具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，该结合部分包含具有与SEQ ID NO:7具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且该药物分子包含具有与SEQ IDNO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:8具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:8具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:9具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，该结合部分包含具有与SEQ ID NO:9具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且该药物分子包含具有与SEQ IDNO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:10具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO 12至15中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下koff值结合所述药物分子：介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间，诸如介于约1×10-8s-1与约1×10-7s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-8s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-5s-1之间、介于约1×10-7s-1与约1×10-6s-1之间、介于约1×10-6s-1与约1×10-4s-1之间，或介于约1×10-6s-1与约1×10-5s-1之间。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:10具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13或14具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以介于约1×10-7s-1与约1×10-4s-1之间的koff值结合所述药物分子。
当结合部分和药物分子结合在一起时，药物分子不能发挥生物活性，诸如例如结合至生物靶分子。因此，药物的活性被“阻断”，而结合部分与其结合。阻断半衰期(下文中称为“阻断T1/2”)是一半前药复合物解离所花费的时间。因此，T1/2是前药复合物的“半衰期”。阻断T1/2可根据下式计算：
阻断
为了实现药物向受试者中的缓慢释放，阻断半衰期应为至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时。阻断半衰期可落在任何上述值之间。例如，阻断半衰期可以在约10小时至约250小时、约20小时至约250小时、约40小时至约200小时或约50小时至约100小时的范围内。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:2具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:4具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:5具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:6具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:7具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:8具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:9具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：包含与SEQ ID NO:10具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的结合部分，和包含与SEQ ID NO:12至15中的任一者具有至少约85％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复结构域的药物分子，其中所述前药复合物表现出至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约150小时或至少约200小时的阻断半衰期。
对阻断半衰期没有特别的上限。然而，对于某些疾病适应症和相关药物分子，本领域技术人员将理解，如果前药复合物的阻断半衰期太长，则药物可能向体内的释放太慢地而无法具有期望的治疗益处。因此，阻断半衰期应使得给定药物分子的期望治疗益处仍可观察到。
组合物
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含如本文所定义的结合部分；如本文所定义的药物分子；其中所述结合部分可逆地结合至药物分子；并且其中所述结合部分当结合时抑制所述药物分子的生物活性。在一个实施方案中，所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。在一个实施方案中，所述结合部分对所述药物分子的结合亲和力允许药物分子在体内施用后随着时间变化释放。如本文所用，术语“组合物”可与“前药复合物”互换使用。
上面列出的任何蛋白质结合部分可以与上面列出的任何药物分子组合以形成组合物(即，前药复合物)，条件是结合部分对药物分子具有期望的结合亲和力和特异性。
组合物可包含上述任何结合部分和药物分子组合，特别是具有明确公开的结合系数(诸如KD和koff)或阻断半衰期的任何具体公开的组合。
如上所述，经设计的锚蛋白重复结构域是用于本发明的优选结合部分。因此，在一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分。在另一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分和含有经设计的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复结构域结合部分和含有两个、三个、四个、五个或更多个经设计的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分和含有替代性支架的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分和含有抗体的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分和含有衍生自T细胞受体(TCR)的抗原结合结构域的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分和作为T细胞接合剂药物分子的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分和作为免疫检查点调节剂药物分子的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含含有经设计的锚蛋白重复蛋白的结合部分和作为双特异性抗体药物分子的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分和作为表达CAR的免疫细胞(诸如CAR-T细胞或CAR-NK细胞)的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1和(2)与SEQ ID No:1具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:1具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:1具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:1具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID No:1中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中任选地SEQ ID NO:1中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:1中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:1的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:1的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:2，和(2)与SEQ ID NO:2具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:2具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:2具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:2具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:2中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:2中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:2中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:2的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:2的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:3，和(2)与SEQ ID NO:3具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:3具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:3具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:3具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:3中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:3中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:3中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:4，和(2)与SEQ ID NO:4具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:4具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:4具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:4具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:4中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:4中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:4中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:4的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:4的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，和(2)与SEQ ID NO:5具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:5具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:5具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:5具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:5中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:5中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:5中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:5的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:5的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，和(2)与SEQ ID NO:6具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:6具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:6具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:6具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:6中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:6中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:6中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:6的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:6的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，和(2)与SEQ ID NO:7具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:7具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:7具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:7具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:7中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:7中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:7中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:7的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:7的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，和(2)与SEQ ID NO:8具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:8具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:8具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:8具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:8中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:8中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:8中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:8的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:8的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，和(2)与SEQ ID NO:9具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:9具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:9具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ IDNO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:9具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:9中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:9中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:9中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:9的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:9的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，组合物包含(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:10，和(2)与SEQ IDNO:10具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:10具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13和14中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:10具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:10具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性，和(2)包含SEQ ID NO:13和14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID No:10中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:12至15，和(2)与SEQ ID NO:12至15具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:10中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:12至15中的任一者的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:10中的至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代，和(2)包含SEQ ID NO:13至14中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:10的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:12至15中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含具有SEQ ID NO:10的锚蛋白重复结构域的结合部分，和(2)包含含有SEQ ID NO:13和14中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，包含在上述任何所述组合物中的所述药物分子是双特异性或多特异性药物分子。在另一个实施方案中，包含在上述任何所述组合物中的所述药物分子是T细胞接合剂药物分子。
如上所述，抗体和替代性支架也是用于本发明的结合部分。因此，在一个实施方案中，组合物包含结合部分，该结合部分包含抗体或替代性支架。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含抗体或替代性支架的结合部分，和(2)包含经设计的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，组合物包含(1)包含抗体或替代性支架的结合部分，(2)和包含抗体的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含(1)包含抗体或替代性支架的结合部分，和(2)作为T细胞接合剂药物分子的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含(1)包含抗体或替代性支架的结合部分，和(2)作为免疫检查点抑制剂药物分子的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含(1)包含抗体或替代性支架的结合部分，和(2)作为双特异性抗体药物分子的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含(1)包含抗体或替代性支架的结合部分，和(2)作为免疫细胞活化药物分子的药物分子。在一个实施方案中，组合物包含(1)包含抗体或替代性支架的结合部分，和(2)作为遗传修饰的免疫细胞(诸如表达CAR的免疫细胞，诸如CAR-T细胞或CAR-NK细胞)的药物分子。
由于本发明的组合物要求基本上所有的药物分子都与结合部分结合，因此优选给予药物组合物足够的时间以使这种结合发生并达到平衡。形成平衡所需的时间将取决于结合常数(kon和koff)。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及制备控释制剂的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供如本文所定义的结合部分；
(ii)提供如本文所定义的药物分子；以及
(iii)使所述结合部分和活性药物分子达到平衡，使得基本上所有的药物分子都与结合部分结合。
在一个实施方案中，使药物分子和结合部分平衡至少约1小时，诸如至少约2小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时或至少约72小时。
组合物中结合部分的浓度应当相对高以确保kon平衡常数显著高于koff平衡常数，这意味着基本上所有的药物分子都被结合部分结合并且药物分子的作用模式基本上被抑制。在一个实施方案中，结合部分和药物分子以1:1的摩尔比提供。在一些实施方案中，与药物分子的量相比，结合部分应当以摩尔过量存在。因此，在这些实施方案中，结合部分以至少1.2:1、至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少20:1、至少50:1、至少100:1、至少200:1、至少400:1或至少1000:1的与药物分子的摩尔比提供。
本发明还涉及包含本文所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本文还描述了使用所述药物组合物的用途和治疗方法。下面更详细地描述本发明所包括的方法和用途。应注意，该药物组合物、方法和用途治疗由用于制备该药物组合物的药物分子治疗的疾病适应症。
结合部分的主要功能是与药物分子结合以实现药物分子的缓慢释放。因此，在一些实施方案中，结合部分基本上不改变药物分子的体内生物效应，除了以比没有预先与蛋白质结合部分复合的直接施用更慢的速率将药物分子释放到体内。然而，结合部分可以包含附加的官能部分。这种附加的功能部分可以提供特定的优点，诸如生物活性，或者可以用于标记/标示结合部分以用于例如检测目的。
本文所述的药物组合物可以使用本领域已知的方法制备。
药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。标准药物载体包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水或水/油乳液以及各种类型的润湿剂。
药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶推进剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、基料、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂布剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、填料、成膜剂、风味增强剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、湿润剂、润滑剂、粘膜粘附剂、膏剂基料、膏剂、含油溶媒、有机基料、锭剂基料、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基料、界面活性剂、表面活性剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水混溶性共溶剂、水软化剂或润湿剂。参见例如Handbook ofPharmaceutical Excipients第三版，A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press，London，UK，2000年)，其全文以引用方式并入。Remington’s Pharmaceutical Sciences，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980年)，其全文以引用方式并入。
可配制药物组合物以实现生理上相容的pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH可例如介于约4或约5和约8.0之间，或介于约4.5和约7.5之间，或介于约5.0和约7.5之间。在示例性实施方案中，药物组合物的pH介于约5.5与约7.5之间。
在一个实施方案中，本发明涉及在有需要的受试者中免疫细胞活化、诸如T细胞活化或NK细胞活化的方法，该方法包括向所述受试者施用如本文所述的药物组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本发明涉及控制活性药物分子在体内释放的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗受试者的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所定义的药物组合物的步骤。在一些实施方案中，该方法是治疗增殖性疾病的方法。在一些实施方案中，该方法是治疗癌症的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于疗法的如本文所定义的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及用于疗法的如本文所定义的药物组合物。优选地，提供如本文所定义的药物组合物用于治疗增殖性疾病。在更优选的实施方案中，增殖性疾病是癌症。
通常将本发明的药物组合物施用于已被鉴定为具有通常与药物分子相关的特异性副作用的高风险和/或需要大剂量药物分子使得有问题的副作用具有增加的可能性的受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在优选地实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，药物组合物的单次施用可能是足够的。在其他实施方案中，重复施用可能是必需的。各种因素将影响施用的次数和频率，诸如受试者的年龄和一般健康状况，以及药物分子的性质和典型的剂量方案。
本文所述的药物组合物可经由任何合适的施用途径施用给受试者，这些施用途径诸如肠胃外、鼻腔、口服、肺部、局部、***或直肠施用。适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。另外的细节参见Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.LippincottCompany，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编辑，第238-250页，1982年，以及ASHPHandbook on Injectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页，1986年。
本文所述的药物组合物可与另一种治疗剂组合使用。每种治疗剂可同时施用(例如，在相同药物中或同时施用)、并行施用(即，在单独的药物中以任何顺序一个接一个地施用)或以任何顺序依次施用。当组合疗法中的治疗剂为不同剂型(例如，一种药剂是片剂或胶囊剂，并且另一种药剂是无菌液体)和/或以不同给药方案施用时，顺序施用可能是有用的，例如，至少每日施用的镇痛剂和较不频繁施用的生物治疗剂，诸如每周一次或每两周一次。
附加的治疗剂包括但不限于镇痛剂、类固醇、抗癌剂、抗生素、青霉素、抗高血压剂、抗糖尿病剂、抗惊厥药、止吐药、抗抑郁药、检查点抑制剂(例如抗PD-1、PD-L1、Tim-3、LAG-3等)、免疫激动剂(例如41-BB、CD28、CD40等)、细胞因子(IL-15、IL-12等或抗TGFb、抗IL-10等)、免疫刺激剂、T细胞刺激剂、免疫肿瘤学模式(例如CAR-T和细胞疗法、抗体药物缀合物(ADC)、溶瘤病毒等)、化学疗法、放射性免疫缀合物等。
核酸和方法
本发明还涉及编码如本文所述的结合部分的核酸。在一个实施方案中，核酸编码包含如本文所定义的经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分。该核酸的示例由SEQ ID NO:16至19提供。本发明还涉及包含所述核酸的宿主细胞。
本发明还涉及制备本文所定义的结合部分的方法，该方法包括在表达所述重组结合蛋白的条件下培养本文所定义的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核宿主细胞。在其他实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞。在一个实施方案中，制备结合部分的方法包括在表达所述重组结合蛋白的条件下培养宿主细胞，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述宿主细胞是原核宿主细胞，诸如例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，制备结合部分的方法包括在表达所述重组结合蛋白的条件下培养宿主细胞，其中所述结合部分包含抗体，并且其中所述宿主细胞是真核宿主细胞，诸如例如CHO细胞。
实施例
下文公开的起始材料和试剂是本领域技术人员已知的，是可商购获得的和/或可使用熟知的技术制备。
材料
化学品购自Sigma-Aldrich(USA)。寡核苷酸来自Microsynth(Switzerland)。除非另有说明，否则DNA聚合酶、限制酶和缓冲液来自New England Biolabs(USA)或Fermentas/Thermo Fisher Scientific(USA)。诱导型大肠杆菌表达菌株用于克隆和蛋白质产生，例如大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，USA)或BL21(Novagen，USA)。用于SPR测量的NLC芯片来自BioRad(BioRad，USA)。HTRF试剂来自Cisbio(Cisbio，France)。泛T细胞分离试剂盒来自Miltenyi Biotec(Germany)。用于24孔格式的“复杂”Incucyte的聚酯***物来自Corning(USA)，并且中性抗生物素蛋白珠来自Thermo Fischer(USA)。Nuclight Red慢病毒来自Sartorius(Germany)。细胞毒性检测(通过LDH释放)试剂盒来自Roche。
分子生物学
除非另有说明，否则根据已知方案执行方法(参见例如Sambrook J.、FritschE.F.和Maniatis T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory 1989,New York)。
经设计的锚蛋白重复蛋白文库
用于生成经设计的锚蛋白重复蛋白文库的方法已经描述于以下中：例如，美国专利号7,417,130；Binz等人，2003，同前；Binz等人，2004，同前。通过此类方法，可构建具有随机化锚蛋白重复模块和/或随机化封端模块的经设计的锚蛋白重复蛋白文库。例如，此类文库可以因此基于固定的N-末端封端模块(例如SEQ ID NO:21、22或23的N-末端封端模块)或根据SEQ ID NO:24的随机化N-末端封端模块、根据SEQ ID NO:25、26或27的序列基序的一个或多个随机化重复模块以及固定的C-末端封端模块(例如SEQ ID NO:28的C-末端封端模块)或根据SEQ ID NO:29的随机化C-末端封端模块进行组装。优选地，此类文库被组装成在重复或封端模块的随机化位置处不具有氨基酸C、G、M、N(在G残基前面)和P中的任一者。
此外，此类文库中的此类随机化模块可包含具有随机化氨基酸位置的附加的多肽环***。此类多肽环***的示例是抗体的互补决定区(CDR)环文库或从头生成的肽文库。例如，可以使用人核糖核酸酶L的N-末端锚蛋白重复结构域的结构(Tanaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)作为指导来设计这种环***。类似于其中将十个氨基酸***在靠近两个锚蛋白重复的边界存在的β-转角中的这种锚蛋白重复结构域，锚蛋白重复蛋白文库可以含有***锚蛋白重复结构域的一个或多个β-转角中的可变长度(例如，1个至20个氨基酸)的随机化环(具有固定位置和随机化位置)。
锚蛋白重复蛋白文库的N-末端封端模块优选具有RILLAA、RILLKA或RELLKA基序，并且锚蛋白重复蛋白文库的任何此类C-末端封端模块优选具有KLN、KLA或KAA基序。
此类锚蛋白重复蛋白文库的设计可由与靶标相互作用的锚蛋白重复结构域的已知结构来指导。由其蛋白质数据库(PDB)唯一登录号或识别码(PDB-ID)识别的此类结构的示例为1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70和2ZGD。
已经描述了经设计的锚蛋白重复蛋白文库(诸如N2C和N3C经设计的锚蛋白重复蛋白文库)的示例(美国专利号7,417,130；Binz等人，2003，同前；Binz等人，2004，同前)。N2C和N3C中的数字描述了存在于N-末端和C-末端封端模块之间的随机化重复模块的数量。
用于定义重复单元和模块内部的位置的命名法基于Binz等人，2004(同前)，修改之处在于，锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边界移位一个氨基酸位置。例如，Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置1对应于本公开的锚蛋白重复模块的位置2，因而Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置33对应于本公开的以下锚蛋白重复模块的位置1。
实施例1：对CD3特异性结合结构域具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的选择
概述
使用核糖体展示(Hanes,J.和Plückthun,A.，PNAS 94,4937-42,1997)，以类似于Binz等人，2004(同前)描述的方式，以具体条件和附加的反选择步骤，从文库中选择对T细胞接合剂分子(TCE)的CD3特异性结合结构域具有结合特异性的多个锚蛋白重复结构域。通过大肠杆菌粗提取物均相时间分辨荧光(HTRF)，评估所选克隆对CD3特异性结合结构域的结合和特异性，指示成功选择了特异性结合CD3特异性结合结构域的多种结合蛋白。这些最初鉴定的结合蛋白被进一步开发以获得对TCE的CD3特异性结合结构域具有甚至更高亲和力和/或甚至更低解离速率的结合蛋白。例如，SEQ ID NO:1至10的锚蛋白重复结构域构成结合蛋白的氨基酸序列，该结合蛋白包含具有与双特异性T细胞接合剂分子的CD3特异性结合结构域的结合特异性和高结合亲和力和/或低解离速率的锚蛋白重复结构域。
CD3特异性结合结构域作为靶标和选择材料
双特异性TCE的CD3特异性结合结构域用作靶标和选择材料。这种靶结构域是选自SEQ ID NO:11-15的多肽。使用标准方法将靶蛋白生物素化。
通过核糖体展示选择靶特异性锚蛋白重复蛋白
经设计的锚蛋白重复蛋白文库(N2C和N3C)用于针对用作靶标的CD3特异性结合结构域(SEQ ID NO:11)的核糖体展示选择中(参见Binz等人，Nat Biotechnol22，575-582(2004)；Zahnd等人，Nat Methods 4,269-279(2007)；Hanes等人，Proc Natl Acad Sci USA95,14130-14135(1998))。
每个靶标和文库进行四轮选择。四轮选择采用标准核糖体展示选择，使用降低靶标浓度和增加洗涤严格性来增加从第1轮到第4轮的选择压力(Binz等人，2004，同前)。每轮选择后，逆转录(RT)-PCR循环数不断减少，从而由于结合物的富集而调整收率。然后对得到的3个池进行结合物筛选。
如通过粗提取物HTRF所示，所选克隆特异性结合TCE的CD3特异性结合结构域
使用标准方案，使用表达锚蛋白重复蛋白的大肠杆菌细胞的粗提取物，通过均相时间分辨荧光(HTRF)测定来鉴定溶液中特异性结合TCE的CD3特异性结合结构域的单独选择的锚蛋白重复蛋白。将通过核糖体展示选择的锚蛋白重复蛋白克隆以一种格式克隆到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，其中克隆与人血清白蛋白(HSA)结合结构域和CD3结合结构域(SEQ ID NO:11)共价连接，转化到大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)中，铺在LB-琼脂(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄西林)上，然后在37℃下温育过夜。将单个菌落挑取到含有165μl生长培养基(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄青霉素的LB)的96孔板中(每个克隆在单个孔中)，并以800rpm振荡在37℃处温育过夜。将含50μg/ml氨苄青霉素的150μl新鲜LB培养基与8.5μl过夜培养物一起接种于新鲜的96深孔板中。在37℃和850rpm处温育120分钟后，用IPTG(0.5mM最终浓度)诱导表达并持续6小时。通过将板离心来收获细胞，弃去上清液并将沉淀物在-20℃处冷冻过夜，然后重悬于10μlμl B-PERII(Thermo Scientific)中，并在室温处振荡(600rpm)温育一小时。然后，添加160μl PBS，并通过离心(3220g持续10min)去除细胞碎片。
将每个裂解克隆的提取物作为PBSTB(补充有0.1％ Tween 和0.1％(w/v)BSA的PBS，pH7.4)中的1:800稀释液(最终浓度)与12.5nM(最终浓度)生物素化CD3结合结构域、1:300(最终浓度)的抗FLAG-D2HTRF抗体-FRET受体缀合物(Cisbio)和1:300(最终浓度)的抗strep-Tb抗体FRET供体缀合物(Cisbio,France)一起施加到384孔板的孔中，并在4℃处温育120分钟。使用340nm激发波长及用于背景荧光检测的620±10nm发射滤光片和用于检测特异性结合的荧光信号的665±10nm发射滤光片，在Tecan M1000上读出HTRF。
将相同的裂解物与12.5nM(最终浓度)生物素化HSA、1∶300(最终浓度)抗FLAG-D2HTRF抗体-FRET受体缀合物(Cisbio)和1∶300(最终浓度)抗strep-Tb抗体FRET供体缀合物(Cisbio，France)混合到384孔板的孔中，并在4℃处温育120分钟。使用340nm激发波长及用于背景荧光检测的620±10nm发射滤光片和用于检测特异性结合的荧光信号的665±10nm发射滤光片，在Tecan M1000上读出HTRF。
测试每个裂解克隆的提取物对与生物素化CD3结合靶结构域的结合和对生物素化HSA的不受阻碍的结合的抑制，以便评估与CD3结合结构域的特异性结合。
对靶蛋白具有非常高亲和力的结合蛋白的进一步分析和选择
最初鉴定了总共744种结合蛋白。基于结合谱，选择172个候选物以在96孔格式中表达，并平行于DNA测序纯化至均一性。通过尺寸排阻色谱法、Sypro-Orange热稳定性评估(参见Niesen等人，Nat Protoc2，2212-2221，(2007))、ProteOn表面等离子体共振(SPR)靶亲和力评估、ELISA、靶蛋白竞争HTRF实验和/或SDS-PAGE来以生物物理方式表征候选物。
在最初鉴定的结合蛋白的进一步开发中，使用两种不同的方法产生对靶蛋白具有非常高的亲和力和/或从靶蛋白具有非常低的解离速率的结合物。在第一种方法中，选择一种最初鉴定的结合蛋白(“亲本”结合蛋白)作为亲和力成熟的合适起始点。亲和成熟程序包括用作起始点的锚蛋白重复结构域的每个随机位置的饱和诱变。通过竞争HTRF针对较低解离速率筛选由亲和力成熟程序产生的序列。由此鉴定的有益突变通过蛋白质工程化结合在结合蛋白中。通过表面等离子体共振(SPR)验证亲和力成熟和工程化的结合蛋白的结合性质。通过该方法产生衍生自亲本结合物的结合物#1至#4(SEQ ID NO:1至4)。
在第二种方法中，在针对靶蛋白(SEQ ID NO:11)进行四轮核糖体展示选择后获得的选择池用作附加的解离速率选择的起始点。针对另外两种生物素化靶蛋白(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)连续进行从池中的解离速率选择，每次在过量的各自非生物素化靶蛋白存在下进行。在一些情况下，解离速率选择过程与易错PCR组合。然后通过SPR评价通过该程序产生的数百种结合蛋白的结合性质。
基于这些第二种方法，选择以高亲和力和/或低解离速率与CD3特异性结合靶结构域结合的结合物#5至#10(SEQ ID NO:5至10)用于进一步分析。
总之，由这两种不同方法衍生的这10种结合蛋白(SEQ ID NO:1至10)构成本发明的结合部分。
如下所述，将这些对TCE CD3结合结构域具有结合特异性的所选结合蛋白克隆到基于pQE(QIAgen，Germany)的表达载体中，从而提供N-末端His-标签(SEQ ID NO:20)以有利于简单蛋白纯化。构建编码以下结合物的表达载体：
结合物#1(SEQ ID NO:1，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))；
结合物#2(SEQ ID NO:2，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))；
结合物#3(SEQ ID NO:3，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))。
结合物#4(SEQ ID NO:4，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))。
结合物#5(SEQ ID NO:5，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))。
结合物#6(SEQ ID NO:6，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))。
结合物#7(SEQ ID NO:7，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))；
结合物#8(SEQ ID NO:8，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))；
结合物#9(SEQ ID NO:9，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))；和
结合物#10(SEQ ID NO:10，具有融合至其N-末端的His-标签(SEQ ID NO:20))。
选择用于分析的结合蛋白的高水平和可溶性表达
为了进一步分析，将结合物在大肠杆菌细胞中表达，并根据标准方案使用它们的His-标签纯化。使用50ml固定过夜培养物(TB，1％葡萄糖、50mg/l的氨苄青霉素；37℃)接种1000ml培养物(TB，50mg/l氨苄青霉素，37℃)。在600nm处1.0至1.5的吸光度下，用0.5mMIPTG诱导培养物并在37℃处温育4小时-5小时，同时振荡。将培养物离心，并将所得沉淀物重悬于25ml TBS500(50mM Tris–HCl，500mM NaCl，pH8)中并裂解(超声处理或弗氏压碎器)。裂解后，将样品与50KU DNase/ml混合，温育15分钟，然后在62.5℃处热处理30分钟，离心并收集上清液并过滤。向匀浆中添加Triton X100(1％(v/v)最终浓度)和咪唑(20mM最终浓度)。根据本领域技术人员已知的标准方案和树脂，将蛋白质在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上进行纯化，随后在***上进行尺寸排阻色谱法。从大肠杆菌培养物(每升培养物至多200mg锚蛋白重复蛋白)中纯化对TCE CD3结合结构域具有结合特异性的高度可溶性锚蛋白重复蛋白，如从4％-12％ SDS-PAGE估计的纯度>95％。
实施例2：SPR结合测定
本发明的结合部分的一个重要特征是其对药物分子的亲和力。相关方面包括结合部分从药物分子的解离速率和所得的阻断半衰期。需要高亲和力、低解离速率和显著的阻断半衰期以实现药物分子从复合物中的缓慢释放，其中药物分子被结合部分可逆地结合。参见图1至图3以进一步说明和解释本发明的前药复合物的功能和性质。
使用表面等离子体共振(SPR)测定来确定锚蛋白重复结合结构域与TCE药物分子的CD3结合结构域的结合亲和力和解离速率。
使用Bio-Rad ProteOn XPR36仪器以PBS-T(0.005％Tween 20)作为运行缓冲液产生所有SPR数据。根据Bio-Rad手册对新的中性抗生物素蛋白传感器芯片(NLC)进行空气初始化和条件化。
生成结合至芯片上分别具有SEQ ID NO:13和14的生物素化CD3特异性结合结构域的结合物#1、#4、#5和结合物#9的前体(如上述实施例1中所列)以及用于亲和成熟方法的亲本结合物(参见实施例1)的SPR数据。在25℃处生成数据，并使用100nM的一种结合物浓度(即单迹线)测量2小时期间的解离速率。用SEQ ID NO:13作为靶蛋白获得的SPR迹线示于图4中。与亲本结合物相比，结合物#1、#4、#5和结合物#9的前体都展示出明显降低的解离速率。用SEQ ID NO:14作为靶蛋白获得了类似的结果。
生成结合至芯片上分别具有SEQ ID NO:13和14的生物素化CD3特异性结合结构域的结合物#1至结合物#9(如上文实施例1中所列)的进一步的SPR数据。在33℃处生成数据，并使用几种结合物浓度(26.7nM、3nM、1nM)(即，多迹线)测量2小时期间的结合速率(kon)、解离速率(koff)，并导出平衡解离常数(KD)。然后计算阻断半衰期(T1/2)。结果提供在下表2中：
表2
表2提供了针对两种不同的CD3结合蛋白(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)的一些超高亲和力结合物(分析物)的kon、koff和KD值，其中使用式T1/2＝ln2/koff＝0.693/koff从解离速率(koff)计算阻断T1/2。结合物的解离速率均低于1×10-4s-1。KD值均低于1×10-10M。对于结合物#5至结合物#9(SEQ ID NO:5至9)的SPR测量没有产生比表2中所示的那些更精确的值，这是由于在解离阶段期间缺乏至少10％的信号下降(koff计算基于此)。
所有结合物展示出至少3小时的阻断半衰期(T1/2)，其中一些展示出至少10小时的阻断半衰期。因此，这些实验显示，结合物#1至结合物#9对用于TCE药物分子中的CD3特异性结合结构域具有非常高的结合亲和力。此外，结合物#1至结合物#9从这些靶蛋白的解离速率非常低，因此具有非常显著的阻断半衰期。当在可比较的SPR测定中测试时，结合物#10展示出与结合物#9类似的性质。
实施例3：T细胞活化/杀伤测定
在该实施例中，测试了本发明的三个结合部分和亲本结合物抑制T细胞被T细胞接合剂(在本文中称为TCE#1)活化和被活化的T细胞杀伤肿瘤细胞的潜力。TCE#1包含与肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合结构域(TAA结合结构域)共价连接的CD3特异性结合结构域(SEQID NO:13)。TAA在用于测定的肿瘤细胞上表达。
如下所指示制备前药复合物样品，浓度为最终测定浓度的100倍，以确保基本上所有TCE都被结合部分结合。
前药复合物样品的制备和添加到T细胞活化/杀伤测定中
1.制备最终10pM 200x浓缩(2nM)的恒定的TCE
2.制备结合部分滴定液，最终起始10nM，200x浓缩(起始2000nM，1:3系列稀释：2000nM、666nM、222nM、74nM、25nM、8.2nM、2.7nM、0.91nM、0.30nM)。
3.1:1混合TCE与结合部分滴定液(或单独的TCE或单独的结合部分与测定介质)→100x
4.在pH控制的温育箱中，37℃平衡至少24小时
5.在测定开始前1:100(200μl体积中的2μl)稀释到T细胞活化/杀伤实验→1x
6.温育48小时
对于T细胞活化测定，将靶肿瘤细胞和效应T细胞(来自健康血液供体的泛T细胞)以5:1的效应细胞与靶细胞比率组合，添加前药复合物样品，并将混合物在37℃处温育48小时。分析上清液中杀伤的肿瘤细胞的LDH释放，并通过FACS(使用CD25单克隆抗体(BC96)，PerCP-Cyanine5.5，eBioscienceTM)确定CD8+T细胞上的活化标记(CD25)的水平。如图5a和图5b中所指示，包括各种对照(即仅T细胞、仅肿瘤细胞、Triton对照、仅结合部分)。
结果提供在图5a和图5b中。可以看出，本发明的三个结合部分(结合物#4(SEQ IDNO:4))；结合物#5(SEQ ID NO:5)；和结合物#9(SEQ ID NO:9))在比亲本结合物低得多的浓度下抑制T细胞活化和肿瘤细胞杀伤，这与本发明的结合部分的高得多的结合亲和力一致。IC50值(以nM表示)提供在图5a和图5b中。
实施例4：“简单” 测定
标准T细胞活化测定(诸如上述实施例3中的那些)在限定的时间点后提供单一读出。为了本发明的目的，需要在不同的时间点的多次读出以获得关于T细胞介导的肿瘤细胞生长抑制(用作T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的替代物)的时间分辨的视图。分析(参见https://www.essenbioscience.com/en/products/incucyte/)可以提供这样的信息。Incucyte测定原理是将T细胞(或者是hPBMC的泛T细胞)与肿瘤细胞共温育，该肿瘤细胞已经用NucLight Red慢病毒转导，该NucLight红慢病毒使细胞呈红色，因此对于Incucyte照相机是可检测的，并且通过确定红色物体(即，被Incucyte (一种核限制性mKate2蛋白(红色荧光蛋白))标记的肿瘤细胞)的面积，可以通过Incucyte照相机以时间分辨方式监测存在T细胞下的肿瘤细胞生长。
在初始实验中，制备T细胞接合剂(TCE#1)，100倍浓缩，从2nM的浓度开始以2倍系列稀释(在测定中为20pM最终浓度)。将TCE#1添加到表达TAA的泛T细胞和肿瘤细胞中，并用NucLight Red标记用于通过检测。在4.5天的过程中，在/>装置中观察到红色标记的肿瘤细胞的生长。图6a显示，在较高浓度的TCE#1(从20pM开始)处，TCE#1有效地抑制肿瘤细胞生长，并且随着浓度降低(以2倍步长)，肿瘤细胞生长的抑制逐渐降低，在0.16pM和0.64pM之间转变(EC50为约0.27pM)。因此，在0.1pM以下，TCE对肿瘤细胞生长没有显著影响，而在0.1pM与1pM之间，TCE处于T细胞介导的肿瘤细胞生长抑制的动态范围内，而在>1pM处，TCE导致完全的T细胞介导的肿瘤细胞生长抑制(用作T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的替代物)。图6b说明了这些发现并显示TCE活性的EC50为约0.27pM。/>
滴定前药复合物的“简单” 测定设置
为了研究本发明的结合部分对TCE介导的表达TAA的肿瘤细胞生长的抑制的作用，用各种药物复合物样品进行了进一步的测定。通过将结合部分滴定至恒定浓度的TCE(TCE#1)来制备药物复合物样品。将混合物制备成100x浓缩储液，以确保在实验开始时(即，将前药复合物添加到T细胞和肿瘤细胞中)基本上所有药物分子都被结合部分复合。将平衡的100x浓缩储液通过添加到细胞中而稀释100倍，并且在4.5天的持续时间内跟踪红色标记的肿瘤细胞的生长变化，作为T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的替代物(见图7和图8)。
前药复合物样品的制备和添加到实验中：
1.制备最终10pM 200x浓缩(2nM)的恒定的TCE
2.制备结合部分滴定液，最终起始浓度为10nM，200x浓缩(起始2μM)
3.1:1混合TCE与结合部分滴定液(或单独的TCE或单独的结合部分与测定介质)→100x浓缩储液样品
4.在pH控制的温育箱中于37℃处平衡至少24小时
5.在测定开始前1:100稀释到实验(用NucLight Red标记的T细胞+肿瘤细胞)(200μl体积中的2μl)
6.在中确定肿瘤细胞增殖长达5天
在第一个实验中，研究了简单测定区分亲本结合物(KD约200pM)和具有SEQ ID NO:5的超高亲和力结合部分(KD约6pM或更低)(结合物#5)的能力。图7a至图7d清楚地显示，亲本结合物在样品中展示出在亲本结合物相对于药物分子330倍至110倍摩尔过量之间的阻断损失，而超高亲和力结合部分(结合物#5)完全阻断药物分子的活性，即使在前药复合物样品中结合部分相对于药物分子低得多的4倍摩尔过量。
在第二个实验中，在类似的设置中研究了不同的超高亲和力结合部分(图8a至图8c)。随着药物复合物样品中结合部分相对于药物分子(TCE#1)的摩尔过量降低，观察到药物分子的抗肿瘤活性的抑制的损失。这种抑制是损失显示与结合部分对药物分子的结合亲和力相关。结合物#4在4倍摩尔过量时已经显示出TCE活性的抑制损失，导致肿瘤细胞生长的抑制增加，而其他两个结合部分结合物#5和结合物#9在4倍摩尔过量时仍然有效地抑制TCE活性，产生没有任何T细胞介导的抑制的正常生长曲线。只有当摩尔比降低到1:1时，结合物#5和结合物#9才显示对TCE活性的抑制的损失，导致T细胞介导的对肿瘤细胞生长的抑制增加。即使在1:1的摩尔比处，结合物#9也可以在一定程度上抑制TCE活性，导致对肿瘤细胞生长的弱抑制。
这些数据证实，测定是研究超高亲和力结合部分的TCE阻断的灵敏方法，并且结合部分表现出如由实施例2中SPR显示的超高亲和力所预期的阻断活性。
总之，这些实验指示，本发明的结合部分可以有效地抑制药物分子的生物活性，这取决于结合部分对药物分子的结合亲和力，如本文以TCE#1作为药物分子和实施例1中描述的结合物作为结合部分的示例性方式所展现的。
实施例5：“复杂” 测定/>
在体内情况下，结合部分由于其短的半衰期，一旦从药物分子解离，其就被快速消除。相反，如果药物分子被设计成具有长半衰期，则无论其是否复合，药物分子都可以在体内循环远更长的时间。产生具有长半衰期的药物分子的方法是本领域熟知的，包括例如与半衰期延长部分融合。为了模拟结合物的快速肾消除，“复杂”设置配备有附加的所谓“槽”室。在该槽室中，添加大量过量的测试的结合部分的珠固定的靶蛋白(相对于添加到主室中的前药复合物中所含的结合部分的量>10,000倍摩尔过量)。这种固定的靶蛋白一旦从前药复合物解离并扩散到槽室中，就清除游离的结合部分。
在本文描述的实验中，使用TCE(TCE#1)作为药物分子。因此，添加到槽室中的固定的清除剂蛋白是以高亲和力被测试的结合部分结合的CD3特异性结合结构域(SEQ ID NO:11)。
实验设置
如在实施例4中，表达TAA的肿瘤细胞系用作靶细胞系，其已经用IncucyteNuclight Red慢病毒转导用于通过照相机检测。将泛T细胞与不同的前药复合物一起添加。通过在123pM(12.3倍摩尔过量)、41pM(4.1倍摩尔过量)和13.7pM(1.37倍摩尔过量)处用不同量的结合物#9预平衡10pM TCE#1(最终浓度)来产生前药复合物。然后将这些前药复合物中的每一前药复合物用于“复杂”/>设置中，其具有不隔离游离结合部分的未包被的珠(图9a)作为阴性对照，或具有CD3特异性结合结构域包被的珠，因此具有功能槽(图9b)。另外，未结合的TCE#1(10pM)以及背景(即没有前药复合物或TCE，但具有珠)用作对照。通过确定由/>照相机检测到的红色物体的面积来测量肿瘤细胞生长达5天的时段。
图9a显示，在具有含有未包被的珠的槽室的孔中，所测试的结合部分完全抑制TCE活性，因此没有观察到T细胞介导的肿瘤细胞生长的抑制，除了用最低的结合物:TCE比(1.37:1)产生的前药复合物。这与实施例4中所示的结果一致。相反，在具有含有用CD3特异性结合结构域包被的珠的功能槽室(图9b)的孔中，所测试的结合部分仅部分抑制TCE活性，因此甚至在最高的结合物:TCE比率(12.3:1)处，也观察到T细胞介导的肿瘤细胞生长的抑制。与具有未结合的TCE的对照相比，具有前药复合物的孔中的T细胞介导的肿瘤细胞生长的抑制(作为T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的替代物)以显著延迟开始，仅在实验开始后约1.5天-2天。在实验开始后约1天，具有未结合的TCE的孔中肿瘤细胞生长的抑制已经开始。在肿瘤细胞生长的延迟抑制中反映的TCE药物分子的延迟活性展现，当与药物分子复合形成前药复合物时，结合部分可以延迟药物分子的生物活性。这些数据支持这样的概念，即本发明的结合部分可以与药物分子形成前药复合物，与施用未结合的药物分子相比，在将前药复合物施用于患者时导致药物分子的释放减慢并因此导致药物分子的活性下调。
实施例6：在离体人全血测定中，通过与结合物复合瞬时阻断TCE药物分子的CD3效 应部分减少细胞因子释放。
为了研究结合物对TCE药物分子(在该实施例中，TCE#1(SEQ ID NO:54)，α-CD123xα-CD33 xα-CD3 T细胞接合剂)的细胞因子释放概况的作用，在Immuneed AB，Sweden进行离体人全血液测定。
所应用的全血回路***可用于研究血液和药物样品之间的相互作用，包括对细胞因子释放的作用。血回路***独特地包括血液中的免疫细胞、免疫球蛋白以及完整的补体和凝血级联***(Fletcher，E.A.K.等人，Int Immunopharmacol，2018.54：第1页-第11页)。通过将测试制品掺入来自含有CD123+和CD33+靶细胞的一个健康人供体的新鲜人全血中、随后在旋转轮上温育样品以避免血液凝固以及模拟血液循环来确定细胞因子释放。
作为对照，将媒介物或1nM抗CD 123x抗CD3工业对照测试制品掺入人全血中。以1nM浓度掺入TCE#1分子，并与1nM TCE#1+1.2nM结合物#5比较。将复合的TCE用1.2倍摩尔过量的结合物预平衡以保证在实验开始时TCE的100％复合率。测试制品示于图10A和图10B中。
通过Meso Scale技术在时间点0小时、2小时、4小时、8小时、24小时确定人TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的细胞因子释放。
如图10C至图10F中所示，在测量的24小时期间，观察到响应于α-CD123 xα-CD3工业对照，所有细胞因子相对于媒介物的水平增加，并且未结合的TCE#1的程度较小。然而，在所有时间点，与未结合的TCE#1相比，由与结合物#5复合的TCE#1组成的复合TCE极大地减少了TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的细胞因子释放。
总之，在离体人全血测定中显示包含TCE(诸如TCE#1)与结合物(诸如结合物#5)的复合物的TCE前药复合物有效地阻抑细胞因子释放。
实施例7：在体内功效研究中，TCE前药复合物维持最佳抗肿瘤活性
体内功效研究的目的是比较未结合的TCE药物分子(在该实施例中，TCE#2(SEQ IDNO:55)，一种α-HSA xα-CD123 xα-CD33 xα-CD3 T细胞接合剂，其包含半衰期延长部分(α-HSA))和复合的TCE药物分子(TCE前药复合物)(在该实施例中，TCE#2与两种不同的结合物之一的复合物，该两种不同的结合物具有在两位数pM(结合物#4)或甚至1pM或更低范围(结合物#10)内的亲和力)的抗肿瘤活性。在第0天用来自两个人供体(n＝5供体A和n＝5供体B)的PBMC将NOG小鼠人源化。在第2天皮下注射1x106Molm-13肿瘤细胞，随机化后第6天开始治疗，肿瘤大小为约70mm3。质量控制包括在分离后1天通过FC分析PBMC亚群和生存力，以及在第19天通过FC成功人源化小鼠血液。在注射前1天测试Molm-13细胞的生存力和CD33阳性。
用于体内功效研究的测试制品示于图11A和图11B中。研究设计和治疗组概述于图11C中。以200μg/kg或1000μg/kg剂量给予TCE#2，并与1000μg/kg TCE#2和结合物#4(KD约20pM)或结合物#10(KD≤1pM)的复合物进行比较。使用2x摩尔过量的结合物预平衡复合物以保证在治疗开始时100％的复合率。i.v.给予治疗。除了抗CD 33x抗CD 3工业对照组2(其中每日以200μg/kg给予治疗)之外，所有治疗组(包括媒介物)从第6天至第16天每周3次。在第一治疗剂量之前和第一治疗剂量后4小时采集血样以确定以这些相对小的肿瘤在治疗开始时的细胞因子水平。监测肿瘤生长并用卡尺每周测量3次宽度和长度，使用式长度x宽度x高度xπ/6计算肿瘤体积。
图11D显示了用供体A或供体B的PBMC人源化的n＝10只小鼠的所有6个治疗组的肿瘤生长曲线，绘制为平均值±SEM。对于第2组(α-CD33xα-CD3工业对照)，用供体B的PBMC人源化的两只动物由于人源化不成功而被排除在分析之外。
对于组合的供体A和供体B，对于以200μg/kg每日给予的非半衰期延长的抗CD33 x抗CD3工业对照组观察到强的肿瘤生长抑制，并且对于以1000μg/kg每周3次给予的半衰期延长的TCE#2观察到肿瘤根除。对于以200μg/kg每周3次给予的TCE#2，以及对于包含1000μg/kg TCE#2+2x摩尔过量的结合物#4每周3次剂量的TCE前药复合物，观察到较不显著的肿瘤生长抑制。在这些实验条件下，对于包含1000μg/kg TCE#2+2x摩尔过量的结合物#10的TCE前药复合物，没有观察到类似的肿瘤生长抑制。
计算机模拟建模预测200μg/kg游离TCE与1000μg/kg TCE-结合物复合物之间的类似AUC，该TCE-结合物复合物由用结合物#4(KD约20pM)瞬时阻断的TCE#2组成。相反，预计TCE#2的PK与结合物#10的非常高的亲和力(KD≤1pM)的组合导致活性TCE的较低暴露，因为在结合物可以释放活性TCE#2之前，可以从循环中消除较大比例的TCE#2+结合物#10复合物。因此，就在维持完全抗肿瘤功效的同时最佳减少细胞因子释放而言，“最佳点”是结合物亲和力与TCE的血清半衰期的相互作用。所提供的缓慢释放TCE前药工具箱允许将足够的结合物与TCE匹配。
图11E显示了用供体A的PBMC人源化的n＝5只小鼠的所有六个治疗组的肿瘤生长曲线，绘制为平均值±SEM，而图11F显示了用供体B的PBMC人源化的n＝5只小鼠的所有六个治疗组的肿瘤生长曲线，除了第2组，其中由于人源化不成功而排除了两只动物。在该实验中观察到显著的供体-供体可变性，来自供体A的PBMC对Molm-13细胞的生长显示出比来自供体B的PBMC更强的抑制作用。图11G显示了图11D至图11F的图例。
图12显示了当肿瘤仍然相对小时，在体内功效研究的第一次治疗剂量之前和之后4小时采集的血样的血清中确定的细胞因子水平。通过CBA人Th1/Th2/Th17试剂盒(BDBiosciences)对未稀释的血清样品确定人细胞因子水平。
对于α-CD33×α-CD3工业对照，对于所有测量的细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6)，可以观察到从0小时到4小时细胞因子显著增加，而对于TCE#2，在两种施用剂量下都有较小程度的增加。然而，这种细胞因子的增加被包含TCE#2+结合物#4或结合物#10的TCE前药复合物阻止，这支持了以下发现：TCE药物分子与高亲和力结合物的复合导致活性TCE的缓慢释放并且因此改变了暴露概况。
总之，缓慢释放TCE前药复合物(包含TCE#2与结合物#4的复合物(对CD3效应部分的KD为约20pM))在较低剂量处显示与未结合的TCE相等的抗肿瘤功效，并且在第一治疗剂量后4小时降低TCE#2的轻度细胞因子水平。
实施例8：体内安全性研究中缓慢释放TCE前药复合物减少细胞因子释放
两个独立的体内安全性研究的目的是比较由未结合的TCE药物分子(在该实施例中，TCE#2，一种α-HSA xα-CD123 xα-CD33 xα-CD3 T细胞接合剂)和缓慢释放TCE前药复合物(在该实施例中，TCE#2与三种不同结合物之一的复合物，该三种不同结合物具有双位数pM(结合物#1和结合物#4，研究1)或甚至≤1pM范围(结合物#10，研究2)的亲和力)触发的细胞因子释放的程度。
用于体内安全性研究的测试制品示于图13A和图13B中。研究设计和治疗组概述于图13C中。将体内安全性研究与体内功效研究分开的原因是需要中等大小的肿瘤以具有足够量的靶细胞并因此在首次施用TCE后引发可测量的细胞因子应答。
在第0天用来自两个人供体(n＝5供体A和n＝5供体B)的PBMC将NOG小鼠人源化。在第2天皮下注射1x106Molm-13肿瘤细胞，并且在第14天在肿瘤大小为约300mm3-800mm3时静脉内给予单剂量(攻击)。质量控制包括在分离后1天通过FC分析PBMC亚群和生存力，以及在第15天(研究1)或第19天(研究2)通过FC成功人源化小鼠血液。将以1000μg/kg施用的半衰期延长的未结合TCE#2与TCE前药复合物(TCE#2与结合物#1、结合物#4或结合物#10的复合物)进行比较。用2倍摩尔过量的结合物预平衡复合物以保证在治疗开始时100％的复合率。在给药前、第一治疗剂量后2小时、4小时、8小时和24小时取血样，以用中等大小肿瘤确定细胞因子水平。图13D显示了在单剂量治疗之前或在之后的指示时间点采集的血样的血清中的人细胞因子水平(TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6)。通过CBA人Th1/Th2/Th17试剂盒(BDBiosciences)对未稀释的血清样品确定细胞因子水平。
在单剂量的未结合的TCE#2之后所有细胞因子都升高，而对于所测试的三种不同的TCE前药复合物可以观察到减少的细胞因子释放。细胞因子释放的减少确实与结合物亲和力相关，并且随着结合物亲和力从顶行(KD为约40pM的结合物#1)到中间行(KD为约20pM的结合物#4)到底行(KD≤1pM的结合物#10)增加而变得更显著。结合物#10几乎完全抑制细胞因子释放。
总之，与未结合的TCE相比，缓慢释放TCE前药复合物能够减少细胞因子体内释放。此外，TCE中对CD3效应部分的结合物亲和力与细胞因子释放的减少相关。
按照本说明书内引用的参考文献的教导内容最彻底地理解本说明书。本说明书内的实施方案提供了对本发明实施方案的说明，并且不应理解为限制本发明的范围。技术人员容易认识到，本发明涵盖许多其他实施方案。本公开中引用的所有出版物、专利和GenBank序列均全文以引用方式并入。在以引用方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何此类材料。对本文任何参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。
本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求涵盖。
序列
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序列表
<110> MOLECULAR PARTNERS AG
<120> 新的缓慢释放前药
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<141>2021-12-16
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<150> EP 20216705
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<151> 2020-12-16
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<223> /注释=“经设计的锚蛋白重复结构域”
<400> 7
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Glu Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ser His Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Ser Ser Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 8
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“经设计的锚蛋白重复结构域”
<400> 8
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Arg Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Val Ala Ala Ser His Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Leu Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Gln Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 9
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“经设计的锚蛋白重复结构域”
<400> 9
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Glu Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Phe Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Val Ser Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Gln Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 10
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“经设计的锚蛋白重复结构域”
<400> 10
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Glu Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Phe Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Val Ser Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Gln Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 11
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“CD3特异性结合结构域”
<400> 11
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“CD3特异性结合结构域”
<400> 12
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ser Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“CD3特异性结合结构域”
<400> 13
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 14
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“CD3特异性结合结构域”
<400> 14
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 15
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“CD3特异性结合结构域”
<400> 15
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Asn Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 16
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸”
<400> 16
gacttaggaa agaaattgct gcaagccgca cgcgccggtc aacttgatga ggtgcgcgaa 60
ttattgaagg caggtgcaga cgtgaacgct aaagacttta agggacttac tcctttacac 120
ttagcggccg cacatggtca tttggaaatt gtggaggtcc tgttgaaggc tggcgccgac 180
gtgaacgcca aagatgttta cggttggacc ccattacaca ttgctgccgc ctcgggacat 240
ctggaaattg ttgaggttct gcttaaagct ggcgcagacg ttaatgccaa ggactggttg 300
gggattacgc ccttacacct ggccgcgtca catggacatt tagagattgt agaagtcctg 360
ttaaaggcgg gcgcggacgt taatgcccaa gacaaaagtg gcaaaacacc agcggatctg 420
gccgctcgtg ctggacacca ggacattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471
<210> 17
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸”
<400> 17
gacttaggaa agaaattgct gcaagccgca cgcgccggtc aacttgatga ggtgcgcgaa 60
ttattgaagg caggtgcaga cgtgaacgct aaagacttta agggacttac tcctttacac 120
ttagcggccg agcatggtca tttggaaatt gtggaggtcc tgttgaaggc tggcgccgac 180
gtgaacgcca aagatgttta cggttggacc ccattacact gggctgccgc caagggacat 240
ctggaaattg ttgaggttct gcttaaagct ggcgcagacg ttaatgccaa ggactggttg 300
gggattacgc ccttacacct ggccgcgtca catggacatt tagagattgt agaagtcctg 360
ttaaaggcgg gcgcggacgt taatgcccaa gacaaaagtg gcaaaacacc agcggatctg 420
gccgctcgtg ctggacacca ggacattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471
<210> 18
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸”
<400> 18
gacttgggga aaaaactgct tcaggctgca cgcgctggtc agttagatga ggtgcgtgag 60
ttgttaaaag ctggagcgga cgtaaatgct aaagatcatt acggatggac acccctgcat 120
cttgcagcgt cagaaggtca ccttgaaatc gtcgaggtcc ttttgaaagc aggggcagat 180
gtcaacgcca aggactggat cggttggacc cctcttcatt tagctgcttc gttcggtcat 240
ctggagattg tagaagtttt attaaaagcc ggtgcggatg tgaatgcaaa agatgtctca 300
gggaaaaccc cgttacacat cgccgctcgt caagggcatt tagagatcgt cgaggtactg 360
ttgaaagcgg gcgcagatgt caatgcacag gacaagtccg gcaaaactcc agcggattta 420
gctgcgcgcg caggacacca agacattgcg gaagtcttac aactgcagaa ggcagcg 477
<210> 19
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸”
<400> 19
gacttgggga aaaaactgct tcaggctgca cgcgctggtc agttagatga ggtgcgtgag 60
ttgttaaaag ctggagcgga cgtaaatgct aaagatcatt acggatggac acccctgcat 120
cttgcagcgt cagaaggtca ccttgaaatc gtcgaggtcc ttttgaaagc aggggcagat 180
gtcaacgcca aggactggat cggttggacc cctcttcatt tagctgcttc gttcggtcat 240
ctggagattg tagaagtttt attaaaagcc ggtgcggatg tgaatgcaaa agatgtctca 300
gggaaaaccc cgttacacat cgccgctcgt caagggcatt tagagatcgt cgaggtactg 360
ttgaaagcgg gcgcagatgt caatgcacag gacaagtccg gcaaaactcc agcggattta 420
gctgcgcgcg caggacacca agacattgcg gaagtcctgc agaaggcagc g 471
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“His-标签”
<400> 20
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“N-末端封端模块”
<400> 21
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“N-末端封端模块”
<400> 22
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“N-末端封端模块”
<400> 23
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“N-末端封端模块”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(12)
<223> 任何氨基酸
<400> 24
Asp Leu Gly Xaa Lys Leu Leu Gln Ala Ala Xaa Xaa Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 25
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 任何氨基酸
<400> 25
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 26
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 任何氨基酸
<400> 26
Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 27
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 任何氨基酸
<400> 27
Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 28
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“C-末端封端模块”
<400> 28
Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly
1 5 10 15
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 29
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“C-末端封端模块”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 任何氨基酸
<400> 29
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Xaa Ala Ala Arg Xaa Gly
1 5 10 15
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 30
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 30
Lys Asp Phe Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 31
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 31
Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 32
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 32
Lys Asp Trp Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 33
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 33
Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 34
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 34
Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Ala Lys Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 35
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 35
Lys Asp Phe Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 36
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 36
Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Ala Lys Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 37
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 37
Lys Asp His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ile Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 38
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 38
Lys Asp Trp Ile Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 39
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 39
Lys Asp Val Ser Gly Lys Thr Pro Leu His Val Ala Ala Ala His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 40
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 40
Lys Asp Gln Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Ser Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 41
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 41
Lys Asp Trp Val Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 42
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 42
Lys Asp Glu Ala Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Lys Gln Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 43
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 43
Lys Asp His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Glu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 44
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 44
Lys Asp Trp Ile Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 45
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 45
Lys Asp Ser Ser Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 46
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 46
Lys Asp His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Arg Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 47
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 47
Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Val Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 48
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 48
Lys Asp Leu Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Gln Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 49
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 49
Lys Asp His Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Glu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 50
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 50
Lys Asp Trp Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Phe Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 51
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<400> 51
Lys Asp Val Ser Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Gln Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 52
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(15)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(27)
<223> 任何氨基酸
<400> 52
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Xaa Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Leu Val Xaa Val Leu Leu Xaa Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 53
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“锚蛋白重复模块”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 任何氨基酸
<400> 53
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Glx Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 54
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“TCE （没有半衰期延长部分）”
<400> 54
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp
20 25 30
Trp Leu Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Glu Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile
50 55 60
Asp Asp Asn Asn Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Asp Gly
65 70 75 80
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
85 90 95
Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn
100 105 110
Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro
115 120 125
Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Asp Lys Leu Leu Leu Ala Ala Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp
165 170 175
Val Asn Ala Lys Asp Tyr Asp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
180 185 190
Asp Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
195 200 205
Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Leu His Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
225 230 235 240
Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Val Phe Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu
245 250 255
Ala Ala Tyr Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala
260 265 270
Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu
290 295 300
Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys
305 310 315 320
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu
325 330 335
His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro
355 360 365
Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
370 375 380
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr
385 390 395 400
Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val
405 410 415
Leu Gln Lys Ala Ala
420
<210> 55
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 源
<223> /注释=“TCE （具有半衰期延长部分）”
<400> 55
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Leu Asp Trp Leu Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Ile Asp Asp Asn Asn Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala
210 215 220
Ala Ile Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly
225 230 235 240
Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile
245 250 255
Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala
260 265 270
Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Asp Lys Leu Leu
290 295 300
Leu Ala Ala Thr Ser Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala
305 310 315 320
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Asp Gly Asp Thr Pro Leu
325 330 335
His Leu Ala Ala Asp Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Ser Gly Ser Thr Pro
355 360 365
Leu His Ala Ala Ala Ala Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
370 375 380
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Val Phe Gly Tyr Thr
385 390 395 400
Pro Ala Asp Leu Ala Ala Tyr Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val
405 410 415
Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
420 425 430
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly
435 440 445
Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg
450 455 460
Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly
465 470 475 480
Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe
485 490 495
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys
500 505 510
Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile
515 520 525
Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser
530 535 540
Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gln Asp
545 550 555 560
Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565

Claims (15)

1.一种组合物，所述组合物包含(i)结合部分和(ii)药物分子；
其中所述结合部分可逆地结合至所述药物分子；并且
其中所述结合部分当结合时抑制所述药物分子的生物活性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述结合部分包含抗体、替代性支架或多肽。
3.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
4.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述结合部分对所述药物分子的结合亲和力允许在将所述组合物施用于哺乳动物后随着时间变化释放所述药物分子。
5.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述结合部分以小于10nM的解离常数(KD)结合所述药物分子。
6.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述结合部分与所述药物分子的解离速率(koff)介于约1×10-8s-1与约1×10-4s-1之间。
7.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述结合部分当与所述药物分子复合时具有阻断半衰期(T1/2)，其中所述阻断半衰期根据下式计算：
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述阻断半衰期(T1/2)为至少约2小时。
9.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30至51，以及(2)其中SEQ ID NO:30至51中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1至10，以及(2)与SEQ ID NO:1至10中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
12.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述药物分子对CD3具有结合特异性。
13.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述药物分子是T细胞接合剂药物分子(TCE)。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的组合物，其中所述结合部分与所述TCE药物分子的结合抑制所述TCE药物分子与T细胞的结合和/或T细胞的活化。
15.根据任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物用于疗法中。
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